ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ YAYINLARI BİYOKİMYA UYGULAMA EL KİTABI

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ YAYINLARI BİYOKİMYA UYGULAMA EL KİTABI

2 Ç U K U R O V A Ü N İ V E R S İ T E S İ T I P F A K Ü L T E S İ Y A Y I N L A R I Biyokimya Uygulama El Kitabı Prof. Dr. Abdullah TULİ Prof. Dr. Kıymet AKSOY Prof. Dr. Levent KAYRIN Prof. Dr. Nurten DİKMEN Prof. Dr. Mehmet Akif ÇÜRÜK Doç. Dr. Tamer C. İNAL Doç. Dr.Özlem Görüroğlu Öztürk Öğr. Gör. Dr. Ebru Dündar Yenilmez Biyokimya Anabilim Dalı 2015 Adana

3 İÇİNDEKİLER Genel Laboratuvar Bilgileri... 1 Spektrofotometre... 7 Asit-Baz, ph ve Titrasyon Karbohidratlar Lipitler-Yağlar Proteinler Kağıt Kromatografisi Enzim Açlık Kan Şekeri Tayini PCR Uygulamaları Elektroforez Rutin İdrar Analizi Oral Glukoz Tolerans Testi Üre Analizi Ürik Asit Tayini EKLER i

4 ÖNSÖZ Birçok bilim dalının eğitiminde temel taşlardan birini oluşturan Biyokimya her gün ilerleyen ve gelişmelere kapısını açık tutan uygulamalı bilim dalıdır. Biyokimya eğitimi ancak uygulama ile koşut yürütüldüğünde bir anlam kazanmakta, kuramsal bilgilerin pekiştirilmesinde önemli bir zemin oluşturmaktadır. Bu kitabı yazmaktaki amacımız, Tıp Fakültesi öğrencileri için bu koşutluğu biraz olsun sağlamak, ayrıca daha sonraki baskılarda olası gelişmeler ışığında düzenlemeler yaparak bir kaynak oluşturmanın yanında, bir açıdan da biyokimyasal yöntemlerin gelişim sürecine sinema şeridi akışıyla bir bakış yaratmaktır. Kitabın hazırlanışında emeği geçen öğretim üyelerine (Prof. Dr. Abdullah TULİ, Prof. Dr. Sakine Kıymet AKSOY, Prof. Dr. Levent KAYRIN, Prof. Dr. Nurten DİKMEN, Prof. Dr. Mehmet Akif ÇÜRÜK, Doç. Dr. Tamer Cevat İNAL, Doç. Dr. Özlem Görüroğlu ÖZTÜRK, Öğr. Gör. Dr. Ebru Dündar YENİLMEZ) ve Araştırma Görevlilerine (Arş. Gör. Duygu Düzgünce BOĞA, Bio. Ümit YAŞAR, Bio. Gülüzar ÖZBOLAT, Arş. Gör. Umut KÖKBAŞ, Arş. Gör. Mustafa Muhlis ALPARSLAN, Arş. Gör. Başak SANNA, Arş. Gör. Dr. Nevin YILMAZ, Mol. Bio. Kezban KARTLAŞMIŞ, Kim. Mehmet BULUT) teşekkür ederiz. Ç.Ü. Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı ii

5 G E N EL L A BO R AT U VA R B İ L G İ L E Rİ 1 Genel Laboratuvar Bilgileri LABORATUVAR ÇALIŞMALARININ KAPSAMI VE AMACI Bilim; evreni ve doğayı anlama yolunda, deneysel yöntemlerle ve gözlemlerle elde ettiği bilgi birikimlerine dayanarak yasalar çıkarmaya çalışan disiplinlerin tümü olarak tanımlanabilir. Bu disiplinlerden biri olan Biyokimya yaşamı kimyasal temellerde tanımlamayı ve anlamayı kendisine amaç edinmiştir. Günümüzde Biyokimya; Ekoloji, Klinik Biyoloji, Tıp, Farmakoloji ve Ziraat gibi bir çok disiplinin temelini oluşturmaktadır. Bilim ve teknolojideki hızlı ilerlemeler her şeyden önce kontrollü deneylere ve bu deneylerden ortaya çıkan sonuçlara dayanmaktadır. Pozitif bilimleri temel alan disiplinlerde öğrenim gören öğrenciler bilimsel gözlem yapmayı ve bilimsel düşünmeyi öğrenmelidirler. Gözlemin nasıl yapılması gerektiği en iyi laboratuvarlarda öğrenilmektedir. Yapılan gözlemlerin ve alınan verilerin doğruluğu, değerlendirilmesi ve yorumlanması da en az deneyin hassas bir şekilde yapılması kadar önemlidir. Klinik Biyokimya biyolojik sıvı ve dokuların analizi ile hastalıkların tanısında, tedavisinde ve tedavinin takibinde önemli bilgiler sunan bir bilim dalıdır. Günümüzde, vücut sıvıları kullanılarak yüze yakın parametre bu amaç için Klinik Biyokimya laboratuvarlarında analiz edilmektedir. Bu uygulama el kitabında tıp fakültesi öğrencilerine klinik biyokimyanın analiz yöntemlerinin prensiplerini aktarabilmek amacıyla temel deneyler seçilmiştir. Deneylerde materyal olarak vücut sıvıları kullanılacak ve bu sıvılarda kimyasal ve enzimatik analizler; kolorimetrik, elektroforetik ve kromatografik yöntemlerle analiz edilecektir. Bu teknikler klinik biyokimyada halen geniş uygulama alanları bulmakta ve çoğu analizin prensibini içermektedir. CAM MALZEMELER Laboratuvarlarda kullanılan malzemeler genelde camdan yapılmaktadır. Cam malzemelere ek olarak; plastik, metal, ahşap ve porselen malzemeler de laboratuvarlarda sıkça kullanım alanı bulurlar (Şekil 5). Cam malzemelerin bir bölümü çözeltilerin ölçümü amacıyla kullanılırken diğer bölümü çözeltilerin aktarılması, taşınması ve saklanması amacıyla kullanılır. Bu nedenle cam malzemeleri derecelendirilmiş (Şekil 3) ve derecelendirilmemiş (Şekil 4) olarak iki ana gruba ayırabiliriz. Derecelendirilmiş Cam Malzemeler Sıkça kullanılan dereceli cam malzemeler; mezür, büret, pipet ve balon joje olarak sıralanabilir. Dereceli cam malzemeler genellikle sıvıların hacimlerinin ölçülmesinde kullanılır. Ölçüm yapılırken işaretin göz hizasında tutulması gereklidir. Sıvıların hassas ölçümlerinde, sıvıların yüzey gerilimi ile dar cam borularda oluşan menüsküsün doğru okunması önemlidir. Sıvıların büyük bir çoğunluğu dar cam borularda iç bükey menüsküs oluşturur. Cıva gibi moleküller arası birleşme kuvveti büyük olan sıvılarda ise dış bükey menüsküs oluşur. İç bükey bir menüsküs durumunda hacim, menüsküs işaret çizgisine teğet geçecek şekilde, en düşük noktasında okunur (Şekil 1).

6 2 G E N EL L A BO R AT U VA R B İ L G İ L E Rİ Menüsküs Şekil 1. Menüsküsün okunuşu Mezür (dereceli silindir): Üzerlerindeki bir seri çizgilerin ölçülebilen hacimleri gösterdiği mililitre olarak işaretlenmiş, hassasiyet gerektirmeyen sıvı ölçümlerinde kullanılırlar. Büret: Herhangi bir hacmi maksimum kapasitelerinde boşaltmaya yarayan alt kısmında bir musluk bulunan ölçüm malzemeleridir. Sıvıların titrasyonunda da kullanılır. Pipet: Genellikle kaplar arasında belirli sıvı hacimlerinin ölçülerek aktarılmasında kullanılır. Pipet orta ve başparmak arasında tutulur (Şekil 2). Çözelti istenilen hacim çizgisini biraz geçinceye kadar hafif bir emme ile çekilir. Üst ucu işaret parmağı ile hemen kapatılır. İşaret parmağını baskısı çözelti hacim çizgisine gelinceye kadar yavaş yavaş azaltılır. Pipetler boşaltılırken üst ucundan ve dik konumda tutulur. İşaretleme pipetin ucunda biten pipetlerde son damla üflenerek boşaltılır. İşaretleme pipetin ucundan yukarıda bitiyor ise işaretin altında kalan miktar boşaltılmaz. Şekil 2. Pipetin tutuluşu Balon joje: Tampon ve standart çözeltiler gibi derişimlerinin hassas olarak ayarlanması gereken çözeltilerin hazırlanmasında kullanılır. Hacimleri ml arasında değişen modelleri mevcuttur. Hazırlanacak çözelti için gerekli katı veya sıvı madde tartılıp balon jojeye aktarıldıktan sonra bir miktar çözücüde tamamen çözüldükten sonra son hacme çözücü ile tamamlanır.

7 G E N EL L A BO R AT U VA R B İ L G İ L E Rİ 3 Derecelendirilmemiş Cam Malzemeler Beher, erlen, balon, şişe gibi ölçeklendirilmemiş bazı cam malzemeler her ne kadar belirli hacimleri gösterirlerse de duyarlı hacim ölçümlerinde kullanılmazlar. Bu kaplar ölçmeden çok esas olarak sıvıyı bulundurmak için kullanılırlar. Beher: Taban ve ağız kısmı aynı çapta olup genellikle bir sıvının başka bir kaba aktarılmasında, çözelti hazırlanmasında, karıştırılmasında ve ısıtılmasında kullanılır. Erlen: Dar bir boyun ve geniş bir tabanı olan konik yapıda cam kaplardır. Özellikle buharlaşması istenmeyen çözeltilerin hazırlanmasında ısıtılmasında ve titrasyonlarında kullanılır. Ağızları dar olduğu için çalkalanmaları kolaydır. Balon: Hacim ölçümü yapılmaz çözeltilerin hazırlanmasında ve ısıtılmasında kullanılırlar. Ölçeklendirilmemişlerdir. Cam şişe: Hazırlanan çözeltilerin saklanmasında kullanılır. Çözeltinin güneş ışınlarından korunması amacıyla çoğunlukla koyu renklidirler. Üzerinde çözelti ile ilgili etiket olmalıdır, etikette çözeltinin adı, hazırlanış tarihi ve hazırlayanın adı yazılmalıdır. Bu ölçü malzemelerinin dışında çeşitli amaçlarla kullanılan deney tüpü, cam çubuk (baget), cam boru, huni, saat camı, havan, petri kutusu, desikatör vb. gibi malzemeler de laboratuvarda sıkça kullanılmaktadır. Mezür (dereceli silindir) Pipet Dereceli balon (balon joje) Şekil 3. Derecelendirilmiş cam malzemeler Folin-Wu tüpü Büret

8 4 G E N EL L A BO R AT U VA R B İ L G İ L E Rİ Balon çeşitleri Beher çeşitleri Deney tüpü Çeşitli santrifüj tüpleri Saklama şişesi Erlen çeşitleri Şekil 4. Derecelendirilmemiş cam malzemeler

9 G E N EL L A BO R AT U VA R B İ L G İ L E Rİ 5 Çeşitli huniler Temizlik fırçası Ayaklı spor Üç ayak Kil üçgen Amyant tel Bunsen beki Süzgeçli huni Ayırma hunileri Porselen kroze Büret kıskacı Şekil 5. Çeşitli laboratuvar malzemeleri Piset

10 6 G E N EL L A BO R AT U VA R B İ L G İ L E Rİ ÇÖZELTİLER VE DERİŞİM KAVRAMLARI İki veya daha fazla bileşenin homojen karışımlarına çözelti denir. Bu bileşenler, çözücü içinde iyon ve/veya moleküllerine kadar ayrılırlar. Bir çözeltiyi oluşturan maddelerden her birine o çözeltinin bileşenleri denir. Bu bileşenlerden bağıl miktarı fazla olana çözücü, miktarca az olana ise çözünen denir. Örneğin tuzlu suda, suya çözücü, tuza çözünen denir. Bileşenleri birbiri içine dağılmış fakat ayrı fazlarda bulunan çözeltilere heterojen çözeltiler denir. Bir sıvı içinde bir katının dağılmasıyla oluşan heterojen karışımlara süspansiyon (örn. Penisilin çözeltisi) denir. Sıvı içinde dağılan madde sıvı ise böyle çözeltilere emülsiyon (örn. Su ile karıştırılmış sıvı yağlar) denir. Bir çözelti içinde dağılan maddenin tanecikleri tek tek atom ya da moleküllerine dağılmış ise, böyle karışımlara homojen karışım yani çözelti denir. Böyle çözeltilerin her bir noktası aynıdır. Örneğin glukoz distile su içerisinde tamamen çözündüğünde şeker molekülleri tek tek sıvı faza geçerler ve homojen bir karışım oluşur. Bir çözeltideki çözünenlerden birinin madde miktarına, o bileşenin içinde bulunduğu çözeltideki derişimi (konsantrasyonu) denir. Çözünenin çözelti içindeki miktarı ne kadar çok ise, derişimi de o kadar büyüktür. Yani daha derişiktir. Derişimi daha küçük ise çözelti daha seyreltik olur ve az miktarda çözünen içerir. Bir çözeltinin derişimi; çeşitli derişim birimleri ile tanımlanabilir. Biyokimyasal hesaplamalarda sıklıkla kullanılan derişim birimleri aşağıda tanımlanmaktadır. 1- Yüzde (%) çözeltiler: Bir çözeltinin derişimi genellikle yüzde olarak tanımlanır. Yüzdenin anlamı 100 ml veya 100 g çözeltideki çözünmüş olan madde miktarıdır. Yüzde çözeltilerde birim verilmemiş ise katılar için tartılacak madde gram, sıvılar ise mililitre cinsinden alınır. Yüzde derişimlerin tanımlanmasında kullanılan üç en temel yöntem aşağıda sıralanmıştır. a) Yüzde ağırlık(%w/w) = Çözünenin ağırlığı Çözücünün ağırlığı X100 b) Yüzde hacim (%v/v)= Çözünenin hacmi Çözücünün hacmi X100 c) Yüzde ağırlık-hacim(%w/v)= Çözünenin ağırlığı Çözücünün hacmi X100 w/v yüzde derişim birimi derişimlerinin çok hassas olarak hazırlanmalarını gerektirmeyen laboratuvar çözeltilerinin hazırlanmasında sıklıkla kullanılır. 2- Molar çözeltiler: Bir çözeltinin Molaritesi (M), o çözeltinin bir litresinde çözünmüş maddenin mol miktarı ile tanımlanır. Litresinde mol ile ifade edilen miktarlarda madde bulunduran çözeltilere de molar çözelti denir. Molar çözeltiler genellikle köşeli parantez ile gösterilirler, örneğin, H + iyonunun molaritesi=[h + ]. Bir çözeltinin molaritesini hesaplamak için çözünen maddenin ağırlık cinsinden miktarını ve moleküler ağırlığını bilmemiz gerekir. 3- Molal çözeltiler: Bir çözeltinin molalitesi (m), o çözeltinin çözücüsünün 1000 gramında çözünmüş çözünenin mol cinsinden miktarına karşılık gelir. Özellikle farklı sıcaklıklarda yapılacak çalışmalar için molalite biriminin kullanımı doğruluğu artırıcı bir etkendir. 4- Normal çözeltiler: Litresinde ekivalan ile ifade edilen miktarlarda madde çözünmüş bulunan çözeltilere normal çözeltiler denir. Bir çözeltinin bir litresinde çözünen maddenin ekivalan gram sayısı o çözeltinin normalitesine eşittir. N harfi ile gösterilir.

11 SPEKTROFOTOMETRE 7 Laboratuvar Spektrofotometre 1 GENEL BİLGİ Çözelti halindeki bir maddenin ışık yutma kabiliyetinin ölçülmesi biyokimyada oldukça fazla kullanılan bir yöntemdir. Buna neden olarak da, biyokimyacıların ilgilendiği birçok bileşiğin mor ötesi, görünür ve yakın kızıl ötesi alanda ışığı yutması gösterilebilir. Bu ölçümü yapan kolorimetrenin biyokimyada kullanılmasıyla, klinik biyokimyada da büyük ilerlemeler kaydedilmiştir. Biyolojik materyallerde çok düşük derişimlerde bulunan ve bu sebepten tartım veya titrasyon ile miktarlarının tayini mümkün olmayan unsurların ölçülmesi kolorimetrik yöntemlerle mümkün olmuştur. Ayrıca birçok unsurun tayini saatler alırken kolorimetreyle bu analizlerin süresi kısaltılmıştır. Bilindiği gibi güneş ışınlarını prizmadan geçirerek bir ekranın üzerine alırsak ışık tayf elde ederiz. Işık bandı da denilen bu şeridin içinde sırasıyla kırmızı, sarı, yeşil, mavi, lacivert ve mor renkler dizilmiş olarak bulunur. Bu tayf, ışık bandı nm dalga boyu uzunluğundaki ışık dalgalarından oluşur. 400 nm den kısa dalga boyu uzunlukları mor ötesi ışınlardır. 700 nm den büyük dalga boyu uzunlukları ise enfraruj ışınlardır. 400 nm dalga boyu uzunluğundaki ışık prizmadan geçerken en çok kırılır ve renkli görülür. En az kırılan ise kırmızı ışıktır ve ışık dalga boyunun uzunluğu 700 nm dir. Prizmadan ayrışan ışık demetinin önüne kırmızı renkte cam koyup geçen ışınları bir ekran üzerine alırsak ekran üzerindeki ışığın kırmızı renkte olduğunu görürüz. Buna sebep kırmızı filtrenin (kırmızı cam) kırmızıdan başka bütün renkleri tutup yalnız kırmızıyı geçirmesidir. Prizmadan ayrışan ışık demetinin önüne yeşil bir filtre koyacak olursak ekrandaki rengin yeşil olduğunu görürüz. Öyle ise bir cismin renkli görülmesinin sebebi, cisimlerin, içinden geçen ışınların özellikle bir kısmını yutması, diğerlerini geçirmesidir. Kolorimetrik yöntemlerde esas bir maddenin veya kimyasal tepkimelerin neticesinde renk oluşturan bir maddenin ışık yutma kabiliyetine dayanarak derişimin tayin edilmesidir. Daha basit olarak derişimi bilenen bir madde ile derişimi bilinmeyen aynı maddenin eşit koşullar altında oluşturdukları renklerin şiddetlerinin kıyaslanmasıdır. Bir maddenin kolorimetrik yöntemlerle tayin edilebilmesi için: 1) Maddenin renkli olması veya kimyasal tepkimeler sonucunda renk oluşturması, 2) Oluşan rengin yalnız ve yalnız o maddeye ait olması, 3) Rengin sabit kalması, 4) Beer-Lambert Kanununa uyması gerekir. Beer-Lambert Kanununa göre: renkli bir çözelti içinden geçen belirli dalga boyundaki ışığın şiddeti, o eriyiğin derişimine ve ışığın çözelti içinde kat ettiği mesafeye bağlı olarak azalmaktadır. Bu kanunu matematiksel olarak, I= Ioe -k lc (1) formülü ile ifade edebiliriz. Bu formülde;

