Farklý Mayoz Evrelerindeki Oositlerin Ýn-Vitro Maturasyon Sürelerinin Deðerlendirilmesi

Transkript

1 Farklý Mayoz Evrelerindeki Oositlerin Ýn-Vitro Maturasyon Sürelerinin Deðerlendirilmesi DETERMINATION OF THE IN-VITRO MATURATION PERIODS OF THE OOCYTES IN DIFFERENT PHASES Mehmet CINCIK*, Þaban SEZEN**, Tansu KÜÇÜK***, Aysel ÞEFTALÝOÐLU**** * Yrd.Doç.Dr., GATA Týbbi Histoloji ve Embriyoloji AD, ** Uzm.Dr., GATA Týbbi Histoloji ve Embriyoloji AD, *** Doç.Dr., GATA Kadýn Hastalýklarý ve Doðum AD, **** Prof.Dr., Hacettepe Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Histoloji ve Embriyoloji AD, ANKARA. Özet GATA IVF merkezine baþvuran 28 hastadan toplam 216 adet profaz I(PI) ve metafaz I(MI) oositlerin oosit-korona-kumulus (OKK) kompleksi toplandý. Bunlarýn Oosit Maturasyon Ýndeksine (OMI) göre, in-vitro maturasyon (IVM)'larýný en ideal olarak kaç saatte tamamladýklarý araþtýrýldý. PI oositler (n=114) için uygun inkübasyon zaman aralýðý saat, bu zaman aralýðýnda olgunluða ulaþma(mii) oraný %66.5, telofaz II(TII)'ye ulaþma oraný %33 olarak bulundu. MI oositler (n=102) için uygun inkübasyon zaman aralýðý saat olarak bulundu. Bu zaman aralýðýnda, olgunluða ulaþma (MII) oraný %69, TII'ye ulaþma oraný %42.3 olarak belirlendi. PI oositler için uygun inkübasyon zaman aralýðýnýn saat, MI oositler için saat olmasý halinde IVM oranýný yükselteceði deðerlendirildi. Anahtar Kelimeler: Oosit, Mayoz, In-vitro maturasyon T Klin Týp Bilimleri 2000, 20: Summary Oocyte-corona-cumulus complex (OCC) of totally 216 prophase I (PI) and metaphase I (MI) oocytes were obtained from 28 patients who applied to GATA IVF center. It has been researched that PI and MI oocytes could complete their in-vitro maturation's (IVM) within how many hours ideally, based on Oocyte maturation index (OMI). It was found that the appropriate incubation time phase is hours for PI oocytes (n=114), in the same period the rate of maturation (MII) is 65.5%, the rate of having telophase II (TII) is 33%. It was also found that the reasonable incubation time phase is hours for MI oocytes (n=102). In the same period, it was determined that the rate of maturation (MII) is 69% and having TII is 42.3%. It was suggested that IVM rates would be higher if reasonable incubation time phase for PI oocytes hours and hours for MI oocytes. Key Words: Oocyte, Meiosis, In-vitro maturation T Klin J Med Sci 2000, 20: Yardýmcý üreme tekniklerin(yüt)'de inseminasyon ya da mikroenjeksiyon öncesi uygun preinkübasyon süresini saptamak için, her bir oosit olgunluðunun doðru deðerlendirilmesi önem taþýmaktadýr. Bunun için oosit olgunluðunu sýnýflayan sistemler (Oosit Matürasyon Ýndeksi) geliþtirilmiþtir (1). Olgun follikülün yýrtýlmasýyla metafaz II (MII) evresinde atýlan sekonder oosit olgun (matür) oosit Geliþ Tarihi: Yazýþma adresi: Dr. Mehmet CINCIK GATA Týbbi Histoloji ve Embriyoloji AD, Etlik, ANKARA olarak tanýmlanýr. Etrafýnda zona pellusida (ZP), ýþýnsal düzenli korona radiata ve kumulus ooforus tabakasýyla sarýlmýþ olarak oosit-korona-kumulus kompleksini (OKK) yapar. Yardýmcý üreme tekniklerin (YÜT)'de follikül ile beraber bu kompleks aspire edilir. Ovulasyondan yaklaþýk 4 gün önce (doðal siklusta LH pikinden; indüklenen sikluslarda hcg enjeksiyonundan önce) estradiol seviyesi yükselir, korona ve kumulus hücreleri daha yoðun hale gelirler. Merkezde yerleþik çekirdek bir germinal kese (Germinal Vezikül-GV) þeklinde görünür. Çekirdek, belirgin bir çekirdekçiðe sahiptir. LH piki ya da indüklenenlerde hcg'den sonra GV perifere hareket eder (2-5). T Klin J Med Sci 2000,

