2007 Her hakkı saklıdır

Transkript

1 YERLİ ALABALIKLAR (Salmo trutta sp. L.) ARASINDAKİ GENETİKSEL VARYASYONUN MİKROSATELİT MARKIRLAR KULLANILARAK BELİRLENMESİ Saltuk Buğrahan CEYHUN Doktora Tezi Su Ürünleri Anabilim Dalı 2007 Her hakkı saklıdır

2 ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ YERLİ ALABALIKLAR (Salmo trutta sp. L.) ARASINDAKİ GENETİKSEL VARYASYONUN MİKROSATELİT MARKIRLAR KULLANILARAK BELİRLENMESİ Saltuk Buğrahan CEYHUN SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI ERZURUM 2007 Her hakkı saklıdır

3 Doç. Dr. Abdulkadir ÇİLTAŞ danışmanlığında, Saltuk Buğrahan CEYHUN tarafından hazırlanan bu çalışma 23/11/2007 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Su Ürünleri Anabilim Dalı'nda Doktora tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan :Prof. Dr. Ramazan ŞEVİK İmza : Üye : Prof. Dr. Sıtkı ÖZTAŞ Üye : Prof. Dr. Telat YANIK İmza : İmza Üye : Doç. Dr. Abdulkadir ÇİLTAŞ imza : Üye : Doç. Dr. Orhan ERDOĞAN İmza : Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Mehmet ERTUGRUL Enstitü Müdürü

4 1 İÇİNDEKİLER ÖZET.2 ABSTRACT..3 TEŞEKKÜR..4 SİMGELER DİZİNİ.5 ŞEKİLLER DİZİNİ...6 ÇİZELGELER DİZİNİ.7 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Araştırma Yeri Balık Materyali Yöntem Materyallerin Fenotipik Varyasyon Analizi Materyallerin Genotipik Varyasyon Analizi a. Balık Materyallerinden Genomik DNA İzolasyonu b. İzole Edilen DNA ların Kalitatif ve Kantitatif Analizi c. Kullanılan Mikrosatelit Primerler d. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) e. PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi e. 1. Agaroz Jel Elektroforezi e. 2. Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) e. 3. Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi (SSCP) e. 4. Gümüş Boyama (Silver Staining) e. 5. Etidium Bromide Boyama f. İstatistik Analizler Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler Çalışmada Kullanılan Solüsyonlar ve Hazırlanışları ARAŞTIRMA BULGULARI Fenotipik Bulgular Genotipik Bulgular İzole Edilen Genomik DNA ların Kalitatif Analiz Bulguları İzole Edilen Genomik DNA ların Kantitatif Analiz Bulguları Elektroforez Görüntülerine Ait Bulguları İstatistiki Analizlere Ait Bulgular TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 95

5 2 ÖZET Doktora Tezi YERLİ ALABALIKLAR (Salmo trutta sp. L.) ARASINDAKİ GENETİKSEL VARYASYONUN MİKROSATELİT MARKIRLAR KULLANILARAK BELİRLENMESİ Saltuk Buğrahan CEYHUN Atatürk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Abdulkadir ÇİLTAŞ Bu çalışmada Türkiye de bulunan 2 si göl 3 ü derede yaşayan 5 doğal Salmo trutta L. populasyonu arasındaki fenotipik özellikler ve 10 mikrosatelit markır kullanılarak genotipik varyasyon araştırılmıştır. Mikrosatelit bölgelere SSCP uygulamaları ile her lokustaki allel sayıları tespit edilmiştir. Çalışılan 10 adet mikrosatelit lokusta toplam 62 adet allel gözlenmiştir. Faktöriyel benzerlik analizi sonucu tüm populasyonların birbirlerinden ayrı gruplar oluşturduğu kaydedilmiştir. Tüm lokuslar bazında beklenen heterozigotluğun (He) arasında ve gözlenen heterozigotluğun (Ho) değerleri arasında değiştiği saptanmıştır. Ağrı Balıklı göl populasyonunda Ho değeri He değerinden istatistiki olarak önemli derecede yüksek çıkmıştır (p<0.05). Populasyon için populasyon içi fiksasyon indeksi (F IS ) değerlerinin (Ağrı Balıklı Göl) ile (Yeşildere) arasında değiştiği, tüm lokuslar için hesaplanan populasyonlar arası genetik çeşitlilik (F ST ) değerinin ise olduğu saptanmıştır. Populasyonlar arası hesaplanan F ST değerlerine göre, populasyonlar arası genetik mesafelerden 4 ü önemli bulunmuştur. Beş populasyondan 4 ünün Hardy-Weinberg dengesinde (HWE) olduğu belirlenmiştir. Populasyon içi genetik mesafenin dere formlarına göre göl formlarında daha kısa olduğu görülmüştür. 2007, 82 sayfa Anahtar Kelimeler: Salmo trutta, mikrosatelit, SSCP, genetik varyasyon

6 3 ABSTRACT Ph. D. Thesis DETERMINATION OF GENETICAL VARIATIONS OF INDIGENOUS TROUT SPECIES (Salmo trutta sp. L.) WITH MICROSATELLITE MARKERS Saltuk Buğrahan CEYHUN Ataturk University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Fishery Sciences Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Abdulkadir ÇİLTAŞ In this study phenotypic properties and genotypic differences of 5 different trout populations, 2 of them found in lakes and 3 of them in rivers, were compared by using microsatellite markers. Allele numbers in each locus were determined by application of SSCP to the microsatellite sections. A total of 62 alleles were observed from 10 microsatellite locus. According to the results from factorial correspondence analysis, it was determined that all of the populations were formed different groups from each other. Considering all locus, expected heterozygosity (He) and observed heterozygosity (Ho) values were changed from and respectively. Ho value was significantly (p<0.05) higher than He value of populations of Ağrı Balıklı Lake. Fixation index for subpopulations (F IS ) values were ranged from (Ağrı) (Yeşildere) in populations and the overall average diversity between populations (F ST ) value of the all locus was calculated as According to F ST values calculated from between populations, 4 of the genetic distances between populations were found significant (p<0.05). It was determined that 4 of the 5 populations were at the Hardy-Weinberg equilibrium. Considering genetically distance in populations, it was observed that the distance was shorter in lake forms compared to River forms. 2007, 82 pages Keywords: Salmo trutta, microsatellite, SSCP, genetic variation

7 4 TEŞEKKÜR Doktora tezi olarak sunduğum bu çalışmanın yürütülmesi esnasında her konuda yardımlarını gördüğüm ve engin tecrübesinden yararlandığım saygıdeğer hocalarım Sayın Doç. Dr. Abdulkadir ÇİLTAŞ ve Sayın Doç. Dr. Orhan ERDOĞAN minnetlerimi sunarım. Çalışma Atatürk Üniversitesi Fon Saymanlığı tarafından desteklenmiştir. Bu bağlamda projeye destek veren Atatürk Üniversitesi Rektörlüğü ne teşekkürü bir borç bilirim. Engin bilgi ve tecrübelerini tüm iyi niyeti ile bizlerle paylaşan ve çalışmanın önemli bir bölümünü yürüttüğümüz laboratuarlarının imkanlarını bizlere açan çok değerli hocam Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Sıtkı ÖZTAŞ a en derin minnet ve şükranlarımı sunarım. Yine aynı bölümün tüm personeline özelliklede Sayın Dr. Ebru MARZİOĞLU na yardımlarından dolayı teşekkürü bir borç bilirim. Arazi çalışmalarında yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen meslektaşlarım ve mesai arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım. Çalışmanın her aşamasında yardım ve desteklerini esirgemeyen fedakar meslektaşım ve arkadaşım Sayın Arş. Gör. Ercüment AKSAKAL a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bu günlere gelmemde hiç şüphesiz hadsiz emekleri olan aileme sonsuz minnet ve sevgilerimi sunarım. Nişanlılığımızın ilk dönemlerine tekabül eden çalışma sürecinde nazik anlayışından dolayı hayat arkadaşıma sevgi ve şükranlarımı iletirim. Saltuk Buğrahan CEYHUN Kasım 2007

8 5 SİMGELER DİZİNİ AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism APS Amonyum-per-sulfat bp Baz çifti DAF DNA Amplified Fingerprinting dntp Deoksiribonuklezid trifosfat F IS F IT F ST He Ho ISSR kb ma mm mtdna fixation index for subpopulations (pop. içi fiksasyon indeksi) total fixation index (tüm populasyonlar için fiksasyon indeksi) average diversity between pop. (pop. arası genetik çeşitlilik) Beklenen heterozigotluk (Expected heterozygosity) Gözlenen heterozigotluk (Observed heterozygosity) Inter Simple Sequence Repeat Kilo baz Mili amper Mili molar Mitokondrial deoksiribo nükleik asit µl Mikro litre OD Optik dansite PAGE Poliakrilamid jel elektroforezi PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonunu RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SAMPL Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci SCAR Sequence Characterized Amplified Region SSCP Single-Strand Conformation Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat STS Sequence Tagged Sites TEMED N,N,N',N'- tetrametil-etilendiamin UV Ultraviolet V Volt

9 6 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1. PCR Döngüsü Aşamaları Şekil Ağrı Balıklı Göl, avcılıkta kullanılan kıyı sürütme ağı ve çalışma ekibinden bir görünüş Şekil Bolu Abant Gölü, avcılıkta kullanılan olta takımları ve çalışma ekibinden bir görünüş Şekil Erzurum Merkez Yeşil Dere den bir görünüş Şekil Erzurum Merkez Yeşil Dere nin Karasu/Fırat Havzası ndaki konumu Şekil Tekman Hamzanlar Deresi nden bir görünüş Şekil Hamzanlar Deresi ve Ağrı Balıklı Göl ün Aras Havzası ndaki konumu Şekil İspir Yağlı Dere ve çalışma ekibinden bir görünüş Şekil Yağlı Dere nin Çoruh Havzası ndaki konumu Şekil Her bir populasyona ait balık materyali Şekil Kullanılan BioRad Manuel Sequencer System Şekil GeneSnap version 6.05 programı kullanılarak allel uzunluklarının belirlenme işlemlerinden bir görüntü Şekil Materyallere ait röntgen görüntüleri Şekil İzole edilen genomik DNA ların % 1 lik agaroz jel elektroforezindeki görüntüleri Şekil T3-T13 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri Şekil Strutta-12 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri Şekil Strutta-58 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri Şekil BS131 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri Şekil FGT1 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri Şekil Faktöriyel benzerlik analizi sonucu populasyonların 3 boyutlu düzlemdeki görüntüleri Şekil Populasyonlar arasındaki genetiksel ayrımı gösteren ağaç Şekil Populasyonlar arasındaki genetiksel ayrımı gösteren dendogram Şekil Bireyler arasındaki genetiksel ayrımı gösteren ağaç Şekil Bireyler arasındaki genetiksel ayrımı gösteren dendogram... 71

10 7 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Araştırma yerleri ve koordinatları Çizelge Kullanılan balık materyalleri ve ait oldukları populasyonlar Çizelge Salmo trutta sp. lerin bazıları için bazı diagnostik değerler Çizelge Kullanılan mikrosatelit primerler ve özellikleri Çizelge Primerler için kullanılan PCR protokolleri Çizelge PCR karışımının muhteviyatı Çizelge Çalışmada kullanılan araç ve gereçler Çizelge Populasyonlara ait bazı diagnostik veriler Çizelge İzole edilen DNA örneklerinin ortalama absorbans değerleri ve konsantrasyonları Çizelge Populasyon ve mikrosatelit lokus başına gözlenen allel sayıları Çizelge Beklenen heterozigotluk (He) değerlerinin her bir mikrosatelit lokus için populasyonlara göre dağılımı Çizelge Gözlenen heterozigotluk (Ho) değerlerinin her mikrosatelit lokus için populasyonlara göre dağılımı Çizelge Tüm populasyonlarda her bir mikrosatelit lokus için ortalama He ve Ho değerleri ve allel sayıları Çizelge Tüm mikrosatelit lokuslarda populasyonlar için He ve Ho değerleri Çizelge Populasyonların her birisi için F IS değerleri Çizelge Populasyonlar arası hesaplanan F ST değerleri Çizelge Nei ye göre hesaplanan populasyonlar arası genetik mesafeler (D A ) Çizelge Her bir mikrosatelit lokusta gözlenen alleller (A) ve frekansları Çizelge Kullanılan 6 lokusta gözlenen allel sayılarının Estoup et al. (1998) ile karşılaştırılması

11 8 1. GİRİŞ Moleküler biyoloji, hücre biyolojisi ve genom bilimi alanlarındaki bilimsel ilerlemeler sonucu, dünyada özellikle sağlık ve ziraat alanlarındaki biyoteknolojik uygulamalarda bir patlama yaşanmakta; modern biyoteknoloji ya da yeni biyoteknoloji olarak tanımlanan bu gelişmeler, insanlığa daha sağlıklı ve daha kaliteli bir yaşam için eşi görülmemiş fırsatlar oluşturmaktadır. Gelişmiş ülkeler bu fırsatları hızla ekonomik faydaya dönüştürmeyi başarmış ve biyoteknoloji sektörü, ekonomilerinin itici güçlerinden biri haline gelmiştir. Türkiye, dünyadaki bu gelişmeler karşısında henüz kararlı ve tutarlı bir tavır alamamıştır. AB adaylığı ile ivme kazanan toplumsal değişim hareketi sağlık, tarım, hayvancılık ve endüstriyel üretim alanlarında moleküler biyoloji bilimi ve yeni biyoteknoloji alanlarını kucaklamak durumundadır. Bu alanlar için Vizyon 2023 çalışmasında belirlenmiş somut hedeflerin öngörülen yol haritalarına sadık kalmak suretiyle gerçekleştirilebilmesine bağlı olarak, Türkiye 20 yıl gibi kısa bir dönemde moleküler biyoloji, biyoteknoloji ve gen teknolojilerinde küresel bir güç haline gelme şansına sahiptir. Böyle bir güç, ülkemize 21. yüzyılın teknolojisi olarak tanımlanan biyoteknolojide sadece insanımızın yaşam kalitesini yükseltmekle sınırlı kalmayıp ekonomik ve teknolojik bir üstünlük kazandıracaktır. Ülkemiz bu güç ve üstünlüğün ilk işaretlerini 5 10 yıl gibi kısa bir sürede sağlık ve ziraat sektörlerinde görmeye başlayacak; bu başarıların kazandırdığı ivme ile uzun dönemde daha iddialı ve kapsamlı hedeflere yönelebilecektir. Zirai ürünlere yönelik araştırmalarda moleküler genetik tekniklerin kullanımı 1950 li yıllardan beri giderek artış göstermektedir. Bu artışın nedeni uygun tekniklerin ve genetik bilgilerin önemi üzerine olan ilginin artmasıdır. Su ürünleri alanında yapılan ilk çalışmalar özellikle morinalarda, salmonidler ve ton balıklarında kan grubu farklılıkları üzerine olmuş ve populasyon yapısının analizinde kullanılmak üzere genetik olarak kontrol edilen varyasyonların mevcudiyeti başarılı bir şekilde ortaya konulmuştur. Fakat

