YONCA DA (Medicago sativa L.) IN VITRO KO ULLARDA FARKLI BES N ORTAMLARININ MER STEM VE SÜRGÜN UCU KÜLTÜRLER NE ETK LER

Transkript

1 I EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS TEZ ) YONCA DA (Medicago sativa L.) IN VITRO KO ULLARDA FARKLI BES N ORTAMLARININ MER STEM VE SÜRGÜN UCU KÜLTÜRLER NE ETK LER Fatma Gök in BAHAR Biyomühendislik Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: Sunu Tarihi: 17/06/2009 Tez Danı manı: Prof. Dr. Aynur GÜREL Bornova- ZM R

2 II

3 III Fatma Gök in Bahar tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan Yonca da (Medicago sativa L.) In Vitro Ko ullarda Farklı Besin Ortamlarının Meristem ve Sürgün Ucu Kültürlerine Etkileri ba lıklı bu çalı ma E.Ü. Lisansüstü E itim ve Ö retim Yönetmeli i ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü E itim ve Ö retim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan de erlendirilerek savunmaya de er bulunmu ve 17/06/2009 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirli i/oyçoklu u ile ba arılı bulunmu tur. Jüri Üyeleri: mza Jüri Ba kanı: Prof. Dr. Aynur GÜREL... Raportör Üye: Prof. Dr. Ahmet Esen ÇELEN..... Üye: Doç. Dr. Bahattin TANYOLAÇ...

4 IV

5 V ÖZET YONCA DA (Medicago sativa L.) IN VITRO KO ULLARDA FARKLI BES N ORTAMLARININ MER STEM VE SÜRGÜN UCU KÜLTÜRLER NE ETK LER BAHAR, Fatma Gök in Yüksek Lisans Tezi, Biyomühendislik Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Aynur GÜREL Haziran 2009, 61 sayfa Bu çalı mada amaç, önemli bir yem bitkisi olan yonca da meristem ve sürgün ucu kültürlerine farklı besin ortamlarının etkilerinin incelenmesidir. Kalender çe idinin tohumları in vitro da bitki büyüme düzenleyicilerini içermeyen B5 (Gamborg ve ark. 1968) besin ortamında çimlendirilmi lerdir. 4 haftalık büyüme periyodundan sonra, stereomikroskop altında 2 yaprak tasla ıyla birlikte alınan meristem eksplantları (6,68 10,02 m), 1 mg/l ve 2 mg/l kinetin içeren sıvı B5 besin ortamlarında kültüre alınmı lardır. Kültüre alındıktan 4 hafta sonra 1 mg/l kinetin içeren sıvı B5 besin ortamındaki eksplantların %82,0 si, 2 mg/l kinetin içeren sıvı B5 besin ortamındaki eksplantların %91,3 ü kallus olu turmu tur. Stereomikroskop altında 4 veya 6 yaprak tasla ıyla alınan sürgün ucu eksplantları (0,6 0,8 mm) ise, 1 mg/l ve 2 mg/l kinetin içeren B5 besin ortamlarında kültüre alınmı lardır. Kültüre alındıktan 4 hafta sonra 2 mg/l kinetin içeren B5 besin ortamındaki eksplantların %4,4 ünün sürgün verdi i gözlenmi tir. Her iki ortamdaki eksplantların %84,4 ü de kallus olu turmu tur. In vitro da çimlendirilen bitkiciklerin 1 cm boyutundaki sürgün ucu kısımları da eksplant olarak kullanılmı tır. 5 farklı sitokinin konsantrasyonunu -0; 0,125; 0,25; 0,5; 1

6 VI mg/l Benziladenin (BA)- içeren 3 farklı besin ortamında [WPM (Lloyd & McCown, 1980), B5 ve MS (Murashige ve Skoog, 1962)] bu eksplantlar kültüre alınmı tır. Ortalama 4,8 cm boy ile en uzun bitkicikler büyüme düzenleyicisi içermeyen WPM ortamında elde edilmi tir. Eksplant ba ına 3,8 nod sayısı ile en iyi geli me de yine aynı ortamda elde edilmi tir. Sürgün ucu eksplantları en yüksek kallus olu um yüzdelerini 0,25 mg/l BAP (%100) ve 1 mg/l BAP (%100) içeren WPM ortamları ile 0,5 mg/l BAP (%100) içeren B5 ortamında sa lamı lardır. En dü ük kallus olu um yüzdesi ise büyüme düzenleyicilerini içermeyen MS ortamında (%6,7) gözlenmi tir. En iyi kök geli imi büyüme düzenleyicilerini içermeyen WPM ortamında %71,3 lük oran ile elde edilmi tir. Köklenme periyodunun ardından da köklü bitkicikler %50 vermikulit, %50 perlit içeren toprak karı ımlarına aktarılarak dı ko ullara alı tırılmaya çalı ılmı lardır. Tüm denemelerde kültür ko ulları olarak, 4000 lux aydınlatma, 26±2ºC sıcaklık ve 16 saat aydınlık/8 saat karanlık fotoperiyot kullanılmı tır. Anahtar Sözcükler: Medicago sativa, var. Kalender, in vitro, meristem, sürgün ucu kültürü, mikroço altım, aklimatizasyon.

7 VII ABSTRACT THE EFFECTS OF DIFFERENT MEDIA ON MERISTEM AND SHOOT TIP CULTURES IN VITRO CONDITIONS OF ALFALFA (Medicago sativa L.) BAHAR, Fatma Gök in M.Sc. Thesis. Bioengineering Department Supervisor: Prof. Dr. Aynur GÜREL June 2009, 61 pages In this thesis, the effects of different media on meristem and shoot tip cultures in vitro conditions of alfalfa, the important forage crop were investigated. The seeds of the variety Kalender, were germinated and grown in vitro on hormone-free B5 medium (Gamborg ve ark. 1968). After four weeks growing period, Meristem-tip explants with 2 leaf primordia (6,68 10,02 m) were excised under stereomicroscope and cultured on liquid B5 medium supplemented with 1 mg/l or 2 mg/l kinetin. Four weeks later, 82,0% of explants cultivated in B5 medium supplemented with 1mg/L kinetin and 91,3% of explants cultivated in B5 medium supplemented with 2mg/L kinetin were formed callus. Shoot tip explants with 4 or 6 leaf primordia (0,6 0,8 mm) also were excised under stereomicroscope and cultured on B5 medium supplemented with 1 mg/l or 2 mg/l kinetin. After four weeks of cultivation, 4,4% of shoot growth without callus formation was observed in B5 medium supplemented with 2mg/L kinetin. In both media, 84,4% of shoot tip explants were formed callus. The shoot tip explants (1 cm) of in vitro germinated plantlets were also chosen as explants. These explants were cultivated in three

8 VIII regeneration media [i.e. Woody Plant Medium (WPM) (Lloyd & McCown, 1980), B5 and MS (Murashige ve Skoog, 1962)] including five different cytokinin combinations such as 0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 mg/l BA (Benzyladenine). By the end of four weeks in the culture, the tallest plantlets (4,8 cm average plant length) were observed on cytokinin free WPM medium. The best shoot growth (3,8 nodal segments per explant) was also obtained on cytokinin free WPM medium. The shoot tip explants induced high percentage of callus formation on WPM supplemented with 0,25 mg/l BAP (100%) and 1 mg/l BAP (100%), and on B5 supplemented with 0,5 mg/l BAP (100%). The shoot tip explants induced low percentage of callus on cytokinin-free MS medium (6,7%). The best root development was observed on cytokinin-free WPM medium with 71,3%. After rooting period, plantlets were transferred to the soil. The mixture including 50% vermuculite + 50% perlite was used for the acclimatization of in vitro cultured-alfalfa plantlets. 16 hours light and 8 hours dark photoperiodic condition was used with 4000 lux illumination at 26±2ºC as the culture conditions in all of the experiments. Key Words: Medicago sativa, cv. Kalender, in vitro, meristem, shoot tip culture, micropropagation, acclimatization.

9 IX TE EKKÜR Bu tez çalı masına beni yönlendiren ve her türlü deste i sa layan sevgili hocam Prof. Dr. Aynur Gürel e, çalı mamda kullandı ım yonca bitkisi tohumlarını sa layan Neobi Tohumculuk A.. ne, çalı malarım sırasında benden desteklerini hiç esirgemeyen, her daim yanımda olan canım aileme, laboratuarda birlikte çalı tı ım arkada larıma ve sevgili dostlarım Pınar Nartop, Meltem Bayraktar, Hilal Betül Kaya, Sezin Aday, Yasemin Maraba, Nilay Alada, Özlem Erdemir ve Cengiz Akkale ye, te ekkürü bir borç bilirim.

10 X

11 XI Ç NDEK LER Sayfa ÖZET....V ABSTRACT..VII TE EKKÜR....IX EK LLER D Z N. XIV Ç ZELGELER D Z N.....XVIII 1.G R L TERATÜR B LD R LER Yoncanın Bitkisel Özellikleri Yoncanın Yem Bitkisi Olarak Önemi Medicago sativa L. deki Doku Kültürü Çalı maları MATERYAL ve METOT...16

12 XII Ç NDEK LER (devam) 3.1 Materyal Metot Besin ortamlarının hazırlanması Tohum sterilizasyonu Tohumların çimlendirme ortamına alınması In vitro sürgünlerden alınan apikal meristemlerin sürgün geli me ortamlarında kültüre alınması In vitro sürgünlerden alınan sürgün ucu eksplantlarının geli me ortamlarında kültüre alınması In vitro ko ullardaki sürgünlerden alınan nod eksplantlarının geli me ortamlarında kültüre alınması In vitro ko ullardaki sürgünlerden alınan sürgün ucu eksplantlarının geli me ortamlarında kültüre alınması In vitro da geli tirilen köklü bitkiciklerin aklimatizasyon ko ulları Kültür ko ulları Denemenin kurulması ve verilerin de erlendirilmesi BULGULAR Kültüre Alınan Tohumlarda Kontaminasyon Durumu Kültüre Alınan Tohumlarda Görülen Geli meler

13 XIII Ç NDEK LER (devam) 4.3 Medicago sativa var. Kalender Bitkilerinde In Vitro Sürgün Geli imi Apikal meristemlerden sürgün geli imi Sürgün ucu eksplantlarının geli imi In vitro ko ullardaki sürgünlerden alınan nod eksplantlarının geli imi In vitro ko ullardaki sürgünlerden alınan sürgün ucu eksplantlarının geli imi Medicago sativa var. Kalender Bitkilerinde In Vitro Kök Geli imi Medicago sativa var. Kalender Bitkiciklerinin Aklimatizasyonu TARTI MA VE SONUÇ KAYNAKLAR D Z N ÖZGEÇM....61