12 8 SPEKTROFOTOMETRE Io= Çözeltiye düşen ışığın şiddetini, I = Çözeltiden çıkan ışığın şiddetini (Io I), C= Renkli maddenin derişimini, l = Işık yolunun uzunluğunu, є = Çözelti içindeki soğuran materyalin soğurma katsayısı veya molar soğurganlık. ifade etmektedir. Diğer taraftan herhangi bir eriyiğin ışık geçirme kabiliyetine transmitans (T), ışık yutma (soğurma) kabiliyetine ise absorbans (A) denir. Buna göre: T= I/Io (2); A= -log T (3) dir (şekil 1). Şekil 1. Beer-Lambert Kanunu Diğer taraftan (1), (2) ve (3) numaralı formülleri birleştirip doğal logaritmadan 10 tabanlı logaritmaya geçersek; A= Cl formülünü elde ederiz. Beer-Lambert Kanunu T= I/Io = 10 -A = 10 - C l, I= Ioe - C l log1010 I0 /I = Cl A= Cl

13 SPEKTROFOTOMETRE 9 Bu formülde; A= Absorbans veya optik yoğunluğu (OD, [Optical Density]) (emilmiş, soğurulmuş ışık miktarı) = Ekstinksiyon katsayısını C= Derişimi l = Işık yolunun uzunluğunu ifade etmektedir. Absorbans kavramı içinde ekstinksiyon katsayısı ( ) anahtar bir rol oynamaktadır ve çalışılan maddenin bilinen sabit bir derişiminin, sabit bir ışık yolundaki değeridir ve bu nedenle birimi değişken olabilmektedir. Mesela bir A maddesinin değeri için, 1 M 260 = 500 veya 260 : 500 M -1 cm -1 verilmiş ise bunun anlamı; 1 cm 260 nm dalga boyunda, 1 cm ışık yoluna sahip bir ortamda 1 M lık bir A çözeltisinin absorbans değeri 500 demektir. Dolayısı ile bu kavram; 1 mm %1 1 cm veya 1 cm olarak değişik şekillerde ve rakamlarla 275 nm 275 ifade edilebilir. Diğer taraftan transmitansı yüzde olarak ifade ettiğimizi varsayarsak, %T = I / Io x 100 ise, transmitans ile absorbans arasındaki ilişki de A = 2 -log %T dir. Sonuç olarak bir maddenin absorbansı (A) o maddenin derişimiyle doğru orantılıdır. Diğer taraftan bir maddenin derişimi % transmitansa orantılı olmayıp % transmitansın logaritması ile doğru orantılıdır (şekil 2). Şekil 2. %T ve A arasındaki ilişki. Renk şiddetini yukarıda izah edilen esaslara göre ölçen cihazlara FOTOMETRE denir. Fotometrelerde belirli bir dalga boyunda (ki bu özel renkli cam filtrelerle veya prizmalarla elde edilir) renkli bir çözeltiden geçen ışık bir detektör üzerine (photocell) düşürülür ve oluşan elektrik akımı hassas bir galvonometre ile ölçülür. Bu değer isteğe göre ya A değeridir ya da % transmitanstır. Gelişmiş cihazlarda l daima 1 cm ye eşit olduğundan dolayı Beer-Lambert kanunu A= C veya A C olarak basitleştirilmiş olur (şekil 3).

14 10 SPEKTROFOTOMETRE Şekil 3. Bir fotometrenin şematik gösterimi Tüm kolorimetrik analizlerin en önemli kısmını standart eğrilerin çizimi oluşturur. Bu eğriler genelde derişime karşı absorbans değerleri olarak değerlendirilir. Bu eğrilerin çizimi sırasında derişimi bilinen bir maddenin değişik miktarları (protein tayini için B.S.A) seyreltici (su veya tampon) ile karıştırılıp aynı hacime getirip ve renklendirildikten sonra her birinin absorbans değeri okunarak grafik kağıdında derişime karşı absorbans grafiği çizilir. Daha sonra derişimi bilinmeyen aynı madde aynı şartlar altında renklendirilir ve bulunan absorbans değerine karşılık gelen derişimin standart eğrisi kullanılarak hesaplanır. Burada önemli nokta çalışmanın daima standart eğrinin doğrusal bölümünde yapılmasıdır. Eğer ölçümler doğrusal bölgeyi aşıyorsa seyreltme kullanılır ve bulunan sonuç seyreltme katsayısı ile çarpılır. UYGULAMA Çözeltiler 0,1 M Sitrat tamponu (ph 2,4) 1,5 x 10-3 M Bromfenol mavisi %95 Etanol Teknik Yedi adet deney tüpü alınır ve numaralandırdıktan sonra her bir tüpe aşağıdaki tabloda gösterilen ayıraçlar konularak karıştırılır. Çözeltiler (ml) Tüp No ,1 M Sitrat tamponu (ph 2,4) 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 1,5x10-3 M Bromfenol mavisi 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - %95 lik Etanol 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 - - Bilinmeyen ,0 Bromfenol mavisinin son derişimi (x10-5 M) 1,5 3,0 6,0 9, Her bir tüpte oluşan rengin şiddeti 430 nm dalga boyunda (neden 430 nm?) okunur. Okuma yapılmadan önce fotometrenin absorbans değeri örnek yerine su kullanılarak sıfıra ayarlanır (%100 transmitans değeri). Daha sonra bromfenol mavisinin değişik derişimlerine karşılık (tablodan hesaplanacak) bulunan absorbans değerleri grafik kağıdında işaretlenerek standart eğri çizilir. Bilinmeyen numunenin derişimi ise, kendisine ait absorbans değeri standart eğriden değerlendirilerek bulunur.

15 SPEKTROFOTOMETRE 11 Derişimlerin hesaplanışı: 1. tüp için; 2. tüp için 0, ,5x ,5x10 0, ,5x ,0x10 Not: Diğer bir hesaplama yöntemi ise sadece bir standart kullanılarak eğri çizilmeden yapılan hesaplama yöntemidir. Derişimi bilinen standart için AS değeri bulunur (AS = CS l) aynı işlem derişimi bilinmeyen örnek için yapılır. (AB = CB l) bu iki eşitlik birbirine bölünerek (AB = CS x AB / AS) formülünden derişim hesabı yapılır.

16 12 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N Laboratuvar Asit-Baz, ph ve Titrasyon 2 GENEL BİLGİ Kimyasal tepkimelerin çoğunluğu asit ve baz tepkimelerinden oluştuğundan asit ve baz kavramı kimyanın en önemli konularından biridir. Ayrıca yaşamın her döneminde karşılaşılan bileşikler sınıfından olan asit ve bazların (örneğin; sirkenin asetik asitin sulandırılmış çözeltisi, aspirinin de asetil salisilik asit olması gibi) başlıca özellikleri şunlardır: - Asit ve bazlar tepkimeye girerek tuzları verirler. - Asit ve bazlar katalizör etkisi gösterirler. - Asit ve bazlar ortamda indikatörle farklı renk verirler. - Asit ve bazlar kendilerinden daha zayıf olan asit ve bazları molekül haline dönüştürürler. Kimya tarihinin çeşitli dönemlerinde çeşitli asit baz tanımları yapılmış ve kullanılmıştır. İlk zamanlarda tadı ekşi olan maddelere asit (Latince acidus; ekşi) denmiştir. Asitlerin etkisini ortadan kaldıran, nötrleştiren maddelere ise alkaliler (Arapça alkali; bitki külü) ismi verilmiştir. Önceleri her asitin belli bir element oksijen (Yunanca oxus ekşi; genaz doğuran) içermesi gerektiğine inanılırdı da "Davy"nin, HCl'nin yalnız hidrojenle klordan oluştuğunu göstermesi sonucu bütün asitlerin temel bileşiminin hidrojen olduğu fikri kabul edilmiştir arasında Svante Arrhenius tarafından geliştirilen İyonların Ayrışması Teorisi sonucu asit ve bazların tanımlanması yapılmıştır. İyon Teorisi aynı zamanda asitlerin niçin farklı kuvvette olduğuna açıklık getiriyordu. Bu kavramın bir takım açmazları olması üzerine 1923 de Lowry-Brönsted ve yine 1923 de Lewis yeni bir asit baz kavramı geliştirmiştir. Arrhenius a Göre Asit ve Baz Kavramı Arrhenius a göre mavi turnusolü kırmızı yapan, bazı metallerle hidrojen açığa çıkaran, tadı ekşimsi, sıvı ortamına H + veren maddelere asit; kırmızı turnusolü mavi yapan, asitleri nötrleştiren, sıvı ortamına OH veren maddelere de baz denir. Bu kurama göre asit çözeltilerin kimyasal aktiflikleri ve iletkenlikleri, biri H + olan iyonlarına ayrışmasının sonucudur. HCl H + + Cl CH 3COOH CH 3COO + H + Farklı asitlerin kuvvetlerinin farklı olması bunların ayrışma derecelerinin de farklı olmasındandır. Çözeltiye hidroksil iyonu verdikleri kabul edilen bazların davranışı için de buna benzer bir açıklama yapılmaktadır. Diğer bir tanımlama ile asit özelliklerinden proton, baz özelliklerinden ise hidroksil iyonu sorumludur. NaOH (k ) Na + (sıvı) + OH (sıvı)

17 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N 13 Mg(OH) 2 (k) Mg ++ (sıvı) + 2 OH (sıvı) Bu kuram açıklamakta güçlük çektiği iki temel soru ile karşı karşıyadır. Birincisi protonun niteliği; ikincisi ise hidroksil iyonuna sahip olmadıkları halde baz özelliği gösterilebilen maddeler ile ilgilidir. 1) Suyun iyonik bileşikler için bu kadar mükemmel bir çözücü olmasının nedenlerinden biri, iyonların su moleküllerini kuvvetle çekmeleri ve kararlı hale geçmeleridir. Su molekülündeki yük dağılımının asimetrik olması yüzünden bu çekim kuvveti özellikle büyüktür. Sulu çözeltilerde her iyon su ile doymuş durumda bulunmaktadır. Diğer bir değişle su moleküllerini kuvvetle kendine bağlamış, bunlar tarafından sarılmıştır. Proton, çözücü moleküllerin elektronik sistemine diğer iyonlardan çok daha kolay ve fazla yaklaşabilmeli ve kendine bağlayabilmelidir. Başka bir deyişle, iyonların su ile doyduğu durumlarda proton çözücüye daha sıkıca bağlanmaktadır. Buna göre de asitlerin ayrışarak bağımsız protonlar vermesi beklenemez. Bu bilgiler ışığında H + iyonunu sulu çözeltilerde H 3O + olarak kabul edersek, ayrışma olayını yalnız aşağıdaki şekilde düşünemeyiz. HCl H + + Cl Asit ayrışmasını asitten çözücüye bir proton aktarılması olarak düşünmek gerçeğe daha yakındır. HCl + H 2O H 3O + (aq) +Cl (aq) Bu ise bizi asitin bir protona ayrışan değil, başka bir moleküle proton aktarabilen ya da verebilen madde düşüncesine yöneltir. 2) Arrheniusa kuramına göre oluşturulan asit ve baz tanımında ortaya çıkan ikinci güçlük, bütün baz özelliklerinin OH iyonlarından gelmesidir. Oysa OH iyonlarına sahip olmadıkları halde asitleri nötrleştiren bazı maddeler vardır. Örneğin, sıvı amonyak içinde aşağıdaki tepkime olmaktadır. HCl+NH 3 NH 4 +Cl Bilinen bir asitle tepkimeye girerek onu nötrleştirdiği için amonyağa bir baz gözüyle bakılabilir. Sodyum karbonatın (Na 2CO 3) ayrışarak doğrudan doğruya OH iyonları vermesi imkansızdır. Öyleyse asitler ve bazlar için Arrhenius un kuramında tanımlanandan daha geniş bir alanı kapsayan görüşe gereksinim vardır. Lowry-Brönsted e Göre Asit ve Baz Kavramı Bu teoriye göre proton verebilen tüm maddeler asit, proton alabilenler ise bazdır. Bir asit proton verdiği zaman kendisinin KONJUGE ÇİFTİ veya KONJUGE BAZI, bir baz da proton aldığı zaman kendisinin KONJUGE ÇİFTİ veya KONJUGE ASİTİ meydana gelir. Bu basit olarak şöyle gösterilebilir: Asit Baz + Proton

18 14 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N Proton çapı öteki iyonların çapından çok daha küçük (10 13 cm), yük yoğunluğu (yük/yarıçap) çok daha büyüktür. Etrafta bundan başka elektron tabakası olmaması ve protonun ortamda yalnız kalmaması nedeniyle muhakkak bir maddeye bağlanmalıdır. Bu madde de bazdır. Yukarıdaki denge tek başına kurulamayacağından ikinci bir denge daha kurulur. Bu iki denge aşağıdaki şekilde yazılır: Asit 1 Baz 1 + Proton Proton + Baz 2 Asit 2 Yukarıdaki dengelerin taraf tarafa toplanması ile de aşağıdaki eşitlik elde edilir. Asit 1 + Baz 2 Asit 2 + Baz 1 Buna göre bir asitle bir baz tepkimeye girerek yeni bir asit ve baz oluşur. Ancak; yeniden oluşan asit ve baz kuvvet bakımından tepkimeye giren asit ve bazdan çok farklıdır (Tablo 1). Tablo 1. Çeşitli asit-baz tepkimeleri. Asit 1 Baz 2 Asit 2 Baz 1 HCl + H 2O H 3O + + C1 H 2O + NH 3 NH + OH 4 H 2O + H 2O H 3O + + OH HCO + OH H 2O + - CO - 3 H 3O HCO H 3 2CO 3 + H 2O NH + HS H 4 2S + NH 3 Bu tanıma göre kuvvetli bir asit başka bir moleküle bir proton aktarmak için büyük bir eğilim, kuvvetli bir baz ise proton almak için büyük bir eğilim gösterir. Buna göre aşağıdaki tepkimede asitin kuvvetini, tepkimeye katılan maddelerin tepkime ürünlerine dönme yatkınlığının derecesine göre ölçeriz. 3 - HSO 4 + H 2O H 3O + + Asit 1 + Baz 2 Asit 2 + Baz 1 - SO 4 Tepkimenin ürünler yönünde ilerlemesi yalnız Asit 1 in kolayca proton kaybetmesine değil aynı zamanda Baz 2 nin bu protonu alma yatkınlığına da bağlıdır. Bu nedenle çeşitli asitlerin kuvvetini karşılaştırmak için bunların aynı baza proton verme eğilimlerini ölçmemiz gerekir. Çeşitli asitlerin suya proton verme yatkınlıklarına göre bunları asit kuvveti yönünden sıralamak olasıdır. Bir asitin kuvvetinin nicel ölçüsü, bu asitin ayrışma sabitidir.

19 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N 15 HA + H 2O H 3O + + A tepkimesi için, - [ H3O ][ A ] K [ HA] denge sabitidir. Bunlardan başka çözücü içindeki herhangi bir asitin kuvveti: - Asitin konjuge bazının kuvvetine, - Eritenin baz ile kuvvetine (Örneğin, HOAc zayıf bir asit olmasına karşın sıvı amonyak içinde süratle H + iyonu vererek kuvvetli asit olmakta; NH 3 ise süratle H + kabul ettiğinden kuvvetli baz olmaktadır.), 3) Eritenin dielektrik sabitesine (Yüksek dielektrik sabitesi olan bileşikler, karşıt yüklü parçacıklar arasındaki çekimi azaltır. Örneğin, su içinde ayrışma alkole oranla çok daha fazladır.) bağlıdır. G. N. Lewis in Asit ve Baz Tanımı Bir asit elektron alan veya elektron çiftini katabilen, bir baz ise elektron veren veya ortaklanmamış elektron çifti taşıyan bir maddedir. Bu tanıma asit ve bazların elektron tanımları denir. Böyle bir tanım susuz ortamda ve yüksek sıcaklıkta oluşan tepkimeleri açıklamakta çok yararlı ve daha genel bir tanımdır. Fakat analitik kimya tepkimeleri genellikle sulu ortamda gerçekleştiklerinden asit ve bazlar için Lowry ve Brönsted in proton tanımı kullanılır. Suyun İyonizasyonu İki su molekülü yeterli enerji ile çarpışırsa, su molekülleri H + ve OH e ayrışabilir. Diğer bir ifade ile su kendi kendine iyonize olabilir. H-O-H + H-O-H H 3O + + OH veya basitçe; H 2O H + + OH şeklinde yazılabilir. Suyun kendi kendine iyonizasyonu iki yol ile düşünülmektedir: - H + ve OH iyonları veren basit ayrışma ile - Brönsted in konjuge asit-konjuge baz çiftine dayanarak. Her iki durumda amfoter olan suyun H + ve OH iyonlarını verdiği hem proton alıcı hem de proton verici olduğu açıktır. Suyun iyonizasyonu aşağıda gösterildiği gibi AYRIŞMA SABİTİ (Kd), İYONİZASYON SABİTİ (Ki) ve SUYUN ÖZGÜL SABİTİ ile tanımlanabilmektedir. Basit Ayrışma Konjuge Asit Konjuge Baz HOH H + + OH HOH + HOH H 3O + + OH - - [H ][OH ] [H 3O ][OH ] Kd Ki 2 HOH [HOH]