2 Mehmet CINCIK ve Ark. FARKLI MAYOZ EVRELERÝNDEKÝ OOSÝTLERÝN ÝN-VÝTRO MATURASYON SÜRELERÝNÝN DEÐERLENDÝRÝLMESÝ Tablo 1. Oosit matürasyon indeksi (OMÝ) Oosit statüsü Evre Mayotik statü Nüklear Statü Morfolojik Özellikler Immatür (Olgunlaþmamýþ) I Profaz I GV görülür. Yoðun korona hücreleri 1.kutup hücresi henüz Sadece birkaç tabakadan atýlmamýþtýr. ibaret kumulus hücreleri Intermediate II Metafaz I GV yýrtýlmýþ olduðundan Korona radiata hücrelerinin (Ara) seçilemez. yoðunluðu azalmýþtýr. 1.kutup hücresi Kumulus daðýnýktýr. henüz gözlenemez. Matür III Metafaz II Perivitellin aralýkta Ooplazma berrak, düzenlidir. (Olgun) 1.kutup hücresi gözlenir. ZP kolay seçilir. Granüloza hücreleri kumulus ve korona radiatanýn geniþlemesine yol açacak þekilde daðýlmýþtýr. GV: Germinal Vezikül. GV'ün yýkýlmasý (Germinal Vesicule Break Down-GVBD) saatte olur. Bazý kaynaklara göre clomiphene HMG-HCG sikluslarýnda bu 15. saatte olaylanýr (6). Metafaz I(MI)'den 4 saat sonra kromozomlar birinci mayoz ipliðinin metafaz plaðý boyunca dizilirler ve sonra kutuplara hareket ederler (Anafaz I). 34 saat geçince çoðu oosit MII'ye ulaþýr. 1. Kutup hücresi atýlýr ve kromozom sayýsý yarýya indirilir. Ardýndan ikinci mayoz ipliði oluþur. Kumulus ve korona hücrelerinin geniþlemesi (ekspansiyonu) da çekirdek maturasyonunu izler (2,4,5,7). MI'den MII'e geçerken kumuluslar da proteoglikan salgýlar ve ZP'daki porlarý doldururlar. Böylece spermiuma karþý direnç (rezistans) düþer. Bu nedenle de MII'deki oosite spermiumun penetrasyonu ve ooplazmaya girmesi (inkorporasyonu) þansý artar (3). YÜT'de immatür oositlerin in-vitro maturasyonlarý (IVM) saðlanabilirse baþarý artacaktýr. Bu nedenle farklý mayoz evrelerindeki oositlerin invitro matürasyon sürelerinin iyi bilinmesine ihtiyaç vardýr. Bu çalýþmada PI ve MI oositlerin en ideal inkübasyon zaman aralýðýna ulaþýlmaya çalýþýlmýþtýr. Gereç ve Yöntem GATA IVF merkezine farklý zamanlarda baþvuran 28 hastadan, hcg uygulamasýndan saat sonra ultrasonografi (Kretz-Münih) eþliðinde tek ya da çift lumenli aspirasyon iðnesi (Cook 1735 G) ile follikül aspirasyonu yapýlarak toplanan toplam 216 immatür insan oositi, embriyoloji laboratuvarýna aspirasyon sývýsýnýn içinde getirildi, laminar flowda (K-System-Holten, Danimarka), stereomikroskop (Leica Wild MZ8 - Almanya) altýnda incelendi. PI ve MI oositlerin, IVM'larýný ortalama kaç saatte tamamladýklarýný anlamak için, farklý sikluslarda toplanan oosit-korona-kumulus kompleksi, Oosit Matürasyon Ýndeksine (OMI) göre sýnýflandýrýldý (Tablo 1). Ayrýþtýrýlan oositler inkübatöre (Salvis- Biocenter 2001) kaldýrýldý. Ýnkübatör, sabit olarak, ýsýyý 37 C, nemi %90 ve karbondioksit konsantrasyonunu %5 düzeyinde ayarlayacak þekilde düzenlendi. ph'nýn 7.4 ve osmolaritenin mosmol olmasýna özen gösterildi ve çalýþmanýn ayrý basamaklarýnda, phmetre (PHU-92) ve Osmometre (Knauer) ile kontrol edildi. MII oositler 4-6 saat