14 XIV EK LLER D Z N ekil Sayfa 2.1.a Medicago sativa bitkisi b Medicago sativa bitkisinin meyvesi Çalı mada kullanılan Medicago sativa var. Kalender tohumları In vitro da çimlendirilen Medicago sativa var. Kalender bitkici i. Ok ile i aretlenen kısım, sürgün ucu eksplantını göstermektedir Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemlerine göre kontaminasyon yüzdeleri Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemlerine göre çimlenme yüzdeleri a Meristemi alınacak olan, in vitro da çimlendirilmi Medicago sativa var. Kalender bitkici inin Olympus marka stereomikroskopta 1x büyütmedeki görüntüsü b Pens ve bistüri yardımıyla yaprak taslaklarının ayrılması (3,2X büyütme) c 4-5 yaprak tasla ı olan sürgün ucu bölgesi (5X büyütme) d 2 yaprak tasla ı ile birlikte görülen meristematik kubbe (5,6X büyütme) e Sıvı ortama aktarıldıktan 2 hafta sonra eksplantın görüntüsü...31

15 XV EK LLER D Z N (devam) 4.3.f Sıvı ortama aktarıldıktan 4 hafta sonra eksplantın görüntüsü g Sıvı ortama aktarıldıktan 4 hafta sonra kallus olu turup sürgün vermi olan bir ba ka eksplantın görüntüsü Medicago sativa var. Kalender de kallus olu turan sürgün ucu eksplantları a Kallus olu turmu eksplant b Kallustan sürgün geli tirmi olan eksplant c Kallustan hem sürgün, hem de kök geli tirmi olan eksplant a Kallus olu turmadan sürgün geli tirmeye ba lamı olan iki eksplant b Kallus olu turmadan sürgün geli tirmeye ba lamı olan iki eksplant a Ortama temas etti i yerde kallus olu turan nod eksplantı b Kallus olu turan nod eksplantında sürgün geli imi c Nod eksplantının sık nodlu olarak geli imi ve kallustan sürgün geli imi Kültüre alınan 2 nodlu eksplantlarda ortalama sürgün boyu.38

16 XVI EK LLER D Z N (devam) 4.8 Kültüre alınan 2 nodlu eksplantların nod sayılarında görülen geli me Kullanılan besin ortamlarında ölçülen ortalama eksplant boyları Kullanılan besin ortamlarında ölçülen ortalama nod sayıları a Sürgün ço altmaya uygun Medicago sativa var. Kalender bitkicikleri b Sürgün ço altmaya uygun Medicago sativa var. Kalender bitkicikleri Sürgün ço altmaya uygun eksplantların kullanılan besin ortamlarında bulunma yüzdeleri Sürgün ucu eksplantlarının kallus olu turma yüzdeleri Sürgün ucu eksplantlarının köklenme yüzdeleri Sürgün ucu eksplantlarında geli en sürgünlerin in vitro da köklendirilmeleriyle elde edilen steril Medicago sativa var. Kalender bitkicikleri In vitro da köklendirilen bitkiciklerin aklimatizasyonu a Bitkiciklerin topra a aktarılmadan önceki görüntüleri b Bitkiciklerin topra a aktarılmadan önceki görüntüleri 53

17 XVII EK LLER D Z N (devam) 4.16.c Nemini kaybetmemesi için üzerine naylon po et geçirilmi bitkicik d Aklimatizasyonu yapılan bitkiciklerin genel görüntüsü e Topra a aktarıldıktan 3 gün sonra bitkilerin genel görüntüsü f Topra a aktarıldıktan 10 gün sonra bitkilerin genel görüntüsü g Topra a aktarıldıktan 10 gün sonra yeni sürgün geli tirmi olan bitkiler. 53

18 XVIII Ç ZELGELER D Z N Çizelge Sayfa 3.1 MS (1962), WPM (1980) ve B5 (1968) besin ortamlarının içerdi i maddeler ve miktarları Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemleri Apikal meristemlerin, sürgün geli imi için aktarıldıkları sıvı besin ortamlarının kompozisyonları Sürgün ucu eksplantlarının geli imi için kullanılan yarı katı besin ortamlarının kompozisyonları Nod eksplantlarının geli imi için kullanılan yarı katı besin ortamlarının kompozisyonları Sürgün ucu eksplantlarının geli imi için kullanılan yarı katı besin ortamlarının kompozisyonları Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemleri sonucu belirlenen kontaminasyon yüzdeleri Uygulanan sterilizasyon yöntemleri sonucu tohumlarda gözlenen çimlenme yüzdeleri ki farklı besin ortamında kültüre alınan meristem eksplantlarında görülen geli meler

19 XIX Ç ZELGELER D Z N (devam) 4.4 ki farklı besin ortamında kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında görülen geli meler ki farklı besin ortamında kültüre alınan nod eksplantlarında görülen geli meler Be farklı konsantrasyonda (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 mg/l BAP) büyüme düzenleyicisi içeren üç farklı besin ortamında (B5, WPM, MS) kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında gözlenen geli meler WPM ortamında kültüre alınan eksplantlarda gözlenen geli meler..51

20 XX

21 1. G R 1 Otobur çiftlik hayvanlarının ya amlarını sürdürebilmeleri ve istenen ürünleri verebilmeleri için bünyelerine almak zorunda oldukları besin maddelerini yapılarında bulunduran ve belirli sınırlar içinde yedirildiklerinde hayvan sa lı ına ve hayvansal ürünlere zararlı olmayan, do ada kendili inden yeti en veya kültürü yapılan bitkilere yembitkileri denilmektedir. Yembitkileri çayır, mer a ve tarla gibi çe itli alanlarda yeti mektedir (Soya ve ark., 2004). Yembitkileri, ucuz bir kaynak olması, hayvanların mide mikro florası için gerekli besin maddelerini içermesi, mineral ve vitaminlerce zengin olması, hayvanların üreme gücünü artırması ve yüksek kalitede hayvansal ürün sa laması bakımından hayvan beslemede önemlidir (Yolcu ve Tan, 2008). Yembitkileri tarımı, sürekli ve güvenli kaba yem üretiminin en önemli yoludur. Tarımsal faaliyetler içerisinde çok önemli bir yere sahip olan yembitkileri tarımı, bitkisel ve hayvansal üretimin sigortası konumundadır. Tarım arazilerinde üretilen otların öncelikle hayvanlar tarafından kullanılarak et, süt gibi ürünlere dönü türülmeleri ile insanların bu otlardan yararlanmaları sa lanmaktadır (Soya ve ark. 2004). Yembitkileri tarımı, çayır ve meraların üzerindeki a ırı otlatma baskısını hafifletecek, tahıl-nadas sistemlerinde münavebeye girerek nadas alanlarının daralmasına neden olacak ve sonuçta ülkemizdeki erozyon miktarını da azaltacaktır. Yem bitkisi yeti tiricili inin artması ile bozulan çayır ve mera vejetasyonları kendilerini yenileme fırsatını yakalamı olacaklardır. Bunun yanında yembitkileri ekim nöbetine girerek kendisinden sonraki ürünlere de önemli katkılar sa lamaktadır (Soya ve ark. 2004).

22 2 Türkiye de gerek çayır ve meraların a ırı ve erken otlatılması, bakımlarının yapılamaması sonucu tahrip olması, gerekse yurtdı ından getirilen ya da ıslah çalı maları ile elde edilen hayvanların entansif ve yarı entansif yeti tiricili e daha uygun olması, yüksek miktarda kaba yem ihtiyacını ortaya çıkarmı tır. Çünkü entansif hayvancılık sisteminde hayvanların yo un bir ekilde barınaklarda beslenmelerinden dolayı i letmelerin yembitkilerine olan ihtiyaçları çok önemli miktarda artı göstermektedir (Yolcu ve Tan, 2008). Yarı-kurak iklim ku a ında yer alan ülkemizde yembitkileri tarımının geli mesini kısıtlayan bazı teknik sorunlar bulunmaktadır. Bunları; sulama olanaklarının kısıtlılı ı, kaliteli tohumluk yetersizli i, ekim nöbetindeki önemlerinin henüz kavranamamı olması, ot kurutma ve silaj yapım tekniklerinin yeterince bilinmemesi olarak özetlemek olasıdır (Avcıo lu ve ark., 2000). Kar ıla ılan bu sorunlar nedeniyle, tarla tarımı içinde yembitkileri yeti tiricili inin geli meyi i, yalnızca hayvancılı ımızı olumsuz yönde etkilemekle kalmayıp, aynı zamanda toprak ve su kaynaklarımızın da olumsuz yönde etkilenmesine neden olmaktadır. Hayvancılı ımızın kaba yem sorununu çözmek ve toprak ve su kaynaklarımız üzerindeki olumsuz etkiyi ortadan kaldırmak için çayır meralarımızın, uygun ıslah yöntemleri uygulanarak yeniden bol ve kaliteli yem üretir duruma getirilmeleri sa lanmalıdır. Aynı zamanda yembitkileri yeti tiricili ini de geli tirmek gerekmektedir (Süle, 2005). Yembitkilerinin ıslahında, arzu edilen genotiplerin çok kısa sürede ço altılmalarına, kısa sürede homozigot hatların elde edilmesine ve karakterleri kontrol eden genlerin bir organizmadan izole edilerek di er bir organizmaya aktarılmasına olanak sa layarak, bitki ıslahında

23 ıslah sürecinin kısaltılmasına katkıda bulunabilen doku kültürü tekniklerinden de yararlanılmaktadır (Süle, 2005). 3 Bitki doku kültürü teknikleri; steril ko ullarda ve yapay besin ortamlarında, bitkilerden alınan ve eksplant olarak adlandırılan; hücre, doku veya organ gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesini kapsamaktadır (Babao lu ve ark, 2001). Bu tekniklerle yapılacak olan üretimin yani mikroüretimin, mevsime ba lı olmadan kontrollü ko ullarda yıl boyunca yapılabilmesi, ço altım potansiyelinin fazlalı ı, stok bitkilerin muhafaza edilebilmesi, yer ihtiyacının az olması, olumsuz hava ko ullarına, hastalık ve zararlılara kar ı korunma gibi avantajları vardır. Ayrıca in vitro ço altımdan yararlanılarak, ıslah çe it ve hatlarının, kısa süre içinde ticari boyutta klonal ço altımlarının yapılması mümkündür (Emiro lu ve Gürel, 2005). Yem bitkisi çe it geli tirilmesi ve ıslah çalı malarında üzerinde öncelikle durulması gereken en önemli yem bitkisi türü; tüm bölgelerimizde üretimi yapılabilen, yeti tiricili i son yıllarda hızla artan yonca (Medicago sativa L.) dır. Halk dilinde ark yoncası veya kaba yonca olarak bilinen yonca, baklagiller (Fabaceae) familyasından, çok yıllık ve kendine döllenen bir bitkidir. Orta Asya orijinli, 60 dan fazla tür içeren geni bir cinstir (Elçi, 2005). Adını Medya Otu anlamına gelen Herba Medica teriminden alan Yonca (Medicago sativa), tarihte bilinen en eski kültür yembitkisidir. M.Ö yıllarında Anadolu da yeti tirilen yonca M.Ö. 490 yılında Persler ve Medler aracılı ıyla anavatanı olan Trans- Kafkaslar, Anadolu ve ran dan alınarak Yunanistan a götürülmü, M.Ö. 146 yılında da Roma ya ula mı tır. Selçuklu ve Osmanlılar döneminde at

24 4 beslenmesinde önemli rol oynayan yoncanın bilinçli olarak tarımına 18. yüzyılda ba lanmı tır. Günümüzde, Kutuplar dı ında Dünya nın hemen her yerinde yeti tirilebilen yoncaya haklı olarak Yembitkilerinin Kraliçesi hatta Yembitkilerinin mparatoriçesi denilmektedir (Soya ve ark., 2004). Adaptasyon yetene inin yüksek olması ve uzun ömürlülü ü, vejetasyon döneminde birçok defa biçilebilmesi, verim ve besin de erinin yüksekli i, ekim nöbetinde önemli etkinli i ve kimi çe itlerinin otlatılmaya dayanıklılı ı, yoncayı di er yembitkilerinden üstün kılan özelliklerdir (Soya ve ark., 2004; Elçi, 2005). Bu üstün özelliklerinden dolayı yonca bitkisi ülkemizde, tarımı en fazla yapılan yembitkilerinin ba ında gelmektedir (Yolcu ve Tan, 2008). Ülkemizde sulu artlarda tarımı yapılan bu bitki, kuru ot, silaj, pelet ve sun i mer a karı ımlarında da kullanılmaktadır (Karakurt ve Fırıncıo lu, 2003). Amacımız, önemli bir yem bitkisi olan yonca nın (Medicago sativa L.) meristem ve sürgün ucu eksplantlarını kullanarak, in vitro ko ullarda farklı besin ortamlarının etkilerini belirlemektir. Öncelikle klonal olarak sürgün ço altımlarına yönelik ve sonra da köklenme ile ili kili prosedürlerin oturtulmasına çalı ılmı tır.