20 16 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N Suyun iki konjuge asit-konjuge baz çifti oluşturduğuna dikkat etmelidir (HOH/OH ve H 3O + /HOH). H + nin (veya H 3O + ) her molü için 1 mol OH oluşturur. Saf suda [H + ] = 10-7 M, [OH ] = 10-7 M olduğuna göre HOH'nin molaritesi aşağıdaki gibi hesaplanabilir. Molekül Sayısı (H M Litre 2 O) Molekül Sayısı Ağırlık Moleküler (gr) Ağırlık Suyun bir litresi 1000 g ağırlığında olup molekül ağırlığı 18 dir. Buradan; 1000 /18(gr) M 1(L) 55.6 Suyun molaritesi gerçekte 55,6 M (orijinal derişimi), ya da 10-7 M'dır (iyonize miktarı). Bu miktar 55,6 M çok yakın olmakla birlikte 10-7 M ihmal edilebilir. Kd ve Ki ifadelerine yukarıdaki diğerleri uygulayabilir [10 ][10 ] [10 ] [10 ][10 ] [10 ] Kd Ki 2 3 [55,6] 55,6 [55,6] 3,09 10 Kd = 1,8x10-16 Ki = 3,24x10-18 Suyun molaritesi birçok biyokimyasal problemde dikkate alınan sulandırılmış çözeltilerde sabittir. Bu nedenle iki sabiteyi (Kd ve [H 2O] veya [H 2O] 2 ve Ki) birleştirerek suyun iyonizasyonu ya da ayrışması için yeni bir sabit tanımlayabiliriz (Kw) Kw = Kd x [H 2O] Kw = Ki x [H 2O] 2 Kw = (1,8x10-16 ) x (55,6) Kw = (3,24x10-18 ) x (55,6) 2 Kw = 1X10-14 = [H + ] [OH - ] Kw = 1x10-14 = [H 3O + ] [OH - ] ph ve poh ph bir çözeltinin hidrojen iyon etkinliğini kısa yoldan göstermektedir. Diğer bir ifadeyle çözeltinin hidrojen iyon etkinliği ölçütüdür. Bu tanımlamayla ph, hidrojen iyon etkinliğinin negatif logaritmasıdır. Benzer olarak poh, hidroksil iyon derişiminin negatif logaritmasıdır. 1 ph -log qh log poh -log qoh log - qh = -log H + [H + ] = -log OH [OH ] 1 -log γh [H ] log γoh 1 [OH 1 OH ] Asit ve bazların seyreltik çözeltilerde ve saf suda H + ve OH - aktiviteleri, derişimlerine eş olduğu düşünülebilir. ph -log [H 1 ] log [H ] - 1 poh -log [OH ] log - [OH ]

21 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N 17 Tüm sulu çözeltilerde suyun iyonizasyon dengesi sağlanmalıdır. Bu da [H + ] [OH - ] = Kw = 'dür. Böylece [H + ] bilindiğinde [OH - ] de kolayca hesaplanabilmektedir. Ek olarak ph ve poh arasındaki ilişki aşağıdaki biçimde de yazılabilir. [H + ] [OH ] = Kw eşitliğinin logaritması alınır ise, log[h + ] + log[oh ] = logkw -log[h + ] log[oh ] = -logkw -log[h + ] = ph, -log[oh ] = poh, -logkw = pkw ise, ph + poh = pkw Kw = pkw = -log = 14 ph + poh = 14 Böylece [H + ], [OH ], ph veya poh değerlerinden herhangi biri bilindiğinde diğer üçü kolaylıkla hesaplanabilmektedir. 0,1 M dan daha büyük H + ve OH derişimlerinde aktivite katsayıları göz önüne alınmalıdır. Bu ifadelerden de anlaşılacağı gibi ph nin 10 un kuvveti olduğudur. Bir ph birim farkının H + derişiminde 10 kat farklılık getireceği de akılda tutulmalıdır. ph 7 de çözeltiler nötrdür. ph 7 nin altındaki çözeltiler asitik, üstündekiler ise alkalidir. Zayıf Asit Çözeltilerinin ph sı Zayıf bir monoprotik asitin (HA) ayrışmasından eşit derişimlerde H + ve A oluşur. Eğer Ka ve HA nın başlangıç derişimi biliniyorsa [H + ] kolayca hesaplanabilir. [H ][A Ka [HA] 2 ] [H ] [HA] - [H ] Ka[HA] Yukarıdaki eşitlik iyonizasyon derecesinin [HA] nın değişmeden kalacak kadar çok küçük olduğunu kabul eder. ph yi veren bir tanım elde etmek için yukarıdaki eşitlik logaritmik forma çevrilir. log [H ] 1 2 log Ka[HA] 1 2 (log Ka log [HA]) - log Ka - log [HA] - log [H] veya 2 p p[ha] ph Ka 2 Burada p[ha], HA derişiminin (-) logaritmasıdır. Zayıf bazlar, için de benzer ilişkiler türetilebilir.

22 18 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N Henderson-Hasselbalch Eşitliği Zayıf bir asitin (HA), Ka sı ve zayıf asit çözeltisinin ph si veya zayıf bir bazın Kb si ve zayıf baz çözeltisinin poh ı ile ilgili yararlı bir eşitlik türetilebilir. Bu eşitlik Henderson Hasselbalch eşitliği olup bir zayıf asit ile onun tuzu, bir zayıf baz ile onun tuzunun bulunduğu çözeltilerin ph si ölçülür. - [H ][A ] Ka [HA] eşitlikte değişkenlerin yerini değiştirir isek, [HA] [H ] Ka - [A ] her iki tarafın logaritması alındığında, log [HA] log [H ] log Ka - log [A ] her iki taraf -1 ile çarpıldığında, [HA] - log [H ] -log Ka - log - [A ] veya [HA] ph pka - log - [A ] eşitliği ortaya çıkar. Aynı eşitlik poh için de türetilebilir. Herhangi bir zayıf baz MOH olarak simgelendiğinde eşitlik aşağıdaki gibidir. [MOH] poh pkb - log - [OH ] Konjuge asit ve konjuge baz çözeltileri eşit olduğunda ph = pka ve poh = pkb olduğuna dikkat edilmelidir. Aynı ilişki [A - ] = [HA], [H + ] = Ka ve [MOH] =[OH ], [OH - ] = Kb olduğunda orijinal Ka ve Kb tanımlarından da görülebilir. Yukarıdaki eşitliklere göre HA ve A içeren bir çözeltinin ph si derişiminden bağımsızdır. ph sadece konjuge bazın, konjuge asite oranı ile elde edilir. Bu tam doğru değildir. Konjuge baz/konjuge asit oranını belirleyici faktör olarak varsayılacaktır. Bu varsayım [A ] ve [HA], Ka ile karşılaştırıldığında yüksek olduğu fakat; aktivite katsayıları için düzeltimi sağlayacak kadar yüksek olmadığı sürece geçerlidir. Normal laboratuvar koşullarında bu durumla karşılaşılması için derişimlerin 0,1 M veya aşağısı, Ka değerlerinin 10-3 veya aşağısı olmalıdır. Normalite ve Titrasyon Normalite 1 litre çözeltideki bir asit ya da bazın ekivalans sayısı olarak tanımlanır ve aşağıdaki eşitlikte hesaplanır. NORMALİTE (N) ÇÖZÜNENİN EKİVALANSI ÇÖZELTİNİN LİTRESİ Sadece bir H + veya OH - veren bileşikler için (HCl, NaOH veya KOH gibi) normalite ve molarite aynıdır. Yalnız bir asit veya bazın 1 molü 2 veya daha fazla H + veya OH - verebildiğinden normalite molariteden farklı olur. En çok karşılaşılan vakalar H 2SO 4 ve

23 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N 19 H 3PO 4 dür. Bu olgularda çözeltinin normalitesi daima molaritesinden büyüktür. Örneğin, 0,5 M H 2SO 4 çözeltisi (1,0 litresi 49 g) 1,0 N dir (litresi 1,0 ekivalansdır). Titre Edilebilen Asitite ve Gerçek Asitite 10 ml 0,1 N HCl ile 0,1 N NaOH titre edildiğinde ekivalans noktasına, tam 10 ml NaOH harcandığı zaman gelinir. Aynı şekilde 10 ml 0,1 N Asetik Asit (HOAc) ile 0,1 N NaOH ın nötrleşmesi 10 ml 0,1 N NaOH ile gerçekleşir. Demek ki her iki tür asit de aynı molaritede olmak kaydı ile titre edilebilen asit miktarı aynıdır. Çünkü her ikisinde de fenolfitaleyin ile sonuca eşit miktar aynı normalitede baz kullanılarak gelinmiştir. Fakat bilindiği gibi HCl daha kuvvetli bir asittir. HOAc ise daha zayıf asittir. Birinci asit, bir damla elimize değdiğinde yakar iken diğerinde elde etki görülmez. HCl elektrik akımına daha geçirgendir; HOAc ise daha az iletkendir. HCl daha düşük derecede donar; HOAc e ise daha yüksek derecede donar. HCl sulu ortamda tamamen iyonize olur; HOAc kısmen iyonize olur. HCl H + + Cl - %100 HOAc H + + OAc - %1-3 Bu oranlardan da anlaşıldığı gibi titre edilen asitite ile H + iyon derişimi arasında fevkalade bir fark vardır. Titrasyon süresinde HCl üzerine NaOH eklenince serbest olan H + iyonu OH iyonu ile birleşerek su oluşur. Na + ve Cl iyonları tamamen iyonizedir. H 2O ise çok az iyonlaşan bir maddedir. Dolayısıyla titrasyonda ekivalans noktasında HCl çözeltisindeki tüm H + iyonları titre edilmiş olur. HOAc ise biraz önce belirtildiği gibi zayıf asit olup %1-3 arasında ayrışır. Bu kadar az oranda ayrışmasına rağmen NaOH eklenmesiyle NaOAc ile H 2O oluşacaktır. NaOAc da iyoniktir ve H 2O çok az ayrışır. Eklenen OH kuvvetli baz olduğundan çok az ayrışmış H + iyonu ile birleşir. Bu işlem, HOAc nin tamamının ayrışıp H + iyonlarının OH iyonları ile birleşmesine kadar devam eder. Böylece HOAc nin NaOH ile titrasyonunda HCl nin NaOH ile titrasyonundan titre edilebilir asitite yönünde fark olmaz. Titrasyon Derişimi bilinmeyen bir çözeltinin derişimini derişimi bilinen çözelti ile bulunmasıdır. Diğer bir tanımla derişimi bilinen bir çözelti ile bilinmeyen madde miktarını ekivalans noktasına kadar titre etmektir. Derişimi bilinen bu çözelti standart bir çözeltidir. Standart edilmiş bir tüpten karışım nötral olana değin eklenir. Bir asit-baz titrasyonu, tepkimeyi gösterecek hiç bir bulgu vermez. Bu yüzden nötral noktaya ulaşıldığında bize durmamızı söyleyecek bir şey eklememiz gereklidir. Bu amaçla karışımın ekivalans noktasında renk değişikliği veren indikatör denen maddeler eklenir. Bir indikatör, asitik çözeltide bir renk, alkali çözeltide başka bir renk olan organik bileşiktir. Bir titrasyonda nötrleştirme tepkimesini son noktaya kadar yaparız. Bu noktada eklenen asitin (veya bazın) ekivalanslarının sayısı, bilinmeyen çözeltideki bazın veya asitin ekivalanslarının sayısına eşittir. Böylelikle hesap yapmamızı sağlayacak uygun bir eşitlik kurabiliriz. Asitin ekivalans sayısı = Bazın ekivalans sayısı N asit x V asit = N baz x V baz Titrasyon Çeşitleri 1- Asit-Baz Titrasyonları a) Kuvvetli Asit-Kuvvetli Baz Titrasyonu

24 20 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N b) Zayıf Asit-Kuvvetli Baz Titrasyonu c) Kuvvetli Asit-Zayıf Baz Titrasyonu d) Zayıf Asit-Zayıf Baz Titrasyonu 2- Yükseltgenme-İndirgenme Esasına Dayanan Titrasyonlar 3- Çökelme Esasına Dayanan Titrasyonlar Asit-Baz Titrasyonları a)kuvvetli Asit-Kuvvetli Baz Titrasyonu Kuvvetli Asit-Kuvvetli Baz titrasyonunda ne katyon ne de anyon hidrolize olur. Çözeltinin ph si 7 dir. Bu titrasyon için 0,100 N HCl çözeltisinden 50,0 ml lik örnek 0,100 N NaOH çözeltisi ile titre edildiğinde, hem HCl hem de NaOH kuvvetli elektrolitler olduğundan düşünülebilecek tek denge su dengesidir. Titrasyon erlenindeki asitin orijinal 50,0 ml örneğindeki H + derişimi 0,1 M'dır (veya 10-1 M). Böylelikle ph 1 dir. Büretten 10,0 ml 0,100 M NaOH eklenmesinden sonra 0,100 N HCl nin 40,0 ml'lik ekivalanı nötralize olmadan kalır. Böylece titrasyon erlenindeki H + moleküllerin sayısı: mol H (0,1 mol H 40,0 ml x 1000 ml ) 4,0x10-3 mol H Eklenmesinden sonra toplam çözeltinin hacmi 60,0 ml dir (6,00x10-2 L). Böylece [H -3 4,0x10 mol H ] -2 6,0x10 L 6,67x10-2 M Büretten 50,0 ml 0,100 M NaOH eklendiğinde denge noktasına ulaşır. Tüm asit hidrolize olmuş ve ph 7'dir. NaOH çözeltisi, denge noktasının ilerisinde eklendiğinde titrasyon balonundaki çözelti artan şekilde alkali olur. Örneğin, 60,0 ml 0,100 M NaOH eklendiğinde çözeltinin 10,0 ml 0,100 M NaOH'nin ekivalansı: mol OH - 0,1mol OH 10,0 ml 1000 ml - 1,0x10-3 mol OH - 'dir. Bu noktada çözeltinin toplam hacmi 110,0 ml dir (11,0x10-2 L). Böylece; -3-1,0x10 mol OH [OH ] -2 11,0x10 L - poh = 2,04 ph = 11,96 Tablo 3 deki değerler bunun gibi hesaplamalardan elde edilmiştir. Tablo 3 ün verileri şekil 1 de gösterilmiştir. Denge noktası civarında eğrinin keskin olarak yükseldiğinde dikkat edilmelidir.

25 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N 21 Üç indikatörün renk değişim sınırları şekil 1'de gösterilmiştir. Her indikatör, sınırının altındaki ph lerde asit rengini, üstündeki ph lerde alkali rengini gösterir. Titrasyonda çözeltinin ph si eğri boyunca soldan sağa değişir. Titrasyonun son noktası indikatörün alkali rengine dönmesi ile saptanır. Üç indikatörden herhangi biri titrasyonda kullanılması tatmin edici olabilir. Her üçünün de renk değişim sınırları ph eğrisinin düz kısmına (bir damla NaOH çözeltisinin ph de keskin bir artışa sebep olduğu yerde) düşer. Tablo 3. 0,100 M NaOH ile 50,0 ml 0,100 M HCl nin titrasyonundan elde edilen ph değerleri. Eklenen 0,100 M NaOH Hacmi (ml) PH 0,0 1,00 10,0 1,18 20,0 1,37 30,0 1,60 40,0 1,96 49,0 3,00 49,9 4,00 50,0 7,00 50,1 10,00 51,0 11,00 60,0 11,96 70,0 12,22 80,0 12,36 90,0 12,46 100,0 12,52 Şekil 1. 0,100 M NaOH ile 50,0 ml 0,100 M HCl'nin titrasyon eğrisi. b) Zayıf Asit-Kuvvetli Baz Titrasyonu 50 ml 0,1 M asetik asit (CH 3COOH, zayıf bir asit) 0,1 M NaOH ile titre edildiğinde orijinal 50 ml asit örneğindeki H + iyonu derişimi asetik asitin denge sabiti kullanılarak hesaplanabilir. Tablo 4'te [H + ] = 1,34x10-3 M olduğu görülür. Böylece çözelti ph si 2,87'dir. 10 ml 0,1 M NaOH nin, 50 ml 0,1 M CH 3COOH çözeltisine eklenmesi sonucu oluşan çözelti, CH 3COO - iyonlarının bir karışımını içerdiğinden nötralize olmamış CH 3COO - ile birlikte nötralizasyonla oluştuğundan bir tampondur. Tablo C'de asetik asit çözeltilerinin iyonizasyon yüzdesi ve iyon derişimi. ÇÖZELTİNİN DERİŞİMİ [H + ] veya [CH 3COO - ] (M) İYONİZASYON YÜZDESİ 1,00 0, ,426 0,100 0, ,34 0,0100 0, ,18 0, , ,6

26 22 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N Bir tamponun ph si; [HA] ph pka - log - [A ] ilişkisi kullanılarak hesaplanabilir. Asetik Asit için pka 4,74 dür (1,8x10-5 in eksi logaritması). - [HC 2H 3O 2]/ C 2H 3O 2 oranı kolayca hesaplanabilir. 10,0 ml NaOH eklendikten sonra orijinal çözelti asitinin 40/50 si nötralize olmadan kalır. 10/50 si de sodyum asetat tuzuna çevrilir. Bu yüzden oran 4 e 1 dir. Böylece; [CH 3COOH] ph pka - log - [CH COO ] log (4/1) 4.14 Tablo M NaOH ile 50,0 ml 0,100 M CH 3COOH nin titrasyonundan elde edilen ph değerleri. PH Eklenen 0,100 M NaOH Hacmi (ml) 0,0 2,87 10,0 4,14 20,0 4,56 30,0 4,92 40,0 5,34 49,0 6,44 49,9 7,45 50,0 8,72 50,1 10,00 51,0 11,00 60,0 11,96 70,0 12,22 80,0 12,36 90,0 12, ,0 12,52 Şekil 2. 0,100 M NaOH ile 50,0 ml 0,100 M CH 3COOH nin titrasyon eğrisi. Denge noktasında asitin tümü nötralize olmuş; ve oluşan çözelti (100 ml) sodyum asetat da etkin olarak 0,05 M derişimindedir. Bu çözelti ph sinin hesaplanmasında C 2H 3O 2 - iyonunun hidrolizi dikkate alınmalıdır. Bu titrasyonun denge noktası ph 7 de oluşmamaktadır. Denge noktasından sonra NaOH eklenmesi çözeltinin artan derecede alkali olmasına neden olur. Eklenen OH iyonları hidroliz