12 9 bu serolojik işlemler balıkçılık çalışmalarına tam olarak adapte olamadığı için kısa süre içinde yerini protein polimorfizminin genetik olarak belirlendiği elektroforetik işlemlere bırakmıştır. Kolay, hızlı ve ucuz olan protein elektroforezi ile çoğu bitki ve hayvan türlerindeki populasyon farklılıkları etkin bir şekilde tespit edilebilmiştir. Protein veya allozim elektroforezi, nükleer DNA daki farklılıkları dolaylı olarak tahmin etmektedir. Fakat direk tahminler ancak kesici enzimlerin izolasyonu ile mümkün olmuştur. Bu enzimler DNA yı spesifik baz dizilimlerinden kesmekte ve elektroforez jeli üzerinde dağılabilen farklı büyüklükte parçalar oluşturmaktadır. Bu teknolojinin başlangıçtaki kullanımı çoğunlukla mitokondriyal DNA lar (mtdna) üzerinde olmuştur. Çünkü mtdna lar küçük boydadır ve elde edilmeleri kolaydır. Fakat son zamanlarda kesici enzimlerin nükleer DNA lar üzerine kullanımı giderek artmaktadır (Çiftçi 2003). Biyoloji alanındaki gelişmeler moleküler biyolojide dev adım kabul edilen DNA nın yapısının açıklanmasından sonra büyük bir hız kazanmıştır. Kary MULLIS un 1983 yılında mevcut yöntemleri geliştirerek ve duyarlılıklarını artırarak, DNA nın aslına sadık kalarak in vitro çoğaltma esasına dayalı bir teknik olan Polimeraz Zincir Reaksiyonunu (PCR) geliştirmesi bir çığır açmış, moleküler ve biyokimyasal alanda bitkisel ve hayvansal organizmaların gerçek orijinleri olan filogenetik (akrabalık ilişkisi) sınıflandırmaları yapılmaya başlanmıştır. In vitro koşullarda istenilen bir genin ya da özgün bir DNA dizisinin çok sayıda kopyasının elde edilmesi için rekombinant DNA yöntemleri ile DNA klonlanmasına ek olarak, 1983 ten sonra PCR da kullanılmaya başlamıştır. PCR ile istenilen genlerin yada DNA dizilerinin jenerasyonlara bağlı replikasyonu hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir. PCR, özgün bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro bir yöntemdir. PCR ın oluşum mekanizması, çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere iki oligonukleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Kalıp DNA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde denatüre edildikten sonra, tek iplikli DNA molekülleri üzerinde

13 10 kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle eşleşirler. Primerlerin özgün olarak hedef dizilere bağlanması düşük sıcaklık derecelerinde gerçekleşir. DNA polimeraz enzimi uygun tampon ve 4 çeşit deoksiribonukleozid trifosfat (dntp) varlığında primerin 3 hidroksil ucundan uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsü; Denatürasyon Primerin bağlanması (annealing) Uzama (extension) olarak adlandırılan 3 aşamadan meydana gelir. Ardı ardına tekrarlanan denatürasyon, primerlerin bağlanması ve primerlerin uzaması evreleriyle DNA parçaları üstsel olarak artar (Şekil 1.1). Şekil 1.1. PCR Döngüsü Aşamaları (Anonymous 2007)

14 11 Bir döngü sonucu sentezlenen ürünler, ardışık döngüde diğer primerler için kalıp görevi görürler. Her PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır. Her döngünün %100 verimle gerçekleştiği varsayılırsa, 20 döngü sonucu 2 20 kat ürün meydana gelir. PCR verimini etkileyen önemli bir faktör, DNA polimeraz enzimidir. Normalde enzim miktarı PCR döngüsü sonucunda hedef dizi artışı ve termal denatürasyon nedeniyle sınırlayıcı bir etken haline gelir. Bir diğer faktör ise, konsantrasyonu artan hedef dizilerin primer ile bağlanma yarışıdır. PCR ın temel bileşenlerini ise şöyle sıralayabiliriz; Kalıp olarak kullanılan DNA molekülü DNA polimeraz enzimi Primerler dntp karışımı MgCl 2 Kalıp DNA: PCR da kalıp DNA olarak plazmid ve faj DNA ları, çeşitli genler, hatta herhangi bir DNA parçası kalıp olarak kullanılabilir. Bu DNA parçaları amaca göre cdna, genomik DNA veya genom kitaplıkları halinde, ya araştırma laboratuarlarından ya da ticari olarak elde edilebilirler. Polimerazlar: Kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana getirmek üzere orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak 4 çeşit dntp uzun polinukleotid zincirin sentezini kataliz ederler. Bu enzimler sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DNA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. Sentezin yönü 5 uçtan 3 uca doğru olup primerin serbest 3 hidroksil ucuna ortamdaki dntp leri nükleofilik etki yapmalarıyla fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır.

15 12 Termostabil DNA polimeraz enziminin PCR da kullanılmaya başlanması, araştırma ve klinik laboratuarlarında rutin olarak yapılan deneylere teknolojik olarak büyük bir avantaj sağlamıştır. Önceleri kullanılan Escherichia coli nin DNA polimeraz I enzimi sıcaklığa dayanıklı olmadığı için, her PCR döngüsünde denatürasyon aşamasından sonra yeniden enzim ekleme zorunluluğu duyulmaktaydı. Termostabil DNA nın bulunmasından sonra bu problemde ortadan kalkmıştır. Termostabil DNA polimerazlardan PCR da en yaygın olarak kullanılanı, Thermus aquaticus tan elde edilen Taq DNA polimerazdır. Primerler: Gen çoğaltılması dahil PCR ın birçok uygulaması için kalıp DNA nın komplementeri olan primerlere gereksinim vardır. Genel olarak kullanılan kalıp ile yüksek oranda bağlanma sağlamak üzere primerler nükleotid uzunluğundadır. Tasarım yapılırken mümkün olduğunca 4 bazın eşit sayıda kullanımına dikkat edilir. Primerlerin polipurin, poliprimidin ya da tekrarlı bölgeler içermesi ve primer çiftlerinin 3 uçlarının birbirine ya da primer içindeki bir bölgeye komplementer olması istenmez. dntp Karışımı: dntp ler yüksek saflıkta ya tek tek (datp, dttp, dgtp, dctp) yada dörtlü karışım halinde ticari olarak sağlanır. Taq DNA polimeraz düşük dntp konsantrasyonlarında ( µm) kalıba uygun doğru bazları seçmede daha başarılı olmakla birlikte normal koşullarda PCR 100 µm dntp konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. Ayrıca optimum dntp konsantrasyonu; MgCl 2 konsantrasyonuna, Reaksiyon koşullarına, Primer konsantrasyonuna, Çoğaltılmış ürünün boyuna, PCR döngü sayısına bağlıdır.

16 13 Tamponlar ve MgCl 2 : En çok kullanılan tampon, Taq/Amplitaq enzimlerine özgü olan tampondur. PCR buffer ismi ile ticari olarak temin edilebilen 10x tamponlar içerik olarak; oda sıcaklığında ph 8,3 te 100 mm Tris-HCl ve 500 mm KCl ihtiva eder. MgCl 2 tamponla birlikte olabildiği gibi ayrıda kullanılabilmektedir. MgCl 2 ün reaksiyon karışımındaki final konsantrasyonu değişmekle birlikte genellikle 0,5 5,0 mm lık değerler arasında çalışılır. Mg +2 iyonları dntp ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar, polimeraz aktivitesini arttırırlar ve çift iplikli DNA nın Tm değerini (çift iplikli nükleik asit moleküllerindeki baz çiftlerinin yarısının ortadan kalkmasına yol açan sıcaklık derecesi) arttırırlar, ayrıca primer-kalıp etkileşimini sağlarlar. Bu nedenle MgCl 2 ün PCR ın ürün verimi üzerinde çok önemli etkisi vardır. Düşük Mg +2 konsantrasyonu ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg +2 konsantrasyonu ise özgün olmayan ürün birikimine yol açar. Optimum Mg +2 konsantrasyonu olarak 1,0 2,5 mm lık değerler seçilir yılında iki ayrı araştırmacı grubu Welsh and Mcclelland (1990) ve Williams et al. (1990) genomik DNA nın baz dizilimini bilmemize gerek kalmadan PCR yöntemi ile tek bir primer kullanılarak genetik farklılığının tespiti için iki farklı yöntem geliştirmişlerdir. Bu yöntemler temelde aynı prensibe dayanır, ancak isim olarak farklıdırlar. Bu yöntemlere Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) ve Arbitrarily Primed-PCR (AP-PCR) ismi verilmiştir. Sonraki yıl Caetano-Anolles et al. (1991) benzer bir yöntem olan DNA Amplified Fingerprinting (DAF) i geliştirmişlerdir. Türlerin ayrımı gibi biyokimyasal protein yapı farklılığı ön plana çıktığı durumlarında; Restriction Fragment Length Polymorphism / Kesilmiş Bant Uzunluğu Farklılığı (RFLP) analizi gibi kesilmiş DNA bölgeleri arasındaki baz dizilimi farklılığı veya RAPD, Sequence Characterized Amplified Region / Baz Dizilimi Belirlenmiş Çoğaltılan Bölge (SCAR), Amplified Fragment Length Polymorphism / Çoğaltılan Parça Uzunluğu Farklılığı (AFLP), Sequence Tagged Sites / Dizisi Etiketlenmiş Alanlar (STS), Inter Simple Sequence Repeat / Tekrarlanan Basit Baz Dizilimi Arası (ISSR), Simple Sequence Repeat = Tekrarlanan Basit Baz Dizilimi (SSR) ve Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci / Polimorfik Mikrosatelit Lokusların

17 14 Seçilmiş Çoğaltımı (SAMPL) gibi PCR tabanlı DNA analiz yöntemlerine başvurulabilir (Dunham 2004). Bu analiz yöntemlerinden genetiksel varyasyon, tür belirleme ve populasyonların genetiksel analizleri için kullanışlı ve yüksek derecede polimorfik olan mikrosatelitler, 1 6 baz çifti uzunluğundaki tekrar ünitelerini içeren, kısa ardışık tekrarlı dizi motifleridir. Bu motifler yüksek miktarda ökaryotik genomlarda bulunmakla beraber prokaryotlarda da düşük frekanslarda bulunmaktadırlar ve tüm genom boyunca dağılmışlardır. Örneğin memelilerde en yaygın motif olan GT/AC, ortalama her 30 kb da bir ortaya çıkmaktadır. Mikrosatelitlerin genom içinde kodlayıcı ve düzenleyici fonksiyonları olduğu düşünülmektedir (Dunham 2004). Mikrosatelitler ileri derecede polimorfik DNA işaretleyicileri olup, balıklar dahil birçok türde geniş bir uygulama alanına sahiplerdir. Tüm genoma hemen hemen eşit dağılmış olmaları bunların genom haritalama projeleri için kullanışlı olmalarını sağlamaktadır. Populasyon genetiği, paternite ve akrabalık tayininde sahip oldukları yüksek çeşitlilik onları genetik bir işaretleyici haline getirmiştir. Mikrosatelitler, doğal populasyonların yapılarının araştırılmasında gün geçtikçe daha çok önem kazanmaktadırlar (Hoelzel 1998; Dunham 2004). Mikrosatelit mutasyonları, intramoleküler bir mutasyon mekanizmasının neden olduğu tekrar sayılarındaki değişikliklerdir. En yaygın mutasyonlar tek bir tekrar ünitesinin değişiklikleridir. Bu tür mikrosatelit mutasyonlarında, mutasyon sürecinin basamak basamak yorumlanma olanağı vardır. Tekrar ünitelerine bitişik olan primerler PCR amplifikasyonu için kullanılmaktadır. Mikrosatelitlerin allellik durumu PCR aracılığıyla ortaya koyulmaktadır. Yüksek çözünürlükteki jeller üzerindeki PCR ürünlerinin ölçülmesi, tekrar sayısını belirleme ve farklı alleller arasındaki tekrar sayılarındaki varyasyonu ortaya koyma olanağı sağlar (Hoelzel 1998; Dunham 2004). Mikrosatelit uzunluk varyasyonu, spesifik primerler kullanılarak PCR ile kolayca belirlenebilir. Bir tür için geliştirilen PCR primerleri, yakın türlerde de kullanılabilir.

18 15 Mikrosatelitler kullanılarak oluşturulan genetik işaretleyiciler, ekonomik özellikleri kontrol eden genlerin haritalanmasında önemli bir rol alır. Herhangi bir mikrosatelit bölgenin amplifikasyonundan önce, spesifik primerlerin dizaynı için mikrosatelit bölgeye komşu DNA iplikçiğinin dizilim bilgisi sağlanmalıdır. Bazı model organizmaların mikrosatelit dizileri ve onlara komşu diziler internet ortamındaki veri bankalarına kaydedilmektedir. Böylece çok sayıda tür için mikrosatelitlere özgü primer bilgisi içeren merkezler oluşturulmaktadır (Hoelzel 1998; Dunham 2004). Mikrosatelitler cinsiyet, paternite, akrabalık, verim ve bağışıklık özellikleri gibi birçok kriterin araştırılması gibi oldukça geniş bir uygulama alanına sahip bir markırdır. Mikrosatelitlerin sahip olduğu yüksek çeşitlilik, ana ve yavrunun genotiplerinin karşılaştırılması ve paternal allelin tanınmasına olanak verir. Populasyondaki allel frekansına bağlı olarak paternal yansımalar hesaplanabilir (Hoelzel 1998; Dunham 2004). PCR ile çoğaltılmış bir mikrosatelit allelinin en yaygın görünümü, tek bir bant değil bir bantlar merdivenidir. Genellikle en yoğun bant, beklenen allel ölçüsünde ortaya çıkar. Tekrarlayan bantlar olarak ifade edilen ilave bantlar, genellikle orijinal allelden küçük olup, çok sayıda tekrar üniteleri ile uzunluk farkı gösterirler. Benzer şekilde tekrarlayan bantlar PCR amplifikasyonu boyunca in vitro DNA slippage in sonucudur. Tekrarlayan bantların jel üzerinde azalan yoğunluğu DNA slippage dağılımının bir yansımasıdır. İn vitro DNA slippage oranları tekrar ünitesi uzunluğunun artmasıyla azalmaktadır. Dinükleotid tekrarları, trinükleotid tekrarlarına göre daha çok tekrarlayan bant oluşturmaktadır. Tekrarlayan bantlara ilave olarak birçok mikrosatelit beklenen allel ölçüsünden fazla ilave bant gösterebilmektedir (Hoelzel 1998). PCR ile elde edilen ürünlerin görüntülenmesinde ise yaygın olarak kullanılan teknik elektroforez yöntemidir. Elektroforez, yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin izlendiği bir tekniktir. Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik yüklerinin kütlelerine oranıyla belirlenen hızlarda elektriksel alanda hareket etmeleri prensibine dayanır. Elektroforez işlemi jel ortamında yapılır. Ayırımı yapılacak

19 16 moleküllerin hareketi, moleküllerin yüküne, boyutuna, biçimine kimyasal içeriğine ve uygulanan elektriksel alana bağlıdır. Aralarındaki başlıca farkın destek ortamının tipi ve konumu olmak üzere farklı elektroforez tipleri mevcuttur. Dikey yada yatay konumdaki destek ortamı selüloz yada ince (poliakrilamid veya agaroz) jellerden hazırlanmış olabilir. En yaygın olarak kullanılan elektroforez çeşitlerinden bir tanesi poliakrilamid jel elektroforezidir (PAGE). Akrilamidin polimerizasyonu ile hazırlanan poliakrilamid jellerin elektroforetik ayırımlarda çeşitli üstünlükleri vardır. Küçük yada orta boydaki nükleik asitler ve proteinler için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir. Proteinler için çok uygun olduğu gibi DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir. Akrilamid miktarı ve akrilamid/bisakrilamid oranı jelin ayrıştırma kapasitesini belirler. Akrilamid/bisakrilamid oranı yükseldikçe jellerde ısınma fazlalaşır, kırılganlık artar, daha kolay yıkanır. Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez, örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmalarına yol açar çünkü ayrışım hem moleküler elekleme hem de elektroforetik harekete dayanır. Polimerleşme reaksiyonunda akrilamid molekülleri yan yana bağlanarak düz zincirler oluştururlar. Bisakrilamid molekülleri ise iki akrilamid zinciri arasında çapraz bağlanmalar oluşturur. Böylece ağımsı bir yapı meydana gelir. Polimerleşme derecesi; sıcaklık, ph, amonyum-per-sulfat (APS) ve N,N,N',N'-tetrametil-etilendiamin (TEMED) miktarına göre farklılık gösterir. Polimerleşme için serbest radikal oluşuma sebep olan APS reaksiyon başlatıcı, TEMED ise katalizör olarak rol oynar. Fakat PAGE daha çok proteinlerin ve küçük DNA parçalarının ayırımı ve analizi için kullanışlıdır. Poliakrilamid jeldeki küçük por boyutları büyük DNA molekülü parçalarının ayırımı için uygun değildir. Bunun için diğer bir yöntem olan agaroz jel elektroforezi kullanılır. Nükleik asitlerin agaroz jeldeki hareketleri agaroz konsantrasyonu ile nükleik asit moleküllerinin boyutları ve şeklinden etkilenir.