25 2. L TERATÜR B LD R LER Yoncanın Bitkisel Özellikleri Baklagil yembitkileri, Fabaceae (Leguminosae) familyasına aittirler. Bu familya yakla ık 500 cins, türü içermektedir ve 3 (Mimosoideae, Caesalpinoideae, ve Papilionatae (Lotoideae)) altfamilyadan olu maktadır (Soya ve ark., 2004). Papilionatae (Lotoideae) altfamilyasının, Üçgül Benzerleri Oyma ı (Trifolieae) ndan olan ve ünlü türleri içeren Yonca (Medicago L.) cinsi, ço u Akdeniz Bölgesi nde yeti en, yakla ık 50 türü kapsamaktadır. Bu 50 tür içerisinden 10 tanesi tarımsal de er ta ımaktadır. Bu türler unlardır (Gençkan, 1983; Soya ve ark., 2004): Adi yonca (Medicago sativa) Sarıçiçekli yonca (Medicago falcata) Melez yonca (Medicago varia) erbetçiotu yoncası (Medicago lupulina) Diskvari yonca (Medicago orbicularis) Zarif yonca (Medicago elegans) Çanakvari yonca (Medicago scutellata) Pürtüklü yonca (Medicago tuberculata) Benekli yonca (Medicago maculata) Sert tüylü yonca (Medicago hispida) Adi yonca (Medicago sativa), yonca cinsi içinde en çok önem ta ıyan ve tarımı yaygın olarak yapılan dört türden bir tanesidir. Di er türler ise; Sarıçiçekli yonca, Melez yonca ve erbetçiotu yoncasıdır (Gençkan, 1983; Soya ve ark., 2004).

26 6 Çok yıllık olan adi yonca türünün tarımı, birinci derecede do al seleksiyon ile ikinci derecede de insan etkisiyle, çok fazla çe it zenginli i göstererek, Transkafkaslar olan gen merkezinden, do uya, güneye ve güney batıya yayılmı tır. Böylece pek çok ekotip olu mu tur (Gençkan, 1983). Ülkemizde ise 3 ekotip söz konusudur; Do u Anadolu Yoncası; yurdumuzun do u bölgelerinde bulunan, yatık formlu, geli mesine geç ba layan ancak erken tamamlayan bir ekotiptir. Kayseri Yoncası; dik olarak büyüyen, ilkbaharda erken uyanan ve geli mesi uzun süren, Orta Anadolu da yaygın olarak görülen bir ekotiptir. Bayındır Yoncası; Batı Anadolu da özellikle Bayındır çevresinde yaygın olan, fazlaca boylanmayan, sulu ko ullarda üstün verimli ve sıca a dayanıklı olan bir ekotiptir (Soya ve ark., 2004). Medicago sativa nın çiçek rengi mavi ve mavinin tüm tonlarını kapsamaktadır. Taç yaprakları ise genellikle menek e renklidir ( ekil 2.1a). Çiçek durumu salkım tipindedir. Salkımlar, bitkinin sap kitlesinin uç kısımlarında bulunan yaprakların koltu undan çıkmakta olup, 5-10, bazen 25 adet çiçek ta ımaktadır. Çiçe in ikili geli meli (diadelphus) olu uma sahip bir erkek organı ile bir di i organı vardır. Çiçekler genellikle yabancı döllenir. Olu an meyve, helezon biçimindedir ( ekil 2.1b). Her meyvede yakla ık 3-7 adet tohum bulunmaktadır (Gençkan, 1983).

27 7 (a) (b) (a) (b) ekil 2.1. (a) Medicago sativa bitkisi, (b) Medicago sativa bitkisinin meyvesi Yonca da genellikle dik olarak geli en sap, yeti me ko ullarına ve çe ide ba lı olarak cm boylanır. Genç bitkilerde sap ince ve yumu aktır. Olgunla tıkça saplar odunla ır. Yüksek rejenerasyon özelli ine sahip, topra ın derinliklerine (genellikle 2-3 metre) inebilen, silindir biçiminde kazık kökleri vardır. Yan kökler ince, sayısı az, fakat iyi geli mi tir (Soya ve ark., 2004) Yoncanın Yem Bitkisi Olarak Önemi Çok yıllık yembitkileri suda eriyen mineral maddeleri bünyelerine alıp, onları uzun süre koruyarak, yıkanıp gitmelerine engel olmakta, hasat kalıntılarıyla da bu besin maddelerinin önemli bir bölümünü topra a geri vermekte, kendilerinden sonra gelen kültür bitkisine hazır besin ortamı sa lamaktadırlar. Leguminosae (Baklagil) familyasından olan yembitkileri havanın serbest azotunu köklerinde bulunan azot bakterileri (Rhizobium sp.) aracılı ı ile topra a geçirmekte ve topra ı azotça

28 8 zenginle tirmektedir. Topra a en çok azotu çok yıllık bir yembitkisi olan yonca sa larken, en az azotu yıllık yembitkisi olan yem bezelyesi sa lamaktadır. Yonca bitkisinin besin de erleri de yüksektir. Ham protein (%17,9), kül (%9,2), ya (%1,9), ni asta (%38,8) ve ham selüloz (%32,2) içerikleri bakımından di er yembitkilerine oranla daha zengindir (Soya ve ark. 2004). Kuvvetli ve derine giden kökleri yardımıyla yonca bitkisi, kuraklı a ve donlara direnç gösterebilmekte, iklim ve bölgelere ba lı olarak 4-30 yıl ya ayabilmektedir. Ayrıca derine inen kökleri ile topra ın derinliklerine i lemekte, oralarda yararsız durumda bulunan besin maddelerini bünyelerine alarak üst katmanlara çıkarmakta ve yararlı duruma getirmektedirler. Derine inen kuvvetli kökleri, toprakta kanallar açar ve toprak sıkı masını önler, dolayısıyla da havalanmayı sa larlar (Soya ve ark., 2004). Yembitkileri yeti tiricili i en geni olarak Karadeniz Bölgesi nde yapılmakta, fakat en çok kuru ot üretimine de Do u Anadolu Bölgesi nde ula ılmaktadır. Yembitkileri üretimi içinde en önemli kaynak olan yonca; yakla ık ha üretim alanı ve ton kuru ot ürünü ile mısırdan sonra gelmektedir. Buna kar ılık ekilebilen ha alan içindeki payı ancak %1 kadardır. Oysa hayvancılı ı geli mi ülkelerde bu oran en az %10 dolayındadır. Yembitkileri üretim alanlarımızın tarla alanları içindeki payı %5,5 dir ha olan tarım alanlarımız içindeki payı ise %3,7 kadardır (Avcıo lu ve ark., 2000) yılı verilerine göre ülkemizde, mevcut yembitkileri ekim alanları içerisinde en fazla yonca bitkisi yeti tirilmekte (%36,6) bunu sırası ile fi (%31,9), mısır (%21,4) ve korunga (%9,7) bitkileri takip etmektedir. Üretilen toplam kuru ot miktarının ise %68,9 unu mısır, %19,3 ünü yonca, %8,3 ünü fi, %3,4 ünü korunga, %0.07 sini üçgül, % 0.06 sını ise burçak kuru otu olu turmaktadır (Yolcu ve Tan, 2008).

29 2.3. Medicago sativa L. deki Doku Kültürü Çalı maları 9 Dale ve ark.(1980) na ait bir çalı mada, virüssüz materyal elde etmek amacıyla mm uzunlu undaki sürgün uçları çe itli besin ortamlarında kültüre alındıklarında eksplantların %80 inden rejenerasyon sa lanmı tır. Baklagiller üzerine yaptıkları bu çalı malarında sürgün uçları için birçok besin ortamını denemi lerdir. Sonuçta, üçgül türleri (Trifolium repens ve Trifolium pratense) için 0,2 mg/l indol-3-asetik asit (IAA) ve 0,2 mg/l 6 (, -dimetilallilamino) pürin ribozid içeren Blaydes (1966) ortamını ve yonca (Medicago sativa) için 0,2 mg/l -naftalen asetik asit (NAA) içeren Gamborg un B5 (Gamborg ve ark., 1968) besin ortamını en uygun ortamlar olarak belirlemi lerdir. Mroginski ve Kartha (1984), yonca sürgün uçlarından bitki rejenerasyonu için en uygun ortamın 0,2 mg/l NAA içeren B5 ortamı oldu unu, sürgün uçlarından bitki rejenerasyon frekansını etkileyen en önemli faktörün, sürgün ucunun büyüklü ü oldu unu, 2-4 mm uzunlu undaki sürgün uçları kültüre alındı ında bunların %80 inden rejenerasyon sa landı ını bildirmektedirler. Verim artı ı, süreklilik, hastalıklara tolerans ve kalite özelliklerinin geli tirilmesini sa lamak amacıyla Mc Kersie ve ark. (1989), yapay tohum teknolojisinden yararlanarak hibrid yonca bitkisi üretmeye çalı mı lardır. Çiçeklenmemi yonca bitkisinin ikinci ve üçüncü nodları arasındaki saplar, eksplant kayna ı olarak kullanılmı tır. Eksplantlar, B5 ortamında kültüre alınmı lardır. Kallus olu umunu te vik etmek üzere ortama 1,0 mg/l 2,4-diklorofenoksi asetik asit (2,4-D) ilave edilmi tir gün sonra elde edilen kallus yı ınları, küçük parçalara bölünmelerini sa lamak ve embriyo geli imini ba latacak hücre ço altmalarına yardımcı olmak amacıyla 0,1 mg/l NAA içeren sıvı B5 ortamına transfer edilmi lerdir. Olu an embriyolar hormonsuz BOi2Y