27 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N 23 dengesini sola kaydırır. Bununla birlikte oluşan ters yöndeki hidrolizin ph ye etkisi ihmal edilir. Bundan dolayı bu noktadan sonraki hesaplar HCl-NaOH titrasyonu için olanların aynıdır. Bir CH 3COOH -NaOH titrasyonunun verileri tablo 5 de özetlenmiş olup, şekil 2 de de titrasyon eğrisi gösterilmiştir. Bu titrasyonun denge noktası bir önceki titrasyondan daha yüksek ph de oluşur ve denge noktası asit taraftan daha yüksek ph değerlerinde meydana gelir. Sonuç olarak eğrinin denge noktası civarındaki hızlı yükselen bölümünün uzunluğu azalmıştır. Şekil 2 den de anlaşıldığı gibi metil turuncusunun bu titrasyon için uygun indikatör olmadığını görülmektedir. Aynı ifade bromtimol mavisi için de kullanılabilir. Çünkü renk değişikliği 47,34 ml NaOH eklendikten sonra başlamakta ve 49,97 ml eklenene dek sürmektedir. Bu olgu bir titrasyon için çok keskin bitişe neden olduğundan, bu titrasyonda fenolfitaleyin uygun bir indikatör olacaktır. c)kuvvetli Asit-Zayıf Baz Titrasyonu Kuvvetli baz zayıf asit titrasyonunda belirlenen yaklaşımın genel çizgilerini takip ederek diğer titrasyon eğrileri çizilebilir. Bu tür titrasyonda metil turuncusunu indikatör olarak kullanılabilir. d)zayıf Asit-Zayıf Baz Titrasyonu Bu titrasyonda işlev gösterecek hiçbir uygun indikatör bulunamamıştır. Böyle titrasyonlar (zayıf asitler arasındaki) genellikle yürümez. Titrasyonlar potansiyometrik olarak yapılabilir. Örneğin, bir ph metrenin elektrotlarını analiz edilen çözeltinin içine sokarak bir titrasyon gerçekleştirilebilir. Başarılı ayıraç eklemelerinden sonra çözelti ph si saptanır. Titrasyonun denge noktası, ph de ani bir değişiklik ile belirlenir; fakat eklenmeler ve okumalar bu noktanın ötesindedir. Denge noktası, verilerin grafiğini çizerek ve titrasyon eğrisinin hızla yükselen bölümünün orta noktasına karşılık gelen hacmi hesaplayarak bulunabilir. Zayıf bir elektrolitin potansiyometrik titrasyonu elektrolitin ayrışma sabitini belirlemede önemli bir yöntem sağlar. [HA] ph pk - log - [A ] Elektrolitin pk sı, yarı nötralizasyonda çözeltinin ph sine eşit olduğundan ([HA]=[A - ] olduğu durumda), pk ve K nin kendisi titrasyon eğrisinin herhangi bir yerinden saptanabilir. İndikatörler Çok değişik amaçlı indikatör kullanımı vardır. Bunlar; - ph indikatörleri, - Redoks indikatörleri, - Kompleks indikatörleri, - Adsorbsiyon indikatörleri, - Derişim indikatörleri, - Çökelek indikatörleri, - Floresans indikatörleri.

28 24 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N İndikatörler arasında konumuz nedeniyle bizi ilgilendireni ph indikatörleri olduğundan burada sadece bu konudan söz edilecektir. ph indikatörleri, ph değişikliğinde çözeltide renk değiştiren, kompleks yapıda organik bileşiklerdir. ph indikatörleri çok çeşitli olup organik zayıf asit ve bazlardır. Asit indikatörler İndH, bazik indikatörler de İndOH şeklinde gösterilir. Buna göre ortamda aşağıda gösterildiği şekilde bulunurlar. İndH İnd + H + İndOH İnd + + OH İndH ve İnd farklı renklerde olduklarından ortamın rengini [İndH]/[İnd ] belirler. Gözün ayırt edebileceği oran yaklaşık 1/10-1 olduğundan, göz renklerin her orandaki karışımını ayırt edemez. Bundan dolayı bir indikatörün etkin olduğu ph aralığı aşağıdaki şekilde bulunabilir. [İndH] ph pki - log - [İnd ] 1 ph pki - log ph pki -1 dir. Bu eşitlik sonucu bir indikatör pki 1 aralığında kullanılır. Bu da bir ph indikatörünün ancak 2 ph aralığında kullanılabileceği anlamına gelir. İndikatörlerin pki si farklı olduğundan 0-14 aralığındaki ph yi ölçmek için çeşitli indikatörler kullanılır. Çeşitli indikatörler tablo 6 da gösterilmiştir. Tablo 6. Bazı ph indikatörlerinin kullanım derişimleri, renk değişimi ve ph aralığı. İndikatör Çözücü Derişim % İndikatörün Yapısı Asit şekli Renk Baz şekli ph aralığı Alizarin sarısı Su 0,1 Asit Sarı Menekşe 10,1-12,0 Timolfitalein %90 alkol 0,1 Asit Renksiz Mavi 9,3-10,5 Fenolfitalein %60 alkol 0,1 ve 1,0 Asit Renksiz Kırmızı 8,2-9,6 Kresol moru %20 alkol 0,05 Asit Sarı Mor 7,4-9,0 Nötral kırmızı %60 alkol 0,1 Bazik Kırmızı Sarı-Kahverengi 6,8-8,0 Fenol kırmızısı %20 alkol * 0,1 Asit Sarı Kırmızı 6,4-8,0 Bromtimol mavisi %20 alkol ** 0,05 Asit Sarı Mavi 6,0-7,6 Litmus (azolitmin) Su 1,0 Asit Kırmızı Mavi 5,0-8,0 Metil kırmızısı %60 alkol 0,1 ve 0,2 Bazik Kırmızı Sarı 4,2-6,2 Metil turuncusu Su 0,1 Bazik Kırmızı Sarı 3,1-4,4 Bromfenol mavisi Su 0,1 Asit Sarı Mavi 3,0-4,6 Tropeolin 00 Su 0,01, 0,1, 1,0 Bazik Kırmızı Sarı 1,4-3,2 Kristal menekşesi Su Yeşil Menekşe 0,0-2,0 * Veya her bir 100 mg indikatör için 5,7 ml 0,05 N NaOH içeren sulu çözelti. ** Veya her bir 100 mg indikatör için 3,2 ml 0,05 N NaOH içeren sulu çözelti.

29 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N 25 Bu maddelerin çözeltileri kullanılacağı gibi sünger kağıdına emdirilip kurutulmuş biçimleri de kullanılır. Timol mavisi gibi indikatörlerin iki Ki si olduğundan bu gibi indikatörler hem asitik, hem de bazik alanda kullanılır. İndikatörler ile ph nin belirlenmesinde bir takım hatalar yapılmaktadır. Aşağıda sıralanan bu hatalar çözeltinin iyonik şiddetinin arttıracağından indikatörün fazla iyonlaşarak farklı renk göstermesine neden olacaktır. Bunlar: - Ortamda yabancı tuzların bulunması, - Ortamda çözücü olarak sudan başka çözücülerin de bulunması, - Ortamda koloidal taneciklerin bulunması, - Ortamda yükseltgen ve indirgenlerin bulunması, - Ortamın bulanık olmasıdır. UYGULAMA Yöntem ve Gereçler Gereçler - Büret (50 ml) ml lik erlen (2 adet) - Değişik kapasitelerde pipetler - Damlalık - ph ölçüm çubukları veya ph metre Ayıraçlar - 0,100 N HCl: %39 luk HCl asitten 7,8 ml alınıp 1 litreye saf suyla tamamlanarak elde edilir. - 0,100 N NaOH: Sodyum hidroksitte karbonat bulunduğundan ve sodyum hidroksitin su emme özelliğinden dolayı analitik terazide tartarak standart eriyik elde etmek imkansızdır. Bundan dolayı sodyum hidroksitin doymuş eriyiğinden istenilen 0,100 N NaOH standardı hazırlanır. Bunun değeri hazırlanmış ön standart 0,100 N Potasyum Asit Fitalat ile titre edilerek tayin edilir. - 0,100 N CH 3COOH: %96 lık asetik asitten 6,0 ml alınıp 1 litreye saf suyla tamamlanarak elde edilir. Tam 0,100 N yapmak için ayarlı bir çözeltiyle hassas olarak titre edilir. - Fenolfitalein: 0,5 g fenolfitalein 100 ml %60 lık alkol içinde eritilerek hazırlanır. - Metil kırmızısı: 0,1 g metil kırmızısı 100 ml %60 lık alkol içinde eritilerek hazırlanır. Yöntem Kuvvetli asit-kuvvetli baz titrasyonu - Büretteki çözelti damlatmasını önlemek için büret musluğundaki tıpa çıkarıldıktan sonra iyice silinip yağlanarak yerine tekrardan takılır. - 0,100 N NaOH bir miktar bürete konur. Birkaç damla çözelti büretin musluğundan akıtıldıktan sonra musluk kapatılıp yatay bir konumda elde çevrilerek durulanır. Bu olay üç kez tekrarlanır. - Büret NaOH ile doldurulur. Sıvı seviyesi tam sıfırın üzerine getirilir. Cıva hariç birçok sıvı ince bir borunun içinde iç bükey yüzey konumundadır. Bu nedenle sıvı yüzeyinin, büretin sıfır çizgisinden geçen düzleme teğet olması gerekir. Ayrıca dikkat edilecek nokta, büreti ayarlar iken büretin sıfır çizgisi ile gözün aynı hizada olmasıdır.

30 26 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N - 0,100 N HCl den 100 ml lik erlen içine 25,0 ml konur ve içine 2-3 damla fenolfitalein damlatılır. - Titrasyon sırasında kuvvetli asit ve bazın değişik miktardaki karışımlarında ph ölçümü ve indikatör değişimi gözlenir. Bu amaçla çözeltiler tablo 7'de gösterilen miktarlarda eklenerek elde edilen karışımın ph si ph metre (ya da ph ölçüm çubukları) ile ölçülüp kuramsal hesaplamalarda elde edilen değerlerle karşılaştırılır. Her iki ölçüm sonucun (ph metre ölçümü ile kuramsal hesaplamalar sonucu elde edilen) verileri kullanılarak titrasyon eğri grafiği çizilir. Aşamalar Tablo 7. Her aşamada büretten erlene aktarılacak 0,100 N NaOH hacmi. Erlendeki 25 ml 0,100 N HCl ye eklenecek 0,100 N NaOH hacmi (ml) Erlene eklenen toplam 0,100 N NaOH hacmi (ml) 1 2 2,5 2,5 3 5,0 7,5 4 5,0 12,5 5 5,0 17,5 6 2,5 20,0 7 2,5 22,5 8 2,5 25,0 9 2,5 27,5 - Gerçekte titrasyona (büretten NaOH eklenmesine) çözeltinin pembe rengi 30 saniye sabit kalana dek devam edilir. Kuvvetli asit-kuvvetli baz titrasyonunda ekivalans noktasının ph aralığı geniş olduğundan burada kullanılan indikatör, ph aralığı 8,2-9,6 olan fenolfitaleindir. - Titrasyon sonucu derişimini ayarlamak istediğimiz çözeltinin derişimi aşağıdaki eşitlik kullanılarak hesaplanır. V 1 x N 1 = V 2 x N 2 V 1: Erlene konulan HCl nin hacmi (25,0 ml) N 1: HCl nin bulunması gereken derişimi (yaklaşık 0,100 N olacağını biliyoruz) V 2: Harcanan (büretten akıtılan) NaOH nin hacmi N 2: NaOH nin derişimi (0,100 N). Zayıf asit-kuvvetli baz titrasyonu - Kuvvetli asit-kuvvetli baz titrasyonunda anlatılanlar aynen tekrarlanır. Ancak; 100,0 ml lik erlen içine 25,0 ml normalitesi yaklaşık 0,100 N olan asetik asit konur. Ayrıca; bu deney için belirlenen çözeltiler aşağıdaki tabloda gösterilen miktarlarda konularak deney ve hesaplamalar aynı kuvvetli asit-kuvvetli baz titrasyonundaki gibi yapılır. - Anlatılan her şey indikatör olarak fenolfitalein yerine metil kırmızısı kullanılarak tekrarlanır. - Her iki deneyde de asetik asitin istenilen derişimde olup olmadığı V 1 x N 1 = V 2 x N 2 eşitliği kullanılarak bulunur.

31 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N 27 V 1= 25,0 ml asetik asitin hacmi N 1= Asetik asitin bulunması gereken derişimi V 2= Büretten harcanan NaOH ın hacmi (ml) N 2=NaOH ın derişimi (0,100 N) Aşamalar Tablo 8. Her aşamada büretten erlene aktarılacak 0,100 N NaOH hacmi. Erlendeki 25 ml 0,100 N CH 3COOH ye eklenecek 0,100 N NaOH hacmi (ml) Erlene eklenen toplam 0,100 N NaOH hacmi (ml) 1 2 2,5 2,5 3 5,0 7,5 4 5,0 12,5 5 5,0 17,5 6 2,5 20,0 7 2,5 22,5 8 2,5 25,0 9 2,5 27,5 Örnek Problemler Çözeltilerin normalitesi istediğimiz normaliteden yani 0,100 den düşük veya yüksek çıkar ise bunu tam 0,100 N yapmak için aşağıdaki örneklerde verilen işlemler yapılır. Örnek 1) HCl nin normalitesi istenilenden küçük ise (örneğin 0,08 N) ayarlama şu şekilde yapılır. Şişenin içerisinden 100,0 ml kullanmış olalım geriye 900,0 ml 0,08 N HCl kalmıştır. Normalitesi bilinen stok HCl den (10,0 M) ne kadar ekleyeceğimiz aşağıdaki eşitlikten hesaplanır. (V 1 x N 1) + (V 2 x N 2) = N 3 x V 3 N 1= HCl nin hesaplana normalitesi (0,08 N) V 1= Ayarlanmak istenen HCl nin hacmi (900,0 ml) N 2= Stok HCl nin derişimi (10,0 M) V 2= Eklenecek stok HCl nin bilinmeyen miktarı N 3= İstenilen normalite V 3= İstenilen hacim V 2= 2,8 ml dir. Buna göre 10,0 M HCl den alınan 2,8 ml sıvı, elimizdeki 900,0 ml HCl içine eklenip 1 litreye saf su ile tamamlandığında 0,100 N HCl elde edilmiş olur. Örnek 2) HCl nin normalitesi istenilenden (0,100 N) yüksek çıkmış ise (örneğin 0,130 N) aşağıdaki formül uygulanarak derişim istenilene ayarlanır. N 1 x V 1 = N 2 x V 2 0,130 x 900 = 0,100 x V 2 V 2 = 1170 ml

32 28 A SİT-BAZ, p H v e T İ T R AS Y O N = 270 ml saf su 0,130 N HCl ye eklendiğinde tam 0,100 N HCl elde edilmiş olur. Ancak tam değerin tekrar kontrol edilmesi için bir titrasyon daha gereklidir. KAYNAKLAR 1. Segel, Irwin H. Biochemical Calculations. Canada, John Wiley Sons, Inc Fesseden, Ralph J. Basic Chemistry For The Health Siences. Massachusetts, Allyn and Bacon, Inc Mahan, Bruce H. University Chemistry. Masschusetts, Addison-Wesley Publishing Company, Mortimer, Charles E. Chemistry: A Conceptual Approach. New York, D. Van Nostrand Company, Skoog, Douglas A. and West, Donalt M. Fundamentals Of Analytical Chemistry. New York, Holt, Rinehart and Winston, Inc Hamilton, Leicester F., Simpson, Stephen G., Ellis, Dawiv W. Tokya, Kojakusha Co., Ltd., 1969.

33 KARBOHİDRATLAR 29 Laboratuvar Karbohidratlar 3 GENEL BİLGİ Karbohidratlar, potansiyel olarak aktif aldehit keton grubu içeren polihidroksi alkoller veya hidroliz edildiklerinde bu bileşikleri veren maddelerdir. Yapılarında başlıca C, H, O bulunur. Üç ana gruba ayrılırlar. - Monosakkaritler - Disakkaritler - Polisakkaritler 1- Monosakkaritler: Karbohidratların temel yapı taşlarıdır. İki grupta incelenirler. a) Aldozlar: Aldehit grubu içeren monosakkaritlerdir. b) Ketozlar: Keton grubu içeren monosakkaritlerdir. Her iki grup da 3-9 arasında C iskeletten oluşurlar. Dihidroksi aseton dışında asimetrik C atomu içerirler. 3 karbonlu bileşikler triozlar olarak adlandırılır. Gliseraldehit bir aldoz, dihidroksi aseton ise bir ketozdur. 4 karbonlu bileşikler, tetroz olarak adlandırılır. Eritroz bir aldoz, eritruloz ise ketozdur. 5 karbonlu bileşikler pentozlar olarak adlandırılır. DNA ve RNA'daki ozlar pentoz olup aldoz yapıdadır. Riboz RNA'nın, deoksiriboz ise DNA'nın şekeridir. Ketozlara örnek olarak ksilüloz örnek verilebilir. 6 karbonlu bileşikler, heksozlar olarak bilinmektedir. Glukoz, galaktoz, mannoz, bir aldoheksoz; fruktoz ise bir ketoheksozdur. Glukoz Galaktoz Mannoz Fruktoz Canlı organizmalarda ana enerji kaynağı glukozdur. Açlık kan şekeri (AKŞ) normal sınırları (10-12 saatlik açlıktan sonra) Folin-Wu yöntemi göre mg/dl, glukoz oksidaz yöntemiyle mg/dl düzeyindedir. Glukoz oksidaz yönteminde gerçek glukoz ölçüldüğünden kan şekeri daha