20 17 Mikroorganizma genomundaki bazların haritasının çıkarılması olarak tanımlanan dizi analizi (sequencing) moleküler teknikler arasında en klasik ve güvenilirliği nedeni ile referans yöntem olarak kullanılan yöntemdir. Lakin uygulama ve değerlendirme güçlüğü, yüksek maliyet ve zaman alıcılığı nedenleri ile laboratuarlarda rutin olarak uygulanması güçtür. Bu zorlukları egale etmek amacı ile geliştirilmiş alternatif bir yöntem Single-Strand Conformation Polymorphism / Tek Sarmal Yapısal Polimorfizm (SSCP) dir. Amplifiye ürünler ısı ile denatüre edilip çift yapılı sarmal ayrıldıktan sonra renatürasyonu önlemek amacı ile buzlu ortama aktarılır. Tek sarmal olarak yeni bir konformasyon kazanmış olan DNA lar nondenatüre poliakrilamid jele yüklenirler. Kazanılan yeni konformasyon bağlı olarak elektroforezdeki yürüme farklılığından kaynaklanan polimorfizm tespit edilir (Turenne 2000). Moleküler biyoloji alanında yaygın olarak kullanılan bu teknikler sayesinde canlıların DNA dizin haritalarının çıkarılması, diğer canlılarla benzerlik ve farklılıklarının tespit edilmesine yönelik çalışmalar hız kazanmıştır. Gelişen bu teknikler sayesinde genom üzerinde bulunan ve karakterleri kodlayan genler belirlenmeye başlanmıştır. Belirlenen bu genlerden önemli olanlar ıslah çalışmaları ile geliştirilmesi arzu edilen bireylere aktarılmaya çalışılmaktadır. Su ürünleri sahasında Salmonidler, üzerinde en fazla çalışılmış olan türlerdendir. Bunun nedenleri ise; ilginç hayat hikayeleri, gerek türler arası (Ovenden et al. 1993) gerekse aynı türün farklı ortamlarda yaşayan stokları arasındaki genetik farklılıklar (Liskauskas and Ferguson 1991), dış görünüşünün ilgi çekici olması, et özellikleri ve yetiştiricilik çalışmalarında başarı oranının diğer türlere nazaran yüksek olmasıdır (Çelikkale 1994). Salmonidea familyasına mensup, yağ yüzgeçleri ile karakterize edilen ve Türkiye sularına doğal olarak girmiş olan alabalıkların tamamı Salmo cinsi ve trutta türünden olup 4 coğrafik ırka ayrılarak incelenmiştir. Fakat bu ırkların bazıları henüz tartışmalı durumlar sergilemektedirler, çünkü ayrı ırk olarak kabul edildikleri halde, bazı sularda her iki ırka ait bireyleri bir arada görme olasılığı vardır. Bu bakımdan Türkiye alabalıklarının alt tür seviyesindeki taksonomik durumu henüz kesinlik kazanmış değildir. Ancak ileride yapılacak elektroforetik çalışmalarla kesin olarak ayrımın

21 18 sağlanabileceği (Aras 1976; Geldiay ve Balık 2002) tavsiyesi, moleküler gen teknolojisinin de gelişimi ile sahip olunan imkanlar doğrultusunda bu çalışmayı yapma ihtiyacını doğurmuştur. Bu amaçla, Salmonidea familyasına mensup ülkemizde yaşayan ikisi göl üçü dere olmak üzere toplam 5 doğal alabalık populasyonu arasındaki fenotipik ve genotipik varyasyon ortaya koyulmaya çalışılmıştır.

22 19 2. KAYNAK ÖZETLERİ Alabalık türleri sistematikte Salmonidae familyasında yer alırlar ve morfolojik olarak yağ yüzgeci ile karakterize edilirler. Salmonidae familyasına mensup bu alabalıklar yetiştiricilik ve doğal suların balıklandırılması için önem arz eden üç cinsin türleridir. Bu cinsler şunlardır; a- Salmo b- Salvelinus c- Oncorhynchus Dünya genelinde en çok tanınan alabalık türleri aşağıdaki gibidir; (Bruno and Poppe 1996). Salmo salar Linnaeus (Atlantik Salmonu) Salmo trutta f. trutta Linnaeus (Deniz alabalığı) Salmo trutta f. fario Linnaeus (Dere alabalığı) Oncorhynchus mykiss Walbaum (Gökkuşağı alabalığı) Salvelinus fontinalis Mitchill (Kaynak alabalığı) Salvelinus alpinus Linnaeus (Alp alabalığı) Salhvelinus namaycush Walbaum (Göl alabalığı) Ülkemiz sularında yaşayan yerel alabalık alt türleri ise şöyle sıralanabilir; Salmo trutta macrostigma Dumeril (Anadolu Dağ alabalığı) Salmo trutta abanticus Tortonese (Abant alabalığı) Salmo trutta caspius Kessler (Aras alabalığı) Salmo trutta labrax Pallas (Karadeniz alabalığı) Geldiay ve Balık (1996) Salmo trutta labrax ırkının ülkemizde yaşayan ve birbirinden farklı natio marina, natio fario ve natio lacustris isimlerinde 3 ekotipinin mevcut olduğunu Slastenenko (1955) ten aktarmıştır. Tortonese (1954) alabalıklar üzerine yaptığı araştırmada Türkiye de Salmo trutta tür ünün S. trutta labrax, S. trutta macrostigma, S. trutta caspius ve S. trutta abanticus olmak üzere dört alt tür şeklinde temsil edildiğini tespit etmiştir.

23 20 Aras (1976) Çoruh ve Aras havzası alabalıkları üzerinde biyo-ekolojik araştırmalar yapmıştır. Değerli hocamız çalışmasında söz konusu havzalarda yaşayan alabalıklar hakkında referans bilgiler sunmuştur. Kuru (1975) Dicle-Fırat, Kura-Aras, Van Gölü ve Karadeniz havzası tatlı su balıklarının sistematik ve zoocoğrafik yönden incelenmesi konulu ve Doğu Anadolu balık faunası üzerine araştırmalar yapmıştır. Kuru (1980) çalışmasında, o zamana kadar Türkiye de tespit edilmiş iç su balıklarının resimlerini ve haritalar üzerinde yayılış alanlarını vermiştir. Kocaman vd. (2004) Karasu Irmağı nın kaynaklarından Tekederesi nde yaşayan Salmo trutta macrostigma (Dumeril, 1858) nın bazı büyüme özelliklerini incelemişlerdir. Was and Wenne (2002) tarafından yapılan bir çalışmada; Deniz alarının, Baltık Denizi nde ticari öneme sahip, yumurtlamak için doğduğu ırmaklara göç eden önemli salmonid türlerinden birisi olduğu bildirilir. Yine deniz alalarının Atlantik soyuna ait olduğu ve Avrupa kahverengi alabalıklarının anadromik bir formu olduğu kaydedilmiştir. Yumurtlamak için ırmaklara göç eden doğal alalar ile kuluçkalıklarda üretilenler arasındaki genetik varyasyonu çalışmak amacıyla mikrosatelit bölgeler kullanılmıştır. Polimorfizmi Ssa197, Ssa171, Ssa85, Str15 ve Str73 olmak üzere beş bölgede değerlendirmişlerdir. Çalışmada PCR ürünleri %6 lık 3M üre kullanılarak hazırlanan denatürasyon poliakrilamid jel elektroforezi ile yürütüldükten sonra DNA fragmentleri gümüş boyama (silver staining) ile gözlemişlerdir. Heterozigotluk seviyesinin tüm populasyonlarda benzer iken suni populasyondaki allel sayılarının düşük olduğu, Vistula Nehri ne yazın geri dönen yetişkin balıkların genetik kompozisyonunun Rega Nehri ile benzer olduğu, aslında Vistula Nehri denizalalarından üretilen populasyonların Rega Nehri denizalası populasyonu ile benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Colihueque et al. (2003) Güney Şili de kültüre alınmış beş kahverengi alabalık populasyonunun populasyon içi ve populasyonlar arası genetik değişkenlik ve ayrılık seviyesini belirlemek için mikrosatelit ve allozim kullanmışlardır. Çalışmalarında

24 21 kahverengi alabalıklara spesifik 3 ü mikrosatelit toplam 23 bölge içeren 14 enzimatik sistem kullanmışlardır. Çalışmada toplam genetik farklılık seviyesi (H T ) (allozimler için; 0,1216 ve mikrosatelitler için; 0,3504) ve rölatif genetik farklılık (G ST ) (allozimler için; % 9,5 ve mikrosatelitler için; % 15) değerlerinin Şili ye ait kahverengi alabalık populasyonları ile daha önce yapılan çalışmalarla benzer olduğunu belirlemişlerdir. Bu seviyeleri Avrupa da elde edilenlerle karşılaştırdıklarında, H T için benzer olduğunu fakat G ST için düşük olduğunu gözlemlemişlerdir. Populasyonlar arası düşük genetik farklılığı, populasyonlar arası gözlenen küçük genetik mesafeye uygun olarak analiz etmişlerdir (D Nei = 0,004 0,025). Fransa nın kuzey bölgesinde bulunan Normandia ırmağında (Oir nehri) birlikte yaşayan anodrom ve anodrom olmayan alabalıklar arasındaki genetik farklılığın seviyesi 15 mikrosatelit markırla test edilmiştir. Bu iki formun morfolojik, democoğrafik ve ekolojik karakterleri ve geçmişte farklı türler olarak sınıflandırılmasından dolayı farklı oldukları saptanmıştır. Geniş miktardaki varyasyona rağmen formlar arasında genetik farklılık bulunamamıştır. Kültüre alınmış dört stok aynı bölgelerle genotiplenmiş ve doğal örneklerle yüksek öneme sahip farklar bulunmuştur. Yerli ve anodrom alabalıkların bu nehir sisteminde sadece bir doğal üretimin parçası olduklarına karar verilmiştir (Charles et al. 2005). Gratton et al. (2004) batı Bengal ve Hindistan da doğal olarak yaşayan 4 zebrafish (Danio rerio) populasyonunda allozim ve mikrosatelit markırlar kullanarak genetik varyasyonun modelini ve seviyesini analiz etmişlerdir. Buldukları sonuçlar genetik değişkenlik seviyesinin yüksek olduğunu ve genetik yapının zayıf olduğunu göstermektedir. Michael et al. (2000) mikrosatelit ve mitokondrial DNA markır kullanarak bir Danimarka ırmağında doğal populasyonlar içerisinde kuluçka alabalıklarının stok etkilerini çalışmışlardır. Çalışma sahası olarak kahverengi alabalıkların geniş bir populasyonunu içeren Karup Nehrine odaklanmışlardır. Ana hat örnekleri daha önceki stoklar tarafından etkilenmediği düşünülen vahşi alabalıklardan ve kuluçka

25 22 alabalıklarından alınmışlardır. Ayrıca örneklemeyi ırmağın bir bölümünde stoklanan yerli denizalalarından da yapmışlardır. Çalışmalarında biri üç nükleotid ve altısı iki nükleotid olmak üzere toplam 7 mikrosatelit bölge analiz etmişler ve her bir primer setinden bir primeri florasans CY5 boya ile işaretlemişlerdir. Yerleşik doğal populasyonlar ile kuluçka türleri arasındaki genetik farklılığın az miktarda olduğunu (mikrosatelit F ST = 0,06) bulmuşlardır. Belirleme testleri kullanarak ana hat örnekleri bireylerinden %90 ın dan fazlasını doğru bir şekilde sınıflandırmışlardır. Melezleme indeks analizinin ve kuluçka türünün belli olduğu doğal alabalıklar için spesifik mtdna haplotiplerinin yüksek yüzdesinin, doğal alabalıklar ile kuluçkalıklar arasındaki melezlemeyi akla getirdiğini savunmuşlardır. Sonraki sonuçlarında erkek kuluçkalıkların dişilerden daha fazla melezlemeye karıştığını gösterdiğini söylemişlerdir. Araştırmacılar sıkı bir seleksiyonla tekrar yerli stokların geri getirilebileceğini önermişlerdir. Yerleşik alabalıkların çoğunun erkek olmasının, erkeklerin baskısı altına girmiş bir doğal alabalık kuluçkalığından gen akışının sebebini açıklayabildiğinden bahsetmişlerdir. Balık çiftliği populasyonlarından ebeveyn tayini için sekiz kalkan ve sekiz gökkuşağı alabalığı mikrosateliti seçilmiştir. Allel sayıları, gen farklılığı ve polimorfik bilgi içeriği sırasıyla kalkan balıklarında; 8,0;0,76 ve 0,55 gökkuşağı alabalıkları için ise yine sırayla 4,0;0,65 ve 0,39 olarak bulunmuştur. Sekiz kalkan mikrosateliti sekiz gökkuşağı bölgesinden daha geniş aralıkta çiftleşme şeması (en geniş çiftleşme şeması f gu 0,95) verdiği saptanmıştır. Mikrosatelitler γ 33 P radyoaktif PCR kullanılarak amplifiye edilmiştir. Her bir primer çiftinden bir tanesi γ 33 P-dATP ile (end-labeled) işaretlenmiştir. Elde edilen PCR ürünleri 4 dak. 90 o C de denatüre edildikten sonra %6 lık denatüre poliakrilamid jelde elektroforeze tabi tutulmuşlardır. Kalkan balıklarına özgü mikrosatelitler ebeveyn belirleme denemelerinde gökkuşağı alabalıkları markırlarından daha etkili olduğu belirlenmiştir (Estoup et al. 1997). 54 mikrosatelit ve 473 AFLP markır kullanılarak Atlantik salmonlarının (Salmo salar) genetik bağlantı haritası (genetic linkage) çıkarılmıştır. Erkek ve dişilerin kendi cinsiyetlerine has haritalanmasını kolaylaştıran bir haritalama tekniği geliştirilmiştir.