30 10 (Bingham ve ark., 1975) ortamında, yakla ık 7 gün bekletildikten sonra kalp eklinde embriyolar görülmü tür. Arcioni ve ark. (1990), biyoteknolojik yöntemlerin oldukça büyük kazanımlar sa layıp, klasik yonca ıslahına alternatif bir çizgi sunabilece ini, somaklonal varyasyonla hastalık ve stres ko ullarına dayanıklı hatlar seçilebilirken, protoplast füzyonu ve embriyo kültürü ile uyu mazlık engelinin a ılabilece ini, olgun ya da olgunla mamı eksplantların kullanımı ile donör bitkilerin kısa sürede ço altımının sa lanabilece ini bildirmektedirler. Pupilli ve ark. (1992), farklı geli me dönemlerindeki Medicago sativa L. bitkilerine ait, bitkinin de i ik yerlerindeki bo um eksplantlarını 3 farklı hormonun [6-benzilaminopürin (BAP), kinetin, ve N 6 -isopentenil-adenin(2-ip)] 7 farklı konsantrasyonunu ( 0, 1, 5, 10, 15, 20, 30 mg/l ) içeren MS (Murashige and Skoog, 1962) besin ortamlarında kültüre almı lardır. Sonuçta nod ba ına geli en sürgün sayısında bir de i iklik olmamı, sadece 2-iP sitokininin varlı ı (10 ve 20 mg/l) sürgün uzunlu unu artırmı tır. Bu çalı malardan elde edilen sürgünler, kallus ve protoplast kültürlerinden rejenere olan sürgünlerin köklendirilmesinde ba arılı sonuçlar vermi olan 2 mg/l IAA içeren MS ortamına aktarılmı lardır. Fakat kök geli imi görülmemi tir. Sarul ve ark. (1995), Medicago sativa Mongolian var. Burgaltay ve Medicago sativa var. Rangelander çe itlerinde köklenme ile ilgili yaptıkları çalı malarında kullandıkları sürgünleri, tohumları çimlendirerek elde etmi lerdir. Tohum sterilizasyonu, %70 lik alkolde 30 saniye, %0,2 lik HgCl 2 solüsyonunda 3-4 dakika bekletildikten sonra 5 kez steril destile su ile çalkalanarak gerçekle tirilmi tir. Büyüme düzenleyicisi içermeyen B5 besin ortamında tohumların çimlendirilmesi sa lanmı tır.

31 11 Özgen ve ark. (1997), in vitro ko ullarda yonca (Medicago sativa L.) çe itlerinin mikroço altımları için yaptıkları çalı malarında, Elçi ve Mesa-Sirsa yonca çe itlerini kullanmı lardır. Eksplant kayna ı, bu çe itlerin in vitro da büyütülmü fidelerinin sürgün uçlarıdır. Eksplantları farklı konsantrasyonlarda BAP ve NAA içeren MS besin ortamında kültüre almı lardır. En fazla sürgün sayısının, Elçi çe idinde 2 mg/l BAP ve 0,2 mg/l NAA; Mesa-Sirsa çe idinde ise, 1 mg/l BAP ve 0,2 mg/l NAA içeren kültür ortamlarında oldu u belirtilmi tir. Her iki çe itte de, ortalama sap uzunlu u 2 mg/l BAP ve 0,2 mg/l NAA içeren MS kültür ortamında daha fazla ölçülmü tür. Kültür ortamına ilave edilen indol-3- bütirik asit (IBA) oranının artırılması ile köklenme miktarının %80-90 oranına ula tı ı ve çe itlerde farklı IBA konsantrasyonlarının her bir sürgünde olu an kök sayısını önemli miktarda etkiledi i, fakat her bir sürgünde olu an kök uzunlu unda IBA konsantrasyonlarının bir etkisi olmadı ı bildirilmi tir. Bununla beraber, Elçi çe idinin ortalama kök uzunlu unun Mesa-Sirsa çe idinden daha fazla oldu u gözlenmi tir. Zagorska ve ark. (1997), yoncada anter kültürü yolu ile haploid bireyler elde etmenin çok zor oldu unu belirttikleri çalı malarında, çok sayıda genotip, ortam ve 30 un üzerinde hormon kombinasyonu denediklerini, en yüksek kallus indüksiyonunun (%76) Blaydes ortamında 9,29 M kinetin, 9,05 M 2,4-D, 10,74 M NAA kombinasyonu ile sa landı ını, yine Blaydes ortamında ve 2 mg/l zeatin, 500 mg/l inositol ve 2 mg/l maya ekstraktı ilavesi ile %15,2-12,8 oranlarında rejenere olan bitkilerde haploid, dihaploid ve miksoploid bireylere rastlandı ını bildirmi lerdir. Korunga (Onobrychis viciifolia Scop.) bitkisinin in vitro da mikroço altımı ile ilgili yaptı ı çalı masında Sancak (1999), farklı konsantrasyonlardaki BAP, IBA NAA ilave edilen MS ortamında, tek bir embriyodan, 8 hafta içerisinde çok yüksek oranda sürgün ço altımı elde etmi tir. En yüksek sürgün ço altımını, 2 mg/l BAP ile IBA nın 0,05 ve

32 12 0,1 mg/l lik ortamlarından ve 2 mg/l BAP ile NAA nın 0,05, 0,1 ve 0,5 mg/l lik ortamlarından veya 8 mg/l BAP ile 0,05 mg/l NAA ortamından elde etmi tir. En yüksek sürgün boyu yalnızca 2 mg/l BAP ın bulundu u ortamda gözlenmi tir. Elde edilen sürgünler 1 mg/l IBA içeren MS ortamında 4 hafta içerisinde %60 oranında köklendirilerek, normal bitkiler elde edilmi tir. Tian ve ark. (2002), yonca embriyogenik kalluslarının B5 ve SH4K (Schenk and Hildebrandt, 1972) olmak üzere iki indüksiyon ortamında meydana geldi ini belirtmi lerdir. B5 ortamında meydana gelen ve muhafaza edilen kalluslar alt kültür süresince embriyogenik kapasitelerini çabuk kaybederlerken, SH4K ortamında muhafaza süresince kallus yı ınları düzgün bir büyüme göstermi tir. SH4K ortamında olu an embriyolar yüksek çimlenme göstermi tir ve geli en embriyolardan normal ve tam fertil bitkiler meydana gelmi tir. Ehsanpour ve Fatahian (2003) Medicago sativa var. Yazdi ve Medicago sativa var. Hamedani bitkilerinin kalluslarında tuz ve prolinin etkilerini inceledikleri çalı malarında eksplant kayna ı olarak in vitro da geli tirilen fidelerin gövdelerini kullanmı lardır. 10mM NAA, 9mM 2,4- D ve 9mM kinetin içeren MS besin ortamında geli tirilen kalluslar, farklı konsantrasyonlarda (0, 30, 60, 90, 120 mm) NaCl ve (0, 5, 10 mm) prolin içeren MS ortamına transfer edilmi lerdir. Her iki çe itte de tuz konsantrasyonu arttıkça kallus geli iminin azaldı ı görülmü tür. Kültür ortamına ilave edilen prolinin ise kallusların kuru a ırlıklarını arttırdı ı belirtilmi tir. Kalengamaliro ve ark. (2003), yonca çe itlerine ait hücre süspansiyon kültürlerinde büyüme parametrelerini ve eker birikimini inceledikleri çalı malarında, süspansiyon hücrelerini % 2 sukroz içeren B5 ortamında büyütmü lerdir. Tohumlar, Chlorox ticari solüsyonu kullanılarak hazırlanmı, % 2 lik NaOCl de 10 dakika bekletilerek yüzey

33 13 sterilizasyonu yapılmı tır. Üç kere steril destile sudan geçirildikten sonra çimlendirilmi lerdir. Yedi günlük fidelerin kök eksplantları alınarak MS besin ortamına konulmu lar ve karanlıkta 27 C de inkübe edilmi lerdir. Altı hafta sonra elde edilen kalluslar, süspansiyon kültürlerini ba latmak için içerisinde 1 mg/l 2,4-D ve 20 g/l sukroz ilave edilmi B5 ortamı bulunan erlenlere (25 ml ortam/125 ml erlen) aktarılmı lardır. Her 7-10 günde bir 7 ml lik hücre agregatlarını 25 ml lik taze ortamın içine alarak yapılan altkültürlemelerle süspansiyon kültürleri kurmu lardır. Medicago sativa protoplastlarından somatik embriyogenesis yoluyla bitki rejenerasyonun sa lanmasına yönelik yaptıkları çalı malarında Monteiro ve ark. (2003), eksplant kayna ı olarak bitkinin tohumlarını kullanmı lardır. Tohumların sterilizasyonunu ise %1,5 (v/v) NaOCl solüsyonunda 6 dakika beklettikten sonra 4 kez steril destile su ile çalkalayarak gerçekle tirmi lerdir. Besin ortamının içeri indeki tuzların yarım miktarları kullanılarak hazırlanan ½ MS ortamında çimlendirmi lerdir. Ehsanpour ve Taheri (2005), ethinil estradiol ün Medicago sativa bitkisinin somatik embriyogenesisi üzerine etkilerini inceledikleri çalı malarında, kallus olu turması için tohumları 2,4-D, kinetin ve NAA içeren MS ortamında kültüre almı lardır. 3 veya 4 haftalık kalluslar 14 farklı oksin, sitokinin ve ethinil estradiol kombinasyonu içeren rejenerasyon ortamlarına transfer edilmi lerdir. 1 mg/l ethinil estradiol ün ilave edilmesiyle kallusların sürgün, kök ve somatik embriyo geli tirme oranlarının arttı ı belirtilmi tir. Sonuçta ise, ethinil estradiol ve oksinin ayrı ayrı kullanıldıklarında çok fazla etki göstermezlerken, birlikte kullanılmaları halinde somatik embriyogenesisin ve bitki rejenerasyon oranının arttı ını gözlemi lerdir. Eri en (2005), yonca (Medicago sativa L.)'nın Verco çe idinde hücre süspansiyon kültürüyle yüksek oranda somatik embriyo elde