34 30 KARBOHİDRATLAR düşük değerde bulunmaktadır. Bugün artık AKŞ'den ziyade serum glukoz düzeyine bakılmaktadır. Diğer şekerler glukozun izlediği metabolik yolların ara basamaklarına girerek metabolize olmaktadır. Galaktoz süt şekeri içinde bulunurken; fruktoz meyva şekeri olarak bilinir; çay şekerinin yani sükrozun yapısında bulunur. 2- Disakkaritler : 2 monosakkaritin ardarda su çıkışı ile O-glikozidik bağ yaparak birleşmesi ile oluşan karbohidratlardır. Örnekler: a) Sakkaroz (=Sükroz: -D-Glukoz + ß-D-Fruktoz): Glukoz ve fruktoz birimlerinden meydana gelir. Çay şekeri olarak adlandırdığımız disakkarittir. Besinlerle alınan karbohidratlar arasında miktar olarak ikinci yüksek şekerdir. İndirgen özellik göstermez. Bu nedenle, indirgenmeyükseltgenme tepkimesine dayanan şeker tayin yöntemleriyle tepkime vermez. Ancak hidroliz edilip serbest glukoz ve fruktoza ayrıldığında, bu şekerlerin tepkimeye girmesi ile pozitif yanıt alınır. Sakkaroz b) Maltoz ( -D-Glukoz + -D-Glukoz): -D-Glukoz birimlerinin 2 tanesinin birleşmesiyle meydana gelmiştir. Glukoz moleküllerinden birisinin aldehit grubunun serbest olması nedeniyle indirgenme-yükseltgenme temeline dayanan tayin yöntemleri ile tepkime verir. Maltoz c) Laktoz ( -D-Glukoz +ß-D-Galaktoz): Glukoz ve galaktoz monosakkaritlerinden meydana gelmiştir. Süt şekeri olarak bilinir ve indirgen özelliktedir. d) Sellobioz (ß-D-Glukoz +ß-D-Glukoz): Selülozun temel birimlerini oluşturur. ß- Glukoz birimlerinden meydana gelmiştir. Laktoz Sellobioz

35 KARBOHİDRATLAR 31 Besinlerle alınan disakkaritlerin emilebilmesi için barsakta hidroliz olarak monosakkaritlere ayrışmaları gereklidir. Ancak sellobioz ß-D-glukoz birimlerin birleşmesi ile oluştuğundan insanda bu yapıyı hidroliz edebilecek bir enzim mevcut değildir. 3- Polisakkaritler Uzun zincirli monosakkarit polimerleridirler. Çatısal özelliklerine göre 2 alt gruba ayrılırlar. A- Homopolisakkaritler, tek tip monosakkaritin O-glikozidik bağ ile ardarda birleşmesi ile oluşmuşlardır. Önemli homopolisakkaritlerin özellikleri: 1- Nişasta: Bitkisel karbohidrat depo maddesidir. Nişastayı oluşturan -Glukoz birimleri birbirlerine O-glikozidik bağları ile 1-4 ve 1-6 karbon atomları arasında su çıkışı ile bağlanır. İndirgen değildir. Vücutta emilebilmesi için glukoz birimlerine hidrolizi gerekir. Bu ise tükrük bezleri ve pankreastan salgılanan amilaz enzimi ile sağlanır. Nişasta, iyot ile mor renkli kompleks oluşturur ve kalitatif tayin amacı ile kullanılır. Nişasta 2- Glikojen: Hayvansal karbohidrat depo maddesidir. Nişastaya benzer biçimde -D- Glukoz birimlerinden oluşmuştur. O-glikozidik bağlanmalar 1-4 ve 1-6 karbonlar arasındadır. Nişastadan farklı olarak bu 1-6 dallanmaları çok daha sıktır. Amilaz enzimi yardımı ile glukoz birimlerine parçalanır. İyot ile kırmızı-siyah renkli kompleks oluşturur. 3- İnulin: Fruktoz polimeridir moleküler ağırlığındadır. Enginar ve hindiba bitkilerinin köklerinde bulunur. Hayvansal organizmalarda hidroliz edilmeden idrar ile atılır. Bu nedenle böbrek fonksiyon testi olarak kullanılmaktadır. 4- Selüloz: 1-4 karbon atomlarının O-glikozidik bağ ile birleşmesi ile oluşan ß-D-Glukoz polimeridir. Mide-barsak sisteminde selülozu hidroliz edecek enzim sistemi bulunmağından, insan tarafından enerji kaynağı olarak yararlanılamaz; ama önemli bir "kütle" kaynağıdır. Dünyada en çok sentezlenen biyomoleküldür. B- Heteropolisakkaritler: Şeker türevi maddelerin de karışmasıyla birden fazla tipte birimin polimerizasyonuyla oluşturduğu bileşiklerdir. Kan grubu antijenleri, kıkırdak dokusu bileşikleri,

36 32 KARBOHİDRATLAR bakteri hücre duvarı bu tür biyomoleküllerden oluşur. Karbohidratların Vücuttaki Metabolizması Ağızdan alınan karbohidrat nişasta veya glikojen ise önce tükürükte bulunan enzimler (pityalin=tükrük -amilazı) ile hidroliz edilerek nişasta molekülünden maltoz birimleri ayrılmaya başlar. Midede karbohidratları hidroliz edecek enzim yoktur. Karbohidratların sindirimi için gerekli en önemli salgı pankreastan gelir, ekzokrin (dış) salgıyla -amilaz enzimini ince bağırsağa boşaltır. Ancak amilaz şekerlerin emilimleri için yeterli değildir, tüm şekerlerin monosakkaride dönüşmesi lazımdır. Bu amaçla ince bağırsakta maltozu parçalamak için maltaz; sakkarozu parçalamak için sükraz; laktoz parçalamak için laktaz enzimi bulunmaktadır. Monosakkarit halinde emilen şekerler Vena Porta (portal ven) aracılığıyla karaciğere gelir. Glukoza çevrilir veya metabolik yollarda kullanılır. Beyin ve sinir hücreleri, eritrositler enerji kaynağı olarak glukozdan yararlanabilirler. Glukoz; 1. Enerji gereksinimi için Embden-Meyerhof yoluyla GLİKOLİZ e uğrar. Glukoz sitoplazmada bu yol ile PİRÜVAT'a çevrilir. 2. Ortamda oksijen varsa pirüvat, CO2'ye dönüşür. Mitokondride gerçekleşen bu yola KREBS DÖNGÜSÜ (Trikarboksilik Asit Döngüsü) denir. Bu 2 basamak sayesinde vücut enerji gereksinimleri için ATP (Adenosin trifosfat) sağlar. 3. Eğer enerjiye gereksinim yoksa fazla oluşmuş ise glukoz glikojene çevrilir. Bu olaya GLİKOJENEZ denir. 4. Şayet glukoz azalmış, ama glikojen varsa organizma bu glikojeni glukoza geri çevirir. Buna GLİKOJENOLİZ denir. Bu olay karaciğer ve kaslarda gerçekleşir. 5. Eğer ortamda yeterli glikojen kalmamış ise organizma, başka maddelerden glukoz yapmaya çalışır. Proteinleri oluşturan aminoasitler, pirüvat, laktoz, gliserol karaciğerde glukoza döndürülmeye çalışılır. Buna GLUKONEOGENEZ denir. 6. Glukozun direk girdiği önemli bir yolda PENTOZ-FOSFAT ŞANTI dır. Bu yolun amacı: a) Vücutta yağ sentezi, steroid sentezi için gerekli NADPH'lerin (indirgenmiş Nikotinamid dinükleotidfosfat) üretilmesidir. b) Riboz ve deoksiriboz gibi değişik şekerlerin sentezidir. UYGULAMA Karbohidratların Genel Tepkimeleri Deneylerde Kullanılacak Şekerler %5 Glukoz %5 Fruktoz %5 Laktoz %5 Sakkaroz %5 Arabinoz %5 Nişasta

37 KARBOHİDRATLAR Genel Karbohidrat Tanımlanması( Molisch Tepkimesi) Prensip Karbohidratların genel tanıma tepkimesi olup tüm karbohidrat yapısındaki bileşikler bu tepkimeyi verirler. Karbohidratların asitli ortamda oksitlenip furfarallere çevrilir. Bu bileşikler değişik aromatik alkollerle farklı renk tepkimeleri oluşur. Tüm furfural türevlerin -naftol ile pembe-mor renk vermesine dayanır. Ayıraçlar - Molisch Ayıracı: 10 g -naftol bir miktar alkolde çözüldükten sonra 100 ml ye alkol ile tamamlanır. - %98 H2SO4 Teknik Bir deney tüpüne 2-3 ml şeker çözeltisinden konup üzerine 5-6 damla Molisch ayıracından ilave edilerek karıştırılır. Musluk altında soğutulan tüp içeriğinin üzerine dikkatle tabaka teşkil edecek şekilde %98 lik H2SO4 ten (yaklaşık 1mL) konulur, karbohidrat varlığında çözelti ile H2SO4 tin temas yüzeyinde pembe-mor halka oluşur. Karbohidratları tanımlamak için kullanılır. 2- İndirgen Karbohidratların Tanımlanması(Benedict Tepkimesi) Prensip Serbest aldehit ve keton grubu içeren karbohidratların yükseltgenme özelliğinden yararlanır. Alkali ve sıcak ortamda aldehit grupları karboksil grubuna yükseltgenirken ortamda bulunan CuSO4 indirgenerek Cu2O ya dönüşür ve tuğla kırmızısı çökelek oluşur. Ayıraçlar -Benedict Ayıracı: A: 17,.3 g CuSO4 bir miktar suda çözülerek 100 ml ye arık su ile tamamlanır. B: 173 g sodyum-sitrat ve 100 g Na2CO3 susuz 800 ml arık su içinde ısıtılarak eritilir. Soğuduktan sonra A çözeltisi B çözeltisine çalkalanarak ilave edilir. Daha sonra bir litreye arık su ile tamamlanır. Teknik Bir deney tüpüne Benedict ayıracından 5 ml konulup üzerine 8-10 damla şeker çözeltisinden ilave edilir. Bu karışım alevde kaynatılınca mavi renkli çözelti şeker miktarına bağlı olarak tuğla kırmızısına bulanıklık ve çökeleğe dönüşür. Serbest aldehit ve keton grubu içeren bütün karbohidratlar bu tepkimeyi verirken, disakkaritlerden sakkaroz ve polisakkaritler tepkime vermezler. 3- Pentozların Tanımlanması (Bial Testi) Prensip Pentozlar asitli ortamda ısıtıldığında furfural oluşurken, heksozlar asitli ortamda ısıtıldıklarında hidroksimetilfurfuraller meydana gelir. Bial ayıracı içerisindeki orsinol ile sadece pentozların furfuralleri tepkime verirler. Böylece pentozlar heksozlardan ayırt edilebilir. Furfural

38 34 KARBOHİDRATLAR Ayıraçlar Bial Ayıracı: 1,5 g orsinol 500 ml derişik HCl içerisinde çözülerek içerisine damla %10 luk demir III klorür (FeCl3 ) ilave edilir. Teknik Bir deney tüpüne 5 ml bial ayıracından konur, üzerine iki damla şeker çözeltisi ilave edilerek dikkatle kaynatılır ve soğutularak oluşan renk kontrol edilir. Pentozlar bial ayıracı ile kaynatıldığında renk oluşmadığı halde soğumaya başlayınca yeşil renk veya çökelti oluşur. - Ketoheksozların Tanımlanması(Seliwanoff Testi) Prensip Heksozlar asit ortamda ısıtıldıklarında hidroksimetilfurfural türevleri oluşur. Ketoheksozlar bu tepkime daha hassastır. Aldoheksozlar ise daha geç dönüşmektedir. Seliwanoff ayıracındaki rezorsinol ile ketoheksozların furfural türevleri pembe renk verdikleri için aldoheksozlardan kolaylıkla ayrıştırılırlar. Hidroksimetilfurfural Ayıraçlar Seliwanoff Ayıracı: 0,05 g resorsinol 100 ml %12 lik HCl içerisinde çözülür. Teknik Bir deney tüpüne 5 ml seliwanoff ayıracı konulur, üzerine 4-5 damla şeker çözeltisi ilave edilerek kaynatılır, kırmızı renk oluşur. Şeker çözeltisinin derişimi fazla ise kırmızı çökelek oluşur, bu çökelti soğuduktan sonra alkolde çözülürse daha parlak bir renk oluşur. Fruktoza özel olan bu test, sakkarozun hidrolizi ile oluşan fruktozu tanımlamada ve hidrolizin tam yapılıp yapılmadığını kontrol etmede kullanılır. Galaktoz Varlığının Gösterilmesi 5- Musik Asit Testi Prensip Monosakkaritler asitlerle furfural türevlerine dönüştükleri halde heksozlar HNO3 ile uzun süre kaynatılınca şeker asitlerine dönüşürler. Heksozların primer alkol ve aldehid grupları oksitlenerek karboksil grubuna dönüşür. Bu şekilde oluşan şeker asitlerinden sadece galaktoz ve laktoz suda erimeyen musik asite dönüşür.

39 KARBOHİDRATLAR 35 Ayıraçlar %65 HNO3 Teknik Şeker çözeltisinden 50 ml alınarak bir behere konulur. Çeker ocakta üzerine 12 ml derişik HNO3 ilave edilerek kaynar su banyosunda 10 ml kalıncaya kadar ısıtılır. Soğuyunca 10 ml su ilave edilip bir gece bekletildiğinde iğne şeklinde musik asit kristalleri oluşur. 6- Hidroliz Prensip Disakkaritler ve polisakkaritler %10 luk HCI ile ısıtıldıklarında kendilerini meydana getiren monasakkaritlere ayrılırlar. Asit derişimi %10 dan düşükse hidroliz gerçekleşmez. Eğer derişik asit kullanılacak olursa furfural türevleri oluşacaktır. Hidroliz neticesinde oluşan monosakkaridler kendilerine özgü tepkimelerle tanımlanarak hidrolizin tam yapılıp yapılmadığı ve karbohidratın yapısı tanımlan kontrol edilir. Ayıraçlar %10 luk HCI %10 luk NaOH Teknik Bir deney tüpüne 5 ml %5 lik şeker çözeltisi konulup üzerine 1 ml HCI ilave edilerek kaynar su banyosunda 3 dk kaynatılır. Tüp soğuyunca 1 ml %10 luk NaOH ile nötralize edilir. Hidrolizi izleyebilmek için daha sonra nötralize edilmiş çözeltiden belirli kısım ayrılarak her şeker kendisine özgü tepkime ile test edilir. 7- Osazon Testi Prensip Serbest aldehit ve keton grubu içeren şekerler fenil hidrazin ile tepkimeye girip bir molekül H2O kaybederek önce fenil hidrazona dönüşürler. Fenilhidrojen yapılar tekrar fenil hidrazin ile tepkimeye girerek osazonları verir ve sarı renkli kristaller oluştururlar. Osazon kristallerinin görüntüsü şekerin cinsine göre farklı olur. Karbohidratların ilk iki karbonu fenil hidrazine bağlandığı için glukoz, fruktoz ve mannozun geriye kalan dört karbonu aynı konfigürasyona sahip olduklarından aynı osazon kristallerini verir. Yapısında serbest aldehit ve keton grubu bulunmayan sakkaroz ve polisakkaridler ise osazon oluşturamazlar. Glukoz, fruktoz ve mannozun osazon kristalleri ekin demeti şeklinde, galaktozun ( laktoz ) Osazon oluşumu

40 36 KARBOHİDRATLAR atkestanesi şeklinde ve pentozun ise iğne tepkime biçimindedir. Ayıraçlar -Fenil hidrazin klorhidrat -Sodyum asetat Teknik Bir çakı ucu kadar fenil hidrazin klor hidrat deney tüpüne konulur. Üzerine bir çakı ucu kadar sodyum asetat eklenir. Bunun üzerine 10 ml şeker çözeltisi konarak en az 5 dk. kaynatılır. Hareket ettirmeden çeşme altında soğutulur. Tüpün alt kısmında sarı renkli kristaller oluşur, kristaller süzülerek lam-lamel arasında mikroskopta incelenir. 8. İyot Testi Prensip Polisakkaritlerin iyot çözeltisi ile verdiği renk tepkimesi esasına dayanır. Bu renk şiddeti polisakkaritin zincir uzunluğu ile orantılıdır. Nişasta Mavi Amilodekstrin Mor Eritrodekstrin Kırmızı Maltoz Sarı Glukoz Sarı Ayıraçlar İyot: Bir cam havanda 0,5 g potasyum iyodür 10 ml saf suda eritilip üzerine 0,25 g iyot ilave edilerek eritilir,100 ml ye saf suyla tamamlanır. Teknik Bir deney tüpüne 2 ml şeker çözeltisinden konup üzerine 3 damla iyot çözeltisinden ilave edilip oluşan renk izlenir. Testler %1 Nişasta %5 Glukoz %5 Fruktoz %5 Laktoz %5 Sakkaroz %5 Arabinoz Molisch Benedict Bial Seliwanof Hidroliz öncesi Hidroliz sonrası Osazon Musik asit İyot SORULAR:

41 KARBOHİDRATLAR Karbohidratları tanımlayınız. Bir ortamda karbohidrat varlığı hangi test ile gösterilebilir? 2- Serbest aldehit veya keton grubu içeren karbohidratlar hangi test ile tanımlanır? Testin prensibi nedir? 3- Molich testiyle pozitif, Benedict testi ile negetif sonuç veren bir biyolojik materyalde karbohidrat varlığı hangi test ile gösterilebilir? 4- Ortamda laktoz ve sakkaroz bulunmaktadır. Bu iki şekeri hangi testlerle birbirinden ayırtedebiliriz? 5- Hangi monosakkaritin Aldarik asit formu suda çözünmeyen berrak kristaller oluşturur? 6- Osazon testi nedir? Hangi şekerler benzer osazon verirler, neden? 7- Nişasta ve glikojen karbohidrat sınıflandırılmasında hangi gruba girerler? Her iki bileşik arasında kaynaksal ve kimyasal yapı yönünden ne gibi farklılık vardır? 8- Glukoz, fruktoz, galaktoz ve mannoz un açık ve halka formüllerini yazınız. 9- Maltoz, laktoz, sakkaroz, izomaltoz, Sellobioz un yapısı hangi monosakkaritlerden meydana gelmiştir? İnsanda bu disakkaritlerden hangisi/hangileri hidroliz edilemediğinden emilemez? 10- Hamileliğin son devresinde veya süt veren annede idrarda indirgen şeker bulunması patolojik midir (hastalık durumu)? Bu şeker ne olabilir?