26 23 Erkeklerin haritası 103 cm uzunluğunda ve 31 bağlantı grubu ihtiva etmesine karşın dişilerin haritası 901 cm uzunluğuna ve 33 bağlantı grubuna sahip olduğu saptanmıştır. İki harita arasında yirmi beş bağlantı grubunun ortak olduğu saptanmıştır. Genetik haritanın çıkarılması ile erkek ve dişiler arasındaki rekombinasyon değerinde geniş bir farklılık olduğunu ortaya koyulmuştur. Dişilerin rekombinasyon değerinin erkeklerinkine oranını 8,26 olarak bulunmuştur ki bu değer herhangi bir omurgalının kaydedilmiş değerinden daha yüksektir. Oluşturulan bu haritanın dünya çapında önemli bir su ürünleri türü olan Atlantik salmonları için ilk bağlantı haritası olduğu kaydedilmiştir. Çalışmanın mikrosatelit genotipleme aşamasında, PCR karışımında %5 oranında DMSO kullanılmıştır (Moen et al. 2004). Estoup et al. (1993) on üç (GT) n ve dört (CT) n mikrosatelit bölgeyi kahverengi alabalık genomik kütüphanesinden izole etmiş ve dizmişlerdir. Kahverengi alabalık (Salmo trutta L.) genomunda ortalama (GT) n tekrar dizisinin yaklaşık her 23 kb da, (CT) n tekrar dizisinin ise her 76 kb de ortaya çıktığını belirtmişlerdir. PCR da DNA amplifikasyonu için kullanılan primerleri tek bölgeli 3 mikrosatelitten sentezlemişlerdir. Gözlenen polimorfizmlerin Mendel kanunlarına uygunluklarını tamamen aynı ebeveyne sahip ailelerde kanıtlamışlardır. Mikrosatelit ve protein polimorfizmini, aynı ana-babadan gelen aile, genetik hat ve populasyonlara ait kahverengi alabalık örneklerinde analiz etmişlerdir. Her populasyonu temsilen 10 bireyin örnek olarak alındığı dört populasyon, ikisi İtalya ve Fransa da kültüre alınmış olan populasyonlardan, diğer ikisini ise birisi Atlantik diğeri Akdeniz stoku olmak üzere iki doğal populasyondan ibarettir. Bu dört populasyon için ortalama allel sayıları 3 olarak, üç mikrosatelit bölgeden ilki için 5, diğer iki bölge için ise 6 olarak belirlenmiştir. Heterozigotluğun 0,18 ile 0,74 arasında değiştiğini kaydetmişlerdir. En geniş allellik frekansının Akdeniz ile Atlantik populasyonları arasında ortaya çıktığını ve bu sonuçların önceki alloizm verilerine uygun olduğunu belirtmişlerdir. Üç mikrosatelit bölgenin tamamı için kahverengi alabalık dizilerinden dizayn edilen primerlerin gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) gibi Salmonid türlerinin diğer yakın akrabaları içinde kullanılabilir olduğunu ve buradan da mikrosatelit markırların Salmonid türleri ve balıkların genelindeki genetik çalışmalarında geniş bir kullanım alanına sahip olduklarını savunmuşlardır.

27 24 Fransa Orb Nehri nde Akdeniz kahverengi alabalık populasyonlarının kuluçka stokları ile birlikte yeniden stoka katılımlarının genetik etkileri üç mikrosatelit bölge kullanarak incelenmiştir. Örnekler, birisi her yıl yeniden stoka katılımın gerçekleştiği ana ırmaktan, diğeri ise 6 yıldır stoka katılımın gerçekleşmediği ana ırmağın kolundan olmak üzere iki doğal populasyondan alınmıştır. Her örnek gençler ve yetişkinler olmak üzere iki yaş grubuna ayrılmıştır. Doğal populasyonlarda üç mikrosatelit bölgesindeki allellik frekansı ve genetik yapı genellikle yeniden stoka katılım gerçekleştiği drenajdan alınan iki kuluçka örneği ile karşılaştırılmıştır. İki mikrosatelit bölge için yüksek seviyede polimorfizm (her bölge için allel) saptanırken üçüncü bölge için polimorfizm düşük bulunmuştur. PCR ürünleri %6 acrilamid-bisakrilamid/8m üre içeren elektroforezde yürütülmeden önce, 2/3 oranında formamid yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra 95 o C de 5 dak. denatürasyon için bekletilmiştir. Yeniden stoka katılımın olduğu populasyonlardaki polimorfizm, şu an tamamen doğal olan populasyonlarınkinden önemli derecede yüksek bulunmuştur. Ana ırmak populasyonundaki iki yaş grubu arasında önemli farklılıkların gözlendiği fakat bu farklılığın nehrin kollarında olmadığı saptamıştır (Poteaux et al. 1999). Estoup et al. (1998) yürüttükleri bir çalışmada mikrosatelit ve allozim arasında karşılaştırmalı olarak çalışmışlardır. Çalışmada kullanılan örnekler coğrafik bir skalada üreyen yerli kahverengi alabalıkların doğal populasyonlarından oluşmaktadır. Genotipik bağlantı haritasındaki dengesizlik ve populasyon örnekleri arasındaki farklılık için yapılan istatistiksel testlerin en yüksek değerlerine yol açan mikrosatelit bölgede yüksek seviyede polimorfizm gözlemişlerdir. Çalışmada kullanılan mikrosatelitleri γ 33 P PCR kullanarak amplifiye etmişlerdir. Cavalli-Sforza ve Edwards ın genetik mesafeleri mikrosatelitler için allozime göre ortalama iki kez daha geniş olduğunu bulmuşlardır. Fakat çok bölgeli F ST testlerinde her iki marker kategorisi içinde önemli derecede farklılık bulmamışlardır. Populasyonlardan örneklenen balık bireylerinin örnekleme testlerinde mikrosatelitler allozimler ile karşılaştırıldığında çok daha etkili olduğu gözlemişlerdir. İki yönlü çok bölgeli F ST testleri ile ırmak kolları arasındaki genetik mesafeyi önemli düzeyde ilişkilendirmişlerdir. Mesafe ile farklılık azalmasının allozimde, mikrosatelitlerden daha yüksek olduğunu belirtmişlerdir.

28 25 Çivisiz kalkan balığı (Scophthalmus rhombus) ve dil balığı (Platichthys flesus) gibi benzer habitat, yaşam geçmişi ve coğrafik yapı özelliklerine sahip diğer yassı balık türleri ile karşılaştırmalı olarak, kültüre alınmış ve doğal kalkan balığı (Scophthalmus maximus) populasyonlarında genetik farklılık analizi için 12 mikrosatelit ve 28 allozim bölge kullanılmıştır. Primerlerden biri flüoresan CY5 (5-N-N -diethyltetramethylindodicarbocyanine) ile işaretlenmiştir. Kalkan balıkları ile yapılan daha önceki çalışmalar çok fazla miktarda allozim farklılık olduğunu göstermiştir. Allozim bakımından kalkan balıklarında, çivisiz kalkan balıkları ve dil balıklarından daha önemli derecede düşük genetik farklılık gözlenirken, mikrosatelit bölgede farklılık yüksek çıktığı saptanmıştır. Markırlar arası bu farklılığın kalkan balığının evrim geçmişi ile ilişkili olarak mutasyon oranı tarafından açıklanabileceğini savunulmuştur. Kalkan balığının kültüre alınmış bir türünde bu türün doğal populasyonlarından daha düşük derecede önemli bir genetik farklılık gözlenmiştir. Bu örneklemenin mikrosatelit verilerin ışığında, güçlü bir aile yapısının olduğunu belirtmişlerdir. Üç türün analizindeki lokal bir skaladaki genetik alt birim parçalarının analizinde kullanılan iki markır kategorisi arasında güçlü bir uyun bulunmuştur. Ayrıca gözlenen Atlantik ve Catabric bölgeleri arasında düşük ve önemli olmayan genetik farlılık olduğu bildirilmiştir (Bouza et al. 2002) Jeong et al. (2003) siyah deniz izmaritlerinin (Acanthopagrus schlegeli) populasyon yapısını ve genetik çeşitliliğini incelemek için yüksek değişkenliğe sahip dört mikrosatelit bölge izole etmişlerdir. Her bir mikrosatelit bölgenin allellik ayrımı tek yumurtanın çiftleri ve onların nesilleri kullanılarak test etmişlerdir. Mikrosatelit analizlerinde, 2 3 µl PCR ürünü 7M üre içeren %8 lik poliakrilamid jel elektroforezi ile yürütüldükten sonra amplifiye edilen DNA örneklerini naylon membrana transfer etmişler ve kimyasal ışıma yöntemi ile tespit etmişlerdir. Sekiz populasyonda bu bölgelerdeki genetik varyasyonların yüksek seviyedeki değişkenliği gözler önüne serdiğini belirtmişlerdir. Doğal populasyonlarda her bölgenin ortalama allel sayısını 10,8 13,5 arasında ortalama gözlenen heterozigotluğu ise 0,775 0,828 arasında bulmuşlardır. Bu değerlere karşılık kuluçka populasyonları da allellik ve heterozigotluk sırasıyla 10,0 ve 0,776 olarak saptamışlardır. Ayrıca araştırmacılar çalışmalarında,

29 26 genetik mesafenin batı Japonya ile güney Kore arasında coğrafik sapmanın varlığını gösterdiğinden ve batı Japonya populasyonları arasında küçük genetik farklılık olduğundan bahsetmişlerdir. Dokuz doğal kahverengi alabalık (Salmo trutta L.) populasyonuda genetik varyasyon allozim ve mikrosatelit markırlar kullanılarak çalışılmıştır. Tüm kahverengi alabalık populasyonları Sil ve Duero havzalarını temsilen açık bir şekilde iki kola ayrıldığını, her iki markırın havzalar arasındaki güçlü bir genetik farklılığı ortaya koymasına rağmen, mikrosatelit bölge populasyon yapısının havza içi seviye farkı analizlerinde çok daha doğru sonuçlar verdiğini bildirilmiştir. Hatta çok bölgeli F ST testlerinde ve populasyondan örneklenen balık bireylerinin belirleme testlerinde mikrosatelitlerin allozimlere kıyasla çok daha yüksek bir verimde olduğu kanıtlanmıştır. Mikrosatelit analizlerinde PCR ürünleri %6 lık denatüre poliakrilamid jelde yürütülmüş ve jel gümüş boyama tekniği ile boyanarak görüntülenmiştir. Ana sonuç olarak bu çalışmada, Leon Eyaleti hidrocoğrafik havzaları olan Deuro ve Sil havzaları kahverengi alabalık populasyonlarının genetik olarak iki farklı grup olduğu mikrosatelit analizi ile doğrulanmıştır. (Corujo et al. 2004). Belirlenmeleri yoğun çaba ve masraf gerektirmesine rağmen mikrosatelitler hayvanlarda genetik farlılık çalışmalarında kullanılmaktadır. Öyle ki daha önceden belirlenmiş olan markırlar ait olduğu türün akrabaları için kullanılabilmektedirler. Yapılan çalışmada iki farklı timsah türü için belirlenen markırların güney Amerika timsahları için kullanılabilirliği test edilmiştir. Sonuçlar söz konusu markırların farklı üç tür için kullanılabilir olduğunu göstermiştir (Zukoloto et al. 2006). Rutten et al. (2004) son yıllarda üretimi oldukça artan balık türlerinden birisi olan Nil tlapialarından temin edildikleri yerlere göre kültüre alınmış dört türünü (AIT, IDRC, GIFT, GÖTT) 14 mikrosatelit markır kullanarak genetik olarak karakterize etmişlerdir. Her markırın türlere göre ortalama allel sayıları 5,0 (GÖTT), 5,4 (AIT), 5,6 (IDRC), ve 7,5 (GIFT) şeklinde belirtmişler ve özgün allellerin tüm markırlarda 2 ye indiğini bulmuşlardır. Populasyonlar arası büyük bir genetik farklılığın (F ST = 0,178) olduğunu

30 27 bulmuşlar ve türlerdeki hayvanların gruplandırılmasının doğru olduğunu kanıtlamışlardır. Beklenen heterozigotluk seviyesinin 0,624 0,711 aralığında olduğu, fakat üç türün beklenen heterozigotluk seviyesinin bulunan seviye ile önemli derecede farklı olduğu belirtilmiştir. Bu duruma küçük populasyon büyüklüğünün sebep olduğunu kaydetmişlerdir. Bulunan yüksek derecedeki genetik ayrımın türler arasında yumuşadığı bulunmuştur. Türlerin bilinen geçmişinin bir filogenetik ağacı yansıttığını bildirmişlerdir. Tüm olası döllerin genotipik kombinasyonlarını uygulayarak çiftleştirilen ve nesilleri tükenme tehdidi ile karşı karşıya olan, ikisi Salmo salar birisi Salvelinus alpinus olmak üzere toplam üç salmonid populasyonunda potansiyel döllerdeki akrabalık ve genetik farklılık seviyesini yaygın olarak kullanılan yöntemlerden birkaçı (d 2 EST, d 2 scaled-est ve H EST ) ile hesaplanmıştır. Verilere göre döllerin genetik değişkenliğinin sadece ebeveynlere ait getonip verilere bağlı olduğu tahmin edilebilir (Primmer et al. 2003). Koskinen et al. (2002) neslinin tükenme tehlikesi olan salmonid türlerinden birisi olan Avrupa gölge balığını (Thymallus thymallus) 17 mikrosatelit DNA bölgesi ile çalışmışlardır. Populasyonlar arasındaki genetik mesafenin seviyesinin önemli olduğunu bulmuşlardır. Mikrosatelit verilerin, populasyonların ortalama allellerinin her bölge için sadece 3,5 (±2,2) olduğunu gösterdiğini ve bu değerin diğer tatlı su balıkları ile karşılaştırıldığında Thymallus thymallus populasyonlarında populasyon için genetik çeşitlilik seviyesinin düşük olduğunu belirtmişlerdir. Moleküler varyans analizi (AMOVA) verilerine göre populasyon içerisindeki mikrosatelit çeşitliğin % 49,1-58,0 olduğu belirlenmiştir. 111 mikrosatelit ve 352 AFLP fragmenti kullanılarak Japon pisi balıklarının (Paralichthys olivaceus) ilk genetik bağlantı haritası çıkarılmıştır. Erkek ebeveynlerin 25 dişi ebeveynlerin ise 25 bağlantı grubu içerdiklerini saptamışlardır. Çalışmanın Japon pisi balıkları için ilk düşük yoğunluktaki bağlantı haritası ve cinsiyet rekombinasyonunda ki farlılıkları içerdiği belirtilmiştir. Omurgalılar arasında nadiren

31 28 görülmekle beraber rekombinasyon oranının dişi pisi balıklarında erkeklere kıyasla daha yüksek olduğu (7,4:1,0) saptanmıştır (Coimbra et al. 2003). Barroso et al. (2005) Paraı ba do Sul havzasından temin ettikleri yedi doğal ve bir kültüre alınmış Brezilya tatlı su balığı olan Brycon opalinus populasyonlarının genetik yapısını 7 mikrosatelit bölge kullanarak incelemişlerdir. Tüm bölgedeki polimorfizm bulunan 162 farklı allel ile değerlendirmişlerdir. Gözlenen heterozigotluğun 0,23 ten 1.00 a kadar değiştiğini belirtmişlerdir. Bir nehir hariç tüm populasyonlar HWE in gösterdiği heterozigotluk toleransından önemli derecede saptığını tespit etmişlerdir. Tüm populasyonları yüksek mikrosatelit değişkenlik (ortalama H=%85,6) tarafından karakterize etmişlerdir. Genetik yapıyı önemli bir F ST (0,0432) değeri ile belirlemişlerdir. 50 li yıllarda beri stoklanan bu kuluçkalıkların 0,789 değerindeki gen çeşitliliğini ve 13,43 değerindeki ikinci büyük ortalama allel sayısını ortaya koyduğunu kaydetmişlerdir. Yapılan diğer bir çalışma altı salmonid türünde 17 mikrosatelit bölgenin amplifikasyon çaprazlamasının karakterizasyonunu içermektedir. Bu bölgelerden 14 tanesi San Joaquin Irmağı drenajındaki salmonlar için polimorfik olduğu saptanmıştır. Bulunan sonuçlar mikrosatelit markıların bir tür için belirleyici markır olarak kullanılabilirliğini göstermektedir (Kevin et al. 2002). Herbinger et al. (1995) nın yaptıkları çalışma ticari su ürünleri yetiştiriciliğinde mikrosatelit markırlardan elde edilen genetik verilerin kullanıldığı seleksiyon programlarının ve karıştırılmış su ürünleri populasyonlarında soy ağacı tespiti çalışmalarını içermektedir. Küçük bir gökkuşağı alabalığı çiftliğinde 10 erkek ve 10 dişi balığı aralarında tamamen faktöriyel olarak çaprazlamışlardır. En geniş ve en küçük soyu 1 yıl sonra örneklemişler ve ebeveynlerini 4 yada 5 mikrosatelit markır kullanarak belirlemişlerdir. Soylarının hayatta kalmaları ve büyümeleri bakımından erkek ve dişiler arasında önemli farklılıklar bulmuşlardır.