34 14 etmi tir. In vitro'da yeti tirilen Verco çe idine ait steril fidelerden izole edilen yaprak, gövde ve hipokotil eksplantları iki farklı protokol uygulanarak kültüre alınmı tır. Protokollerden birinden sonuç alınamamı tır. Sonuç alınan di er protokolde mg/l 2,4-D ve 0,2 mg/l kinetin içeren (%25 prolin + %50 KCI eklenen) katı SH (Schenk ve Hildebrant, 1972) besin ortamında kültüre alınan eksplantlar kallus olu turduktan sonra 1 mg/l 2,4-D içeren sıvı B5 besin ortamına aktarılarak, 1 hafta aralıklarla alt kültür yapılmı tır. Her alt kültürden sonra 1 ml sıvı süspansiyon kültürü katı BOi2Y besin ortamına yayılmı tır. Bu ortamda somatik embriyo olu umu ba lamı tır. Geli en embriyolar bitkicik geli tirme ortamına aktarılmı tır. Bu denemede en fazla somatik embriyo olu umu petri ba ına 150 adet ile 4 mg/l 2,4-D içeren ortamda kültüre alınan yaprak eksplantlarından elde edilmi tir. Bu embriyoların önemli bir kısmı (%70) bitkiye dönü mü tür. Süle (2005), farklı oksin tipleri kullanılarak, yonca (Medicago sativa L.) da somatik embriyolar üretmek amacıyla yürüttü ü çalı masında, Elçi yonca çe idine ait tohumları in vitro da çimlendirmi ve 6 günlük fidelerden hipokotil ve kotiledon segmentlerini, 1mg/L 2,4- D, NAA, picloram veya dicamba + 0,2 mg/l kinetin içeren SH ortamında kültüre almı tır. Sonuçta, oksin tipine ba lı olarak kallus indüksiyon oranının %23,6 ile %50,8 arasında de i ti ini ve en yüksek de erin 2,4- D oksin grubu içeren ortamlardan elde edildi ini belirtmi tir. Olu an kallusların a ırlı ı ortam kombinasyonlarına ba lı olarak 0,660 mg ile 1,472 mg arasında de i im gösterirken, picloram ın ilave edildi i besin ortamlarında en yüksek ortalama elde edilmi tir. 1 g kallus ba ına 8,6 ile 25,9 arasında somatik embriyo üretilmi tir. Acem üçgülü (Trifolium resupinatum L.) nün mikroço altımının yapılmasına yönelik çalı malarında Uranbey ve ark. (2005), nod, hipokotil ve kotiledonları eksplant olarak kullanmı lardır. BA ve IBA ya da BA, kinetin ve IBA nın farklı konsantrasyonlarını içeren MS

35 15 ortamında eksplantlar, 6 hafta boyunca kültüre alınmı lardır. En iyi sürgün ço altımı kotiledonlarda ve 7,1 M BA ve 1 M IBA içeren ortamda gözlenmi tir. Uzayan sürgünlerin köklendirilmesinde ise hem hormonsuz MS ortamında, hem de IBA, IAA ve NAA nın farklı kombinasyonlarını içeren MS ortamında ba arılı sonuçlar alınmı tır. En yüksek köklenme oranı ise 8 M IBA içeren ½ MS ortamında görülmü tür.

36 16 3. MATERYAL ve METOT 3.1. Materyal Neobi Tohumculuk A.. firması tarafından temin edilen, firma adına tescilli Kalender çe idine ait yonca (Medicago sativa) tohumları materyal olarak kullanılmı lardır ( ekil 3.1). ekil 3.1. Çalı mada kullanılan Medicago sativa var. Kalender tohumları 3.2. Metot Ara tırmada yonca bitkisinin tohumlarının yüzey sterilizasyonları yapılıp, steril ko ullarda çimlenmeleri sa lanmı tır. Geli en steril bitkicikler farklı doku kültürü yöntemleri uygulanarak, de i ik hormon kombinasyonlarına sahip MS (Murashige ve Skoog, 1962), B5 (Gamborg ve ark., 1968) ve WPM (Lloyd ve McCown, 1980) besin ortamlarında kültüre alınmı lardır. Besin ortamlarının hazırlanması, tohumların

37 sterilizasyonu, çimlendirilmesi ve eksplantların kültüre alınması ile ilgili yöntemler a a ıda ayrıntılı bir ekilde sunulmu tur Besin ortamlarının hazırlanması Ara tırmada, mineral maddeler, vitaminler, bitki büyüme düzenleyicileri ve agar içeren MS, WPM ve B5 besin ortamları kullanılmı tır (Çizelge 3.1). Çimlenme, sürgün olu umu, geli imi ve köklenme çalı maları için bitki büyüme düzenleyicilerinin farklı kombinasyonlarını içeren MS, WPM ve B5 besin ortamları kullanılmı tır. Ara tırmada kullanılan besin ortamlarından bir tanesi olan B5 + 1Kinetin (Çizelge 3.4) ortamının hazırlanması için önceden olu turulmu stok çözeltilerden 1 litre için gerekli olan miktarlar alınarak, behere aktarıldıktan sonra 1 mg Kinetin ilave edilmi tir. Ortama 30 g sukroz eklenip, hacim destile su ile 1 litreye tamamlanmı tır. Sukroz iyice eritildikten sonra seyreltilmi NaOH (sodyum hidroksit) ve HCl (hidrojen klorür) kullanılarak ph=5,8 e ayarlanmı tır. 7 g/l agar ilave edildikten sonra devamlı karı tırılarak kaynatılan ortam, sıcak olarak kapaklı deney tüplerine 10 ar ml olmak üzere dökülmü tür. A ızları kapatılan tüpler, otoklavda 121 C de 15 dakika sterilize edilmi lerdir. Ara tırmada kullanılan di er besin ortamlarının hazırlanması sırasında da aynı i lemler uygulanmı tır.

38 18 Çizelge 3.1. MS (1962), WPM (1980) ve B5 (1968) besin ortamlarının içerdi i maddeler ve miktarları MS besin WPM besin B5 besin Maddeler ortamındaki ortamındaki ortamındaki miktarlar miktarlar miktarlar (mg/l) (mg/l) (mg/l) NH 4 NO (NH 4 ) 2 SO KNO K 2 SO Ca(NO 3 ) MgSO 4.7H 2 O ,7 250 MnSO 4.4H 2 O 22,3 22,3 10 ZnSO 4.7H 2 O 8,6 8,6 2,0 CuSO 4.5H 2 O 0,025 0,25 0,025 H 3 BO 3 6,2 6,2 3,0 KH 2 PO Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,25 0,25 0,25 NaH 2 PO 4.2H 2 O CaCl 2.2H 2 O ,2 150 KI 0,83-0,75 CoCl 2.6H 2 O 0,025-0,025 myo-inositol Tritriplex(Na 2 EDTA) 37,3 37,3 37,3 FeSO 4.7H 2 O 27,8 27,9 27,8 Nikotinik asit 0,5 0,5 1,0 Pridoksin-HCl 0,5 0,5 1,0 Tiamin-HCl 0,1 1,0 10

39 Tohum sterilizasyonu 19 Yonca tohumları, öncelikle sabunlu su ile iyice yıkanıp, akan çe me suyu altında durulanmı tır. Tohumların sterilizasyonu için 6 farklı sterilizasyon yöntemi uygulanmı tır. Durulanan tohumlar akan çe me suyu altında 15, 20 ve 30 dakika yıkanmı lardır. Ardından laminar hava akı lı kabin içerisinde sterilizasyon i lemlerine devam edilmi tir. %70 lik etil alkolde 1 dakika bekletilen tohumlar, %0,75, %2 veya %2,2 lik ticari sodyum hipoklorit (NaOCl) solüsyonunda farklı sürelerle tutulmu lardır (Çizelge 3.2). Bu i lemlerin ardından 4 kez steril destile suda çalkalanan tohumlar, steril filtre ka ıdı üzerine bırakılarak fazla sularından arındırılmı lardır. Çizelge 3.2. Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemleri Uygulama I II III IV V VI Akan Çe me Suyu Altında Bekletme 15 dk 20 dk 30 dk 30 dk 30 dk 30 dk Etil Alkol Uygulaması NaOCl Uygulaması Tween 20 Uygulaması %70 lik 1 dk %70 lik 1 dk %70 lik 1 dk %70 lik 1 dk %0,75 lik %2 lik %2 lik %2 lik 15 dk 10 dk 15 dk 30 dk %70 lik 1 dk %70 lik 1 dk %2,2 lik %2 lik 25 dk 25 dk - 1 damla 1 damla 2 damla 2 damla 2 damla

40 Tohumların çimlendirme ortamına alınması Tohumların çimlendirilmesinde, bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen, katı B5 besin ortamı kullanılmı tır. Sterilizasyon prosedürü uygulanan tohumlar, her bir tüpte 3-5 tohum bulunacak ekilde, çimlendirme ortamlarında kültüre alınmı lardır In vitro sürgünlerden alınan apikal meristemlerin sürgün geli me ortamlarında kültüre alınması In vitro ko ullarda çimlendirilen yonca tohumlarından geli en steril bitkiciklerden elde edilen sürgünlerden Olympus marka stereomikroskop altında alınan apikal meristemlerin geli imi için 2 farklı B5 ortamı kullanılmı tır. Katıla tırıcı ajan olan agarın ilave edilmedi i, sıvı besin ortamlarının sukroz ve bitki büyüme düzenleyicilerinin içerikleri Çizelge 3.3 te verilmi tir. Hazırlanan sıvı besin ortamları tüplere payla tırılmadan önce, filtre ka ıtları M eklinde katlanıp köprü görevi görmesi için tüplerin içerisine yerle tirilmi tir. Köprülerin üzerine konulan meristem eksplantları, filtre ka ıdı yardımıyla besin ortamından besinlerini almaktadırlar.

41 21 Çizelge 3.3. Apikal meristemlerin, sürgün geli imi için aktarıldıkları sıvı besin ortamlarının kompozisyonları Ortam Adı Sukroz Bitki Büyüme Düzenleyicisi 1 Sıvı-B5 1Kinetin 30 g/l 1 mg/l Kinetin 2 Sıvı-B5 2Kinetin 30 g/l 2 mg/l Kinetin In vitro sürgünlerden alınan sürgün ucu eksplantlarının geli me ortamlarında kültüre alınması In vitro ko ullarda çimlendirilen yonca tohumlarından geli en steril bitkiciklere ait sürgünlerin, stereomikroskop altında alınan sürgün ucu kısımlarının geli imi için 2 farklı B5 ortamı kullanılmı tır. Yarı katı besin ortamlarının sukroz ve bitki büyüme düzenleyicilerinin içerikleri Çizelge 3.4 te verilmi tir. Çizelge 3.4. Sürgün ucu eksplantlarının geli imi için kullanılan yarı katı besin ortamlarının kompozisyonları Ortam Adı Sukroz Bitki Büyüme Düzenleyicisi 1 B5 1Kinetin 30 g/l 1 mg/l Kinetin 2 B5 2Kinetin 30 g/l 2 mg/l Kinetin

42 In vitro ko ullardaki sürgünlerden alınan nod eksplantlarının geli me ortamlarında kültüre alınması In vitro ko ullarda çimlendirilen yonca tohumlarından geli en steril bitkiciklere ait sürgünlerden alınan 2 nodlu eksplantların geli imi için iki farklı konsantrasyonda kinetin içeren B5 besin ortamı kullanılmı tır. Yarı katı besin ortamlarının sukroz ve bitki büyüme düzenleyicilerinin içerikleri Çizelge 3.5 te verilmi tir. Çizelge 3.5. Nod eksplantlarının geli imi için kullanılan yarı katı besin ortamlarının kompozisyonları Ortam Adı Sukroz Bitki Büyüme Düzenleyicileri 1 B5 1Kinetin 30 g/l 1 mg/l Kinetin 2 B5 2Kinetin 30 g/l 2 mg/l Kinetin In vitro ko ullardaki sürgünlerden alınan sürgün ucu eksplantlarının geli me ortamlarında kültüre alınması In vitro ko ullarda çimlendirilen yonca tohumlarından geli en steril bitkiciklere ait sürgünlerin en üst sürgün ucu kısmından yakla ık 1 cm büyüklükte alınan eksplantların ( ekil 3.2) geli imi için farklı konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicilerini içeren B5, WPM ve MS ortamları kullanılmı tır. Yarı katı besin ortamlarının sukroz ve bitki büyüme düzenleyicilerinin içerikleri Çizelge 3.6 da verilmi tir.