42 L İ PİTLER - YA Ğ L A R 39 Laboratuvar Lipitler-Yağlar 4 GENEL BİLGİ Lipitler; protein, karbohidrat ve nükleotidlerden sonra dördüncü ana grubu oluşturan biyomoleküllerdir. Diğer grup biyomoleküllerden farklı olarak lipitler yapısal olarak geniş bir çeşitlilik gösterirler. Lipitler; genellikle, biyolojik sistemlerde bulunan suda çözünemeyen organik bileşikler olarak tanımlanırlar. Eter, kloroform ve benzen gibi polar olmayan çözücülerde çözünebilirler. Lipitlerin görevleri şöyle sıralanabilir: 1- Hücre zarının yapı taşıdırlar. 2- Metabolizma için gerekli hücresel yakıt maddesi olarak depo edilmişlerdir. Karbohidratların bir gramı 4,2 kcal enerji verirken, yağlarda bu 9,3 kcal ye çıkmaktadır. 3- Bakterilerin hücre duvarı, bazı bitkilerin de yapraklarındaki koruyucu tabaka lipit yapıdadır. 4- Vitamin olarak rol oynarlar. Bazı vitaminlerin de emilimleri için gereklidirler. 5- Prostaglandinler, steroidal hormonlar gibi bazı biyomoleküllerin ön maddesini oluştururlar. Lipitlerin büyük bir kısmı besinlerle dışarıdan alınmaktadır. Bir bölümü de organizma tarafından sentezlenmektedir. Lipitler hayvansal organizmalarda başlıca şu gruplarda incelenirler: A- Yağ Asitleri Bunlar uzun bir hidrokarbon zincirin ucunda karboksilik asit fonksiyonel grupları olan organik asitlerdir. - Doymuş yağ asitleri, - Doymamış yağ asitleri, olarak sınıflandırılırlar. Doymuş yağ asitleri; hidrokarbon zincirin doymuş yapıda olduğu yağ asitleridir. Doymamış yağ asitleri ise hidrokarbon zincirde bir veya daha fazla çift bağ içerirler. Doğada gözlenen yağ asitlerinin karbon sayıları genellikle çift sayılardır; 4 ile 24 arasında karbon atomundan oluşmuşlardır. B- Gliserol esterleri Gliseritler Gliserol ile yağ asitlerinin esterleşmesi ile meydana gelirler. Gliserol molekülünün üç hidroksil grubu da esterleşebileceği gibi, bir veya ikisi de bağlanabilir. Buna göre tanımlanırlar

43 40 L İ PİTLER - YA Ğ L A R (monogliserit, digliserit, trigliserit). Gliserole bağlanan yağ asitlerinin hepsi aynı tür olabileceği gibi farklı yağ asitleri de olabilir. Fosfolipitler Beyaz mumsu maddelerdir. Yapılarında ortak olarak gliserol, yağ asiti, fosforik asit kombinasyonu bulunur. Bu tür bileşik Fosfatidik asit olarak adlandırılır. Fosfolipitler, bu yapıya, değişik alkolik türevlerin eklenmesiyle meydana gelirler. Hücre zarında önemli bileşiklerdir. Ayrıca hücreye dışarıdan gelen uyarıların hücre içine iletilmesinde görevinde rol oynamaktadırlar. Başlıca fosfolipitler şunlardır: - Fosfatidil serin, - Fosfatidil inozitol, - Fosfatidilkolin (Lesitin), - Fosfatidil lizin. - Fosfolipitler, fosfolipaz denilen enzimler tarafından hidroliz edilirler. C- Mumlar Yağ asitleriyle uzun zincirli alkollerin birleşmesiyle oluşan ester yapılardır. D- Steroidler Siklopentanoperhidrofenantren çekirdeği içeren maddelerdir. Hayvansal ve bitkisel organizmalarda çok önemli bileşiklerdir. Hayvansal organizmalarda temel steroidal bileşik kolesteroldür. Diğer steroidlerin sentezinde ön maddedir. Steroidal Hormonlar; değişik sayıda karbon atomu taşımaktadırlar. En büyük grup 21 karbon atomlu bileşiklerdir. Bunlar, Korpus luteumdan ve plasentadan salgılanan progesteron ile böbrek üstü bezinden salgılanan kortikosteroidlerdir. 19 Karbonlu türevler ise androjenler olarak adlandırılan erkek seks hormonlarıdır. 18 karbonlu bileşikler ise, östrojenler yani dişi seks hormonlarıdır. Bunların dışında safra asitleri steroidal yapı taşır. D vitamini de steroid türevi bir biyomoleküldür. E- Sfingolipitler Sfingozin adlı özel bir alkolün amino grubuna 18 veya daha fazla sayıda karbon içeren yağ asitinin bağlanması seramit oluşturur. Bu öncül maddeden üç tür sfingolipit meydana gelir. Bunlar; sfingomiyelin, galaktozil seramit, glukozil seramit' ir. Bu lipitler santral sinir sisteminde, hücre membranın yapısında birincil öneme sahiptirler. F- Terpenler 5 karbonlu izopren ünitelerinden oluşmuşlardır. Kolesterol sentezinde ara madde olarak sentezlenirler. A, E, K vitaminleri bu grup biyomoleküllerdir. Yağların Sindirim ve Emilimi Midede lipitlerin sindirimi için mide lipazı denilen bir enzim mevcutsa da bu yetişkinlerde etkin değildir. Süt çocuklarında süt lipitlerinin, yağ asitleri ve gliserole hidrolizini sağlayabilir. İnce bağırsaklarda ise safra kesesinden salınan safra asitleri pankreastan salgılanan pankreas lipazı, lipitlerden yağ asitlerinin hidrolizini sağlarlar.

44 L İ PİTLER - YA Ğ L A R 41 Barsak tarafından emilen kolesterol ile burada trigliseritlere çevrilen yağ asitleri şilomikron halinde Vena porta ve lenf sistemine aktarılırlar. Bu nedenle yemeklerden sonra plazma veya serum bulanık bir görünüm alır. Plazma Lipitleri İnsan plazması mg/dl kadar lipit içermektedir. Bu fosfolipitler, steroidler, kolesterol ve gliseritlerden oluşur. Ancak lipitler suda çözünmediklerinden plazmada bir yerden diğer tarafa lipoproteinler halinde taşınmaktadırlar. Lipoproteinler, elektroforezdeki ayırımlarına göre 4 grupta incelenirler: 1- Şilomikronlar: Barsaktan emilen lipitlerin taşındığı fraksiyondur. Açlık örneklerinde lipoprotein elektroforezinde bu bantın görülmemesi gerekir. Bulunması patolojiktir. 2- Beta Lipoproteinler: Özellikle kolesterolce zengindirler. Serumda kolesterolün artışı elektroforezde kendisini beta bantında yükselme ile gösterir. 3- Pre beta Lipoproteinler: Karaciğerde sentezlenen trigliseridleri içeren lipoprotein fraksiyonudur. Lipoprotein elektroforezinde oranları normal kişilerde %15 in altında olmalıdır. 4- Alfa Lipoproteinler: En yüksek protein ve fosfolipit oranı bu fraksiyondadır. Kolesterol de ihtiva eder. Bu fraksiyondaki kolesterolü yansıtan HDL-Kolesterol düzeyi çok önemlidir, zira bunun miktarında azalma, kişide ateroskleroz riskinin yüksek olduğunu gösterir. Şekil 1. LDL molekülü

45 42 L İ PİTLER - YA Ğ L A R Lipoproteinler ultrasantrifüjde ayrıldıkları fraksiyonlara göre de gruplandırılırlar. 1- Şilomikronlar, 2- LDL-Düşük dansiteli lipoproteinler, elektroforezdeki betalipoproteinlere karşılıktır. 3- VLDL-Çok düşük dansiteli lipoproteinler, elektroforezde, prebeta lipoproteinlere karşılıktırlar, Plazmada trigliseritleri uzaklaşarak LDL ye dönüşürler. 4- HDL-Yüksek dansiteli lipoproteinler, elektroforetik ayrımda alfa-lipoproteinlere karşılıktır. İnsan plazma lipoproteinlerinin esas sınıfları ve bunlara ait özellikler tablo I de gösterilmiştir. Tablo I: İnsan Plazma Lipoproteinleri Lipoprotein Şilomikronlar VLDL LDL HDL Yoğunluk (g/ml) 1,006 0,95-1,006 1,006-1,063 1,063-1,210 Bileşenler (% ağırlık) Protein Fosfolipit Serbest kolesterol Kolesteril esterleri Triaçil gliseroller Serum Total Kolesterol Tayini Kolesterol steroid yapısında bir biyomoleküldür (Şekil 2a). 3. karbonda bulunan hidroksil grubu kolesterol esterlerindeki yağ asitinin bağlanma yöresini oluşturur (Şekil 2b). Şekil 2. a) Siklopentanoperhidrofenantren çekirdeği b) Kolesterol molekülü

46 L İ PİTLER - YA Ğ L A R 43 Plazma kolesterolünün %70 i esterleşmiş şekilde %30 ise serbest haldedir. Kolesterol esterleri kolesterolün dokulardaki depo şeklidir. Kolesterol bir amfipatik lipit olması dolayısı ile bütün hücre zarlarının, plazma lipoproteinlerinin bir bileşenidir. Vücutta kortikosteroidler, seks hormonları, safra asitleri ve D vitamini gibi diğer steroidlerin öncül maddesidir. Kolesterol vücutta başlıca karaciğerde de novo sentezi ile bağırsak, adrenal korteks ve üreme organları (yumurtalık, testis, plasenta) gibi hemen hemen tüm dokularda sentezlenir. Yumurta sarısı, et, karaciğer gibi besinlerle de alınabilir. Diyetle alınan; karaciğerde de novo sentezlenen ve ekstra hepatik dokularda yapılan kolesterol, karaciğerde toplanır. Karaciğer, kolesterol dengesinin sağlanması açısından önemli role sahiptir. Alınım ve atılımı arasındaki dengenin bozulmasıyla birlikte birçok patalojik olay gerçekleşir. Yüksek kolesterol düzeyine sahip olan kişiler ateroskleroz riski taşırlar. Kolesterol Sentezi, Taşınması ve Yıkımı Kolesterol sentezi, Asetil-KoA dan başlamak üzere çok basamaklı işlevlerle sitozol ve endoplazmik retikulumda bulunan enzimlerle gerçekleşir. Kolesterol, dokular arası taşınımı için özellikle LDL( -lipoprotein) lipoproteinlerinin yapısına girer. Ekstrahepatik dokularda sentezlenen kolesterol ise HDL ile ayrılır ve karaciğere getirilir. Ortamda VLDL miktarının yüksek olduğu durumlarda plazma kolesterolünün daha büyük bir kısmı VLDL içinde kalır. Kolesterol vücutta enerji kaynağı olarak kullanılmadığından insanlarda H 2O ve CO 2 de metabolize edilemez, yıkım için karaciğere gelir. Safra sıvısı içinde kolesterol veya safra asitleri halinde bağırsağa verilir. Safra asitlerine dönüştükten sonra yaklaşık olarak yarısı feçes ile atılır. Diğer kısmı ise tekrar safra içine salgılanır. Kolesterol Tayin Yöntemleri Kolesterol direkt veya indirekt olmak üzere kimyasal ya da enzimatik yöntemler ile tayin edilir. Kimyasal Yöntemler Bu yöntemlerde kolesterolün kimyasal ajanlarla verdiği tepkime sonucu oluşan renkli maddeler niceliksel olarak tayin edilir. -Liebermann-Burchard yöntemi, -Salkowsky yöntemi, -Zlatkis-Zak ve Boyle Yöntemi. Enzimatik Yöntemler Enzimatik yöntemler özgünlüklerinin daha fazla olmasından ötürü 1970 lerden bu yana kimyasal yöntemlerin yerini almıştır. Bunlar kolesterolün oksidaz enzimi ile tepkimesi sonrası oluşan H 2O 2 nin daha sonra renkli komplekslere dönüştürülmesine dayanır. Depolama Kolesterol analizi yapılacak serum veya plazma örnekleri uzun süreli kullanımda 70 C veya daha aşağısındaki sıcaklıklarda saklanabilir. Bir veya iki ay gibi kısa süreli kullanımlarda ise 20 C ta muhafaza edilebilir.

47 44 L İ PİTLER - YA Ğ L A R Zlatkis-Zak Yöntemi ile Kolesterol Tayini Deneyin prensibi Çift bağ içeren steroidlerin sülfürik asit ve asetik asitli ortamda FeCl 3 ile tepkimesi sonucu oluşan bis-kolestadienil-disülfonik asitin verdiği yeşil-eflatun rengin 560nm dalga boyunda okunması esasına dayanır. Renk çok dayanıklı olup yöntem Liebermann-Burchard tepkimesinden 5-10 kez daha hassastır. Ayıraçlar 1- % 0,05 FeCl 3: 50mg FeCl 3 tartılır ve glasiyel asetik asit ile 100mL ye tamamlanır. 2- Konsantre H 2SO 4 3- Stok kolesterol standartı: 400mg kolesterol tartılır, ml glasiyel asetik asitte çözülür ve 100 ml ye tamamlanır (400 mg/dl). 4- Günlük standart: 2mL stok standarttan alınır, üzerine 2mL glasiyel asetik asit eklenir (200mg/dL). Standart Eğri Çizimi; Stok standarttan 100, 200, 300 ve 400mg/dL olacak şekilde standart dizisi hazırlanır. Bunun için 4 tane deney tüpü alınır aşağıdaki şekilde standartlar hazırlanır. Stok çözelti (ml) Glasiyel asetik asit(ml) Son derişim (%mg) 1 3 % % % %400 Standart eğri çizmek için önce 5 tane deney tüpünde bir ön karışım hazırlanır. Ön karışım: Çözeltiler (ml) Tüp No Kör Standart - 0,1 0,1 0,1 0,1 Saf Su 0, %0,05 FeCl Derişim (mg/dl) Tüpler karıştırılarak 10 dk oda ısısında bekletilir. Daha sonra 5 deney tüpü alınır. Aşağıdaki şekilde pipetleme yapılır. Çözeltiler (ml) Tüp No Kör Ön karışım 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Konsantre H 2SO 4 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Derişim (mg/dl)

48 L İ PİTLER - YA Ğ L A R 45 Tüpler karıştırılarak 10 dk oda ısısında bekletilir. Spektrofotometrede 560 nm dalga boyunda köre karşı absorbans okunarak eğri çizilir. Kolesterol Standard Eğrisi OD (560nm) 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 y = 0,0009x R 2 = 0, Konsantrasyon (mg/dl) Örnek Çalışması Üç tane santrifüj tüpü alınarak aşağıdaki pipetleme yapılır. Çözeltiler (ml) Kör Standart Örnek Standart (200mg/dL) - 0,1 - Serum - - 0,1 Saf su 0,1 - - %0,05 lik FeCl Tüpler karıştırılır 10dk santrifüj edilir. Üç tane deney tüpü alınır. Çözeltiler (ml) Kör Standart Örnek Süpernatan 2,5 2,5 2,5 Konsantre H 2SO 4 1,5 1,5 1,5 Tüpler karıştırılarak 10 dk bekletilir. Spektrofotometrede 560 nm dalga boyunda absorbans okunarak derişim, eğriden veya standart ile karşılaştırılarak değerlendirilir. Standart derişimden değerlendirme OD Örnek konsantras yonu (mg/dl) OD 1 2 standart konsantras yonu (200 mg/dl) OD 1: Konsantrasyonu bilinmeyen örneğin optik dansitesi OD 2: Standartın optik dansitesi Not: H 2SO 4 çalışılmalıdır. ve glasiyel asetik asit tahriş edici maddeler olduğundan çok dikkatli

49 46 L İ PİTLER - YA Ğ L A R Referans değerler Referans değerler yaşa ve cinsiyete göre değişir. (mg/dll) 0-20 yaş , yaş E , K , yaş E , K , yaş E , K Klinik olarak istenen değerler: İdeal : 200mg/dL Orta dereceli risk : mg/dl Yüksek risk : 240 mg/dl Kolesterol Tayininde Kimyasal İnterferanslar Kolesterol Değerini artıranlar Askorbik asit Hidroksisteroller Bilirubin Lipemik ikterik veya hemolizli numuneler Kolesterol Değerini düşürenler Sodyumazit ve timerosal gibi serum koruyucuları Plazma Kolesterol Düzeyini Etkileyen (in vivo) Nedenler Kolesterol Düzeyini Artıranlar Amiodaron Androjenler Kateşolaminler Kenodiol Siklosporin Diüretikler Glikojenik kortikosteroidler Yüksek kolesterollü diyetler Kolesterol Düzeyini Azaltanlar Amino salisilik asit Asparaginaz Östrojenler Fibrik asit türevleri (klofibrat vs.) HMG-CoA redüktaz inhibitörleri Düşük kolesterol ve yüksek doymamış yağlı diyetler

50 L İ PİTLER - YA Ğ L A R 47 YORUM Serum kolesterol düzeyinin yükseldiği (= hiper kolesterolemi) durumlar: -İdiyopatik hiperkolesterolemi, -Karaciğer hastalıkları (Ör. Tıkanma sarılıkları, hafif portal siroz, hepatik glikojen depo hastalığı), -Ateroskleroz, -Hipotiroidi, -Böbrek hastalıkları (Ör. Nefrotik sendrom), -Hiperlipoproteinemiler, -Gebelik, -Lösemi. Serum kolesterol düzeyinin azaldığı (=hipokolesterolemi) durumlar -Hipertiroidizm, -Ağır karaciğer hücre harabiyeti, -Kronik anemiler, -Hemofililer, -İnfeksiyonlar, -Malnütrisyon(Ör., üremi, açlık, terminal neoplazm). 1- Kolesterol plazma değerleri yaş ve cinsiyete göre değişir. 2- Kadınlarda (K) değerler, erkeklere (E) göre daha düşüktür. 3- Menapoz döneminden sonra K/E değerleri birbirine yaklaşır. 4- Ateroskleroz ve kalp hastalığı açısından kolesterol yüksekliği risk faktörlerinden yalnızca birisidir. 5- Kolesterol düzeyleri diğer lipit parametreleri( LDL-Kol, HDL-Kol, Trigliserit, Apo B, Apo E) ile birlikte değerlendirilir. Örneğin Total Kol/HDL oranının 5 olması bir diğer risk faktörüdür. 6- Toplumlara göre referans değerler değişir. Örneğin 10 yaş üzerinde Afrikalı Amerikalılarda ortalama 10 mg/dl daha yüksek değerler saptanmıştır. SORULAR: 1- Lipitleri tanımlayınız, görevlerini anlatınız. 2- Trigliserit, fosfolipit ve sfingolipitlerin benzerlik ve farklılıkları nelerdir? 3- Lipoprotein ne demektir? Kaç tipte incelenir? 4- Kolesterol nasıl bir bileşiktir? Önemini anlatınız. 5- Kolesterol tayin yöntemleri hakkında bilgi veriniz. 6- Ateroskleroz nedir?

