İŞLENMİŞ KALAMAR ÜRÜNLERİNDE SİTOKROM OKSİDAZ I GEN DİZİLERİ KULLANILARAK TÜR TAYİNİ

Transkript

1 GIDA (2011) 36 (6): Araflt rma / Research İŞLENMİŞ KALAMAR ÜRÜNLERİNDE SİTOKROM OKSİDAZ I GEN DİZİLERİ KULLANILARAK TÜR TAYİNİ Emre Keskin 1,2 *, Hasan Hüseyin Atar 1 1 Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Su Ürünleri Mühendisli i Bölümü 2 Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Gelifl tarihi / Received: Düzeltilerek Gelifl tarihi / Received in revised form: Kabul tarihi / Accepted: Özet fllenmifl su ürünlerinde kullan lan türlerin tayininde moleküler yaklafl mlar n kullan lmas, iflleme sonucunda morfolojik özelliklerin kaybolmas ndan dolay bir zorunluluk olarak karfl m za ç kmaktad r. Bu çal flmada, kalamar ürünlerinde kullan lan türlerin belirlenmesinde sitokrom oksidaz I gen dizilerinin karfl laflt r lmas yönteminden yararlan lm flt r. Ürünlerden elde edilen DNA dizileri hizaland ktan sonra Gen Bankas veri taban ndaki referans diziler ile karfl laflt r larak tür seviyesinde eflleflmeler gerçeklefltirilmifltir. Ayr ca bu örnekler ve referans dizilerden elde edilen veriler kullan larak filogenetik bir analiz de gerçeklefltirilmifltir. Elde edilen sonuçlar 10 farkl üründen elde edilen DNA dizilerinin 2 farkl familyadan 7 türe ayr ld klar n göstermektedir. Bu örneklerin 3 tanesinin ekonomik önemi yüksek olan Loliginidae familyas ndan, di er 4 örne in ise ekonomik de eri daha düflük olan Ommastrephidae familyas ndan olduklar tespit edilmifltir. Ürün paketlerinde bulunan etiketlerde 6 örnekte tür belirtilmezken, di er 4 örnekte cins belirtilmifl ve bunlardan biri belirtilenden farkl olarak tespit edilmifltir. Anahtar kelimeler: DNA dizi analizi; ifllenmifl su ürünleri; kalamar; moleküler tür tayini; sitokrom oksidaz I. SPECIES IDENTIFICATION IN PROCESSED SQUID PRODUCTS THROUGH CYTOCHROME OXIDASE I GENE SEQUENCES Abstract Molecular approaches used in species identification of processed seafood become a necessity as morphological characters were lost during this process. In this study, we used comparison of cytochrome oxidase I gene sequences to determine the species used in processed squid products. Identifications at species level were implemented through alignment of DNA sequences gathered from the samples and comparing them with reference sequences acquired from GenBank database. Also we performed a phylogenetic analysis using these samples and reference sequences. A phylogenetic tree was build using UPGMA method with 1000 bootstrap replicates for the reliability of the constructed tree. Results showed that species used in 10 products were belonging to 7 species from 2 families. Four of these samples were belonging to high-valued Loliginidae family and the other six samples were belonging to lowervalued Ommastrephidae family. There was no any specification about the species in the labels of 6 squid products but there was about the genus in the labels of the rest of 4 squid products in which one of the genus was found out as different. Keywords: Cytochrome oxidase I; DNA sequence analysis; molecular species identification; processed seafood; squid. * Yazışmalardan sorumlu yazar / Corresponding author; keskin@ankara.edu.tr (+90) (+90)