43 23 ekil 3.2. In vitro da çimlendirilen Medicago sativa var. Kalender bitkici i. Ok ile i aretlenen kısım, sürgün ucu eksplantını göstermektedir Ara tırmada incelenen büyüme parametreleri; ortalama eksplant boyu (cm), eksplant ba ına dü en ortalama nod sayısı (adet), kallus olu turan eksplant sayısı (adet), kök geli tiren eksplant sayısı (adet) dır.

44 24 Çizelge 3.6. Sürgün ucu eksplantlarının geli imi için kullanılan yarı katı besin ortamlarının kompozisyonları Ortam Adı Sukroz Bitki Büyüme Düzenleyicileri 1 B5 30 g/l - 2 B5 0,125 BAP 30 g/l 0,125 mg/l BAP 3 B5 0,25BAP 30 g/l 0,25 mg/l BAP 4 B5 0,5BAP 30 g/l 0,5 mg/l BAP 5 B5 1BAP 30 g/l 1 mg/l BAP 6 WPM 30 g/l - 7 WPM 0,125 BAP 30 g/l 0,125 mg/l BAP 8 WPM 0,25BAP 30 g/l 0,25 mg/l BAP 9 WPM 0,5BAP 30 g/l 0,5 mg/l BAP 10 WPM 1BAP 30 g/l 1 mg/l BAP 11 MS 30 g/l - 12 MS 0,125 BAP 30 g/l 0,125 mg/l BAP 13 MS 0,25BAP 30 g/l 0,25 mg/l BAP 14 MS 0,5BAP 30 g/l 0,5 mg/l BAP 15 MS 1BAP 30 g/l 1 mg/l BAP

45 In vitro da geli tirilen köklü bitkiciklerin aklimatizasyon ko ulları 25 In vitro da sürgün ucu eksplantlarından geli tirilen köklü bitkicikler, 1:1 oranda vermikülit ve perlit karı ımını içeren küçük saksılara dikilmi lerdir. Dı ko ullara alı tırmadan önce, kontrollü ko ullar altında, 16 saat aydınlık/8 saat karanlık fotoperiyotta ve 26±2ºC sıcaklıkta tutulmu lardır. Aktarıldıkları ilk gün nemlerini kaybetmemeleri için üzerleri naylon po etlerle örtülmü tür. kinci gün nem oranının azaltılması için po etlere havalandırma delikleri açılmı tır. Üçüncü günden itibaren, günde yakla ık 2 saat üzerlerindeki po etler çıkarılmı tır. Be inci günde ise naylon po etler tamamen çıkarılmı tır Kültür ko ulları Aydınlıkta bulunan kültürler, flouresan ı ı ında 4000 lux aydınlatmada, 16 saat aydınlık/8 saat karanlık fotoperiyotta ve 26±2ºC sıcaklıkta tutulmu lardır Denemenin kurulması ve verilerin de erlendirilmesi Ara tırmamız, tohumlardan geli tirilen bitkiciklerden stereomikroskop altında alınan meristem ve sürgün ucu eksplantlarında sürgün geli iminin incelendi i kısım ile yine tohumlardan geli tirilen bitkiciklerden alınan sürgün ucu ve nod eksplantlarının geli imlerinin incelendi i iki ayrı deneme eklinde kurulmu tur. Tek faktör olarak besin ortamlarının (Çizelge 3.3, 3.4, 3.5 ve 3.6) ele alındı ı denememiz 3

46 26 tekerrürlü olarak, tesadüf parselleri deneme desenine göre olu turulmu ve de erlendirilmi tir. Tüm de erlendirmelerde farklılıkların önem düzeylerinin ve boyutlarının saptanabilmesi için asgari önemli fark {LSD (Least Significant Difference)} test yöntemi kullanılmı tır (Açıkgöz, 1998). Çalı mada, oransal olarak ifade edilen verilerin de erlendirilmesinde 0 de erleri içeren verilere log transformasyonu uygulanmı tır. Bu transformasyon tipinde sıfır de erlerinin her birine 1 de eri eklendikten sonra transformasyon yapılmı tır. Orijinal verilerin 1 den küçük oldu u durumlarda tüm veriler sabit bir sayı (100) ile çarpılarak negatif sonuç önlenmi ve 10 tabanlı logaritma uygulanmı tır (Açıkgöz, 1988).

47 4. BULGULAR Kültüre Alınan Tohumlarda Kontaminasyon Durumu Çalı mada, toplam 5340 tohum çimlendirilmek üzere bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen yarı katı B5 besin ortamında kültüre alınmı tır. Kullanılan sterilizasyon uygulamalarına (Çizelge 3.2) göre tohumlarda görülen kontaminasyon yüzdelerinin ortalamaları Çizelge 4.1 de gösterilmi tir. Çizelge 4.1. Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemleri sonucu belirlenen kontaminasyon yüzdeleri Uygulama Toplam Tohum Sayısı Kontamine Olan Tohum Sayısı Kontaminasyon Yüzdesi I % 44,4 II % 37,2 III % 57,1 IV % 24,6 V % 20,7 VI % 23,9 V no lu uygulamada kontaminasyon yüzdesinin azaldı ı, fakat çimlenme yüzdeleri açısından de erlendirildi inde sterilizasyon için

48 28 uygun olmadı ı belirlenmi tir. Bunun üzerine yapılan VI. uygulamada kontaminasyon yüzdesi en iyi sonucu vermi olmasa da di er sonuçlar açısından bu uygulamanın en iyi yöntem oldu u kabul edilmi ve di er çimlendirme çalı malarında da kullanılmı tır ( ekil 4.1). ekil 4.1. Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemlerine göre kontaminasyon yüzdeleri 4.2. Kültüre Alınan Tohumlarda Görülen Geli meler Her bir tüpte 3-5 tohum bulunacak ekilde, çimlendirme ortamlarında kültüre alınan tohumlarda ilk çimlenme 2 gün sonra görülmü tür. Sürgün boyları ise farklılık göstermekle birlikte 1 hafta içerisinde 3-7 cm boya ula mı tır. Sürgün boyları 4-5 cm boyu a an bitkilerde köklenmenin de ba ladı ı gözlenmi tir. Kontaminasyon içeren bazı tüplerde, tohumların yine de çimlenebildi i görülmü tür. Bu oranlar da sterilizasyon yönteminin çimlendirmeye etkisini inceleyebilmek için göz önüne alınmı tır.

49 Uygulanan sterilizasyon yöntemine göre kültüre alınan tohumlarda gözlenen çimlenme yüzdeleri Çizelge 4.2 de belirtilmi tir. 29 Çizelge 4.2. Uygulanan sterilizasyon yöntemleri sonucu tohumlarda gözlenen çimlenme yüzdeleri Uygulam a Topla m Tohum Sayısı Kontamin e Olan Tüplerde Çimlenen Tohum Sayısı Steril Çimlene n Tohum Sayısı Steril Çimlenme Yüzdesi Toplam Çimlenme Yüzdesi (Kontamin e olanlar dahil) I % 53,0 % 82,5 II % 54,4 % 76,2 III % 42,9 % 64,8 IV % 73,6 % 88,9 V % 66,9 % 79,9 VI % 73,6 % 92,2 Sterilizasyon uygulamaları arasında hem toplam çimlenme oranının yüksekli i, hem de kontaminasyon yüzdesinin dü üklü ü nedeniyle VI no lu uygulama, kullanılacak yöntem olarak seçilmi tir ( ekil 4.2).

50 30 ekil 4.2. Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemlerine göre çimlenme yüzdeleri 4.3. Medicago sativa var. Kalender Bitkilerinde In Vitro Sürgün Geli imi Apikal meristemlerden sürgün geli imi In vitro da steril ko ullarda çimlendirilen bitkiciklerden stereomikroskop altında ve yine steril ko ullarda iki yaprak tasla ı ile birlikte alınan meristematik kubbeler ( 6,68 10,02 m) iki farklı besin ortamında (Çizelge 3.3) kültüre alınmı lardır. Bitkiciklerden meristematik kubbenin iki yaprak tasla ıyla birlikte alınması a amalı olarak ekil 4.3 te gösterilmi tir.

51 31 (a) (b) (c) (e) (d) (f) (g) ùekil 4.3. (a) Meristemi alınacak olan, in vitro da çimlendirilmiú Medicago sativa var. Kalender bitkici inin Olympus marka stereomikroskopta 1X büyütmedeki görüntüsü, (b) Pens ve bistüri yardımıyla yaprak taslaklarının ayrılması (3,2X büyütme), (c) 4-5 yaprak tasla ı olan sürgün ucu bölgesi (5X büyütme), (d) 2 yaprak tasla ı ile birlikte görülen meristematik kubbe (5,6X büyütme), (e) Sıvı ortama aktarıldıktan 2 hafta sonra eksplantın görüntüsü, (f) Sıvı ortama aktarıldıktan 4 hafta sonra eksplantın görüntüsü, (g) Sıvı ortama aktarıldıktan 4 hafta sonra kallus oluúturup sürgün vermiú olan bir baúka eksplantın görüntüsü

52 32 Besin ortamlarına aktarıldıktan sonra haftada bir yapılan gözlemlerde eksplantların öncelikle yaprak geli tirmeye ba ladıkları görülmü tür. Kültüre alındıktan 4 hafta sonra yapılan gözlemlerde ise yaprak geli tirmeye ba layan eksplantların büyük bir ço unlu unun kallus olu turdu u görülmü tür (Çizelge 4.3). Çizelge 4.3. ki farklı besin ortamında kültüre alınan meristem eksplantlarında görülen geli meler. Eksplant sayısı (adet) Ortalama Eks. Boyu (mm) Yaprak Geli tiren Eks. Sayısı (adet) Yaprak Geli tiren Eks. Yüzdesi (%) Geli meyen Eks. Sayısı (adet) Geli meyen Eks. Yüzdesi (%) Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) Kallus Olu turma Yüzdesi (%) Besin Ortamları Sıvı B5 + 1 Kinetin Sıvı B5 + 2 Kinetin T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT ,57 1,88 2,03 1,63 1,41 1,53 1,23 1, , ,67 46,7 66,7 73,3 62,0 46,7 60,0 66,7 57, , ,3 26,7 13,3 13,3 18,0 0,0 6,7 20,0 8, , ,7 73,3 86,7 86,7 82, ,3 80,0 91,3