32 29 Sazanlarda (Cyprinus carpio L.) (CA) tekrarlı mikrosatelit markırlar belirlenmiştir. (CA) tekrarını içeren klonlar bir sazan genomik kütüphanesinden izole edilmiş ve dizilmiştir. Tekrar sayıları diğer teleost balıklarla benzerlikler göstermesine rağmen memelilerle karşılaştırıldığında yüksek bulunmuştur. Tekrar sınıfları (perfect, imperfect ve karışık) Atlantik morinası (Gadus morhua L.), gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) ve Atlantik salmonu (Salmo salar L.) ile karşılaştırılmıştır. Hazırlanan 41 primerin tamamı sekiz hayvanın test panelinde polimorfizm bakımından dizayn ve test edilmiştir. 32 markırın polimorfik olduğu bulunmuştur. Heterozigotluk ebeveynlerinde akrabalık ilişkisi bulunmayan hayvanlarda %60,4 iken ebeveynlerinde akrabalık ilişkisi bulunan hayvanlarda %51,1 ve gynogenetic klonlanan hayvanlarda ise %0 bulunmuştur. Sekiz havyan arasında ortalama allel sayısı 4,7 bulunmuştur. Sazan balıkları için populasyon, üreme ve evrimsel çalışmalarda kullanılmak üzere genetik markırlar olarak kullanılabilecek polimorfik bölge tanımlanmıştır (Crooijmas et al. 1997) O Reilly et al. (2004) yaptıkları çalışmada mikrosatelitlerin deniz balıklarında ve geniş populasyon ve yüksek gen akışı tarafından karakterize edilen diğer türlerde zayıf populasyon yapısının belirlenmesi çalışmalarında kullanılabilirliğini göstermişlerdir. Yinede bu markırların belirli mutasyon özellikleri ve ayrım denemelerinde sergiledikleri polimorfizm bölgenin farklılık seviyesi hakkında belirsizliğin sürmekte olduğunu bildirmişlerdir. Çalışmada Theragra chalcogramma türünün bir populasyonunda gözlenen farlılığın seviyesinde mikrosatelit polimorfizm varyasyonunun etkileri denenmiştir. Bering Denizi ve Kuzey Pasifik Okyanusu ndan olduğu sanılan altı populasyon arasında 14 mikrosatelit bölgede genetik farklılığı zayıf bulmuşlardır. Tahmin edilen populasyonun alt bölümlerinin büyüklüğü ile çeşitlilik bölgesi arasında negatif bir ilişki bulmuşlardır. Hesaplanan F ST değerinin düşük olduğunu söylemişlerdir. Buldukları deneysel sonuçların, çoğu deniz balığına özgü zayıf genetik yapının çözülmesini sınırlandırmak için bazı mikrosatelit bölgelerin mutasyon oranının yeterince yüksek olduğunu kaydetmişlerdir. Yapılan diğer bir çalışmada mikrosatelit DNA bölgeleri mtdna kontrol bölgelerinin nükleotid dizileri ile birlikte genetik işaretleyici olarak kullanılmıştır yılı Eylül

33 30 ayında bir kuluçka istasyonunda (Japan Sea-Farming Association hatchery (JASFA)) üretilen genç Japon pisi balıkları (Paralichthys olivaceus) doğal bir deniz ortamına stoklanmış ve aynı zamanda ve aynı deniz ortamına başka bir kuluçka istasyonu tarafından farklı bir kuluçkalık türü serbest bırakılmıştır. 1 yıl sonra 6 aylık periyotlarla hem doğal hem de serbest bırakılan pisi balıklarının kapsayan toplam 1576 birey yakalanmıştır. Bu uygulamada gerek JASFA gerekse diğer kuluçkalıklardan serbest bırakılan balıkları temsilen 149 birey seçilmiştir. JASFA kuluçkalıklarından serbest bırakılan balıklardan hayatta kalan 149 bireyden 35 i genetik profile dayandırılan ebeveynsel payı yeniden kazandığı saptanmıştır (Sekino et al. 2004). Altısı önceki çalışmalardan ve dokuzu yeni geliştirilen 15 mikrosatelit markırın kalıtım modu dört kontrollü çaprazlamadan kuluçkalanan Pasifik abalon (Haliotis discus hannai) larvasında incelenmiştir. Mikrosatelitler Chelex adı verilen bir metotla izole edilmiştir ve sonunda 15 mikrosatelit bölge tek bir larvada analiz edilmiştir. Altı mikrosatelit bölgenin tamamının Mendel kanunları ile bağdaştığı tespit edilmiştir. mikrosatelit bölgelerden bir tanesinin bir ailede hiçbir allel göstermediği saptanmıştır. Heterozigot allelin olmamasına rağmen genetik mesafenin hesaplanmasında homozigot olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen sonuçların mikrosatelit markırların soy ağaçları hakkında bilgi temin edilemeyen akraba ve akraba olmayan abalon larvaları arasında ayrım yapabileceğini gösterdiğini kaydetmişlerdir (Li et al. 2003). Moleküler markılar kullanılarak Atlantik ringa balıklarının (Clupea harengus L.) stok yapısı hakkında yapılan önceki denemeler söz konusu balık için genetik varyasyon seviyesini açıklar nitelikte olmadığını söyleyen Shaw et al. (1999) yaptıkları çalışmada, populasyonların alt gruplara ayrılarak mikrosatelit DNA markırları Atlantik ringa balıklarında ilk kez denemişlerdir. Sonuçların önceden kullanılan moleküler markırlara nazaran dört mikrosatelit bölgenin yüksek ve bilgi verici varyasyon sergilediğini saptamışlardır. Mikrosatelit analizlerde amplifiye ettikleri ürünler %6 lık denatüre edici jele yüklemeden önce mini bir agaroz jelde kontrol etmişlerdir. Her bölge için allel sayısını: iken ortalama beklenen heterozigotluk değerlerini 0, arasında bulmuşlardır. F ST ve R ST testleri verilerinden de görüldüğü üzere hemen hemen tüm

34 31 örnekler arasında önemli derecede genetik farklılık bulunduğunu bildirmişlerdir. Allozim ve mtdna RFLP verileri ile aynı örnekler karşılaştırıldığında yüksek bir skalada mikrosatelitlerin daha belirleyici olabileceği önermişlerdir. Castro et al. (2003) gynogenesisi kalkan balıklarında (Scophthalmus maximus) gynogenetik döllerden olan iki ailede farklı metotlarla değerlendirmişlerdir. Embriyo ve larvalardaki karyotip analizleri ploidi seviyesinin belirlenmesinde yüksek nispette doğruluk olduğunu fakat performansının düşük kaliteli ve düzensiz olduğunu belirtmişlerdir. Her çekirdekçiği belirlemede gümüş boyama tekniğinin örneklerin ploidi değerlendirme çalışmaları için kolay ve doğru bir teknik olduğunu bildirmişlerdir. 11 yüksek değişken mikrosatelit bölgenin kullanımının kalkan balıklarında gynogenetik döller için özellikle paternal kalıtım için güçlü bir metot olduğunu kanıtlamışlardır. Fugu balığı (Takifugu rubripes) genomunda mikrosatelit modellerin varlığı ve dağılımı DNA veri bankaları kullanılarak analiz edilmiştir. Mikrosatelit bölgelerin, tüm genom uzunluğunun 22,5 milyon bp olan fugu balığı veri tabanının sadece %0,96 sını oluşturduğu saptanmıştır. Di-nükleotid tekrarların tüm mikrosatelitlere %90,1 oranla en yaygın durumda olduğu belirtilmiştir. 12 mikrosatelit bölge veri bankası girdilerinden izole edilmiştir. 50 adet doğal fugu balığındaki bu bölgelerde genetik polimorfizm analizleri, her lokus için 11 den 30 a kadar değişen allel sayısı ile geniş polimorfizmin yüksek bir derecede olduğunu ortaya koyulmuştur. Heterozigotluk değerinin 0,869 ile 0,953 arasında beklenildiği ve tüm bölgelerin benzerlik olasılığının 0,007 den 0,028 e kadar değiştiği bildirilmiştir. Bulunan sonuçlar ışığında mikrosatelitlerin fugu balığının gelecekteki analizlerinde belirleyici olarak kullanılabileceği kanısına varılmıştır (Takagi et al. 2003) Oligonükleotid prob ile melezleme seçiciliği ve mikrosatelit veri zenginleştirilmesinde kullanılmak üzere deniz levreğinden (Dicentrarchus labrax) 28 polimorfik mikrosatelit izole edilmiştir. Bu markırlar ve D. labrax türü için son zamanlarda tespit edilen 11 mikrosatelit ile yapılan analizlerde 26 bölge arasında bağlantı bulunurken 8 bağlantı grubunun olduğu saptanmıştır (Chistiakov et al.2003).

35 32 Gökkuşağı alabalığında (Oncorhynchus mykiss) populasyon genetiği ve genom haritalama çalışmaları için 24 yeni mikrosatelit markır geliştirilmiştir. Diğer alabalık türlerinden elde edilen genomik DNA nın amplifiyesinde her bir markırın kullanılabilirliği, heterozigotluk yüzdesi ve polimorfizm miktarı kaydedilmiştir. Yedi markırın klonlanan homozigot balıklarda bir allelden daha fazla allel içeren gökkuşağı alabalıkları genomunda kopyalanmış olduğu gözlenmiştir (Rodriguez et al. 2003). Wolfus et al. (1996) kültüre alınmış türlerin büyüme programlarının yönetimi için bir genetik analiz aracı olarak genetik markırların kullanımını göstermek için mikrosatelit tekniği kullanmışlardır. Bu tekniği 4 farklı populasyondan ve doğal dişi kuluçkalıklarından toplam 312 P. vannamei karides türünde kullanmışlardır. Bir numaralı mikrosatelit markırı (M1) Guatemala stokundan iki grup ve iki populasyondan 14 ailenin allellik kalıtımını belirlemek için kullanmışlardır. Döllerin tamamının tahmin edilen ebeveynlerinin genetik soyundan olduğunu gözlemlemişlerdir. Kırk yedi allelin tamamını M1 lokusunda bulmuşlardır. Her bir populasyon için allel sayısının, 4 ten (populasyon 2 için) 23 e (populasyon 4 için) değiştiği saptamışlardır. Heterozigotluk seviyesinin %45 ten %100 e kadar değiştiğini gözlemlemişlerdir. PCR sonrası amplifiye örnekler önce %1,5 lik ve 0,3 µg/µl etidium bromide içeren ve 1xTAE tamponu ile hazırlanan agaroz jel elektroforezinde 15 V ta saat yada 80 V ta 2 4 saat yürütmüşlerdir. Amplifiye örnekler daha sonrada %7,6 akrilamid/bis (10:1) 7,6 M urea ve 1xTBE nin tampon olarak kullanıldığı poliakrilamid jel elektroforezinde 30 dak. lık ön yürütmenin ardından 60 W ta 3-6 saat yürütmüşlerdir. Sonuç olarak mikrosatelit markırların hayvansal üretim programlarının başlangıcında genetik çeşitliliğe ilişkin bilgilerin sağlanması bakımından kullanılabilir olduğunu savunmuşlardır. Yapılan diğer bir çalışmada ise Fransa doğal kahverengi alabalık populasyonları araştırmacılar tarafından Atlantik ve Akdeniz alt türlerine ayrılmıştır. İki grup arasındaki Nei nin genetik mesafe standardı 47 enzimatik bölgede ortalama 0,10 olarak bulunmuştur. Fransa ırmak stoklarını tamamlamak için kullanılan kültür türlerinin tamamı Atlantik tür orijinli olduğu saptanmıştır. Bu çalışmada kültür genotiplerinin Akdeniz populasyonları içerisine salıverildiğinde yavru balıkların erken dağılımları

36 33 üzerine introgression etkileri araştırılmıştır. Çalışma için DS (kültür dişileri ile saf Akdeniz populasyonundan erkeklerin çaprazlanması ile elde edilen) ve DD (aynı dişiler ile aynı türün kültüre alınmış erkekleri arasındaki çiftleştirme sonucu elde edilen) olmak üzere iki grup üretilmiştir. İki aylık kontrollü büyütmenin sonunda geriye kalan tüm yavrular DNA analizleri için toplanmışlardır. Tamamen tanısal bir mikrosatelit lokus kullanarak her bir yavru balığın ebeveynsel orijini belirlenmiştir. İki grup arasında yerli yavruların sayılarında yada akıntı kinetiğinde önemli olmayan farklılıklar bulunmuştur. Bununla birlikte DD grubunun DS grubundan önemli derecede yüksek bir büyüme rotası gösterdiği saptanmıştır. Sonuçlardan aynı tip populasyonlar içeren doğal istasyonlarda kültür türlerinin salındığı doğal stokların erken seçicilik üstünlüğünün olmadığı önerisi sunulmuştur (Krieg et al. 1995). McConnell et al. (1995) Norveç ve İrlanda dan örneklenen ve Kanada ve Nova Scotia da bulunan beş Atlantik salmon populasyonunda, ikisi Atlantik salmonu ve ikisi gökkuşağı alabalığından izole edilen 4 mikrosatelit bölgedeki genetik varyasyonu değerlendirmişlerdir. Aynı bölgede heterozigotluğun 0,9 olduğunu ve her bölgedeki allel sayısının 38 kadar olduğunu gözlemlemişlerdir. Genetik mesafeyi tüm populasyonlar için dört bölge üzerinde hesaplamışlardır. Bu bölgelerin örnekleme denemelerinin hızı ve kolaylığından ve bireysel lokuslar üzerinde gözlenen polimorfizm oranından dolayı Atlantik salmonlarında potansiyel genetik markırları olarak görüldüğünü savunmuşlardır. Kültürü yapılan balıkların genetik etiketlenmesinde ve kültüre alınmış doğal stoklarda gen introgresisinin seviyesinin belirlenmesi denemelerinde, yüksek derecede değişkenliğe sahip bölgelerin yardımcı olacağını kaydetmişlerdir. Gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss) populasyon genetiği ve genom haritalama çalışmalarında kullanılmak üzere otuz sekiz yeni mikrosatelit markır geliştirilmiştir. Diğer alabalık türlerinden elde edilen genomik DNA nın amplifiyesinde her bir markırın kullanılabilirliği, heterozigotluk yüzdesi ve polimorfizm miktarı kaydedilmiştir. Beş markırın klonlanan homozigot balıklarda bir allelden daha fazla

37 34 allel içeren gökkuşağı alabalığı genomunda kopyalanmış olduğu gözlenmiştir (Palti et al. 2002). Spies et al. (2005) yaptıkları çalışmada 40 polimorfik gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) mikrosatelit bölgesinin karakterizasyonunu ve geliştirilmesini ele almışlardır. On dört dinükleotit, 7 trinükleotid, 11 tetranükleotid ve 8 dinükleotit/ tetranükleotid karışımı izole etmek için zenginleştirilmiş kütüphaneleri kullanmışlardır. Bu markırların, markırlar tarafından desteklenen en iyi yetiştirmenin seçiminde, populasyon genetiği çalışmalarında, ebeveyn analizlerinde ve zaten kullanılan genom haritalanmasında kullanışlı olabileceğini savunmuşlardır. Kuzey British Columbia daki kırmızı salmonların (Oncorhynchus nerka) göl ve dere tiplerinin populasyon yapıları mikrosatelit varyasyon analizi kullanılarak çalışılmıştır. 14 mikrosatelit bölgedeki varyasyon British Columbia daki altı nehir drenajından 47 populasyonun 3000 göl tipi ve 3200 dere tipi kırmızı salomon bireyinde analiz edilmiştir. tüm dere tipi populasyonlarda 14 mikrosatelit bölge ve 47 populasyon için F ST ortalaması 0,068 ve 0,034 olarak bulunmuştur. Dere tipi kırmızı salmonlar genellikle göl tiplerinden daha değişken oldukları saptanmıştır. Dere tiplerinin beklenen heterozigotluk seviyesi 0,72 ve her lokus için ortalama allel sayısı 12,7 iken göl tipi için bu değerler sırayla 0,65 ve 10,5 olarak bulunmuştur. Irmak drenajının populasyon yapısının önemli bir ünitesi olduğu savunulmuştur. British Columbia da geniş coğrafik bir alandaki farklı drenajlardan alınan kırmızı salmonların dere tiplerinin populasyonları arasında genetik farklılığın açık delillerini bulunmuştur (Beacham et al. 2004).