2 E. Keskin, H. Hüseyin Atar GİRİŞ Kafadanbacakl lar, Yumuflakçalar flubesinin bir parças olarak yaklafl k 1000 türü içerisinde bar nd r r (1). Bunlar içerisinde bulunan kalamarlar, dünyadaki toplam deniz avc l n n %3.6 s n, avlanan kafadanbacakl lar n ise %70 ini, oluflturarak ekonomik ve ekolojik aç dan çok önemli bir yer teflkil ederler (2-4). Yakalanan kalamarlar n büyük ço unlu u barsaklar n ve derinin ç kar lmas, kafan n, kollar n, tentaküllerin ve yüzgeçlerin ayr lmas ve vücudun dilimlenmesi aflamalar n içeren iflleme tekni i uyguland ktan sonra sat lmaktad r (4). Bu iflleme aflamalar sonras nda tür tespiti, hatta baz durumlarda cins tespiti bile gerçeklefltirmek neredeyse imkâns z hale gelmektedir (5). Bu uygulama sonras nda tür tespitinin zorlaflmas, ürünlerde Loliginidae familyas na ait ekonomik de eri yüksek türler yerine daha düflük ekonomik öneme sahip türlerin kullan lmas na olanak sa lamaktad r (6). Özellikle Ommastrephidae familyas ndan birçok türün, Avrupa pazar nda ekonomik olarak de erli türler gibi yüksek fiyatlarla sat ld bilinmektedir (4). Bu durum, morfolojik karakterler ortadan kalkt ktan sonra bile kalamar türlerinin tespitinin yap lmas na imkân sa layan yöntemler için bir gereksinim ortaya ç karm flt r. Morfolojik karakterlerin olmad böyle durumlarda, biyokimyasal ve moleküler taksonomik karakterlerin, özellikle de protein ve nükleik asit dizilerinin kullan lmas tür ayr m nda s kça baflvurulan yöntemlerdir. Tür tespitinin do ru bir flekilde gerçeklefltirilmesi, yasal düzenlemeler gere i bir zorunluluk olmakla beraber deniz ürünleri pazar ndaki ürünlere tüketicinin güveninin sa lanmas aç s ndan da büyük önem tafl maktad r (6). Kafadanbacakl lar içerisinde bulunan türlerin tespit edilmesine yönelik çal flmalarda ayn lokustaki farkl alleller taraf ndan eksprese edilen izozimler olan allozimlerin polimorfizminden yararlan lm flt r (7, 8). Allozim yaklafl m ayr ca bu türlerin populasyon yap lar n n incelenmesinde de kullan lm flt r (9, 10). Fakat bu yöntem taze doku ile çal fl lmas zorunlulu u nedeni ile ifllenmifl deniz ürünlerinde uygulanmas kolay bir yöntem de ildir (11). Bir baflka yaklafl m olan protein temelli moleküler yöntemler de iflleme esnas ndaki baz aflamalarda denatürasyona u ramalar ndan dolay tercih edilmemektedir (12). DNA molekülü, proteinlerle k yasland nda s l ifllem, tuzlama, tütsüleme ve benzeri iflleme tekniklerine karfl daha dayan kl olmas ndan dolay (13), ifllenmifl deniz ürünlerinin tan mlanmas nda, en çok tercih edilen yöntem olarak DNA analizi içeren yöntemler karfl m za ç kmaktad r. Önceleri iyi kalitede, degrede olmam fl DNA n n elde edilememesi ve karfl laflt rma yap lacak referans gen dizilerinin bulunmamas nedeniyle tercih edilmeyen DNA dizilerinin karfl laflt r lmas yöntemi (14), moleküler tekniklerin geliflmesi ve DNA veri tabanlar n n art fl ile birlikte en çok kullan lan yöntem haline gelmifltir. Ommastrephidae ve Loliginidae familyalar na giren türlerin tespit edilip birbirlerinden ayr lmas na yönelik çal flmalarda genellikle PCR-RFLP ve FINS yöntemlerinden yararlan lm flt r. Çal flmalar n özellikle 16S rrna (6, 15) ve sitokrom b (5, 16) genleri üzerinde yo unlaflt