inkübasyondan sonra, eþlerinin swim-up yöntemi uygulanmýþ spermiumlarý ile insemine edildi ya da erkek faktörü varsa mikroenjeksiyona tabi tutuldu. Olgun olmayan oositlerin IVM periyodu sonundaki durumlarý tesbit edildi. Sony Color Video Printer-Thermal Kamera kullanýlarak polaroid fotoðraflarý çekildi. Bulgular IVM'larýný ortalama kaç saatte tamamladýklarýný anlamak için, farklý sikluslarda toplanan oosit-korona-kumulus kompleksi Oosit Maturasyon Ýndeksine (OMI) göre sýnýflandýrýlarak görüntülendi (Þekil 1,2). 296 T Klin Týp Bilimleri 2000, 20

3 FARKLI MAYOZ EVRELERÝNDEKÝ OOSÝTLERÝN ÝN-VÝTRO MATURASYON SÜRELERÝNÝN DEÐERLENDÝRÝLMESÝ Mehmet CINCIK ve Ark. Þekil 1. (a) PI oosit mikrografýdýr. Oosit korona kumulus kompleksinde germinal vezikül (GV) belirgin olarak seçilmektedir. S: sitoplazma, Kor: Korona hücreleri, Kum: Kumulus hücreleri (b) Korona-Kumulus hücreleri temizlendikten sonraki PI oosit. GV: Germinal vezikül, ZP:Zona Pellusida, S: sitoplazma. (c) PI oositin faz-kontrast mikroskobundaki görüntüsünün mikrografýdýr. Z:Zar, GV: Germinal vezikül. Þekil 2. MI oositin mikrografýdýr. (a) Korona-Kumulus kompleksi ile birlikte MI oosit (b) Korona-Kumulus hücreleri uzaklaþtýrýldýktan sonra MI oosit. Germinal vezikül yýkýlmýþtýr. (c) Ayný oositin faz kontrast görüntüsüdür. T Klin J Med Sci 2000,

4 Mehmet CINCIK ve Ark. FARKLI MAYOZ EVRELERÝNDEKÝ OOSÝTLERÝN ÝN-VÝTRO MATURASYON SÜRELERÝNÝN DEÐERLENDÝRÝLMESÝ MII oositler 4-6 saat inkübasyondan sonra, eþlerinin swim-up yöntemi uygulanmýþ spermiumlarý ile insemine edildiler ya da erkek faktörü varsa mikroenjeksiyona tabi tutuldular (Þekil 3). Olgun olmayan oositler Tablo 2'de belirtilen zaman aralýklarýnda, %90 Nem, %5 C0 2 ve 37 C'de inkübe edildiler. 4 saat aralýklarla mayotik statülerinde bir deðiþiklik olup olmadýðýna bakýldý. Gözlem sýrasýnda 1. kutup hücresini attýðý görülenler, ayrý petri dishlere alýnarak 4 saat sonra eþlerinin spermleriyle insemine edildiler. Bunlardan da ne kadarýnýn telofaz II (TII) evresine ulaþtýðýna bakýldý (Þekil 4). Farklý sikluslarda toplanýp ayný ortam koþullarý ve medium içinde gözlenen oosit örneklerinin birleþtirilmesi ile aþaðýdaki Tablo 2 ve 3 oluþtu. Þekil 3. (a) Olgun (MII) oositin mikrografýdýr. Germinal vezikül yýkýlmýþtýr. 1. kutup hücresi (KH1) net olarak seçilmektedir. S: Sitoplazma, ZP: Zona Pellusida (b) MII oositin faz kontrast mikrografýdýr. KH1: 1. kutup hücresi, S: Sitoplazma, ZP: Zona pellusida (c) Ýntrasitoplazmik spermium enjeksiyonu (ICSI) mikrografýdýr. Sp: Spermium, Mp: Mikroenjeksiyon pipeti, Hp: Holding pipet, Zona pellusida (ZP) geçilmiþ, zar (Z) henüz geçilmemiþtir. Þekil 4. (a) TII evresindeki oositin mikrografýdýr (solda). Birinci ve ikinci kutup hücreleri (kh1 ve kh2) perivitellin aralýkta net olarak seçilmektedir. kh2 nin görülmesi oositin döllendiðinin ve 2. Mayoz bölünmenin sürdüðünün bir iþaretidir. (b) TII oositin faz kontrast mikrografýdýr. kh1: 1.kutup hücresi, kh2: 2. Kutup hücresi, PVA: perivitellin aralýk, ZP: Zona pellusida, S: Sitoplazma. 298 T Klin Týp Bilimleri 2000, 20