51 48 P RO T E İ N L ER Laboratuvar Proteinler 5 GENEL BİLGİ Amino asitlerin peptit bağı ile bağlanmaları sonucu meydana gelen proteinler, tüm canlıların yapısında ve yaşamları boyunca fonksiyonlarını yürütmede ön planda yer alır. C, H, O, N ve çoğu kez S içeren bileşikler olup bazılarının yapısında fosfor, demir, bakır, çinko gibi elementler bulunur (hemoglobin de demir, serüloplazminde bakır gibi). Proteinlerin yapı taşları doğal olarak bildiğimiz 20 amino asitten meydana gelmiştir. Bir amino asidin -karboksil grubu ile diğer bir amino asidin -amino grubu arasından bir mol su açığa çıkmasıyla peptit bağı (amit bağları) oluşur (Şekil 1). Şekil 1. İki amino asit arasında oluşan peptit bağı. Peptit bağları kendiliğinden veya ısıtılarak ya da üre gibi yüksek derişimlerde proteinleri denatüre eden ajanlarla yıkılmazlar. Bu bağları nonenzimatik olarak parçalamak için yüksek sıcaklıkta uzun süre, kuvvetli asit ya da alkaliye maruz bırakmak gerekir. Proteinler canlı organizmanın çok önemli fonksiyonlarını oluştururlar. Bunlar: - Biyokimyasal tepkimeleri katalizleme (enzimler), - Hücre ileti sistemi (hormon), - Taşıma (Hb), - Organizmanın mekanik hareketleri (kas gibi), - Savunma (Ig). Proteinlerin yapısını dört basamakta incelemek mümkündür. Bunlar; primer, sekonder, tersiyer, kuaterner yapılar olarak bilinmektedir. Primer Yapı (birincil): Bir proteindeki amino asitlerin sayısı, türü ve diziliş sırası primer yapıyı tayin eder. Birincil yapının en karakteristik özelliği peptit bağıdır. Bazı genetik hastalıklarda

52 P RO T E İ N L ER 49 anormal proteinler (amino asit dizilişindeki farklılıktan dolayı) meydana gelmekte olup, bu değişimin üç boyutlu yapıyı etkilemesi sonucu proteinlerin fonksiyonu değişmekte veya stabilitesi bozulmaktadır. Bu nedenle primer yapıyı anlamak çok önemlidir. Normal ve mutasyona uğramış proteinlerin primer yapıları bilindiği takdirde bu bilgi kullanılarak hastalığın moleküler patolojisi araştırılabilir ve kesin tanı konulabilir. Sekonder Yapı (ikincil): Polipeptit ana yapısı gelişigüzel bir üç boyutlu yapı oluşturmayıp genellikle lineer (düz) dizide birbirine yakın olan amino asitlerin kurallı (karboksil ve amino grupları arasındaki hidrojen bağlarının) düzenlenmesiyle yapılanır. Bu düzenlemelere polipeptitlerin sekonder yapısı denir. -sarmal, -kırmalı tabaka ve üçlü sarmal bu yapılara örnek teşkil eder. Tersiyer Yapı (üçüncül): Proteinin polipeptit ünitelerinin üç boyutla yapısı tersiyer yapıyı gösterir. Protein molekülünün yuvarlak veya elipsoid bir şekil alabilmesi için ikinci yapıyı meydana getiren konformasyonların üst üste katlanması veya yumak şeklinde sıralanması gerekmektedir. Bu ise yan zincirlerin yapıya girmesi ile mümkün olur. Polipeptit zinciri sarmal şeklinde kıvrıldığında sarmalı bu durumda tutmak gerekir. Hidrojen köprüleri ise bütün molekülü kıvrık halde tutacak kadar kuvvetli değildir. Yapıyı istenilen formda tutabilmek için bazı yeni bağlara gereksinim vardır. Bu yapıda görev alan bağlar şunlardır: - Hidrojen bağları, - Hidrofobik etkileşimler, - İyonik etkileşimler, - Disülfit bağları, - Van der Waals kuvvetleri. Kuaterner Yapı (dördüncül): Her üç yapıyı içeren polipeptit birimleri birleşerek kuaterner yapıyı oluşturur. Birçok protein tek bir polipeptit zincirinden meydana gelir, bunlar monomerik proteinlerdir (miyoglobin). Birçoğu da yapısal olarak benzer veya tamamen ilgisiz bir veya daha fazla polipeptit zincirinden oluşur. Bu polipeptit zincirlerinin düzenlenmesine kuaterner yapı denir. Bu yapıya en güzel örnek hemoglobin dir. Protein Metabolizması Plazma proteinlerinin yaklaşık tamamı karaciğerde sentezlenirken, sadece immünglobulinler immün sistemin plazma hücrelerinde üretilirler. Proteinlerin yine büyük bir kısmı yapıtaşları olan amino asitlerine karaciğerde katabolize edilirler. Amino asitler de katabolizmalarında deamine edilerek amonyağa ve keto asitlerine dönüştürülür. Organizma için toksik olan amonyak da karaciğerde üre döngüsü ile üreye metabolize edilir ve daha sonra idrarla atılır. Keto asitler sitrik asit döngüsünde okside edilerek glukoza veya yağ asitlerine dönüştürülür. Azot Dengesi Her ne kadar protein döngüsü (turnover) her bir protein için farklılık gösterse de proteinlerin metabolizmaları ile katabolizmaları arasında genel bir denge vardır, bu da azot dengesi olarak bilinir. Eğer, protein katabolizması ya da kaybı sentezini geçer ise negatif; sentez, katabolizmayı geçer ise pozitif azot dengesi olarak tanımlanır.

53 50 P RO T E İ N L ER UYGULAMALAR A- Proteinlerin Renk Tepkimesi Proteinler belirli ayıraçlarla farklı karakteristik renk tepkimesi verirler. En karakteristik tepkime biüret tepkimesi'dir. Az miktarlarda bulunan proteinleri ölçmek için Lowry yönteminde kullanılan Folin Ciocalteu ayıracından yararlanılır. Prensip: Biüret tepkimesinde proteinler kuvvetli alkali bir ortamda bakır sülfat ile pembemsi mor renkte bir kompleks oluştururlar (Şekil 2). Bu tepkimenin gerçekleşmesi için en az iki peptit bağı bulunmalıdır. Biüret Çözeltisi Biüre Mor renkli kompleks Şekil 2. Biüret ile oluşan renkli kompleksin yapısı. Ayıraçlar Biüret Çözeltisi: 1,5 g bakır sülfat ve 6 g sodyum potasyum tartarat bir miktar arık suda eritilir. Şiddetle çalkalanarak üzerine 300 ml %10 luk sodyum hidroksit ve 1 g potasyum iyodür eklenir. Karışım 1 litreye arık su ile tamamlanır. Kırmızı veya siyah bir çökelti oluşursa ayıraç kullanılmaz. Yumurta Akı Çözeltisi (%1): 10 ml yumurta akı %1 lik sodyum klorür solüsyonu ile 1 litreye tamamlanır. Üre Çözeltisi (%1): 1 g üre bir miktar arık suda çözülerek 100 ml ye tamamlanır. Üre Kristalleri: Orijinal ambalajından alınır. Alanin (%1): 1 g alanin ml saf suda çözülerek 100 ml'ye tamamlanır. Glutamik asit (%1): 1 g glutamik asit ml saf suda çözülerek 100 ml'ye tamamlanır. Deneyin Yapılışı Aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi örneklere biüret ayıracı ilave edildikten sonra karıştırılır, oluşan renk kaydedilir. Ayrıca bir deney tüpüne bir miktar üre kristali konur. Daha sonra bek alevinde amonyak kokusu çıkıncaya kadar ısıtılır. Üre kristalleri ısının etkisiyle sıvı hale dönüşürken amonyak çıkışı olur ve biüret meydana gelir. Soğutulan tüpün üzerine 4 ml biüret çözeltisi ilave edilir, karıştırıldıktan sonra oluşan renk kaydedilir. Tüp No Örnekler Renk reaktifi Renk 1 1 ml %1 lik üre çözeltisi 4 ml Biüret çözeltisi

54 P RO T E İ N L ER ml süt 4 ml Biüret çözeltisi 3 1 ml serum 4 ml Biüret çözeltisi 4 1 ml %1 lik yumurta akı çözeltisi 4 ml Biüret çözeltisi 5 1 ml alanin 4 ml Biüret çözeltisi 6 1 ml glutamik asit 4 ml Biüret çözeltisi 7 1 ml su 4 ml Biüret çözeltisi 8 Biüret kristalleri 4 ml Biüret çözeltisi Yorum Biüret deneyinde su kontrol amaçlı kullanılmıştır. Biüret tepkimesi peptit bağına özgün bir tepkime olduğundan süt, serum, %1 lik yumurta akı gibi protein içeren yapılarda pembemsi mor renk oluşurken; alanin, glutamik asit ve %1 lik üre çözeltisinde bu renk gözlenmemiştir. Üre kristalleri ısıtıldığında iki üre molekülü arasında bir peptit bağı oluşarak biüret isimli madde (Şekil 3) teşekkül etmiş ve pembe mor renk oluşmuştur. Isı Üre Üre Biüre Amonyak Şekil 3. İki mol ürenin ısıtılmasıyla oluşan biüre molekülü. B- Denatürasyon Proteinlerin denatürasyonu, 3 boyutlu yapının bozulması ile meydana gelir. Denatüre olmuş proteinin birincil yapısını oluşturan peptit bağları korunurken, ikincil, üçüncül ve dördüncül yapısını belirleyen bağlar kırılır. Prensip: Hidrojen bağları, polar-apolar etkileşimler, sülfidril köprüleri gibi bağlarını kaybetmesi ile özgün yapılarını yitirmeleri proteinlerin denatürasyonu olarak bilinir ve çok sayıda farklı kimyasal ve fiziksel ajanlar tarafından gerçekleştirilebilir. Bunlardan bazılar aşağıdaki tabloda gösterilmiştir. - Yüksek sıcaklık, - Ağır metal iyonları, - Organik çözücüler, - Basınç, - Mekanik karıştırma, - UV, radyasyon, - Kuvvetli asit veya bazlar, - Yüksek tuz konsantrasyonları, - Deterjanlar, - Üre, guanidin,

55 52 P RO T E İ N L ER Yukarıda bahsedilen fiziksel ve kimyasal ajanlar proteinleri özelliklerine ve etki sürelerine göre çeşitli derecelerde denatüre ederler. Denatürasyonun derecesini ölçmek için kullanılan deneysel kriterler: -Çözünürlüğün azalması, -Peptid zincirindeki yan grupların reaktivitelerinin azalması, -Biyolojik aktivitenin kaybı, -Viskozite ve sedimantasyon kat sayılarının farklılaşmasına yol açan şekil ve boyut değişimleri, -Absorbsiyon ve floresan spektrumundaki değişimler olarak özetlenebilir. Ayıraçlar Trikloro asetik asit, TCA (%20): 20 g trikloroasetik asit bir miktar arık suda çözülerek 100 ml ye tamamlanır. Sodyum hidroksit, NaOH (%40) : 40 g sodyum hidroksit bir miktar arık suda çözülerek 100 ml ye tamamlanır. Deneyin Yapılışı Sıcaklık: 6-7mL yumurta akı solüsyonu bir deney tüpüne konarak kaynatılır, değişiklikler gözlenir, sonra üzerine biüret ayıracı konularak oluşan renk kaydedilir. Baz: Bir deney tüpüne 3-4 ml süt konulur. Üzerine 1-2 ml %40' lık sodyum hidroksit (tüp eğilerek yavaş yavaş) ilave edilir. Oluşan değişiklikler gözlenir, sonra biüret ayıracı eklenerek renk kaydedilir. Asit: Bir deney tüpüne 3-4 ml süt konulup üzerine 1-2 ml %20 TCA(tüp eğilerek yavaş yavaş) ilave edilir, değişiklik izlenir, sonra ortamı alkali yapmak için % 40' lık NaOH'den 1 ml eklenerek karıştırılır, biüret ayıracı eklenerek oluşan renk kaydedilir. Sıcaklık Baz Asit* Isıtıldıktan sonraki gözlenen değişiklikler Biüret tepkimesi sonrası renk değişikliği Bazik işlem sonrası gözlenen değişiklikler Biüret tepkimesi sonrası renk değişikliği Asidik işlem sonrası gözlenen değişiklikler Biüret tepkimesi sonrası renk değişikliği Yumurta akı Süt Serum *Ortam alkali yapıldıktan sonra biüret eklenir. C- Diyaliz Proteinlerin en karakteristik özelliklerinden biri büyük çaplı olmalarıdır. Bu özelliklerinden yararlanılarak küçük moleküllerden ayrıştırılmaları için basit yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerden biri de diyalizdir.

56 P RO T E İ N L ER 53 Prensip: Proteinlerin yarı geçirgen bir zar kullanılarak düşük moleküler ağırlığına sahip olan iyonlardan ve moleküllerden ayrıştırılmasına diyaliz denir. Diyalizdeki yarı geçirgen zar protein molekülünü tutar; küçük ebatlı çözünen moleküllerin ve elektrolitlerin (Na +, K +, Cl - gibi) zardan dışarı çıkmasına, bunların yerine suyun içeriye girmesine izin verir (Şekil 4). Bu şekilde uzaklaştırılması istenen glukoz ya da amonyum sülfat gibi küçük moleküllerin derişimi yok denecek bir miktara düşürülebilir. İşlem sırasında zarın içine giren su daha sonra uzaklaştırılarak iyonlardan ve küçük moleküllerden arındırılmış protein elde edilir. Şekil 4. Diyaliz olayının şematik olarak gösterimi Ayıraçlar Baryum Klorür, BaCl 2 (%1) : 1 g baryum klorür suda çözülerek 100 ml ye tamamlanır. Gümüş Nitrat, AgNO 3 (%1) : 1 g gümüş nitrat suda çözülerek 100 ml ye tamamlanır. Deneyin Yapılışı Bir tüpe 0,5 ml serum, 2 ml arık su ve 7,5 ml sodyum sülfat konur ve karıştırılır. Bu karışım, bir ucu daha önce iple bağlanmış olan yarı geçirgen zarın (bağırsağın) içine konur ve bağırsağın açık olan ucu yeniden bir iple bağlanır. İçinde arık su bulunan bir behere konur ve 15 dakika zaman zaman yavaşça karıştırılarak bekletilir. Sonra bu beherdeki sudan üç ayrı örnek farklı tüplere alınarak birine %1 lik BaCl 2, diğerine %1 lik AgNO 3 çözeltisinden 3-5 damla damlatılır. Beyaz çökelti görülürse, beherdeki su dökülür, yeniden saf su ile doldurulur ve bağırsak içine konur. Üçüncü tüpe 4 ml biüret ayıracı eklenerek renk değişimi gözlenir. Aynı işlemler 15 dakika sonra tekrarlanır. Beherdeki suyun kontrollerine beyaz çökelek vermeyinceye kadar devam edilir. Beherdeki suyu değiştirdikçe bağırsak içindeki iyonlar biter, bu arada su da bağırsak içine girer ve diyaliz tamamlanır. Yorum

57 54 P RO T E İ N L ER %1 lik BaCl 2 damlatılan tüpte, zardan dışarı çıkan SO 4-2 anyonları varsa baryum sülfat oluşur, beyaz çökelek meydana gelir. Baryum sülfatın çözünürlüğü az olduğu için tüpün dibinde çökelir. %1 lik AgNO 3 damlatılan tüpte zardan dışarı çıkan Cl - anyonları varsa gümüş klorür oluşur, beyaz çökelek meydana gelir. Sülfat iyonları sodyum sülfat, klorür iyonları ise deneyimizde serum kaynaklıdır. D- İzoelektrik Nokta Teorik açıdan bir proteinin bütün çözülebilir gruplarının (örneğin: karboksil, amino, imidazol, guanidiniyum vb. gibi) yüklerinin toplamının yani proteinin net yükünün sıfıra eşit olduğu ph izoelektrik noktadır. İzoelektrik nokta, bir elektrik alanında proteinlerin ne anoda ne de katoda göç ettikleri ph değeri olarak tanımlanır. İzoelektrik noktanın diğer bir tanımı da, proteinlerin en az çözündükleri nokta olarak yapılabilir. Aşağıda yapılacak olan deney bu prensip üzerine kurulmuştur. Ayıraçlar Sodyum asetat (0,1M): 13,6 g sodyum asetat bir miktar arık suda eritilerek 1 L ye tamamlanır. Asetik Asit (0,1M): 6 ml glasiyel asetik asit 1L ye arık su ile tamamlanır. Asetik Asit (0,01M): 100 ml 0,1M asetik asit 1L ye arık su ile tamamlanır. Serum (%5): Çeşitli serumlardan bir serum gölcüğü hazırlanır. Balon jojeye serum gölcüğünden 5 ml konup 100 ml ye arık su ile tamamlanır. Etanol (Etil alkol 95 o ) Deneyin Yapılışı : Deney tüpleri tabloda görüldüğü gibi hazırlanır: Çözeltiler (ml) 1. Tüp 2. Tüp 3. Tüp 4. Tüp 5. Tüp 6. Tüp 7. Tüp 8. Tüp 01 M Sodyum asetat 0,1 M Asetik asit (0,1 M) 0,01 M Asetik asit 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 4,0 2,0 1, ,0 2,5 1,25 0,6 0,3 Su 2,0 4,0 5,0 1,0 3,5 4,75 5,4 5,7 PH 4,1 4,4 4,7 5,1 5,4 5,7 6,0 6,3 Tüpler yukarıdaki gibi hazırlandıktan sonra baş aşağı çevrilerek iyice karıştırılır ve deneysel ph kaydedilir. Daha sonra her bir tüpe birer ml sulandırılmış serum (% 5) ilave edilerek tüm tüpler yeniden iyice karıştırılır ve bulanıklık kaydedilir. Kaydetme işleminden sonra her tüpe 5 ml etanol ilave edilerek çalkalanır. Tüplerin bulanıklıklarındaki değişim gözlenerek kaydedilmek üzere bir köşeye bırakılır. Proteinlerin en fazla çökeldikleri tüp saptanır ve o tüpün ph sı izoelektrik nokta olarak kaydedilir. Yorum