görülmektedir. PCR-RFLP yöntemi kullan larak gerçeklefltirilen çal flmalarda yaflanan en önemli zorluk çal fl lan tür say s n n az olmas durumunda birbirinden farkl iki türün ayn RFLP paternini gösterme ihtimalinin bulunmas d r. Ayr ca tür içi çeflitlilik de bu yöntemde göz önünde bulundurulmas gereken bir baflka k s tlay c faktördür. Seçilen gen bölgesinde yüksek varyasyon görülmesi durumunda ayn türün bireyleri aras nda elde edilen farkl RFLP paternleri yan lt c sonuçlar do urabilmektedir (5). Yine PCR-RFLP yöntemi kullan larak gerçeklefltirilen bir çal flmada (15) Illex coindeii ve I. Illecebrosus türlerinin 16S rrna geni kullan larak ayr mlar n n gerçeklefltirilemeyece i, çünkü bu bölgenin her iki tür için de ayn oldu u ortaya koyulmufltur. FINS yöntemi kullan lan çal flmalar ise sadece 16S rrna ve sitokrom b genleri ile s n rl kalm fl ve yaklafl k 200 baz çifti uzunlu undaki bir parças ço alt lan bölgelerden tür seviyesinde ayr m sa layacak varyasyon tespit edilememifltir. Ayr ca bu bölgelerin ço alt lmas için oluflturulmufl evrensel primerler bulunmad ndan çal fl lan türe göre farkl primerlerin tasarlanmas na gerek duyulmaktad r. DNA barkodlama yöntemi ile evrensel bir primer çifti kullan larak tüm kafadanbacakl lar s n f na 344

3 İşlenmiş Kalamar Ürünlerinde Sitokrom Oksidaz I... ait türlerin birbirinden ayr m n sa layabilecek varyasyona sahip, 655 baz çiftlik bir gen bölgesi ço alt l p veri bankalar ndaki türler ile karfl laflt r larak tür tespiti h zl, güvenilir ve ekonomik bir flekilde gerçeklefltirilebilir. Bu çal flmada ifllenmifl kalamar ürünlerinin tür tespitinde mitokondriyal sitokrom oksidaz I (COI) gen dizilerinin karfl laflt r lmas ndan yararlan lm flt r. Marketlerden elde edilen 10 farkl ticari markaya ait üründe kullan lan kalamar örneklerinden elde edilen DNA dizileri, Gen Bankas veri taban ndan elde edilen referans diziler ile karfl laflt r larak tür tespitleri gerçeklefltirilmifltir. Bu çal flmadaki amac m z, ifllenmifl kalamarlar n tür tayininde COI dizilerinin karfl laflt r lmas yönteminin yeterlili inin de erlendirilmesi ve bu ürünlerin yap m nda kullan lan türlerin ortaya ç kar lmas d r. fllenmifl kalamar ürünlerinde kullan lan türlerin tayininde COI dizilerinin karfl laflt r lmas ile elde edilecek sonuçlar ilk kez bu çal flma sonras nda ortaya ç kar lacakt r. MATERYAL VE YÖNTEM DNA izolasyonu için 10 farkl markaya ait ifllenmifl ve dondurulmufl kalamar ürünlerinden 15 mg kas dokusu örnekleri elde edildi. Kas dokular DNA izolasyonu öncesinde 1 gece boyunca 5.5 µl tampon çözelti (%1, w/v, SDS, 150 mm NaCl, 2 mm EDTA, 10 mm Tris-HCl, ph 8,0), 650 µl 5 M guanidin tiyosiyanat ve 265 µl proteinaz K (20 mg/ml) içerisinde inkübasyona b rak ld (17). DNA izolasyonlar n n gerçeklefltirilmesinde DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Almanya), üretici firman n protokolüne uygun olarak kullan ld. Elde edilen DNA lar da degredasyon olup olmad n n tespiti için örnekler %1 lik agaroz jelde yürütülerek UV transiluminatör alt nda görüntülendi. DNA moleküllerinin RNA ve proteinler ile alkolden iyice temizlenmifl oldu unun belirlenmesinde NanoDrop ND (Thermo Scientific, A.B.D.) spektrofotometre kullan ld. Mitokondriyal COI