5 FARKLI MAYOZ EVRELERÝNDEKÝ OOSÝTLERÝN ÝN-VÝTRO MATURASYON SÜRELERÝNÝN DEÐERLENDÝRÝLMESÝ Mehmet CINCIK ve Ark. Profaz I oositler için en uygun inkübasyon zaman aralýðý saat olarak bulundu (Tablo 2). Bu zaman aralýðýnda olgunluða ulaþma (MII) oraný %66.5, TII'e ulaþma oraný %33 olarak bulundu (Þekil 5). MI oositler için en uygun inkübasyon zaman aralýðý saat olarak bulundu. Bu zaman aralýðýnda, olgunluða ulaþma (MII) oraný %69, TII'ye ulaþma oraný %42.3 olarak saptandý (Tablo 3). Þekil 5. (a) PI oositi gösteren bir mikrograftýr. Aspire edildiði anda fotograflanmýþ olup germinal vezikül (GV) seçilmektedir. (b) (a)'daki oositin olgunlaþma sürecini gösteren mikrograftýr. A: 12 saat sonra germinal vezikül kaybolmuþtur (alttaki oosit). B: 22 saat sonra 1. kutup hücresi (KH1) atýlmýþtýr. (c) (a)'daki oositin 26. Saatteki TII durumunu gösteren mikrograftýr. 2. kutup hücresi de atýlmýþtýr. KH1: 1. kutup hücresi, KH2: 2. kutup hücresi. Tartýþma ve Sonuç YÜT'de toplanan PI ve MI oositlerin döllenebilme yeteneði bulunmamaktadýr (2,8,9,10). Matürasyon ilerledikçe fertilizasyon yeteneði artmaktadýr (11). MII evresindeki oositler fertilizasyon yeteneði en yüksek olanlardýr. Mayotik statünün MII'de olmasý ve spermiumun ZP ile oosit zarý engelini geçerek sitoplazma içine girmesi de döllenme için her zaman yeterli deðildir (2,9,12,13). Dolayýsýyla oosit immatüritesi IVF'de baþarýsýzlýk oranýnýn büyük bir kýsmýný oluþturmaktadýr (11,14). Bununla birlikte, matürasyonlarýný invitro olarak tamamlayan PI ve MI oositlerin döllenebildiði bildirilmiþtir (10,15). Ýmmatür oositlerin IVM'larýnýn saðlanmasý YÜT'nin baþarýsýný arttýracak ve immatür, matür ve postmatür oositlerin oranlarýnýn bilinmesi her hastanýn indüksiyona vermiþ olduðu cevabýn deðerlendirilmesini saðlayacaktýr. Ýnseminasyon öncesi uygun preinkübasyon süresini tesbit için her bir oositin olgunluðunun doðru deðerlendirilmesi çok önem taþýmaktadýr. Genellikle 16 mm'den küçük çaplý folliküllerden toplanan GV'ün görüldüðü immatür (PI) ve intermediate (MI) oositlerin ise olgunlaþma süreleri, kültür ortamý içinde, in-vitro olarak devam ettiðinden inseminasyon zamanlarý iyi bilinmemektedir. Bunlarýn IVM'undan sonra döllenebildiklerine ve gebelik oluþtuðuna dair raporlar bildirilmiþ olmasýna raðmen, inkübasyon süreleri ve inseminasyon zamaný konusunda bir uzlaþma saðlanabilmiþ deðildir (9,16). Daha önce yapýlan çalýþmalarda, olgun olmayan oositlerin IVM sürelerini Sathananthan ve arkadaþlarý saat, L. Veeck ve arkadaþlarý saat, Edwards ve arkadaþlarý saat olarak bildirmiþlerdir (17,18). L. Veeck ve arkadaþ- T Klin J Med Sci 2000,

6 Mehmet CINCIK ve Ark. FARKLI MAYOZ EVRELERÝNDEKÝ OOSÝTLERÝN ÝN-VÝTRO MATURASYON SÜRELERÝNÝN DEÐERLENDÝRÝLMESÝ Tablo 2. Profaz I (GV görülen) oositlerin IVM süreleri ve ulaþtýklarý evreler GV. görülen IVM süresi sonunda ulaþtýklarý evre Kültür Süresi (Saat) Oosit sayýsý MI % M II % T II % TOPLAM Tablo 3. MI oositlerin IVM süreleri Kültür MI Oosit IVM süresi sonunda ulaþtýklarý evre süresi (Saat) sayýsý MII % T II % TOPLAM larý saatlik inkübasyonla oositleri matür hale getirmeyi baþarmýþlardýr. Ýmmatür 74 oositten 44'ünün IVM'nun tamamladýðýný ve bunlardan 8 gebelik elde edildiðini bildirmiþlerdir. L.Veeck ve arkadaþlarý bu çalýþmalarda, PI'den MII'e ulaþan oosit oranýný %83 olarak bulmuþ ve bunlarýn %82'sinin döllendiðini bildirmiþlerdir. In vitro matürasyonunu tamamlayarak geliþen embriyonlar ile