58 P RO T E İ N L ER 55 Proteinlerin en az çözündükleri, en fazla çöktükleri nokta izoelektrik nokta olduğu için bu niteliği taşıyan tüpün ph sı izoelektrik nokta olarak kabul edilir. Karışım halinde bulunan proteinlerin her birinin izoelektrik noktası farklı olduğundan elektrik alanda izoelektrik fokuslama ile proteinleri birbirinden ayırma ve karakterize etme imkanı bulunmaktadır. İnsan Serum ve Plazma Proteinleri Kan plazmada asılı halde bulunan şekilli elemanlar olan eritrositler ve lökositler ile trombositlerden oluşur. Kan pıhtılaştıktan sonra kalan sıvıya serum denir. Serum, plazmada normalde bulunan fakat pıhtılaşma sonucu tüketilen pıhtılaşma faktörlerini içermezken (fibrinojen dahil) bazı pıhtılaşma faktörlerinin yıkım ürünlerini ihtiva eder. İnsan serumu, çok çeşitli fonksiyonları olan 100 den fazla protein içermektedir. Bu proteinler arasında taşıyıcı olarak görev yapanlar, antikorlar, enzim inhibitörleri ve pıhtılaşma faktörleri bulunur. Plazma, yaklaşık 0,3 g/dl kadar fibrinojen içerir. Bu protein serumda bulunmaz. Total serum protein derişimleri ve her bir fraksiyonun miktarı, çeşitli hastalıklar sırasında değişime uğrar. Bu nedenle serum total proteini ve diğer protein fraksiyonlarının klinik tanıda önemi fazladır. E- Serum Proteinlerinin Tuzla Ayrıştırılması (Salting-Out) Proteinlerin denatüre olmadan beraberce bulunduğu bileşiklerden (genelde biyolojik sıvı ve doku) ayrıştırılması işlemine tuzla ayrıştırma denir. Genel olarak bu işlem doymuş tuz eriyikleri ile yapıldığından bu ad verilmiştir. Bu metot enzimlerin saflaştırılmasında ve klinik biyokimyada kan proteinlerinin ölçülmesinde kullanılır. Serum proteinlerinin alkali ortamda bakır sülfat ile menekşe renk vermesi esasına dayanan biüret tepkimesi sonucu kan serumundaki total protein içeriği niceliksel olarak analiz edilir. Serum globülinleri ise %23 lük sodyum sülfat ile çökeltilince eriyikte kalan albumin biüret tepkimesine tabi tutulacaktır. Serumdaki total protein ile albumin miktarlarının farkı da globülin miktarını verecektir. Prensip: Serumdaki proteinlerden albumin doymuş amonyum sülfat kullanılarak tamamen çöktürülebilir. Kalan proteinler globülinler olarak tanımlanır. Ayrıca serum %23 lük sodyum sülfat solüsyonu ile çöktürülürse ortamda çözünür olarak yalnızca albumin fraksiyonu kalır. Ayıraçlar 1- Sodyum Sülfat (%23): 230 g sodyum sülfat (anhidrit) 600 ml kadar sıcak su ile çözülür, ılık arık su ile 1L ye tamamlanır ve 37 0 C de saklanır. 2- Dietil eter, 3- Biüret solüsyonu, 4- Serum 5- Serum (1/20 seyreltilmiş): 0,5 ml serum üzerine 9,5 ml. arık su ilave edilerek karıştırılır. Serum total protein ve albumin miktarının biüret yöntemi ile tayini Bir santrifüj tüpüne 0,5 ml serum konur. Üzerine 7,5 ml %23 lük sodyum sülfat ilave edilerek iyice çalkalanır. 3 ml dietil eter eklenen tüpün ağzı kapak ile kapatılıp, tekrar şiddetle çalkalanır, 10 dakika santrifüj edilir. Eter tabakasının altında kalan berrak kısımda albumin bulunur. Bu berrak kısım ile eter tabakasının arasında yüzer şekilde çöktürülmüş beyaz globulin halkası göze çarpar. Böylece sodyum sülfat kullanılarak serumdaki globulinler ayrıştırılmış olur.

59 56 P RO T E İ N L ER Bir pipetin ucu eter tabakasından dikkatlice geçirilir, beyaz globulin tabakasını mümkün olduğunca parçalamadan ve alttaki berrak sıvıyı bulandırmadan yeterince sıvı pipete çekilir. Bu fraksiyon albumin miktar tayini için aşağıda verilen basamaklarda kullanılır. Üç adet deney tüpü alınır ve aşağıdaki şekilde hazırlanır. Çözelti (Ml) Kör Albumin Total Protein Arık su Albumin fraksiyonu Serum (1/20) Biüret Tüpler karıştırılarak 15 dakika bekletilir. 540 nm de köre karşı spektrofotometrede okunur. Absorbanslar standart eğriden değerlendirilerek albumin ve total protein derişimleri elde edilir. Serum albumin değerini bulmak için elde edilen değer 0,8 (seyreltme faktörü nedeniyle) ile çarpılır. Serum total protein (g/l)=albumin (g/l)+globulin (g/l) formülünde yerine konarak serum globulin derişimi elde edilir. Serum proteinlerinin normal değerleri: Total Protein = 6-8 g/dl Albumin (A) = 3,5-5,6 g/dl Globulin (G) = 1,2-3,2 g/dl A/G = 1,6 Yorum Serum albumini; albumin sentezinde azalma olduğu zaman (malnütrisyon, malabsorbsiyon, karaciğer sirozu, cerrahi müdahaleler, enfeksiyonlar, kanser, analbuminemi, bisalbuminemi) veya aşırı albumin kaybı olduğunda (nefrotik sendrom, yanıklar, vb.) azalır. Serum globulininin arttığı durumlar arasında: dehidrasyon, malnütrisyon enflamasyon, karsinomalar, myeloma, sarkoidozis ya da kollajen hastalıklar, karaciğer sirozu gibi nedenler sayılabilir. Serum proteinleri elektroforezle ayrıştırılıp daha geniş bilgi elde edilebilir. Bu durumda globulinler dört farklı fraksiyona ayrılır ve serum proteinleri sırayla; albumin, 1, 2,, globulinler şeklinde 5 bant halinde görülür. Globulin fraksiyonu, heterojen bir gruptur. Daha ayrıntılı bir teknik ile ayrıştırıldığında ise bunların da alt gruplardan oluştuğu görülür. Bu subgrubların da her birinde çok farklı proteinler bulunmaktadır. Sorular 1- Proteinler yapılarına göre kaç basamakta incelenir? Kısaca anlatınız. 2- Peptit bağı nasıl oluşur çizerek gösteriniz? 3- Biüret deneyinin prensibi nedir? 4- Üre kristalleri biüret ile tepkime verirken ; % 1 lik üre çözeltisi neden biüret ile tepkime vermez? 5- Denatürasyon nedir? Proteinlerin hangi yapıları bozulmaz açıklayınız.

60 P RO T E İ N L ER Denatürasyona neden olan ajanlar nelerdir? 7- İzoelektrik noktanın deneysel ve teorik tanımını yapınız? 8- İzoelektrik nokta deneyini hangi prensibe göre yaptınız? 9- Diyalizin amacı nedir? 10- Diyalizin tamamlanıp tamamlanmadığı hangi çözeltilerle kontrol edilir? Neden? 11- Diyalizin amacı nedir? 12- Serum total protein miktarı hangi fraksiyonların toplamına eşittir? 13- Serum ve plazma arasındaki farklar nelerdir? Tanımlayınız. 14- Serum albumin, serum globulinlerini çöktürmek için hangi solüsyonlar kullanılır?

61 58 K AĞ I T K ROM AT O G R AFİSİ Laboratuvar Kağıt Kromatografisi 6 GENEL BİLGİ Kromatografi; bir karışımdaki, kimyasal yapıları çok az farklılık gösteren maddeleri, birbirinden ayrıştırmak veya saflaştırmak amacıyla kullanılan yöntemlerden birisidir. Yöntemi ilk kez geliştiren Rus botanikçi Mikhail Tsweet, bitki pigmentini kalsiyum karbonat (tebeşir) kolonundan geçirerek çeşitli renk bantları elde etmiş ve 1906'da yayınladığı makalesinde bu ayrışmanın kimyasalların adsorbsiyonuna bağlı olduğunu belirtmiştir. Beyaz tebeşir kolonda renkli bantların görülmesi üzerine chroma=renk ve graphe=yazı anlamında kromatografi terimini kullanmıştır yılında Martin ve Synge partisyon (partition) kromatografiyi geliştirerek suyla kaplı silika jel kolonunda monoamino monokarboksilik asitleri ayrıştırmayı başarmışlardır. Silika jelin istenilen performansı göstermemesi üzerine, bunun yerine kağıt kullanmışlar ve kağıt kromatografisini oluşturmuşlardır. Kromatografik sistemde, durgun ve hareketli faz olmak üzere iki faz bulunur. Durgun faz (katı veya sıvı) sabit, hareketli faz (sıvı veya gaz) ise akışkan haldedir. Ayrıştırılmak istenen moleküller durgun ve hareketli fazlar arasında dağılıp bir dengeye ulaşırlar. Hareketli faz içinde daha iyi çözünen ve durgun faza daha az ilgi gösteren bir molekül; hareketli fazda daha az çözünen ve durgun faza daha fazla ilgi gösteren bir başka moleküle oranla daha hızlı hareket edecek ve bu iki molekül birbirlerinden farklı alanlara göç ederek ayrışmış olacaktır. Eğer bu moleküller renkli maddeler ise doğrudan görüldükleri halde, renksiz maddeler ikinci bir boyama işlemini takiben görülebilirler. Değişik çalışma prensipleri içeren kromatografik yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemleri mekanizmalarına göre sınıflamak mümkünse de, aynı kromatografik sistem içinde birden fazla mekanizmadan yararlanmak da mümkündür. Başlıca kromatografi yöntemleri aşağıda özetlenmiştir. Adsorbsiyon: Durgun fazı oluşturan destek madde ile molekül arasındaki elektrostatik etkileşim, hidrojen bağları veya destek madde içinde molekülün dağılması gibi özellikler adsorpsiyon kromatografisinin temelini oluşturur. Moleküllerin hareket hızları, hareketli faz içinde çözülme oranlarına ve durgun faza olan ilgi derecelerine bağlı olarak değişkenlik gösterir ve kimyasal olarak farklı özellik içeren moleküller birbirlerinden farklı alanlara göç ederler. Durgun ve hareketli fazı oluşturan maddeler ayrıştırılmak istenen moleküllerin özelliklerine göre seçilir. Örneğin sıvı kromatografide genellikle üç tip adsorban madde kullanılır: non-polar, asit-polar ve bazik-polar. Partisyon (partition): Moleküllerin durgun ve hareketli fazlarda çözünme oranlarına bağlı olarak ayrıştırılmaları esasına dayanır. Normal faz partisyon kromatografide durgun fazda polar bir madde, hareketli fazda ise non-polar bir madde kullanılır. Genellikle adsorpsiyon ve partisyon mekanizmaları iç içe geçmiştir ve ayrıştırma işlemlerinde her iki mekanizma da rol oynamaktadır.

62 K AĞ I T K ROM AT O G R AFİSİ 59 İyon Değiştirici Kromatografi: Bu tip kromatografide moleküllerin iyonik yüklerinin yönü ve kuvveti ayrışmanın temelini oluşturur. İnorganik iyonlar, amino asitler, nükleik asitler ve proteinler bu tip ayrıştırma için ideal moleküllerdir. Katyonları ayrıştırmak için negatif yüklü gruplardan oluşan katyon-değiştirici reçineler (sülfonat veya karboksilat iyonları gibi); anyonları ayrıştırmak için ise pozitif yüklü gruplardan oluşan anyon-değiştirici reçineler (trietilaminoetil) kullanılır. Karışım halindeki numune kolona uygulandıktan sonra hareketli fazın ph'sı veya iyonik gücü değiştirilerek istenen özellikteki moleküllerin akışkanlığı sağlanır (şekil 1). Numune içindeki diğer madde ise kolonda kalır. ph veya iyonik gücü biraz daha değiştirilerek ikinci fraksiyonun da kolondan alınması mümkündür. Şekil 1. Kolon kromatografisi ile bir numunenin (A+B) ayrıştırılması. Affinite Kromatografi: Ayrıştırılmak istenen molekülün biyokimyasal özelliğine göre, durgun fazda onu bağlayabilecek özel yapıların kullanılması prensibine dayanır. En sık olarak enzim-substrat, hormon-reseptör veya antijen-antikor etkileşimleri kullanılır. Moleküler Eleme: Her ne kadar şekil ve hidrasyon durumları etken olsa da, temel olarak molekülleri büyüklüklerine göre ayrışmasını sağlayan bir kromatografi türüdür. Kağıt Kromatografisi Kağıt kromatografisi adsorpsiyon ve partisyon prensiplerinin bir arada kullanılması ile oluşturulmuş bir yöntemdir. Durgun ve hareketli fazların her ikisi de sıvıdır. Durgun fazı kağıtta bulunan selüloz lifleri arasına emilmiş olan atmosferdeki su buharı; hareketli fazı ise suda çözünmeyen (non-aquous) bir sıvı oluşturur. Kapiller boru etkisi ile durgun faz üzerinde hareket eden sıvı, kağıt üzerinde herhangi bir moleküle rastlayınca çözerek, onu da beraberinde sürüklemekte ve iki faz arasında dağıtmaktadır. Moleküller, hareketli faz içerisinde ne kadar çok çözünür ve durgun faz ile ne kadar az etkileşime girer ise, o kadar hızlı hareket edecektir. Kromatografide hareketli fazı oluşturan sıvı yukarı doğru ilerliyorsa buna asendan (çıkıcı), aşağı doğru ilerliyorsa buna da desendan (inici) adı verilir. Asendan kromatografide kapiller boru etkisinden, desendan da ise yer çekimi etkisinden yararlanılır (şekil 2). Asendan kromatografi prensibine göre numuneler kağıda uygulandıktan sonra (şekil 3) kağıt rulo haline getirilerek (iplikle tutturularak) hareketli fazın bulunduğu kaba yerleştirilir. Belli bir süre sonunda kağıt çıkarılarak çözücünün kat ettiği mesafe (y) ölçülür. Boyama işleminden sonra numunenin kat ettiği mesafe (x) ölçülür. Elde edilen x ve y ölçümleri aşağıda verilen eşitlikte yerlerine konarak R f (Relative to front ) değeri hesaplanır. R f x y

63 60 K AĞ I T K ROM AT O G R AFİSİ a. b. Şekil 2. Asendan (a) ve desendan (b) kağıt kromatografisi düzenekleri UYGULAMA Gereçler Kromatografi tankı: 1000 ml'lik beher Durgun faz: Whatman No.1 filtre kağıdı Ambalaj kağıdı: Çalışma esnasında Whatman kağıdını korumak amacıyla Pipet: Numuneleri uygulamak için Amino asit kromatografisi Ayıraçlar %2'lik Ninhidrin: Aminoasitleri boyamak için kullanılır. 2 gram ninhidrin bir miktar aseton içinde çözülerek 1 litreye aseton ile tamamlanır. Kahverengi bir şişede ağzı sıkıca kapatılarak saklanır. n-butanol:asetik asit:su (12:3:5): 120 ml n-butanol, 30 ml glasiyel asetik asit ve 50 ml arık su karıştırılarak hazırlanır. Amino asitlerin çözücüsü olarak kullanılır. %75 lik etil alkol: 375 ml %95 lik etil alkol 100 ml arık su ile karıştırılarak hazırlanır. Amino asitlerin standartlarının hazırlanmasında kullanılır. %0,3 lük amino asit standartları: 150 şer mg L-alanin, L-glutamik asit, L-prolin, L- treonin ve L-sistein minimum miktarda %75 lik etil alkol içinde çözülür; gerekirse bir kaç damla derişik HCl ilave edilir. Daha sonra 50 ml ye %75 etil alkol ile tamamlanır.

64 K AĞ I T K ROM AT O G R AFİSİ 61 Yöntem Whatman No.1 filtre kağıdı alınarak temiz ambalaj kağıdı üzerine konur. Ambalaj kağıdının kullanım amacı sadece Whatman kağıdının laboratuvar masası ile temasını engellemek ve el temasını en aza indirmektir. Yapılan deneyle hiçbir ilgisi yoktur. Kağıdın alt kısmından 2 cm. ölçülerek kurşun kalem ile bir çizgi çizilir. Çözücü ile temas ettiğinde dağılma olabileceğinden kesinlikle tükenmez veya dolma kalem kullanılmaz. Daha sonra bu çizgi üzerinde aralarında en az 2 cm kalacak şekilde beş nokta tespit edilerek bu noktaların etrafına 0,5 cm çapında daireler çizilir (şekil 3). Alanin için A, prolin için P, treonin için T, glutamik asit için G ve sistein için S yazılır. Şekil 3. Amino asit kromatografisi DİKKAT: Tüm işlemler sırasında Whatman kağıdına mümkün olduğu kadar dokunulmaması gerekmektedir. Hafif nemli bir parmak dahi, kağıt ninhidrin ile muamele edildiğinde parlak menekşe-mor bir renk verir. El terinde bulunan çok düşük derişimlerdeki aminoasitler dahi ninhidrin ile tepkime verirler. Numune uygulaması (aplikasyon) pastör pipeti veya mikropipet ile yapılır. Bir damla çözelti, kağıtta daha önceden kendisi için işaretlenmiş alana taşırmadan damlatılır, uygulanan miktarın iyice kuruduğundan emin olduktan sonra ikinci uygulama yapılır. Örnek aplikasyonu sırasında kağıdın alttan havalanabilmesi için alt ucuna kalem veya pipet konarak hafifçe havada tutulur. Bu uygulama işlemini 5 kez tekrar edilir. İşlemin tekrarlanma amacı uygulanan örneğin yoğunluğunu veya miktarını arttırmaktır. Birinci uygulama kurumadan ikincisine geçilmez. Uygulama sırasında 0,5 cm lik çap aşılmamalıdır. Bu çap aşıldığı taktirde yaygın leke elde edilir. Numunelerin uygulama işlemi bittikten sonra yine iyice kurumaları beklenir. Kuruduktan sonra kağıdın enlemesine olarak karşılıklı uçları bir araya getirilerek silindir bir boru şekli verilir ve bu uçlar iğne