geninin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile ço alt lmas nda LCO1490f (5 -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 ) ve HCO2198r (5 -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ) primer çiftinden yararlan lm flt r (18). Amplifikasyonlar 50 µl lik reaksiyon hacimlerinde; 5 µl 10X Taq Buffer with KCl (100 mm Tris-HCl, 500 mm KCl, ph 8.8), 4µl MgCl 2 (25 mm), 1µl dntp (10 mm), her primerden 2 µl (10 pm/µl), 2 U Taq polimeraz (5 U/µl), 2 µl DNA (50 ng/µl) ve steril distile su içerecek flekilde ayarlanm flt r. Reaksiyonlar termal döngü cihaz nda 95 C de 2 dakikal k bir ön denaturasyon aflamas n takiben 30 döngülük 94 C de 60 saniye, 50 C de 1 dakika, 72 C de 90 saniye ve son olarak 72 C de 10 dakikal k program kullan larak gerçeklefltirilmifltir. DNA dizi analizi öncesinde, elde edilen ürünlerin pürifikasyonunda Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, A.B.D.), üreticinin sa lad protokole uygun olarak kullan lm flt r. Pürifikasyon ifllemi sonras nda örneklerin DNA dizi analizi CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter, A.B.D.) kullan larak, CEQ 8000 (Beckman Coulter, A.B.D.) cihaz nda gerçeklefltirilmifltir. Elde edilen nükleotid dizilerinin Gen Bankas ndan elde edilen referans diziler ile hizalanmas nda ClustalW2 program ndan yararlan lm flt r. Çal flma s ras nda kullan lan Çizelge 1. Çal flmada analizi gerçeklefltirilen kalamar ürünlerinde etikette beyan edilen türler, moleküler analiz sonucu tespit edilen türler, familyalar, örnek numaralar ve eflleflti i türün referans dizilerinin Gen Bankas eriflim numaralar Örnek Beyan Edilen Tür Tespit Edilen Tür Familya Eflleflti i Referans Dizi Örnek 1 Loligo sp. Loligo gahi Loliginidae AF Örnek 2 Loligo sp. Loligo gahi Loliginidae AF Örnek 3 Loligo sp. Loligo opalescens Loliginidae AF Örnek 4 Loligo sp. Uroteuthis chinensis Loliginidae EU Örnek 5 Bilgi yok Todarodes pacificus Ommastrephidae AB Örnek 6 Bilgi yok Illex argentinus Ommastrephidae DQ Örnek 7 Bilgi yok Ommastrephes bartramii Ommastrephidae AF Örnek 8 Bilgi yok Dosidicus gigas Ommastrephidae FJ Örnek 9 Bilgi yok Dosidicus gigas Ommastrephidae FJ Örnek 10 Bilgi yok Dosidicus gigas Ommastrephidae FJ

4 E. Keskin, H. Hüseyin Atar referans dizilerin Gen Bankas eriflim numaralar Çizelge 1 de gösterilmifltir. En uygun nükleotid substitüsyon modelinin hesaplanmas nda maximum likelihood yönteminden yararlan lm flt r. Hesaplama sonucunda en düflük AICc (Akaike Information Criterion, corrected) puan na sahip model olan Tamura Nei modeli, filogenetik a ac n çizilmesinde en uygun model olarak belirlenmifltir. Filogenetik a ac n (fiekil 1) çizilmesinde unweighted pair-group method of arithmetic average (UPGMA) algoritmas ndan yararlan lm flt r. Oluflturulan a ac n güvenilirli inin tespit edilmesi için 1000 tekrarl bootstrap testleri kullan lm flt r. Gerçeklefltirilen tüm filogenetik analizlerde MEGA 5 program ndan faydalan lm flt r (19). SONUÇLAR Bu çal flma sonucunda oluflturulan veri seti, 10 farkl markaya ait üründen elde edilen kalamar doku örneklerine ve tür tayini amac yla Gen Bankas veri taban ndan elde edilen 7 kalamar türüne ait mitokondriyal COI gen dizisinden oluflmaktad r. fllenmifl