38 35 3. MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Araştırma Yeri Çalışmada araştırma yeri olarak Aras, Çoruh ve Karasu/Fırat Havza sistemlerini temsilen birer memba deresi, Bolu Abant Gölü ve Ağrı Balıklı Göl kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan istasyonların lökaliteleri ve koordinatları Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge Araştırma yerleri ve koordinatları İst. Bulunduğu Havza Materyalin Temin Edildiği Yer Koordinatları 1 Balıklı Göl Balıklı Göl / Ağrı 2 Abant Gölü Abant Gölü / Bolu ,9 N ,7 E ,5 N ,1 E 3 Karasu-Fırat 4 Aras 5 Çoruh Yeşil Dere / Erzurum Hamzanlar Deresi/ Tekman/Erzurum Yağlı Deresi / İspir/Erzurum ,0 N ,9 E ,7 N ,4 E ,2 N ,4 E Araştırma istasyonlarından çeşitli görüntüler ve temsil ettikleri havza sistemindeki konumları Şekil 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 ve 3.8 deki resim ve haritalarda sunulmuştur.

39 36 Şekil Ağrı Balıklı Göl, avcılıkta kullanılan kıyı sürütme ağı ve çalışma ekibinden bir görünüş Şekil Bolu Abant Gölü, avcılıkta kullanılan olta takımları ve çalışma ekibinden bir görünüş.

40 37 Şekil Erzurum Merkez Yeşil Dere den bir görünüş Şekil Erzurum Merkez Yeşil Dere nin Karasu/Fırat Havzası ndaki konumu

41 38 Şekil Tekman Hamzanlar Deresi nden bir görünüş Şekil Hamzanlar Deresi ve Ağrı Balıklı Göl ün Aras Havzası ndaki konumu

42 39 Şekil İspir Yağlı Dere ve çalışma ekibinden bir görünüş Şekil Yağlı Dere nin Çoruh Havzası ndaki konumu

43 Balık Materyali Araştırmada Salmonidea familyasının ülkemizde yaşayan ve üçü dere ikisi göl formu olmak üzere toplam 5 doğal alabalık populasyonu materyal olarak kullanılmıştır. Populasyonlardan göl formları Ağrı Balıklı Göl (Pop 1) ve Bolu Abant Gölü nden (Pop 2) dere formları ise Karasu-Fırat Havzası nı temsilen Karasu Nehri nin memba derelerinden Yeşil Dere Çayı ndan (Pop 3), Aras Havzası nı temsilen Aras Irmağı nın kaynak derelerinden Hamzanlar Deresi nden (Pop 4), Çoruh Havzası nı temsilen Çoruh Irmağı nın memba derelerinden Yağlı Dere den (Pop 5) çeşitli av araçları kullanılarak temin edilmiştir. Her populasyona ait 12 şer adet toplam 60 adet doğal alabalık materyal olarak kullanılmıştır. Materyal olarak kullanılan her bir populasyona ait birer bireyin görüntüsü Şekil 3.6. da verilmiştir. Hem çalışma hem de değerlendirme aşamalarında kolaylık olması amacı ile araştırmada kullanılan balık materyalleri Çizelge 3.2. deki gibi gruplandırılmıştır. Çizelge Kullanılan balık materyalleri ve ait oldukları populasyonlar Pop. Grupları Havzası Balık materyallerinin numaraları Pop 1 Balıklı Göl Ağrı a-1b Pop 2 Abant Gölü Bolu a-2b Pop 3 Karasu/Fırat a-3b Pop 4 Aras a-4b Pop 5 Çoruh a-5b

44 41 Şekil Her bir populasyona ait balık materyali

45 Yöntem Materyallerin Fenotipik Varyasyon Analizi Aynı populasyonun bireyleri arasında renk ve desen yönünden birtakım farklılıklar görülebilir. Çünkü Salmo trutta türünün bireyleri cinsiyete, yaşa, alınan besin ve yaşama ortamına göre değişiklikler gösterir. Bu balıklara araştırıcılar tarafından büyük önem verildiği halde, bugüne kadar yapılan çalışmalar mevcut alt türler hakkında kesin bir durum ortaya koymuş değildir. Buna karşın metrik ve meristik özelliklerine dayanılarak gerçekleştirilen son çalışmaların verdiği sonuçlara göre, Türkiye deki tüm alabalıkların tek bir türde (Salmo trutta) birleşebileceği ve bununda birçok coğrafik ırklarının olabileceği ileri sürülmektedir (Geldiay ve Balık 2002). Bu türün yayılış alanı genel olarak Avrupa nın kuzeyi, güneyde Korsika ve Sardunya adaları ile Cezayir, doğuda ise İran ve Himalaya dağlarının kuzey eteklerine kadar uzanmaktadır. Anadolu da ise genellikle soğuk suların bulunduğu yüksek dağ dereleri ve dağ göllerine yayılmış bulunmaktadır (Geldiay ve Balık 1996). Salmo trutta türünün başlıca alt türlerinin ayırıcı özellikleri şöyle sıralanabilir (Geldiay ve Balık 1996); Omur sayısı en fazla 57 dir. Yan çizgi boyunca genellikle muntazam bir sıra üzerinde dizilmiş ve küçük nokta kümelerinden oluşmuş adet siyah leke vardır.... Salmo trutta macrostigma Omur sayısı daima 57 nin üstündedir. Siyah lekeler yan çizgi üzerinde muntazam dizilmiş iri benekler şeklinde değil, vücudun her tarafına düzensiz şekilde dağılmış küçük siyah benekler halindedir Vücudun yan taraflarında kırmızı lekeler yoktur salmo trutta abanticus

46 43 Vücudun yan tarafında kırmızı lekeler vardır Kırmızı lekeler vücudun genellikle her tarafına dağılmıştır ve her birinin etrafında beyaz haleler vardır. Preoperküller üzerinde her zaman açıkça görülebilen siyah birer benek vardır. Salmo trutta labrax Kırmızı lekeler çoğu zaman yan çizginin altında ve vücudun anteriöründe görülür salmo trutta caspius Ayrıca Salmo trutta labrax ırkının bazı ekotipleri vardır ki, bunlar belli bir gölde kapalı olarak kalmış olup hayatlarının tümünü orada geçirmektedirler. Salmo trutta labrax ın bu ekotipine natio lacustris adı verilmektedir (Geldiay ve Balık 1996). Bu alttürlere ait bazı diagnostik veriler Çizelge 3.3 de verilmiştir. Çizelgedeki verilerden S.t. macrostigma, S.t. abanticus, S.t. labrax ve S.t. caspius a ait olanlar (Geldiay ve Balık 1996) dan S.t. labrax natio lacustris e ait veriler ise (Ural 1997) den litere edilmiştir. Araştırmada kullanılan materyalleri bu verilerle değerlendirmek amacıyla balıkların röntgen filmleri çekilmiştir. Çizelge Salmo trutta sp. lerin bazıları için bazı diagnostik değerler Türler L. Lateralis D A Omur Sayısı S. t. l. natio lacustris III / 9 10 II-III / S. t. abanticus IV / 9 11 III / S. t. macrostigma III-IV / III-IV / S. t. caspius III-IV / 9 10 III / S. t. labrax III-IV / 5 11 III-IV /

47 44 Çelikkale (1994) Karadeniz alabalığı diye isimlendirdiği S.t. labrax alttürüne ait bazı özellikleri şöyle bildirmiştir; Vücutta esas renk zeytin yeşili, üst kısımları kahverengi veya sarımtırak, yanlar daha açık ve karın kısmı beyazdır. Yan taraf boyunca adet koyu leke bulunabilir. Sırt yüzgecinde sıralanmış siyah lekeler ve yüzgeç kaidesinde kırmızı lekeler vardır. Yan çizgi boyunca görülen lekeler tuğla kırmızısıdır. Omur sayısı arasındadır. Çelikkale (1994) Aras alabalığı veya Kafkas alabalığı diye isimlendirdiği S.t. caspius alttürüne ait bazı özellikleri şöyle bildirmiştir; Vücudun yan tarafında ve sırta doğru, etrafı açık kahve renkli, ortası siyah noktalı benekler bulunmaktadır. Sırt koyu yeşil, yanlar ve karın gümüşi parlak renktedir. Gözler oldukça iri, ağız açıklığı gözün önünden indirilen dikmeye kadar ulaşır. Çelikkale (1994) Anadolu alası diye isimlendirdiği S.t. macrostigma alttürüne ait bazı özellikleri ise şöyle bildirmiştir; Vücut mekik şeklinde olup yanlardan hafif basıktır. Ağız büyükçe ve terminal konumludur. Sırt yüzgecinin serbest kenarları düz veya çok hafif girintilidir. Yağ yüzgecinin uzunluğu göz çapının 1,5 katıdır. Yan hattın üst tarafında 9 12 adet koyu veya siyah renkte ve düzensiz dağılmış benek vardır. Yan taraflarında ve sırt bölgesine yakın kırmızı benekler bulunur. Gözlerin arka tarafında özellikle preoperkulumlarda siyah lekeler bulunur. Kuyruk yüzgeci çatallı ve omur sayısı arasındadır.

48 Materyallerin Genotipik Varyasyon Analizi Her populasyona ait materyallerden 10 ar adeti DNA izolasyonunda kullanılmak üzere steril aletler kullanılarak, dorsal yüzgecin hemen altından alınan kas dokusu örneği daha önceden numaralandırılmış 15 ml lik steril tüplere konulmuştur. Tüplere alınan örnekler derhal sıvı azot tankına aktarılmıştır. Arazi dönüşünde laboratuara getirilen tank boşaltılarak örnekler -80 o C lik örnek depolama ünitesine aktarılmıştır. Kas örneği alınan balık materyali diğer iki balık ile birlikte araç soğutucusu ve buz aküleri yardımı ile fenotipik çalışmalarda kullanılmak üzere laboratuara getirilmiştir. Çalışmada populasyonlar arası ve populasyonlar için genetik varyasyon analizi 10 adet mikrosatelit markır kullanılarak yapılmıştır. Bu amaçla doğal alabalık materyallerinden genomik DNA izole edilmiş ve PCR işlemi ile istenilen bölge çoğaltıldıktan sonra istatistiksel olarak değerlendirilmek üzere çeşitli elektroforetik işlemlerle görüntülenmişlerdir. Moleküler biyolojik çalışmalar oldukça hassas olup özellikle elektroforez analiz sonuçları laboratuardan laboratuara farklılık gösterebilmektedir. Bu farkı minimize edebilmek amacı ile çalışma süresince klima kullanılarak ortamın sürekli 23±1 o C de kalması sağlanmış, tüm cihazlar kesintisiz güç kaynağına bağlanarak elektrik akımının sabit tutulması sağlanmış ve tüm koşullar mümkün olduğunca optimum tutulmaya çalışılmıştır. Yine bu amaçla kullanılan tüm kimyasal vs. malzemelerin aynı firma ürünleri olmasına özen gösterilmiştir a. Balık Materyallerinden Genomik DNA İzolasyonu İzolasyonda aşağıda açıklanmaya çalışılan Fenol/Kloroform Metodu (Asahida et al dan modifiye edilmiştir, Aksakal 2005) kullanılmıştır.

49 46 0,2 0,4 g kas dokusu steril ependorf tüplerine alınmıştır. Her bir tüpe 500 µl DNA Ekstraksiyon Solüsyonu (TNES) konulmuş ve steril bir makas yardımıyla iyice kıyılarak homojenize edilmiştir. Üzerine 10 µl Proteinaz K (10mg/ml) eklenmiş ve 55 o C de, 2 saat rotor disk yardımıyla hafifçe alt üst olacak şekilde inkübasyona bırakılmıştır (Bu aşamada Proteinaz K tüm proteinleri parçalamaktadır). Proteinler parçalandıktan sonra örnek üzerine 4 o C de bulunan Fenol:Kloroform:İzoamil alkolden (P:C:I) (25:24:1) 500 µl çeker ocak ortamında eklenmiş ve rotor disk yardımıyla 10 dak. daha nazik bir şekilde alt üst edilmiştir. Daha sonra 24 o C de, rpm de 15 dak. santrifüj yapılan örneklerde oluşan üç tabakadan en üst tabaka başka bir tüpe aktarılmıştır. o Yeni tüplere aktarılan tabaka üzerine 4 o C de bulunan Kloroform:İzoamil alkolden (C:I) (24:1) 500 µl çeker ocak ortamında eklendikten sonra örnekler rotor disk yardımıyla 10 dak. nazik bir şekilde alt üst edilmiştir. o 10 dak. sonunda 24 o C de, rpm de 15 dak. santrifüj yapılmış ve üst tabaka başka bir tüpe aktarılmıştır (İşlemler bir önceki basamaktan itibaren iki kez tekrarlanmıştır). Yeni tüplere aktarılan örnekler üzerine 50 µl 3 M Sodyum Asetat ilavesinin hemen ardından önceden -20 o C ye bırakılmış %99,9 luk Etanol den 1 ml eklenmiştir. Nazik bir şekilde birkaç kez alt üst edilmiş (bu aşamada DNA peleti gözlemlenmiştir) ve -20 ºC de 1-2 saat inkübasyona bırakılmıştır. 4 o C de, rpm de 20 dak. santrifüj yapılmış ve su trompu yardımıyla süpernatant atılmıştır. o Dipte kalan çökelek üzerine önceden -20 o C de bırakılmış %70 lik Etanol den 1 ml eklenmiştir. o 4 o C de, rpm de 20 dak. santrifüj yapılmış ve su trompu yardımıyla süpernatant atılmıştır (İşlemler bir önceki basamaktan itibaren iki kez tekrarlanmıştır). Tüp içerisindeki çökelek, etüvde 37 o C de 5 dak. kurutulduktan sonra µl (çözünebileceği miktarda) TE tamponu ile çözülmüş ve örnekler çalışılıncaya kadar -20 o C de muhafaza edilmiştir.

50 b. İzole Edilen DNA ların Kalitatif ve Kantitatif Analizi Toplam 50 adet DNA örneğinin 5µl lik miktarları uygun yükleme tamponu ile birlikte %1 agaroz jeli kullanılarak hazırlanan elektroforezde 80 ma, 90 voltta 2 saat yürütülmüş ve UV transimilatöründe fotoğraflanarak değerlendirilmiştir (Şekil 4.2). İzole edilen DNA örneklerinin kantitatif analizi ise spektrofotometrede 260 nm absorbansları ölçülerek, adresinden konsantrasyonları hesaplanmıştır. Ayrıca DNA ların 280 nm deki absorbansları ve A 260/280 oranı da ölçülerek kontaminasyon olup olmadığı kontrol edilmiştir (Çizelge 4.2). 260 nm de 1 optik dansite (OD) değeri 50 µg/ml çift sarmal DNA miktarına karşılık gelmektedir. 260 ve 280 nm dalga boylarında ölçülen absorbans değerleri birbirine oranlandığında bulunacak değerin (A 260/280 ) 2 ye yakın olması (1,7 1,9 aralığında) DNA izolasyonunun başarılı olduğunu göstermektedir (Sambrook 1989). %50 DNA-%50 protein karışımında A 260/280 oranının yaklaşık 1,5 olduğu bilindiğinden (Aynacıoğlu 2006) yaklaşık değer olarak 1,7 den küçük değerlerde DNA izolasyon işlemi tekrarlanmıştır c. Kullanılan Mikrosatelit Primerler Çalışmada 10 adet mikrosatelit primer kullanılmıştır. Primerlerin seçiminde Estoup et al. (1998) (BS131, 543AE, T3-13, 85, 43AEU+43AEL, FGT1), Poteaux et al.. (1999) (MST-73, Strutta-12, Strutta-58) ve Palti et al. (2002) nın (OMM-1338) yaptıkları çalışmalar literatür olarak kullanılmıştır. Primerlerin baz dizilimleri, bağlanma sıcaklıkları ( o C), beklenen PCR ürününün büyüklüğü (bp), MgCl 2 konsantrasyonları (mm) ve allel sayıları Çizelge 3.4 te verilmiştir. Ticari olarak (Alpha DNA) katı halde temin edilen primerler 20 pikomole seyreltilerek kullanım için hazırlanmıştır.

51 48 Çizelge Kullanılan mikrosatelit primerler ve özellikleri Primerler Baz Dizilimleri Forward Reverse BS AE T AEU + 43AEL FGT1 MST-73 Strutta-12 Strutta-58 OMM CACATCATGTTACTGCTCC CAGCCTAATTCTGAATGAG CTTTCTCTTGCGATAGTACGG GTTTCTACAGTCAGCACAAGTC CCAGTTAGGGTTCATTGTCC CGTTACACCTCTCAACAGATG GGAAGGAAGGGAGAAAGGT GGAAAATCAATACTAACAA GTTGTGGGCTGAGTAATTGG CTCCACATGCATCTTACTAACC AGATTTACCCAGCCAGGTAG CATAGTCTGAACAGGGACAG CTATTCTGCTTGTAACTAGCCTA CCTGGAGATCCTCCAGCAGGA AATCTCAAATCGATCAGAAG AGCTATTTCAGACATCACC AACAATGACTTTCTCTGAC AAGGACTTGAAGGACGAC TTCCCCTCAAACTGATGCATA TTTAGAATCCTCCGGTTC Tekrar Bölgeleri Bağlanma Sıc. ( o C) (TG) 6 (TG) (CT) (TG) 10 CG(TG) (CT) (TG) 5 AG(TG) 4 TA(TG) 3 AG (TG) 7 TA(TG) 7 AG(GT) 4 (GT) 23 GC(GT) 5 GC(GT) 2 GCGTGC(GT) 2 GC(GT) (GT) 13 TTATCT(GT) 3 58 (GT) (GT) ATG 58 PCR Ür. Büyüklüğü MgCl2 Kon. (mm) Allel Sayısı 1,5 6 1,2 4 1,0 9 1,5 4 1,2 4 0,8 10 1,5 4 1,5 27 1,5 23 2,5 4

52 d. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Çalışmada kullanılan 10 adet primerin her biri için kullanılan PCR protokolü Çizelge 3.5 te verilmiştir. Çizelge Primerler için kullanılan PCR protokolleri Primerler Ön Denatürasyon 95 o C Denatürasyon 94 o C Bağlanma Sıcaklığı (Tm) Uzama 72 o C Son Uzama 72 o C Döngü Sayısı BS dak. 1 dak. 45 sn. 1 dak. 5 dak AE 10 dak. 1 dak. 45 sn. 1 dak. 5 dak. 30 T dak. 1 dak. 45 sn. 1 dak. 5 dak dak. 1 dak. 45 sn. 1 dak. 5 dak AEU + 43AEL 10 dak. 1 dak. 45 sn. 1 dak. 5 dak. 28 FGT1 10 dak. 1 dak. 45 sn. 1 dak. 5 dak. 27 MST dak. 30 sn. 30 sn. 30 sn. 10 dak. 30 Strutta dak. 45 sn. 45 sn. 45 sn. 10 dak. 30 Strutta dak. 45 sn. 45 sn. 45 sn. 10 dak. 30 OMM dak. 30 sn. 30 sn. 30 sn. 10 dak. 36 PCR karışımları 20 µl lik hacimlerde hazırlanmışlardır. PCR karışımında kullanılan malzemelerin isimleri, konsantrasyonları ve temin edildiği firma/markası Çizelge 3.6 te belirtildiği gibidir.

53 50 Çizelge PCR karışımının muhteviyatı Madde Konsantrasyonu/Hacmi Markası F. Primer 10 pmol/µl Alpha DNA R. Primer 10 pmol/µl Alpha DNA MgCl 2 0,8-2,5 mm Sigma PCR Buffer (10x) 2-3 µl Sigma Taq DNA Polimeraz (without MgCl 2 ) 1 ünite Sigma dntp Karışımı 200 µm (her biri için) Sigma DMSO (Dimetilsülfoksit) Toplam hacmin %5 i Sigma DNA 200 ng ---- ddh 2 O 20 µl ye tamamlanır e. PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi e. 1. Agaroz Jel Elektroforezi PCR ürünlerinin kontrolünde %1 lik agaroz jel elektroforezi kullanılmıştır. Otoklavlanmış steril bir erlen içerisine gereği kadar agar hassas terazide tartıldıktan sonra üzerine gerekli hacimde 1xTAE (tris-asetikasit-edta) ilave edilmiştir. Erlen çalkalanmadan mikrodalga fırına yerleştirilmiştir. Kaynayıncaya kadar mikrodalga fırında ısıtılmıştır. Erlen daha sıcakken iyice çalkalanarak çözünmemiş agaroz parçacıklarının kalmamasına dikkat edilmiştir. Tam homojenizasyon sağlandıktan sonra oda sıcaklığına ayarlanmış su banyosunda soğumaya bırakılmıştır. Erlenin ısısı yaklaşık 50 0 C ye (bileği yakmayacak kadar) düştükten sonra 10 mg/ml konsantrasyonundaki etidium bromide den 14 µl/100 ml oranında ilave edilerek iyice karıştırılmıştır. Fazla soğuyup katılaşmasına izin vermeden, jel önceden hazırlanmış hazne içerisine dökülmüş, steril bir pipet yardımı ile varsa hava kabarcıkları mutlaka uzaklaştırılmıştır. Örneklerin yüklenecekleri kuyucukları oluşturan tarak yada taraklar yerleştirildikten sonra jelin donması için hacminin büyüklüğüne göre dak. beklenilmiştir.

54 51 Jel tamamen donduktan sonra haznesi ile birlikte küvete yerleştirilmiştir. Küvet jelin hazırlanmasında kullanılan 1xTAE tamponu ile doldurulmuştur. Tamponun seviyesi jelin üzerini kaplayacak seviyede olmalıdır. Yeteri miktarda (5 10 µl) PCR ürünü uygun bir yükleme tamponu (loading buffer) ile 1/10 oranında karıştırılarak kuyucuklara zarar vermeden ve taşırmadan yüklenmiştir. Yükleme tamponu olarak 6x loading buffer (Fermentas) (10 mm Tris-HCl, %0,03 bromphenol blue, %0,03 xylene cyanol FF, %60 glycerol, 60 mm EDTA) kullanılmıştır. PCR ürünleri 90 volt 80 ma de jelin büyüklüğüne göre dak. yürütüldükten sonra UV görüntüleme sisteminde fotoğraflanmıştır. Çalışmanın her aşamasında tüm PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi ile yürütülmüş, UV görüntüleme sistemi ile fotoğraflanmış ve bilgisayara aktarılarak kaydedilmiştir e. 2. Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) 5 populasyon ve populasyona ait bireyler arasındaki varyasyonun kontrolü için %6 lık poliakrilamid jel elektroforezi kullanılmıştır. Her jel hazırlanırken cam plakalar, camlar arasına yerleştirilen şerit levhalar (spacer) ve tarak %99 luk etil alkol yardımı ile iyice temizlendikten sonra jelin döküleceği düzenek hazırlanmıştır. Düzenek kurulduktan sonra manyetik karıştırıcı yardımı ile steril bir beher içerisinde ısıtılmadan, 60 ml dh 2 O 23,5 ml %30 akrilamid-bis karışımı 10 ml 10x TBE 5 ml gliserol karıştırılıp homojenize edildikten sonra akrilamidin bis vasıtasıyla polimerizasyonunu katalizlemek amacıyla ard arda 1000 µl 100 µl %10 luk APS ve TEMED ilave edilmiştir.

55 52 APS ve TEMED ilavesinden hemen sonra büyük bir enjektör yardımı ile karışım cam plakalar arasına hava kabarcığı bırakmadan seri bir şekilde boşaltılmış ve kuyucukları oluşturacak tarak yerleştirildikten sonra jelin donması için dak. beklenmiştir. Jelin donduğundan emin olmak için küçük bir miktar karışım, jelin hazırlandığı beher içerisinde bırakılarak takip edilmiştir. Tarak çıkarılmadan kuyucukların yerleri asetat kalem ile işaretlenmiştir. Bu işlem ürünlerin yüklenmesi aşamasında büyük kolaylık sağlamaktadır. Jel tamamen donduktan sonra düzenek sökülerek cam plakalar dikkatli bir şekilde küvete yerleştirilmiştir. Küvet solüsyonu olarak 1x TBE tamponu kullanılmıştır. Tamponun kuyucukları hava kabarcığı bırakmaksızın doldurduğundan emin olduktan sonra ürünlerin uygun miktarları (5 10 µl) uygun bir yükleme tamponu (6x loading buffer) ile 1/10 oranında karıştırılarak kuyucuklara zarar vermeden ve taşırmadan dikkatli bir şekilde yüklenmiştir. Sistem bu aşamada 4 5 saat çalışacağı için oluşacak ısıyı elemine etmek için soğutma tertibatı bağlanarak faaliyete geçirilmiştir. Sistem 120 voltta 4 5 saat yürütüldükten sonra jel etidium bromide ile boyandıktan sonra UV görüntüleme sisteminden görüntü alınmış ve değerlendirilmiştir e. 3. Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi (SSCP) Poliakrilamid jel elektroforezi ile yapılan çalışmalar sonucunda populasyonlar ve bireyler arası farkların olduğunun gözlenmesi üzerine, her bir bireye ait mikrosatelit lokusun bağlanma noktasındaki allel büyüklüklerinin belirlenmesi amacı ile tüm örnekler her bir mikrosatelit lokus ile ayrı ayrı SSCP yöntemi ile analiz edilmişlerdir. Mikrosatelitler kullanılarak yapılan varyasyon analizlerinde, allellerin fragment uzunluklarında gösterecekleri polimorfizmin tespiti analizin esasını teşkil etmektedir. Dolayısı ile her bir lokusa ait allel sayısı tespit edileceğinden analizlerde mümkün olduğu kadar birey bir arada yürütülmeye çalışılmıştır. Bu aşamada 62 adet örneğin bir arada yürütülebileceği, 35x50 cm boyutlarında ve 0,4 mm kalınlığındaki jel ile yürütmenin yapıldığı BioRad Manuel Sequencer System kullanılmıştır.

56 53 Şekil Kullanılan BioRad Manuel Sequencer System SSCP yönteminde değerlendirmenin yapılacağı bantların görüntülenmesi için ya primerler radyoaktif veya radyoaktif olmayan maddelerle işaretlenir yada jel bazı tekniklerle boyanmalıdır. Boyama teknikleri içerisinde en bilinen ve yaygın olarak kullanılanı gümüş boyama (silver staining) tekniğidir. Gümüş boyama tekniği kalınlığının 0,5 0,2 mm olduğu jellerde (kullanılan boyama kitinin özelliğinden dolayı) ve jelin UV transimilatöründe görüntülenemeyecek kadar büyük ölçülerde olması durumlarında tercih edilmiştir. Diğer durumlarda etidium bromide boyama tekniği kullanılmıştır. Daha önce yapılan çalışmalarda da (Yeşilyurt 2007) belirtildiği üzere çok daha düşük maliyetli ve daha kısa sürede tamamlanan etidium bromide boyama tekniğinin, gümüş boyama tekniği yerine kullanılabileceği test edilmiştir. Aralarındaki fark etidium bromide boyama tekniği ile boyanan jelde bantların UV transimilatöründe, gümüş boyama tekniği ile boyanan jelde ise bantların çıplak gözle görülmesidir. Jel poliakrilamid jel elektroforezinde anlatıldığı gibi hazırlanmış ve jel donduktan sonra içerisinde 1x TBE tamponu bulunan küvete yerleştirilmiştir. Yükleme yapılacak olan kuyucuklara 10 ar µl denatürasyon solüsyonu yüklenerek 130 voltta yaklaşık 30 dak. ön

57 54 yürütme yapılmıştır. Ön yürütme sırasında PCR ürünlerinin 5 er µl si ile denatürasyon solüsyonunun 5 µl si ependorf tüpleri içerisinde karıştırılmıştır. Karışım 95 o C de 10 dak. bekletilerek ürünlerin denatürasyonu sağlanmıştır. Bu aşamada PCR cihazı kullanılmıştır. 10 dak. sonunda renatürasyonu önlemek amacı ile karışım derhal leptop cooler adı verilen -20 o C lik kısa süreli saklama kabına yada buzlu su banyosuna aktarılmıştır. 15 dak. soğukta bekletilen PCR ürünleri seri ve dikkatli bir şekilde ön yürütmenin yapıldığı kuyucuklara yüklenmiştir. BioRad Manuel Sequencer System de yükleme 0,2 mm kalınlığındaki yaprak uçlu pipet uçları kullanılarak yapılmıştır. Belirleyici markır olarak 100 bp leader DNA markır kullanılmıştır. Markır denatüre PCR ürünleri ile birlikte ikili grubun ortasındaki kuyuya yüklenmiştir. BioRad Manuel Sequencer System ile yapılan çalışmalarda sistem 200 voltta 16 saat, standart dikey elektroforezi ile yapılan çalışmalarda ise sistem PAGE de olduğu gibi 120 voltta 4 5 saat yürütülmüştür. Yürütme bittikten sonra boyama işlemi ile bantların tespit edildiği jel görüntülerinden bilgisayar ortamında GeneSnap version 6.05 programı kullanılarak her bir allelin fragment uzunluğu belirlenmiştir (Şekil 3.11). Şekil GeneSnap version 6.05 programı kullanılarak allel uzunluklarının belirlenme işlemlerinden bir görüntü

58 e. 4. Gümüş Boyama (Silver Staining) Jel gümüş boyama için 40x55 boyutlarında özel yaptırılan kap içerisine dikkatli bir şekilde alınmıştır. Jel çok ince olduğundan aktarım işlemi sırasında yırtılmamasına özen gösterilmiştir. Boyama işleminde SERVA marka Silver Staining Kit (kat.no: & ) kullanılmıştır. Jel kit protokolüne uygun olarak boyandıktan sonra değerlendirilip fotoğraflandırılmıştır. 0,3 0,5 mm kalınlığındaki akrilamid jeli için kit protokolü şöyledir; Jel 30 dak. fiksatif solüsyonunda (chloride hydrocarbon kullanılarak hazırlanan 100 ml tricloraacetic acid) inkübasyona bırakılmıştır. Fiksatif solüsyonu boşaltılarak jel iki kez 10 ar dak. %30 luk etanol ile yıkanmıştır. Daha sonra jel 30 mg sodiumthisulfate*pentahydrat ın 100 ml distile su içerisinde çözülmesi ile hazırlanan solüsyon içerisinde 1 2 dak. inkübe edilmiştir. Süre sonunda solüsyon boşaltılarak jel üç kez 10 ar saniye distile su ile yıkanmıştır. Sonra jel 10 ml gümüş nitrat ın (AgNO 3 ) 100 ml distile su içerisinde çözülmesi ile hazırlanan gümüş nitrat solüsyonu içerisinde 15 dak. inkübasyona bırakılmıştır. AgNO 3 solüsyonu boşaltıldıktan sonra jel iki kez 10 ar saniye distile su ile yıkanmıştır. Daha sonra jel belirleme solüsyonu içerisinde bantlar gözle görülünceye kadar bekletilmiştir. Belirleme solüsyonu, 20 ml sodium carbonate 100 ml distile su içerisinde çözüldükten sonra üzerine 50 µl %37 lik formaldehyd ilave edilerek hazırlanmıştır. Bantlar gözle görüldükten sonra belirleme solüsyonu boşaltılarak jel 10 saniye distile su ile yıkanmıştır. Reaksiyonu sonlandırmak için jel 20 ml sitrik asitin 100 ml saf su içerisin de çözülmesi ile hazırlanan solüsyon içerisinde 5 dakika bekletilmiştir.

59 e. 5. Etidium Bromide Boyama Jel, hacmi jelin büyüklüğüne göre değişmekle birlikte ml %0,1 lik etidium bromide (1 mg/ml) çözeltisi bulunan cam kap içerisine alınmıştır. Boyama işlemi yavaşça çalkalanarak dakikada tamamlanmıştır (Yeşilyurt 2007). Boyama bitiminde jel yırtılmamasına büyük özen gösterilerek görüntülenmek üzere UV transimilatörüne aktarılmıştır. Aktarım sırasında asetat kağıdı kullanımı kolaylık sağlamaktadır. Etidium bromide kanserojen bir madde olduğundan ve ışıktan etkilendiğinden boyama işlemi, karanlık ortamda, eldiven ve maske kullanılarak yapılmıştır f. İstatistik Analizler Jel görüntülerinden GeneSnap version 6.05 programı ile belirlenen allelleri fragment uzunlukları kullanılarak GENETIX 4.02 programında populasyonların dağılımının 3 boyutlu düzlemde görülebileceği faktöriyel benzerlik analizi, allel frekansları, özgün alleller ve frekansları, beklenen ve gözlenen heterozigotluk değerleri yanı sıra F ST, F IS ve F IT değerleri hesaplanmış ve populasyonların Hary-Weinberg dengesinde olup olmadığı test edilmiştir. Yine aynı program yardımı ile Nei ye göre populasyonlar arası genetik mesafeler belirlenmiştir. Bulunan değerler permutasyon testine tabi tutularak istatistiksel olarak önemliliği test edilmiştir. Faktöriyel benzerlik analizi, hem populasyonlar arasındaki hemde populasyonlara ait bireyler arasındaki genetik mesafenin 3 boyutlu düzlemde ortaya koyulması için yapılan bir analizdir. Populasyona ait her birey için kullanılan her lokus başına elde edilen allel uzunlukları yardımı ile çizilen 3 boyutlu grafik (faktöriyel benzerlik analizi) populasyonlar ve bireyler arasındaki akrabalık bağlarının ve genetik mesafenin değerlendirilmesinde oldukça büyük rol oynamaktadır. Allel frekansı; bir mikrosatelit lokustaki herhangi bir allelin bireylerden hangisinde ne oranda görüldüğü yada bulunma sıklığı olarak tariflenebilir. Kullanılan mikrosatelit lokuslar içerisinde sadece bir tanesinde görülen diğerlerinde görülmeyen allellere ise

60 57 özgün allel denilmektedir. Her bir bireye ait allel frekansı ve özgün alleller tespit edilerek tablo oluşturulmuştur. Allel paylaşım uzaklıklarına göre populasyonlar ve bireyler arası genetik mesafeyi gösteren dendogram ve komşu birleştirme ağacı çizmek üzere veriler Populations programı yardımı ile analiz edilmiş ve TreeView programı yardımı ile de dendogram ve ağaçlar çizilmiştir Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler Çizelge Çalışmada kullanılan araç ve gereçler Malzeme Markası Serpme ve Kıyı Sürütme Ağları Olta takımları Steril bisturi, pens, kesme tahtası, eldiven vs. GPS (Global Positioning System) REC Sıvı azot taşıma tankı Sigma (2 L, D 3295) Etüv Binder Rotor Disk Stuart SB2 Soğutmalı Santrifüj Hettich Derin Dondurucular (-20 o C ve 86 o C) Bosch ve Muaire Buzdolabı (+4 o C) Aqualytic Leptop cooler (-20 o C kısa süreli saklama kabı) Nalgene (cat ) UV-Visible Spektrofotometre Thermo, Aquamate Otomatik Pipetler Eppendorf PCR Cihazı Eppendorf Vorteks Yellow line Mikrosantrifüj Labnet Mikrodalga Fırın Arçelik Yatay Elektroforezler Sigma, Thermo EC340 Dikey Elektroforez Bio-lab

61 58 Çizelge 3.7. (devam) Manuel Sequencer System Bio-rad UV Jel Görüntüleme Sistemi ve Programı GeneSnap version 6.05 Saf Su Cihazı Nüve, NS 168 Manyetik Karıştırıcı Boeco, MSH 300 Dijital ph metre Inolab Çeker Ocak Çalışmada Kullanılan Solüsyonlar ve Hazırlanışları TNES (DNA Ekstraksiyon Solüsyonu) Kimyasalın Adı Tris-HCl NaCl EDTA Son Konsantrasyon (ph=8,0) 100 mm 100 mm 10 mm SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) % 0.1 β-merkapto etanol dh 2 O (Steril) 100 mm 100 ml ye tamamlanmıştır TE Bafırı Kimyasalın Adı Tris-HCl EDTA (Karışım otoklavlanır). Son Konsantrasyon (ph=8,0) 10 mm 1 mm

62 59 Kloroform:İsoamilalkol (24:1) Kimyasalın Adı Kloroform İsoamilalkol Son Hacim 24 ml 1 ml Fenol:Kloroform:İsoamilalkol (25:24:1) Kimyasalın Adı Fenol Kloroform İsoamilalkol Son Hacim 25 ml 24 ml 1 ml TAE (Tris asetik asit edta) Kimyasalın Adı Tris base Glacikal asetik asit EDTA (0,5 M) dh 2 O (Steril) Son Hacim/Miktar (ph=8,0) 242 g 57,1 g 100 ml 1000 ml ye tamamlanmıştır TBE (Tris borik asit edta) Kimyasalın Adı Tris base Borik asit EDTA (0,5 M) dh 2 O (Steril) Son Hacim/Miktar (ph=8,0) 108 g 55 g 40 ml 1000 ml ye tamamlanmıştır

63 60 %30 Akrilamid/bis Karışımı Kimyasalın Adı Akrilamid Bis dh 2 O (Steril) Son Hacim/Miktar 29 g 1 g 100 ml ye tamamlanmıştır %10 luk APS Kimyasalın Adı Amonyumpersülfat dh 2 O (Steril) Son Hacim/Miktar 1 g 10 ml Denatürasyon Solüsyonu (SSCP için) Kimyasalın Adı Formamid Brom fenol blue Xiylen siyanol NaOH (100 mm) dh 2 O (Steril) Son Hacim/Miktar 9,5 ml 0,01 gr 0,01 gr 0,5 ml 10 ml ye tamamlanmıştır.

64 61 4. ARAŞTIRMA BULGULARI Çalışma Atatürk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu tarafından desteklenmiş olup Haziran-Kasım 2007 tarihleri arasında Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Su Ürünleri Bölümü ve Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı Laboratuarları nda yürütülmüş olup elde edilen bulgular şöyledir; Fenotipik Bulgular Laboratuara getirilen materyaller ile yapılan fenotipik araştırmalarında kullanılmak üzere her populasyona ait bir bireyin röntgen filmi çekilmiş (Şekil 4.1) ve elde edilen bulgular Çizelge 4. 1 de verilmiştir. Çizelge Populasyonlara ait bazı diagnostik veriler. Pop. L. Lateralis D A Omur Sayısı Pop III / 9 10 II-III / Pop IV / 9 11 III / Pop III-IV / III-IV / Pop III-IV / 9 10 III / Pop III-IV / 5 11 III-IV / Geldiay ve Balık (2002) nin bildirdiği Salmo trutta türünün alt türlerine ait özellikler dikkate alınarak her populasyona ait birey fenotipik olarak değerlendirilmiş ve daha önce yapılan çalışmalarda (Kuru 1975; Aras 1976; Aras 1986; Çelikkale 1994; Yüksel 1996; Ural 1997; Kocaman vd. 2004) dikkate alınarak türlerinin teşhisi yapılmıştır.

65 62 Şekil Materyallere ait röntgen görüntüleri

66 Genotipik Bulgular İzole Edilen Genomik DNA ların Kalitatif Analiz Bulguları Çalışmada 5 doğal alabalık populasyonunun her birine ait 10 birey ve toplamda 50 adet bireyden genomik DNA izole edilmiştir. İzole edilen DNA lar %1 lik agaroz jel elektroforezi ile yürütülerek UV transimilatörde fotoğraflanmıştır (Şekil 4.2). Şekil İzole edilen genomik DNA ların % 1 lik agaroz jel elektroforezindeki görüntüleri İzole Edilen Genomik DNA ların Kantitatif Analiz Bulguları İzole edilen DNA ların spektrofotometrede 260 nm, 280 nm de absorbansları ölçülmüş ve konsantrasyonları hesaplanmıştır (Çizelge 4.2).

67 64 Çizelge İzole edilen DNA örneklerinin ortalama absorbans değerleri ve konsantrasyonları Pop. Pop 1 Pop 2 Pop 3 Örnek No Ortalama Ölçüm Değerleri Konsnt ng/ml Pop. Pop 3 Örnek No Ortalama Ölçüm Değerleri Konsnt ng/ml 260 nm 280 nm A 260/ nm 280 nm A 260/ ,0241 0,0141 1,709 1, ,0234 0,0131 1,786 1, ,0351 0,0199 1,764 1, ,0343 0,0196 1,750 1, ,0406 0,0239 1,699 2, ,0465 0,0272 1,710 2, ,0324 0,0189 1,714 1, ,0392 0,0211 1,858 1, ,0242 0,0131 1,847 1, ,0289 0,0168 1,720 1, ,0293 0,0168 1,744 1, ,0384 0,0206 1,864 1, ,0366 0,0197 1,858 1, ,0470 0,0273 1,722 2, ,0286 0,0165 1,733 1, ,0249 0,0145 1,717 1, ,0318 0,0169 1,882 1, ,0382 0,0219 1,744 1, ,0470 0,0276 1,703 2, ,0461 0,0268 1,720 2,305 Pop ,0232 0,131 0,177 1, ,0293 0,0159 1,843 1, ,0368 0,0199 1,849 1, ,0349 0,0187 1,866 1, ,0236 0,0138 1,710 1, ,0433 0,0249 1,739 2, ,0100 0,0056 1,786 0, ,0282 0,0163 1,730 1, ,0331 0,0179 1,849 1, ,0304 0,0162 1,877 1, ,0365 0,0199 1,834 1, ,0331 0,0181 1,829 1, ,0348 0,0191 1,822 1, ,0297 0,0166 1,789 1, ,0100 0,0059 1,695 0, ,0216 0,0123 1,756 1, ,0337 0,0184 1,832 1, ,0223 0,0126 1,770 1, ,0327 0,0183 1,787 1, ,0213 0,0118 1,805 1,065 Pop ,0352 0,0195 1,805 1, ,0219 0,0129 1,698 1, ,0295 0,0173 1,705 1, ,0199 0,0112 1,777 0, ,0335 0,0185 1,811 1, ,0193 0,0109 1,771 0, ,0100 0,0055 1,782 0, ,0197 0,0108 1,824 0, ,0333 0,0191 1,743 1, ,0169 0,0093 1,817 0,845 Spektrofotometrede yapılan ölçümler 3 er tekerrürlü olarak yapılmış olup Çizelge 4.2 de ortalama ölçüm değerleri verilmiştir. Yapılan ölçümlerde 5,18,19,24,25,26 ve 30 numaralı bireylerin DNA örneklerinin A 260/280 oranı 1,7 nin altında ölçülmesinden dolayı izolasyonları tekrarlanmıştır.

68 Elektroforez Görüntülerine Ait Bulguları 5 farklı populasyondan birer birey ile yapılan ve populasyonlar arası varyasyonların görülebileceği sırayla agaroz jel elektroforezi, PAGE ve SSCP görüntülerini içeren çeşitli jel fotoğrafları Şekil 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 ve 4.7 de verilmiştir. Şekil T3-T13 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri Şekil Strutta-12 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri.

69 66 Şekil Strutta-58 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri Şekil BS131 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri Şekil FGT1 lokusuna ait agaroz jel, PAGE ve SSCP görüntüleri

70 İstatistiki Analizlere Ait Bulgular GENETIX 4.02 programı yardımı ile yapılan ve populasyonlara ait bireylerin üç boyutlu düzlemde gruplandırılabileceği faktöriyel benzerlik analizi Şekil 4.8 de verilmiştir. Şekildeki her bir renk bir populasyonu temsil etmektedir. Aynı populasyona ait bireyler halka içerisine alınmıştır. Resimde sarı renkli noktalar Ağrı Balıklı Göl populasyonuna (Pop 1) ait bireyleri, mavi renkli noktalar Bolu Abant Gölü populasyonuna (Pop 2) ait bireyleri, beyaz renkli noktalar Yeşil Dere populasyonuna (Pop 3) ait bireyleri, gri renkli noktalar Hamzanlar deresi populasyonuna (Pop 4) ait bireyleri ve eflatun renkli noktalar ise Yağlı deresi populasyonuna (Pop 5) ait bireyleri temsil etmektedir. Şekil Faktöriyel benzerlik analizi sonucu populasyonların 3 boyutlu düzlemdeki görüntüleri Her bir bireye ait allelin fragment büyüklüğü Populations programında analiz edilmiş ve elde edilen elde edilen veriler TreeView programı yardımı ile populasyonlar arası ve bireyler arası genetik ayrılığı sergileyen ağaçlar ve dendogramlar