53 33 Yapılan gözlemlerin sonucunda geli me göstermeyen eksplantlar hariç, di er tüm eksplantların kallus olu turdu u belirlenmi tir. Farklı besin ortamlarının etkilerini gözlemleyebilmek amacıyla yaptı ımız çalı mada, kallustan geli en sürgünleri kullanmak yerine direkt rejenerasyon gösteren eksplantları kullanmayı tercih etmemizden dolayı, bu eksplantların kullanılmasına devam edilmemi tir Sürgün ucu eksplantlarının geli imi In vitro da steril ko ullarda çimlendirilen bitkiciklerden mikroskop altında ve yine steril ko ullarda alınan, 4 veya 6 yaprak tasla ı içeren sürgün ucu eksplantları ( 0,6 0,8 mm) iki farklı besin ortamında (Çizelge 3.3) kültüre alınmı lardır. Haftalık yapılan gözlemlerde, eksplantların ço unlu unun kallus olu umuna yönlendikleri görülmü tür. Kallus olu turan eksplantların, sürgün geli tirdikleri ve bazılarının kök verdikleri de gözlenmi tir ( ekil 4.4). (a) (b) (c) ekil 4.4. Medicago sativa var. Kalender de kallus olu turan sürgün ucu eksplantları. (a) Kallus olu turmu eksplant, (b) Kallustan sürgün geli tirmi olan eksplant, (c) Kallustan hem sürgün, hem de kök geli tirmi olan eksplant

54 34 Kültüre alındıktan 4 hafta sonra yapılan gözlemler sonucunda, sürgün ucu eksplantlarında görülen geli meler Çizelge 4.4 te bildirilmi tir. Çizelge 4.4. ki farklı besin ortamında kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında görülen geli meler Eksplant sayısı (adet) Kallus Olu turmadan Sürgün Veren Eks. Sayısı (adet) Kallus Olu turmadan Sürgün Veren Eks. Yüzdesi (%) Geli meyen Eks. Sayısı (adet) Geli meyen Eks. Yüzdesi (%) Kontamine Olan Eks. Sayısı (adet) Kontaminasyon Yüzdesi (%) Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) Kallus Olu turma Yüzdesi (%) Besin Ortamları Katı B5 + 1 Kinetin Katı B5 + 2 Kinetin T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT ,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,7 6,7 4, , ,33 6,7 13,3 6,7 8,9 6, , ,33 20,0 0,0 0,0 6,7 26,7 0,0 0,0 8, , ,7 73,3 86,7 93,3 84,4 66,7 93,3 93,3 84,4

55 35 Çizelge 4.4 te de görüldü ü üzere, her iki besin ortamındaki eksplantların % 84,4 ü kallus olu turmu lardır. B5 + 2 Kinetin besin ortamında Tekerrür 2 de ve Tekerrür 3 te birer tane olmak üzere iki eksplant, kallus olu turmadan sürgün geli tirmeye ba lamı tır ( ekil 4.5). Geli meye ba layan iki sürgün, alt kültürü yapılarak yine aynı besin ortamına alınmı tır. Bir hafta sonra gözlemleri yapıldı ında geli meye devam etmedi i görülmü tür. (a) (b) ekil 4.5. (a) ve (b) Kallus olu turmadan sürgün geli tirmeye ba lamı olan iki eksplant Mikroskop altında, 4 veya 6 yaprak tasla ı ile birlikte alınan toplam 90 sürgün ucu eksplantının %84,4 ü kallus olu turmu ve arkasından sürgün geli tirmi tir. Sürgün ucu eksplantlarının %6,7 si kallus olu turmadan sürgün vermi tir. Geriye kalan %8,9 lık kısım ise ya geli me göstermemi ya da kontamine olmu tur. Farklı besin ortamlarının etkilerini gözlemleyebilmek amacıyla yaptı ımız çalı mada, kallustan geli en sürgünleri kullanmak yerine direkt rejenerasyon gösteren eksplantları kullanmayı tercih etmemizden dolayı, bu eksplantların da kullanılmasına devam edilmemi tir.

56 In vitro ko ullardaki sürgünlerden alınan nod eksplantlarının geli imi In vitro ko ullarda çimlenen yonca tohumlarından geli en steril bitkiciklerin sürgünlerine ait 2 nodlu eksplantlar, sürgün geli im ortamlarına aktarılmı lardır (Çizelge 3.5). Kültüre alındıktan 4 hafta sonra yapılan gözlemler sonucunda, nodal eksplantlarda görülen geli meler Çizelge 4.5 te bildirilmi tir. Çizelge 4.5. ki farklı besin ortamında kültüre alınan nod eksplantlarında görülen geli meler Besin Ortamları Eksplant sayısı (adet) Ortalama Sürgün Boyu (cm) Ortalama Nod Sayısı (adet) Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) Kallus Olu turma Yüzdesi (%) Katı B5 + 1 Kinetin Katı B5 + 2 Kinetin T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT ,71 1,63 1,63 1,66 1,53 1,73 2,10 1,79 2,67 2,53 3,20 2,80 2,73 4,00 3,13 3, ,0 93,3 93,3 93,3 93,3 93,3

57 37 Her iki besin ortamında da nod eksplantlarının %93,3 ü kallus olu turmu tur. Kallustan büyümelerin gözlendi i eksplantların boyları çok fazla geli memekle birlikte, nod sayılarında da önemli oranda bir artı görülmemi tir ( ekil 4.6). Eksplant boyunun uzaması bakımından yapılan istatistiki de erlendirmeye göre, besin ortamları arasındaki fark önemsiz bulunmu tur (F= 0,591). (a) (b) (c) ekil 4.6. (a) Ortama temas etti i yerde kallus olu turan nod eksplantı, (b) Kallus olu turan nod eksplantında sürgün geli imi, (c) Nod eksplantının sık nodlu olarak geli imi ve kallustan sürgün geli imi Sürgün geli imi için farklı oranlarda kinetin içeren B5 ortamlarının kullanıldı ı çalı mada geli en sürgünlerin boyu bakımından en iyi sonuç 2 mg/l kinetin içeren B5 ortamından elde edilmi tir ( ekil 4.7).

58 38 ekil 4.7. Kültüre alınan 2 nodlu eksplantlarda ortalama sürgün boyu Eksplantlardaki nod sayılarının artması bakımından yapılan istatistiki de erlendirmeye göre de, ortamlar arasındaki farklılıklar önemsiz bulunmu tur (F= 1,300). Buna ra men, sürgünlerin nod sayılarının artması yönünden en iyi sonuç 2 mg/l kinetin içeren B5 besin ortamında alınmı tır ( ekil 4.8). ekil 4.8. Kültüre alınan 2 nodlu eksplantların nod sayılarında görülen geli me

59 In vitro ko ullardaki sürgünlerden alınan sürgün ucu eksplantlarının geli imi 39 In vitro ko ullarda çimlendirilen yonca tohumlarından geli en steril bitkiciklere ait sürgünlerin en üst sürgün ucu kısmından alınan eksplantlar, sürgün geli im ortamlarına aktarılmı tır (Çizelge 3.6). Sürgün ucu eksplantlarında, kültüre alındıktan 4 hafta sonra gözlenen geli meler Çizelge 4.6 da bildirilmi tir.

60 40 40 Çizelge 4.6. Be farklı konsantrasyonda (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 mg/l BAP) büyüme düzenleyicisi içeren üç farklı besin ortamında (B5, WPM, MS) kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında gözlenen geli meler Besin Ortamları B5 WPM MS T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. Eksplant sayısı (adet) Ortalama Eksplant Boyu (cm) 2,67 2,47 3,47 2,87 6,40 4,53 3,47 4,80 2,80 2,73 2,86 2,79 Ortalama Nod Sayısı (adet) 2,53 3,73 3,27 3,17 5,07 3,27 3,07 3,80 2,20 2,53 2,73 2,48 Sürgün Ço altmaya Uygun Eks. Sayısı (adet) , , ,67 Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Yüzdesi (%) 20,0 13,3 33,3 22,2 73,3 53,3 53,3 60,0 20,0 60,0 13,3 31,1 Geli meyen Eks. Sayısı (adet) , ,33 Geli meyen Eks. Yüzdesi (%) 20,0 0,0 0,0 6,7 0,0 20,0 13,3 11,1 26,7 26,7 13,3 22,2 Tamamen Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) , ,33 Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) Kallus Olu turma Yüzdesi (%) 80,0 66,7 53,3 66,7 26,7 6,7 6,7 13,3 6,7 13,3 0 6,7 Kök Veren Eks. Sayısı (adet) , , Köklenme Yüzdesi (%) 33,3 33,3 46,7 37,8 66,7 66,7 80,0 71,3 13,3 53,3 13,3 26,7

61 41 Çizelge 4.6. (Devam) Be farklı konsantrasyonda (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 mg/l BAP) büyüme düzenleyicisi içeren üç farklı besin ortamında (B5, WPM, MS) kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında gözlenen geli meler Besin Ortamları B5 + 0,125 BAP WPM + 0,125 BAP MS + 0,125 BAP T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. Eksplant sayısı (adet) Ortalama Eksplant Boyu (cm) 1,37 1,43 1,23 1,34 2,57 2,97 2,17 2,57 1,53 1,8 1,8 1,71 Ortalama Nod Sayısı (adet) 1,67 2,33 2,40 2,13 3,40 3,33 3,13 3,29 2,07 2,33 2,80 2,40 Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Sayısı (adet) , ,67 Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Yüzdesi (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,7 0,0 2,2 0,0 0,0 13,3 4,4 Geli meyen Eks. Sayısı (adet) , , ,67 Geli meyen Eks. Yüzdesi (%) 0,0 0,0 6,7 2,2 0,0 6,7 0,0 2,2 13,3 0,0 0,0 4,4 Tamamen Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) ,33 Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) , , ,33 Kallus Olu turma Yüzdesi (%) ,3 97, ,3 93,3 95,5 33,3 46,7 26,7 35,6 Kök Veren Eks. Sayısı (adet) ,33 Köklenme Yüzdesi (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 13,3 6,7 0,0 6,7 0,0 0,0 6,7 2,2 41

62 42 42 Çizelge 4.6. (Devam) Be farklı konsantrasyonda (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 mg/l BAP) büyüme düzenleyicisi içeren üç farklı besin ortamında (B5, WPM, MS) kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında gözlenen geli meler Besin Ortamları B5 + 0,25 BAP WPM + 0,25 BAP MS + 0,25 BAP T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. Eksplant sayısı (adet) Ortalama Eksplant Boyu (cm) 1,43 1,03 1,07 1,18 2,63 2,17 2,30 2,37 2,97 2,33 2,57 2,62 Ortalama Nod Sayısı (adet) 2,00 1,47 2,20 1,89 3,33 3,07 2,87 3,09 2,80 3,13 3,27 3,07 Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Sayısı (adet) Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Yüzdesi (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 13,3 6,7 6,7 6,7 0,0 13,3 6,7 Geli meyen Eks. Sayısı (adet) Geli meyen Eks. Yüzdesi (%) 13,3 6,7 0,0 6,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Tamamen Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) , , ,33 Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) , ,33 Kallus Olu turma Yüzdesi (%) 73,3 93, , ,3 66,7 86,7 75,5 Kök Veren Eks. Sayısı (adet) ,33 Köklenme Yüzdesi (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 6,7 6,7 6,7 6,7 0,0 6,7 0,0 2,2