kalamar ürünlerinin tamam ndan 655 baz çifti uzunlu unda nükleotid dizileri elde edilmifltir. Örneklerin DNA dizilerinin hizalanmas s ras nda tüm örneklerin her iki zincirinin de birbiriyle tamamen örtüfltü ü tespit edilmifltir. Zincirler bak m ndan herhangi bir farkl l k olmad ndan dolay analizlerde düz zincir dizilerinden yararlan lm flt r. Ayr ca hizalama s ras nda diziler aras nda herhangi bir insersiyon veya delesyona rastlanmam flt r. Çal flma sonucunda 2 farkl familyadan toplam 7 tür tan mlanm flt r. Kalamar ürünlerinin DNA dizi analizi sonucunda, örneklerin BLAST ( taramas sonras %98-99 aras nda de iflen benzerlik oranlar ile tür seviyesinde tan mlamas gerçeklefltirilmifltir. Kullan lan ifllenmifl kalamar ürünlerinin etiketlerinin alt s nda kullan lan türe iliflkin bir bilgiye rastlan lmam fl, di er dört örnekte ise kullan lan türün Loligo cinsine ait oldu u belirtilmifltir. Elde edilen sonuçlar sonras nda etiketinde bilgi bulunmayan ürünlerin, ekonomik de eri daha düflük olan Ommastrephidae familyas ndan türler olduklar tespit edilmifl, Loligo cinsine ait oldu u belirtilen ürünlerden bir tanesinin (Örnek 4) baflka bir cinse ait oldu u tespit edilmifltir (Çizelge 1). Filogenetik analizin gerçeklefltirilmesinde tüm örneklere iliflkin DNA dizileri ve Gen Bankas ndan elde edilen referans dizileri kullan lm flt r. Veri setinin tamam kullan larak, UPGMA algoritmas ve Tamura-Nei modeli temel al narak bir filogenetik a aç oluflturulmufltur (fiekil 1). Filogenetik a ac n güvenilirli in sa lanmas için gerçeklefltirilen 1000 tekrarl bootstrap test de erlerinin tamam %78 den büyük olarak tespit edilerek oluflturulan kümelerin do rulu u sa lanm flt r. ki ana daldan oluflan filogenetik a aç toplamda 7 farkl küme alt nda toplanan türlerin genetik uzakl klar n göstermektedir. Tür tan mlanmas nda kullan lmak üzere seçilen referans dizileri benzerlik oran en yüksek (Maximum identitiy) olan dizilerden seçilmifltir. A aç iki ana daldan oluflmaktad r: birinci ana dal ekonomik de eri yüksek kalamar türlerini içeren Loliginidae familyas alt nda toplanan türlerin dizilerinden oluflmaktad r. Bu ana dal kendi içerisinde iki dala ayr larak Loligo ve Uroteuthis cinslerine ait örnekleri birbirinden belirgin bir biçimde ay rmaktad r. Loligo cinsine ait türlerin kümelendi i dal iki alt dala ayr larak, Loligo cinsine ait iki farkl kalamar türü olan L. opalescens ile L. gahi türlerini birbirinden ay rmaktad r. Uroteuthis cinsine ait dal ise sadece U. chinensis türünü içermektedir. kinci ana dal ekonomik de eri daha düflük kalamar türlerini içeren Ommastrephidae familyas n n üyelerini alt nda bar nd rmaktad r. Bu ana dal iki dal olarak ayr lmakta ve 4 farkl cinse ait örnekleri birbirinden ay rmaktad r. Birinci dal Todarodes ve Illex cinsine ait türler olan T. pacificus ve I. argentinus türlerini içermekte ve bu türler farkl alt dallar alt nda birbirlerinden belirgin bir biçimde farkl l k göstermektedir. kinci dal ise ayn alt familyadan iki farkl cins olan Dosidicus ve Ommastrephes cinslerine ait kalamar türleri olan D. gigas ve O. bartramii nin bulundu u alt dallar içermektedir. Farkl cinsler burada da birbirlerinden bariz bir biçimde ayr lm fllard r. Ayn türün kullan ld farkl örnekler aras nda (8, 9, 10 aras nda ve 1, 2 aras nda) herhangi bir farkl l k gözükmemektedir. 346