gebelik oranýný PI oositlerde %12, MII oositlerde %25 olarak bulmuþlardýr (11,14,18). Çalýþmamýzda daha önceki araþtýrmalardan farklý olarak, PI ve MI oositler için IVM sürelerini ayrý ayrý araþtýrmanýn daha doðru olacaðý deðerlendirilmiþtir. Bu zaman aralýðýnda oositler, her 4 saatte bir stereomikroskopla gözlenmiþlerdir. MII oositlerin de 4-5 saatlik inkübasyondan yararlandýklarý görülmüþtür. YÜT'de inseminasyon ya da mikroenjeksiyon zamanýnýn mayotik statünün irdelenmesinden sonra tesbiti daha doðru olacaktýr. Bulgularýmýza göre, IVM için uygun inkübasyon zaman aralýklarý PI oositler için saat, MI oositler için saat olarak belirlenmiþtir. IVF için, inseminasyon ya da mikroenjeksiyon yapýlacaksa bu sürelere uyulmasý baþarýyý arttýracaktýr. KAYNAKLAR 1. Jones HW, Jones GS. In Vitro Fertilization, Norfolk Williams and Wilkins Baltimore, Gruzinskas JG, Yovich JL. Gametes-The Oocytes. Cambridge Univ. Press Cambridge Blerkom JV, Motta PM. Ultrastructure of Human Gametogenezis and Early Embriyogenezis. Kluwer Academic Publishers, Van der Elst J, et al. In vitro maturation of mouse germinal vesicle-stages oocytes following cooling, exposure to cryoprotectants and ultrarapid freezing limited effect on the morphology of the second meiotic spindle. Hum Reprod 1992, Nov; 7 (10) Goodrowe KL. Nuclear maturation of domestic cat ovarian oocytes in vitro. Biol Reprod 1991; 45 (3): Racowsky L, et al. Nuclear degeneration and meiotic aberrations observed in human oocytes matured in-vitro analysis by light microscopy. Fertil Steril. 1992; 58 (4): Downs SM, et al. Differantial regulation of oocyte maturation and cumulus expansion in the mouse oocyte. Dev Biol 1995, 172(1): Terada Y. Localization of microfilaments during oocyte maturation of golden hamster Ang: 1995; 41(4) T Klin Týp Bilimleri 2000, 20

7 FARKLI MAYOZ EVRELERÝNDEKÝ OOSÝTLERÝN ÝN-VÝTRO MATURASYON SÜRELERÝNÝN DEÐERLENDÝRÝLMESÝ Mehmet CINCIK ve Ark. 9. Veeck L.L. Atlas of the human oocyte and early conceptus. Philadelphia: Williams -Wilkins, Tesarik J. et al. Progression of oocyte maturation from metaphase I to metaphase II is disturbed by previous immunological interference with cumulus cell function. Exp Zool 1991; 260(1): Plachot M., Mandebaum J. Oocyte maturation fertilization and embriyonic growth in vitro. British Medical Bulletin 1990; 40(3): Rowe P.J. Hargreave TB. Hand book of IVF Cambridge, Cambridge University Press, Moore KL, Persaud TVN. The Developing Human. Philadelphia: WB Saunders C, Galli C, et al. Development of immature boxine oocytes into viable embryos in vitro Bull Assoc Anat 1991; 75: Dersch Mark A. Bement William M. Cortical mebrane - trafficking during the meiotic resumption of xenopous laevis oocytes. Cell Tissue Res 1991, 263: Sathananthan A.Henry. Maturation of the human oocyte in vitro: nuclear events during meiosis (an ultrastructural study)--gamete Research 1985; 12: Dekel N, et al. Experimental extension of the time interval between oocyte maturation and ovulation effect on fertilization and first cleavage. Fertil Steril 1995; 64 (5): Armstrong, DT. Hormonal actions during oocyte maturation influence fertilization and early embryonic development. New York Academy of Sciences T Klin J Med Sci 2000,