63 43 Çizelge 4.6. (Devam) Be farklı konsantrasyonda (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 mg/l BAP) büyüme düzenleyicisi içeren üç farklı besin ortamında (B5, WPM, MS) kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında gözlenen geli meler Besin Ortamları B5 + 0,5 BAP WPM + 0,5 BAP MS + 0,5 BAP T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. Eksplant sayısı (adet) Ortalama Eksplant Boyu (cm) 1,33 1,17 1,10 1,20 2,13 1,20 1,93 1,75 2,67 2,57 2,37 2,54 Ortalama Nod Sayısı (adet) 2,00 2,07 2,93 2,33 2,40 1,87 3,00 2,42 2,60 3,33 3,00 2,98 Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Sayısı (adet) ,33 Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Yüzdesi (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,7 0,0 2,2 Geli meyen Eks. Sayısı (adet) , , ,33 Geli meyen Eks. Yüzdesi (%) 0,0 6,7 0,0 2,2 0,0 13,3 0,0 4,4 6,7 0,0 0,0 2,2 Tamamen Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) , ,67 Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) , ,33 Kallus Olu turma Yüzdesi (%) , ,5 40,0 80,0 26,7 48,9 Kök Veren Eks. Sayısı (adet) Köklenme Yüzdesi (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 43

64 44 44 Çizelge 4.6. (Devam) Be farklı konsantrasyonda (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 mg/l BAP) büyüme düzenleyicisi içeren üç farklı besin ortamında (B5, WPM, MS) kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında gözlenen geli meler Besin Ortamları B5 + 1 BAP WPM + 1 BAP MS + 1 BAP T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. T1 T2 T3 ORT. Eksplant sayısı (adet) Ortalama Eksplant Boyu (cm) 1,90 1,10 1,60 1,53 1,67 2,40 2,10 2,06 2,63 2,53 1,63 2,26 Ortalama Nod Sayısı (adet) 2,13 1,93 1,87 1,98 1,47 2,80 3,20 2,49 2,40 3,00 2,47 2,62 Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Sayısı (adet) Sürgün Ço altmaya Uygun Eksplant Yüzdesi (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Geli meyen Eks. Sayısı (adet) , ,33 Geli meyen Eks. Yüzdesi (%) 0,0 6,7 0,0 2,2 0,0 0,0 0,0 0,0 20,0 0,0 6,7 8,9 Tamamen Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) ,67 Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) , ,33 Kallus Olu turma Yüzdesi (%) , , ,7 53,3 26,7 42,2 Kök Veren Eks. Sayısı (adet) , Köklenme Yüzdesi (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,7 2,2 0,0 0,0 0,0 0,0

65 45 Gözlemler sonucunda belirlenen eksplant boyları bakımından yapılan istatistiki de erlendirmeye göre (HKO = 0,333), kullanılan besin ortamları (F = 20,467) ve bitki büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyon oranları (F = 12,567) arasındaki fark %1 seviyesinde önemli bulunmu tur. Besin ortamlarına uygulanan LSD testinde WPM ve MS besin ortamları sırasıyla %2,667 ve %2,600 ile birinci grupta yer alırken, B5 besin ortamı %1,467 ile ikinci grupta yer almı tır (LSD = 0,580). Bitki büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyonlarına uygulanan LSD testinde ise bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen besin ortamları %3,444 ile birinci grupta bulunurken, farklı konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicilerini içeren besin ortamlarının hepsi ikinci grupta yer almı tır (LSD = 0,748). Denemede kullanılan besin ortamları arasında, ortalama 4,8 cm ile en uzun eksplant boyu bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen WPM ortamında elde edilmi tir. Eksplantların uzamasını sa layan ikinci en iyi ortam 2,87 cm ile bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen B5 ortamı olurken, 2,79 cm ortalama boyla bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen MS besin ortamı üçüncü ortam olmu tur ( ekil 4.9). ekil 4.9. Kullanılan besin ortamlarında ölçülen ortalama eksplant boyları

66 46 Ölçülen ortalama nod sayıları bakımından yapılan istatistiki de erlendirmeye göre (HKO = 0,333), kullanılan besin ortamları (F = 4,200) ve bitki büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyon oranları (F = 3,767) arasındaki fark %5 seviyesinde önemli bulunmu tur. Besin ortamlarına uygulanan LSD testinde WPM ve MS besin ortamları sırasıyla %2,867 ve %2,667 ile birinci grupta yer alırlarken, B5 besin ortamı %2,267 ile ikinci grupta yer almı tır (LSD = 0,431). Bitki büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyonlarına uygulanan LSD testinde ise bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen besin ortamları %3,222 ile birinci grupta bulunurken, farklı konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicilerini içeren besin ortamlarının hepsi ikinci grupta yer almı tır (LSD = 0,556). statistiki de erlendirme sonucunda da görüldü ü gibi, eksplantların nod sayılarını arttıran en uygun ortam bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen WPM olarak bulunmu tur (3,8 adet). kinci en uygun ortam, 0,125 mg/l BAP içeren WPM ortamı iken (3,29 adet), üçüncü en iyi ortam B5 ortamı (3,17 adet) olarak belirlenmi tir ( ekil 4.10). ekil Kullanılan besin ortamlarında ölçülen ortalama nod sayıları

67 47 Sürgün ço altımı için iyi görünümlü, sa lıklı, uzun boylu, sık nodlu olmayan ve geli mesini sürdüren uygun bitkilere ait eksplantların kullanımlarına dikkat edilmi tir ( ekil 4.11). (a) (b) ekil (a) ve (b). Sürgün ço altmaya uygun Medigaco sativa var. Kalender bitkicikleri Belirtilen özellikleri gösteren eksplantlar % 60 oranıyla bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen WPM besin ortamındaki bitkilerden elde edilmi tir. Bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen MS besin ortamındaki eksplantların % 31,1 i ile bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen B5 besin ortamındaki eksplantların % 22,2 si de bu özellikleri ta ımaktadır ( ekil 4.12).

68 48 ekil Sürgün ço altmaya uygun eksplantların kullanılan besin ortamlarında bulunma yüzdeleri Eksplantların kallus olu turma yüzdeleri açısından yapılan istatistiki de erlendirmede (HKO = 0,684), kullanılan besin ortamları (F = 51,592) ve bitki büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyon oranları (F = 34,658) arasındaki fark %1 seviyesinde önemli bulunmu tur. Besin ortamlarına uygulanan LSD testinde B5 besin ortamı %9,459 ile birinci grubu, WPM besin ortamı %8,607 ile ikinci grubu ve MS besin ortamı %6,422 ile üçüncü grubu olu turmu lardır (LSD = 0,832). Bitki büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyonlarına uygulanan LSD testinde ise sırasıyla; 0,25 mg/l BAP içeren ortamlar %9,360, 0,5 mg/l BAP içeren ortamlar %8,866, 1 mg/l BAP içeren ortamlar %8,775 ve 0,125 mg/l BAP içeren ortamlar %8,525 de erleriyle birinci grubu olu tururlarken, bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen besin ortamları %5,144 de erleriyle ikinci grupta yer almı lardır (LSD = 1,140).

69 49 En fazla kallus oranı ço unlukla farklı konsantrasyonlarda hormon içeren B5 besin ortamlarında görülürken, en az kallus oranları MS besin ortamlarında belirlenmi tir ( ekil 4.13). ekil Sürgün ucu eksplantlarının kallus olu turma yüzdeleri Farklı besin ortamlarının sürgün ucu kültürlerine etkisini denemek üzere yapılan çalı mada, kullanılan 675 sürgün ucu eksplantından 70 tane eksplant kök vermi tir. Kök veren eksplantların % 45,7 si bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen WPM besin ortamında bulunmaktadır. WPM besin ortamındaki eksplantların ise % 71,3 ü köklenmi tir. Di er besin ortamlarında köklenme durumları ise ekil 4.14 te gösterilmi tir.

70 50 ekil Sürgün ucu eksplantlarının köklenme yüzdeleri Ara tırmada elde edilen sonuçlar ve yapılan istatistiki de erlendirmelere göre; in vitro da çimlendirilen Medicago sativa var. Kalender bitkilerine ait sürgün ucu eksplantlarının ( ekil 3.2), bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen WPM besin ortamında en iyi geli tikleri belirlenmi tir. Bu nedenle, sürgün ço altmaya en uygun eksplantlar, klonal ço altımları için WPM ortamlarına aktarılmı lardır Medicago sativa var. Kalender Bitkilerinde In Vitro Kök Geli imi Sürgün geli mesi için büyüme düzenleyicisi içermeyen WPM ortamına aktarılan sürgün ucu eksplantları, uygun boya geldiklerinde in vitro köklendirme denemeleri kurulmu tur. Eksplantların geli meleriyle birlikte kültüre alındıktan 15 gün sonra kök vermeye ba ladıkları gözlenmi tir. Kültüre alındıktan 5 hafta sonra yapılan gözlemlerde elde edilen de erler Çizelge 4.7 de bildirilmi tir.

71 51 Çizelge 4.7. WPM ortamında kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarında gözlenen geli meler Besin ortamı WPM T1 T2 T3 ORT. Eksplant sayısı (adet) Ortalama Sürgün Boyu (cm) 3,98 4,94 4,64 4,52 Ortalama Nod Sayısı (adet) 3,53 4,05 3,90 3,83 Kallus Olu turan Eks. Sayısı (adet) ,67 Kallus Olu turma Yüzdesi (%) 45,0 25,0 40,0 36,7 Köklenen Eks. Sayısı (adet) ,33 Köklenme Yüzdesi (%) 45,0 62,5 52,5 53,3 Yapılan gözlemler sonucunda, kültüre alınan sürgün ucu eksplantlarının %53,3 ünün in vitro da köklü bitkicik geli tirdikleri belirlenmi tir ( ekil 4.15). Elde edilen köklendirme oranı, ba arılı kabul edilerek köklendirme çalı malarına devam edilmemi tir. (a) (b) (c ) (d) ekil Sürgün ucu eksplantlarında geli en sürgünlerin in vitro da köklendirilmeleriyle elde edilen steril Medicago sativa var. Kalender bitkicikleri

72 Medicago sativa var. Kalender Bitkiciklerinin Aklimatizasyonu In vitro ko ullarda köklendirilen bitkiciklerden 6-10 cm yüksekli e ula mı bitkiciklerden 50 tanesinin aklimatizasyonu yapılmı tır. Topra a aktarıldıktan 10 gün sonra yapılan gözlemlerde, aktarılan 50 bitkici in de canlılıklarını devam ettirdikleri, yeni sürgünler geli tirmeye ba ladıkları görülmü tür ( ekil 4.16). Geli meye ba layan yeni sürgünlerin, ana bitkiye oranla daha açık ye il oldukları gözlenmi tir.

73 53 (a) (c) (b) (d) (e) (f) (g) (h) ùekil In vitro da sürgünlerin köklendirilmesiyle elde edilen bitkiciklerin aklimatizasyonu. (a) ve (b) Bitkiciklerin topra a aktarılmadan önceki görüntüleri, (c) Nemini kaybetmemesi için üzerine naylon poúet geçirilmiú bitkicik, (d) Aklimatizasyonu yapılan bitkiciklerin genel görüntüsü, (e) Topra a aktarıldıktan 3 gün sonra bitkilerin genel görüntüsü, (f) Topra a aktarıldıktan 10 gün sonra bitkilerin genel görüntüsü, (g) ve (h) Topra a aktarıldıktan 10 gün sonra yeni sürgün geliútirmiú olan bitkiler