5 İşlenmiş Kalamar Ürünlerinde Sitokrom Oksidaz I... fiekil 1. Ticari kalamar örnekleri ile referans dizilerin filogenetik iliflkisi Filogenetik a aç UPGMA yöntemi ile Tamura-Nei modeli alt nda oluflturulmufltur. A ac n güvenilirli i 1000 tekrarl bootstrap testi kullan larak sa lanm fl ve bootstrap de erleri dallar n üzerinde gösterilmifltir. TARTIŞMA Çal flmada moleküler belirteç olarak kullan lan bölge olan COI geninin PZR ile ço alt lan k sm 710 baz çifti olarak belirlenmifl, fakat baz örneklerden bu uzunlukta bir bölgenin amplifikasyonu gerçeklefltirilemedi inden tüm örneklerin homojenli ini sa lamak ad na, tüm örneklerde ço alt labilinen en uzun bölge olan 655 baz çiftlik nükleotid dizisi kullan lm flt r. Elde edilen 655 baz çiftlik dizi uzunlu u, mevcut protokolün, ifllenmifl kalamar ürünlerinden bu uzunlukta bir bölgeyi ço altmak için yeterli kalitede DNA izole edilebildi ini göstermektedir. Tüm ticari örneklerden elde edilen kal p DNA lardan LCO1490f - HCO2198r primer çifti kullan larak hedef gen bölgesi baflar l bir flekilde ço alt lm fl ve DNA dizi analizleri her iki DNA ipli i için de gerçeklefltirilmifltir. Elde edilen DNA dizilerinin veri tabanlar ndan elde edilen referans gen dizileri ile karfl laflt r lmalar sonucunda tüm örneklerin tür seviyesinde tan mlamas gerçeklefltirilmifltir. Çal flman n di er bir önemli noktas, analizi gerçeklefltirilen ürünlerin sadece 3 tanesinde etiketinde belirtilen tür ile analiz sonucunda tespit edilen türün ayn oldu u saptanm flt r (Çizelge 1). Örneklerin birinde etiketinde ürünün Loligo cinsine ait kalamar türünden haz rland belirtilmesine ra men, moleküler analizler ürünün Uroteuthis cinsinden olan U. chinensis türüne ait oldu unu göstermifltir. Etiketinde ürün içeri i ile ilgili bilgi bulunmayan di er 6 ürünün ise ekonomik de eri daha düflük olan Ommastrephidae familyas na ait türler içerdi i saptanm flt r. Bu sonuçlar morfolojik ayr ma imkân tan mayan ifllenmifl kalamar ürünlerinin denetlenmesinde moleküler araçlar n kullan lmas n n önemli bir gereksinim oldu unu göstermektedir. Bu sayede ekonomik de eri yüksek türler yerine daha düflük ekonomik de ere sahip türlerin kullan lmas denetim alt na al nabilecek, üreticiler üretimde kulland klar türü etikette do ru flekilde belirtmek zorunda kalacakt r. Bu sayede tüketicinin su ürünleri pazar ndaki ürün içeriklerine olan güveni artacakt r. Tüketici güveni ve ekonomik etkileri d fl nda farkl türlere karfl alerjik reaksiyon ihtimali göz önüne al nd nda, ifllenmifl kalamar ürünlerinin tür tayini insan sa l aç s ndan da çok büyük önem tafl maktad r. Bu nedenlerden ötürü, mevcut çal flmada uygulad m z ve tür seviyesinde sonuçlar ald m z yöntem hem iflleme s ras ndaki ad mlardan etkilenmemesi, hem tüm canl lar n tür ayr m nda çok s k kullan lan bir mitokondriyal gen bölgesini kullanmas nedeniyle mevcut sorunlara ekonomik, h zl ve kolay uygulanabilir bir çözüm önerisi getirmektedir. 347

6 E. Keskin, H. Hüseyin Atar KAYNAKLAR 1. Roper CFE, Sweeney MJ, Nauen CE FAO species catalogue. Cephalopods of the world. An annotated and illustrated catalogue of species of interest to fisheries. FAO Fish Synop, 125(3): FAO Fisheries Department, fishery Information, data and Statistics Unit. FISHSTAT Plus: Universal software for fishery statistical time series. Version /statistics/software/fishstat/en. 3. Shaw PW, Pierce GJ, Boyle PR Subtle population structuring within a highly vagile marine invertebrate, the veined squid Loligo forbesi, demonstrated with microsatellite DNA markers. Mol Ecol, 8: Luna Sales JBL, Rodrigues-Filho LFS, Haimovici M, Sampaio I, Schneider H Molecular differentiation of the species of two squid families (Loliginidae and Ommastrephidae) based on a PCR study of the 5S rdna gene. Food Control, 22(2011): Chapela MJ, Sotelo CG, Pérez-Martin RI Molecular identification of Cephalopods species by FINS and PCR-RFLP of a cytochrome b gene fragment. Eur Food Res Technol, 217: Chapela MJ, Sotelo CG, Calo-Mata P, Pérez- Martín RI, Rehbein H, Hold GL, Quinteiro J, Rey-Mendez M, Rosa C, Santos AT Identification of Cephalopod species (Ommastrephidae and Loliginidae) in seafood products by forensically informative nucleotide sequencing (FINS). J Food Sci, 67(5): Yeatman J, Benzie JAH Genetic structure and distribution of Photololigo spp. In Australia. Mar Biol, 118(1): Sanjuan A, Pérez-Losada M, Guerra A Genetic differentiation in 3 sepia species (Mollusca: Cephalopoda) from Galician waters (north-west Iberian peninsula). Mar Biol, 126(2): Brierley AS, Rodhouse PG, Thorpe JP, Clarke MR Genetic evidence of population heterogeneity and cryptic speciation in the ommastrephid squid Martialia hyadesi from the Patagonian Shelf and Antarctic Polar Frontal Zone. Mar Biol, 116(4): Brierley AS, Thorpe PJ, Pierce GJ, Clarke MR, Boyle PR Genetic variation in the neritic squid Loligo forbesi (Myopsida: Loliginidae) in the northeast Atlantic Ocean. Mar Biol 122(1): Skibinski DOF DNA technology and genetics of aquatic invertebrates. In:. Genetics and evolution of aquatic organisms, Beaumont AR (editor), London: Chapman & Hall, pp Sotelo CG, Piñeiro C, Gallardo JM, Pérez-Martín RI Fish species identification in seafood products. Trends Food Sci Tech, 4(12): Sin YW, Yau C, Chu KH Morphological and genetic differentiation of two loliginid squids, Uroteuthis (Photololigo) chinensis and Uroteuthis (Photololigo) edulis (Cephalopoda: Loliginidae), in Asia. J Exp Mar Biol Ecol, 369(1): Shaw PW Polymorphic microsatellite markers in a cephalopod: the veined squid Loligo forbesi. Mol Ecol, 6: Colombo F, Cerioli M, Colombo MM, Marchisio E, Malandra R, Reonon P A simple polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method for the differentiation of cephalopod mollusc families Loliginidae from Ommastrephidae, to avoid substitutions in fishery field. Food Control, 13: Santaclara FJ, Espineira M, Vieittes JM Genetic Identification of Squids (Families Ommastrephidae and Loliginidae) by PCR RFLP and FINS Methodologies. J Agric Food Chem, 55: Kocher TD, Thomas WK, Meyer A, Edwards SV, Pääbo S, Villablanca FX, Wilson AC Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc Natl Acad Sci, 86: Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mo. Mar Bio Biotech, 3: Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol, 24: