INNO-LiPA HLA-A Update

Transkript

1 INNO-LiPA HLA-A Update ANAHTAR-KODU: FRI INNO-LiPA HLA-A Update v p 1/15 Türkçe Tarafından üretildi: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belgium Tel BTW BE RPR Gent Tarafından dağıtılan: Fujirebio Europe N.V. Tel Fax customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel Fax germany@fujirebio-europe.com 0459 Fujirebio Italia S.r.l. Tel Fax italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel Fax spain@fujirebio-europe.com "Vurgulanan Not değişiklikleri" Fujirebio France SARL Tel Fax france@fujirebio-europe.com Diğer Dillere bakınız / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: EUROPE GR IS LT RO SK TR LI MT EE non-europe US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

2 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 2/15 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 INNO-LiPA HLA-A Update : basamakları dahil... 4 Reaktifler... 4 Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları... 4 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 6 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 6 Örnekler... 7 Manipülasyon prosedürleri... 8 Strip kullanımı... 8 Manuel inkübasyon için talimatlar... 8 Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar... 9 Uyarılar ve önlemler... 9 Manual test prosedür... 9 Numuneler... 9 Denatürasyon ve hibridizasyon Sıkı yıkama Renk gelişimi Otomatik test prosedürü: Sonuçlar Okuma Doğrulama Sonuçların Yorumlanması Yorumlama yazılımı: LiRAS Prosedür sınırlamaları Test performans Doğruluk Çözünürlük (tipleme tablosu sürüm v1.0/ ) Numune reaktivitesi Duyarlılık Kesinlik Ticari markalar Kullanılan Semboller Üretici In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Parti kodu Katalog numarası Tarafından Kullanılan Kullanım Talimatlarına başvurun Sıcaklık sınırlaması <n> testleri için yeterli içerir

3 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 3/15 Kullanım amacı Konjugat Diluent Konjugat 100x Denatürasyon Çözeltisi Hibridizasyon Çözeltisi Durulama Çözeltisi 5x Sıkı Yıkama Çözeltisi Stripler 1 Stripler 2 Substrat BCIP/NBT 100x Substrat Tampon Tehlike Uyarı: INNO-LiPA HLA-A Update, insan lökosit antijen (HLA) A allellerinin, allel grup seviyesinde, moleküler tiplemesini yapmak için in vitro kullanım için tasarlanmıştır. Test prensibi INNO-LiPA HLA tipleme testi, şekil 1 de özetlenen ters hibridizasyon temeline dayanmaktadır. Amplifiye biotinlenmiş DNA materyali kimyasal olarak denatüre edilir ve ayrılan iplikler, membran temelli stripler üzerine paralel şekilde sabitlenmiş spesifik oligonükleotidler ile hibridize olur. Bu işlemi, yanlış eşleşmiş amplifiye materyalleri uzaklaştırmak için yapılan sıkı yıkama basamağı izler. Sıkı yıkamadan sonra alkalin fostatazlı streptavidin konjugat eklenir ve önceden şekillenmiş herhangi bir biotinlenmiş hibrite bağlanır. Kromojen içeren substrat çözeltisi ile inkübasyon mor/kahverengi çökelti ile sonuçlanır. Reaksiyon yıkama basamağı ile durdurulur ve probların reaktivite örüntüsü kaydedilir. INNO-LiPA HLA-A Update ile biyotinlenmiş amplifiye materyalin standardize edilmiş hazırlığı için bir amplifikasyon kiti (INNO-LiPA HLA-A Multiplex) bulunmaktadır. Amplifikasyon kiti polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanmaktadır. Bu amplifikasyon kiti polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) temeline dayanmaktadır. Amplifikasyon ürünleri sonradan 43 sekans-spesifik problar ve 2 kontrol çizgisinin sabitlendiği yerde 2 tipleme stripi kullanılarak hibridize edilir (Şekil 2).

4 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 4/15 Şekil 1: IINNO-LiPA HLA tipleme test prosedür prensibi INNO-LiPA HLA-A Update: Basamakları dahil Basamak 1 Basamak 2 Basamak 3 Basamak 4 HLA-A lokusunun 1,2,3 ve 4. ekzonlarının multiplex amplifikasyonu. İki INNO-LiPA HLA-A Update stribi üzerinde hareketsiz 44 prob çizgisiyle hibridizasyon ve sıkı yıkama (56 C). Renk geliştirilmesi Prob reaktivite örüntüsünün yorumlanması. INNO-LiPA HLA-A Update, allellik seviyede (standart HLA isimlendirmesi izlendiğinde, bir allelin isminde yıldızdan sonraki ilk dört basamak demektir. Ör: HLA-A*26) ters hibridizasyon formatını kullanarak mümkün olan en iyi çözünürlüğü sağlamak için tasarlanmıştır. Allele gruplarının yorumlanmasına ek olarak, yazılım bütün olası allel kombinasyonlarını verecektir fakat bu bilgi ekstra sayılmalı ve karar aşamasında kullanılmamalıdır. Reaktifler Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları - Açılmamış ve 2-8 C de saklanmış, kaplı test stripleri dahil tüm test reaktifleri kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Reaktifleri dondurmayın. - Tüm reaktifler ve test striplerini içeren plastik tüpler kullanımdan önce yaklaşık 60 dakika oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmeli ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına kaldırılmalıdır. - Kit bileşenlerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler kararsızlık veya bozulma belirtisi olabilir. - - Bu kit kontamine DNA nın herhangi kaynağından, özellikle amplifiye DNA ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - - Striplerin kullanımdan önce kıvrılmasını önlenmesi için plastik tüplerin yatay olarak saklanması önerilir.

5 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 5/15 Her bir paket içeriği: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Konjugat 100x 1x 1,5 ml Kullanımdan önce Konjugat Seyreltici içinde 1/100 seyreltilecek, protein stabilizatörleri ve koruyucular içeren tampon içerisinde alkalin fosfataz ile etiketli streptavidin. Her test oluğu için 2 ml Konjugat çalışma solüsyonu hazırlayın + 2 ml fazladan (Konjugat çalışma solüsyonu sıkı yıkama esnasında hazırlanabillir) manuel test için. Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Konjugat çalışma tamponu oda sıcaklığında (20-25 C) karanlıkta korunduğu sürece 24 saat kararlıdır. Konjugat Diluent 1x 150 ml NaCl, Triton, protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren fosfat buffer. Denatürasyon Çözeltisi Hibridizasyon Çözeltisi Durulama Çözeltisi 5x Sıkı Yıkama Çözeltisi 1x 1 ml EDTA içeren alkalin çözeltisi. Kullanıldıktan sonra şişe kapağı derhal kapatılmalıdır, çözeltinin havaya uzun süre maruz kalması denatürasyon gücünde hızlı bir gerilemeye sebep olur. 2x 80 ml % sodyum dodecyl sulfat (SDS) içeren Salin sodyum fosfat EDTA (SSPE) buffer. Hibridizasyon Çözeltisi önceden en az 37 C ye ısıtılmalıdır ve sıcaklık 56 C yi aşmamalıdır (kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır). 2x 80 ml Kullanmadan önce distile veya deiyonize suda 1/5 (1 kısım + 4 kısım) oranında seyreltilecek, NaCl, Triton ve koruyucu olarak 0.05% MIT/0.48% CAA içeren fosfat tamponu. Her test oluğu için 8 ml Durulama çalışma solüsyonu hazırlayın + 10 ml fazladan. Auto LiPA için, test oluğu başına başına 12 ml Durulama Çalışma Solüsyonu hazırlayın +20 ml fazladan. Durulama Çalışma Çözeltisi 2-8 C de iki hafta kararlıdır. 2 x 200 ml % 0.1 SDS içeren SSPE tamponu. Sıkı Yıkama Çözeltisi önceden en az 37 C ye ısıtılmalıdır ve sıcaklık 56 C yi aşmamalıdır (kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır). Stripler 1 1x Prussian mavi markır çizgisiyle işaretli INNO-LiPA HLA- A Update için 20 tane strip 1 içerir. Stripler 2 1x Turkuaz markır çizgisiyle işaretli INNO-LiPA HLA-A Update için 20 tane strip 2 içerir. Substrat BCIP/NBT 100x 1x 1,5 ml Kullanımdan önce Substrat buffer içinde 1/100 seyreltilecek, dimethylformamide (DMF) içinde 5-Bromo- 4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP) ve nitroblue tetrazolium (NBT). Manuel test için her test oluğu için 2 ml Substrat Çalışma Çözeltisi hazırlayın + 2 ml fazladan( Substrat Çalışma Çözeltisi konjugat inkübasyonu sırasında hazırlanabilir). Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Substrat çalışma solüsyonu oda sıcaklığında (20-25 C) karanlıkta korunduğu sürece 24 saat kararlıdır. Substrat Tampon 1x 235 ml NaCl, MgCl2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren Tris-tamponu. İnkubasyon tepsisi 5 - Her biri sekiz küvet içerir.

6 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 6/15 Okuma kartı 1 Pozitif probların tanımlanması için. Bileşen Miktar Ref. Açıklama Veri raporlama sayfası 2 Kullanılan striplerin saklanması için. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - INNO-LiPA HLA-A Multiplex - Çalkalayıcı platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapaklı; sıcaklığı 56 C ± 0.5 C de ayarlanabilen). - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre. - Orbital, karşılıklı veya sallanan platform çalkalayıcı. Orbital çalkalayıcı için öneriler: Dairesel hareket çapı 13 mm 'ye eşit ya da daha üstün olmalıdır. 13 mm dairesel hareket için önerilen hız 160 rpm Çift taraflı çalkalayıcı için öneriler: ileri geri hareket için önerilen hız dakikada 80 harekettir. Sallanan bir platform çalkalayıcı için: Sallama açısı sıvı dökülmesini önlemek için 13 'yi geçmemelidir. Önerilen hız 50 rpm. - Vorteks mikser veya eşdeğer. - Dereceli silindirler (10, 25, 50 ve 100 ml). - Distile veya deionize su. - Tek kullanımlık eldiven - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Strip işleme için forsepsler µl, µl, ve µl dağıtmak için ayarlanabilir pipetler. - Dispensing Multipipet (Eppendorf, isteğe bağlı). - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). Güvenlik ve Çevre Koşulları Lütfen Material Safety Data Sheet (SDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz. En son güncellenen SDS versiyonu almaktadır. Tehlike Uyarı. Tehlike Sodyum hidroksit içerir H314-P260-P280-P303+P361+P353-P305+P351+P338-P310-P363 2-Chloroacetamide içerir H317-P280-P261-P362+P364-P333+P313-P302+P352 N,N-Dimethylformamide, 5,5'-diphenyl-3,3'-bis (4-nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride ve methanol içerir H312-H332-H319-H360D P261-P280-P201-P303+P361+P353-P305+P351+P338-P308+P313

7 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 7/15 Tehlike Açıklamaları H312 Cilt ile temasta zararlı. H314 Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur. H317 Allerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. H319 Ciddi derecede göz tahrişine neden olur. H332 Solunması halinde zararlıdır. H360D Doğmamış çocuğa zarar verebilir. Önlem ifadeleri: P201 Kullanmadan önce özel talimatları elde edininiz. P260 Duman/buhar/sprey solumayın. P261 Duman/buhar/sprey solunmaktan kaçının. P280 Koruyucu eldiven/koruyucu giysi/göz koruyucu/yüz koruyucusu kullanın. P303+P361+P353 Cilt temasında(veya aç): Derhal tüm bulaşmış olan kıyafetleri çıkarın. Su/duş ile cildi durulayın. P305+P351+P338 GÖZ TEMASINDA: Dikkatlice bir kaç dakika sudan geçiriniz. Mevcut ve kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Durulamaya devam edin. P308+P313 Maruz kaldığınızda veya endişelendiğinizde: Tıbbi yardım/destek alın. P310 Hemen bir ZEHİR MERKEZİ/doktor/... başvurun. P333+P313 Ciltte tahriş veya kızarıklık meydana gelirse: Tıbbi yardım/destek alın. P362+P364 Kirlenen giysileri çıkartın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. P363 Tekrar kullanmadan önce kontamine olmuş giysileri yıkayın. P302+P352 Cilt temasında: Bol su ve sabun ile yıkayın. - Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. - Numune her zaman potansiyel bulaşıcı gibi ele alınmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenleri ve biyolojik maddeler potansiyel olarak bulaşıcı olarak kabul edilmelidir. Tüm kan bileşenleri ve tüm biyolojik materyaller güvenlik koşullarına uygun olarak atılmalıdır. 121 C de en az 15 dakika otoklavlayın. Tek kullanımlık malzemeleri yakınız. Nihai konsantrasyon ±% 1 sodyum hipokloritli olacak şekilde,sıvı atığı sodyum hipoklorit ile karıştırın. Bertaraf etmeden önce bir gece bekletin. DİKKAT: Asit içeren sıvı atığı sodium hipoklorit eklemeden önce nötralize edin. - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar işlenirken eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık bertaraf kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnekler INNO-LİPA HLA-A Update testi biyotinlenmiş, amplifiye DNA materyali kullanıldığından beri, bir amplifikasyon kiti INNO-LİPA HLA-A Multiplex eşlik eden bir araç olarak kullanılabilir.

8 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 8/15 Manipülasyon prosedürleri Strip kullanımı - Stripler sadece tek kullanılmak üzere tasarlanmıştır! - Striplere çıplak elle dokunmayın, temiz forsepsler kullanın. - Test striplerinin tanımlaması için kurşun kalem kullanın. Tükenmez kalem vs kullanmayın. Kimliği striplerin üzerindeki marker çizgisinin yukarısına yazın. - Farklı inkübasyon aşamaları boyunca, test stripleri her zaman aynı oluk içinde kalmalıdır. - Kullanılmamış veya gelişmiş stripler yoğun ışık ve ısıdan uzak tutulmalıdır. - Yorumlama, kaplama ve depolama öncesi gelişmiş striplerin tamamen kurumasını bekleyin. - Gelişmiş kuru stripler tercihen C de karanlıkta saklanmalıdır. - Olukları tekrar kullanmayın. Manuel inkübasyon için talimatlar - Hibridizasyon ve sıkı yıkama esnasında 56 C ± 0.5 C de inkübasyon yanlış pozitif (sıcaklık çok düşük) veya yanlış negatif/çok zayıf sinyallerden (sıcaklık çok yüksek) kaçınmak için en önemli aşamadır. Eğimli kapaklı bir çalkalamalı su banyosu sıcaklık değişimleri üzerinde iyi bir kontrol sağlar. Kalibre termometre ile sıkı sıcaklık kontrolü gereklidir. - Yanlış pozitif sinyalleri önlemek için inkübasyon sırasında su banyosunun kapağını her zaman kapatın. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için, oluklar su banyosunun çalkalayıcı platformu üzerine konulmalıdır. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Olukların su üstünde yüzmediğinden emin olun. Su oluklar ile doğrudan temas halinde olmalıdır. - Renk gelişimi için inkübasyon basamakları C arasında olmalıdır. Sıcaklık 20 C'nin altındaysa daha zayıf sonuçlar elde edilebilir. Sıcaklık 25 C'nin üzerinde olursa yüksek bir arka plan ve / ya da yalancı pozitif sinyaller elde edilebilir. - Her zaman protokolde belirtilen süre kadar inkübasyon yapın. - Çalkalamalı su banyosu (hibridizasyon ve sıkı yıkama prosedürü) ve çalkalayıcı (renk geliştirme prosedürü) tarafından üretilen hareket genliği maksimum duyarlılık ve homojen boyama için kritiktir. Strip yüzeyi tamamen daldırılmış olmalıdır. Genlik mümkün olduğu kadar yüksek olmalıdır. Bununla birlikte, olukların kenarları boyunca sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! Bu çapraz kontaminasyon ve geçersiz sonuca yol açabilir. - Striplerin inkübasyonu esnasında çalkalama, sıvı olukların kenarlarından dökülmeden, hem test striplerinin hem sıvının oluk içinde ileri ve geri hareket etmesi şeklinde yapılmalıdır. - Tepsiyi örtmeyin. Sıkı yıkama ve hibridizasyon inkübasyonu sırasında, oluklar su banyosu içinde ortada bırakılabilir. Mikroplate kapağı ile olukların kaplanması çapraz kontaminasyona neden olabilir.

9 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 9/15 Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar - Sıvı tercihen bir vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile olukdan aspire edilir. Tepsi tüm sıvının oluğun bir ucuna akmasına izin vermek için bir açıyla tutulur. - Her oluğa uygun çözeltiden 2 ml ekleyin ve protokolu izleyin. Bir dağıtım Multipipet (Eppendorf) bu amaç için yararlıdır. - Bu aşamayı test prosedürü kısmında belirtildiği kadar tekrar edin. NOT: İki aşama arasında striplerin kurumasına izin vermeyin. Aspirasyon sırasında striplerin yüzeylerinin tahrip olmadığından emin olun. Sıvıyı, stripin üst kısmından marker hattına kadar aspire edin. Tüm sıvı aspire olduğundan emin olun. Solüsyon içine tamamen daldırarak tüm stribin iyice yıkandığından emin olun. Gerektiğinde çalkalayıcı hızını uyarlayın. Uyarılar ve önlemler - Sadece in vitro kullanım için. - Sadece profesyonel kullanım için. - DNA kontaminasyonundan kaçınmak için, pre-ve post-amplifikasyon adımları arasında maksimum fiziksel ayrım önerilir: ayrı odalarda, ayrı pipetler ve diğer laboratuvar malzemeleri, ayrı laboratuvar önlük ve eldiveni (ve onların stoğu) iyi laboratuar uygulamaları için alınabilecek minimum önlemlerdir. - Post amplifikasyon odasından pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüşten kaçının. - Otoklavlanmış tek kullanımlık laboratuar malzemesi kullanılması tavsiye edilir. - Tek kullanımlık laboratuar malzemelerini tekrar kullanmayın. - Herbir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Son kullanma tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın. - Bileşenleri aynı lot numarasına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın. - Reaktiflerin mikrobiyel kontaminasyonundan kaçının. Manual test prosedür - NOT: Farklı inkübasyon aşaması boyunca, test stripleri hep aynı oluk içinde kalmalıdır. İnkübasyon öncesinde kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin ve gerekliyse sıcaklığı tepsiyi su banyosuna yerleştirmeden önce ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Numuneler 1. HLA-A amplifiye ürün (10 μl kullanın). Örnek hazırlığı için: INNO-LiPA HLA-A Multiplex kullanım talimatlarına bakın. NOT: Tam olarak 10 μl amplifiye örnek eklendiğinden emin olun. Gereğinden fazla veya az örnek yanlış tiplemeye sebep olabilir. 2. Boş amplifiye kontrol örneği (negatif kontrol; 10 μl kullanın).

10 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 10/15 Denatürasyon ve hibridizasyon 1. Çalkalayıcılı su banyosunu 56 C ± 0.5 C ye ısıtın. Sıcaklığı kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin ve eğer gerekirse ayarlayın. Belirtilen sıcaklığı aşmayın. Hibridizasyon Çözeltisi ve Sıkı Yıkama Çözeltisini kullanmadan önce en az 37 C ye ayarlanmış su banyosunda ısıtın, su banyosu sıcaklığı 56 C yi geçmemelidir. Kullanmadan önce karıştırın. Bütün kristaller çözünmüş olmalıdır. 2. Forseps kullanarak tüpten gerekli miktarda INNO-LiPA HLA-A Update stribi alın (bir test örneği için bir strip1 ve bir strip 2). Kör amplifiye kontrol örneği içinde bir strip ekleyin. Stribe Prusya mavisi / turkuaz marker çizgisinin üzerinde kalan bölgeye kurşun kalem ile bir kimlik numarası yazın. 3. Gerekli sayıda test oluğu alın ve tepsiye yerleştirin ( her strip için bir oluk). 4. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denatürasyon Çözeltisi pipetleyin. NOT: Kullandıktan sonra şişenin kapağını derhal kapatın μl örnek (Örneklere bakın; INNO-LiPA HLA-A Multiplex kullanma talimatına bakın) ekleyin ve pipet ile dikkatlice çekip bırakarak karıştırın. Her zaman steril pipet ucu kullanın. Denatürasyonun gerçekleşmesi için C de 5 dakika bekletin. 6. Önceden ısıtılmış Hibridizasyon Çözeltisini çalkalayın ve her oluğa denatüre amplifiye ürün için yavaşca 2 ml ekleyin. Yavaşça çalkalayarak karıştırın. Pipetleme sırasında komşu oluklarını kontamine etmemeye özen gösterin. 7. Stripleri derhal oluklara yerleştirin. Stripler çözeltiye tamamen batmalıdır. NOT: Tek kullanımlık eldiven giyin, forseps kullanın. 8. Tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin (80 rpm; Manuel inkübasyon için talimatlara bakın), kapağını kapatın 30 dakika inkübasyona bırakın. NOT: Su banyosundan oluklara su sıçramasından kaçının. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Tepsinin kaymasını engellemek için iki ağırlık arasında sabitleyin. Sıkı yıkama 1. Hibridizasyonun ardından tepsiyi su banyosundan kaldırın. 2. Tepsiyi düşük açıda tutun ve tercihen vakum aspiratöre bağlı pipetle oluktan sıvıyı aspire edin. Her oluğa 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin, tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 3 dakika inkübe edin. 3. İnkübasyondan sonra tepsiyi su banyosundan çıkarın ve oluklardaki sıvıyı aspire edin dakikalık inkübasyon aşaması ve aspirasyon aşamasını bir kere tekrarlayın. 5. Sonunda, her oluğa 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin ve tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 4 dakika inkübe edin. NOT: Konsantre haldeki Durulama Çözeltisi 5x ve Konjugat 100x sıkı yıkama basamağı sırasında dilüe edin. Reaktiflere bakın. Renk gelişimi Sonraki bütün inkübasyonlar çalkalayıcıda C de gerçekleştirilir. İnkübasyonlar sırasında oluklardaki sıvı ve stripler homojen bir boyama için ileri geri hareket etmelidir.

11 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 11/15 1. Her stribi 2 ml Durulama çalışma solüsyonu kullanarak 1 dakika boyunca iki kez yıkayın (oluklardaki sıvı değişimi için Talimatlara bakın). 2. Her oluğa 2 ml Konjugat çalışma çözeltisi ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. NOT: Konjugat inkübasyonunun bitmesine yaklaşık on dakika kala Substrat BCIP/NBT 100x Çözeltisini dilüe edin. Reaktiflere bakın. 3. Her stribi 2 ml Durulama çalışma solüsyonu kullanarak 1 dakika iki kez yıkayın ve 2 ml Substrat Buffer kullanarak bir kez daha yıkayın. 4. Her oluğa 2 ml Substrat çalışma çözeltisi ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. DİKKAT: Eldiven ve koruyucu gözlük giyin. 5. En az 3 dakika çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 2 ml distile su içinde iki kez stripleri yıkayarak renk gelişimini durdurun. 6. Forseps kullanarak, stripleri oluklardan çıkarın ve absorban kâğıt üzerine koyun. Sonuçları okumadan önce stripleri tamamen kurutun. Renklenmiş stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürü: Göstergeler ve ilişkili protokoller Fujirebio Avrupa N.V. edinilebilir (bakınız- Sonuçlar Okuma Şekil 2, INNO-LiPA HLA-A Update striplerindeki farklı oligonükleotid problarının pozisyonlarını göstermektedir. Bir çizgi, test prosedürünün sonunda net bir mor/kahverengi bant belirdiğinde Pozitif kabul edilir. Şekil 2: Marker çizgilerinin yerleşimi (Strip 1 de koyu lacivert çizgi Strip 2 de turkuaz çizgi), Konjugat Kontrol çizgisi (conj. control), HLA-A Update Kontrol çizgisi (HLA-A kontrol), INNO-LiPA HLA-A Update Stripleri üzerindeki 44 probe çizgisi.

12 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 12/15 Doğrulama - Her test çalışmasına bir negatif kontrol dahil edin. Herhangi yeni test prosedürüyle olduğu gibi, ek pozitif ve negatif kontrollerin dahil edilmesi doğru test prosedürünün gerçekleştirilmesi konusunda yüksek derecede güvene erişilene kadar dikkate alınmalıdır. Test koşullarının uygunluğunun gösterilmesi için referans DNA kullanılması önerilmektedir. - INNO-LiPA HLA-A Update striplerindeki en üstteki çizgiler (Şekil 2) markır çizgileridir (Prusya mavisi ve turkuaz çizgiler). Bu çizgiler stribin doğru yönlendirilmesini sağlar. - Sonraki çizgi tespit prosedürü sırasında reaktif Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonunun eklenmesini kontrol eder. Bu çizgi plastik okuma kartındaki Konjugat Kontrol çizgisi ile yanyana gelmelidir. Bu çizgi daima pozitif olmalıdır (değilse: yorumlama yapılmamalı!) ve aynı test çalışmasında her strip üstünde yaklaşık aynı yoğunluğa sahip olmalıdır. - Bir sonraki çizgi, hibridizasyon için uygun miktarda HLA- amplifiye materyalin eklenip eklenmediğini kontrol eden HLA-A Update iç hibridizasyon kontrol çizgisidir (okuma kartında HLA-A kontrol). Bu çizgi, Negatif Kontrol hariç, her zaman pozitif olmalıdır ama yoğunluk örnekler arasında farklılık gösterebilir. - Her negatif kontrolün test sonucu Konjugat kontrol çizgisi hariç, strip üzerindeki çizgilerin herhangisi için belirgin sinyal vermemelidir. - Bir stripteki probların renk yoğunlukları bir çizgiden diğerine değişiklik gösterebilir. Sonuçların Yorumlanması - Stripteki konjugat kontrol çizgisi ile plastik okuma kartı üzerindeki konjugat kontrol çizgisi yanyana gelmelidir. - Her bir stribin geçerliğini göstermek için öncelikle kontrol çizgilerinin pozitifliğini kontrol edin (ilk iki çizgi) (Geçerliliğe bakın). - Tipleme sonuçları kit içindeki probların reaktivitesine dayanır. Prob özgüllükleri listesi mevcuttur. - INNO-LiPA HLA-A Update striplerde pozitif olan tüm prob numaralarını belirleyin ve INNO-LiPA HLA-A Update tipleme tablosunu veya LİPA yorumlama yazılımı kullanarak HLA-A tipini anlayın. (Yorumlama yazılımı LİRAS bakın). Yazılım sıklıkla kullanım amacından daha fazla sayıda sonuç verir: muhtemel allel kombinasyonlarının yanısıra allel grupda yorumlama verilir. Bu kit allelleri, allelik seviyede spesifik olarak tiplemek üzerine tasarlanmadığından, bu bilgiler ekstra sayılmalı ve karar aşamasında kullanılmamalıdır. Yorumlama yazılımı: LiRAS INNO-LiPA HLA için LiRAS yazılımı LİPA sonuçlarının yorumlanmasını desteklemek için tasarlanmıştır. En son güncellenen versiyonu öğrenmek için lütfen yerel distribütörünüz ile bağlantıya geçin. Prosedür sınırlamaları - Bu ürünün kullanımı hibridizasyon teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. - Sadece iyi laboratuvar uygulamaları ve belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik hibridizasyon ve hedef DNA'nın doğru tiplenmesini sağlar.

13 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 13/15 - INNO-LiPA HLA-A Update stripleri allel grup seviyesinde çözünürlük vermek üzere tasarlanmıştır (A*01 - A*80). Yine de, belirli allel grupları kombinasyonu benzersiz olmayan prob kombinasyonlarına yol açabilmektedir ve bu yüzden iki ya da daha fazla olası allelik grup kombinasyonlarının belirsiz bir cevaba sebep verir. - Yeni alleller prob bölgeleri dışında polimorfizmlere sahip olabilir, sonuçları yorumlarken bu dikkate alınmalıdır. - HLA-A Update kontrol çizgileri sadece HLA-A için spesifik değildir, aynı zamanda hemen hemen tüm HLA-B ve HLA-C allelleri içinde spesifiktir. Bu nedenle HLA-A Kontrol çizgileri HLA-B ve HLA-C amplifiye ürünleri ile de reaksiyona girebilir. Test performans INNO-LiPAHLA-AMultiplex testinin performansı 4 Avrupa doku tipleme bankasının rutin tipleme örnekleri ile değerlendirilmiştir. Toplamda 346 örnek analiz edilmiştir. DNA, taze veya dondurulmuş EDTA antikoagülanlı veya sitrat lı kandan ekstrakte edilmiştir. DNA ekstraksiyon yöntemleri salting out, QIAamp 96 DNA blood kit (Qiagen),Genomic DNA Purification kit (Promega) vepuregene (Gentra Systems) dahilinde. Taze veya dondurulmuş GeneAmp PCR System PE-9600 veya PE-9700 thermal cycler kullanılarak amplifiye edilmiştir. Amplikonlar striplere eklenmeden önce 2-8 C veya -25/-15 C de saklanmıştır. Tekrar testine bir örnek için ihtiyaç duyulmasına rağmen amplifikasyon başarısızlıklarına rastlanmamıştır. Örnekler Auto-LiPA cihaz kullanılarak işlenmiş ve LiRAS yorumlama yazılımının klinik deneme sürümü ile yorumlanmıştır. Doğruluk 346 örnekten 345 i için HLA-A tipleme sonucu elde edilmiştir. Bir merkezde 18 örnek için tekrar testi gerekmiştir. Bir örnek 'no typing deducible' ile sonlanmıştır fakat araştırmacıya göre bu DNA kontaminasyonu sebebiyledir. Allel grubu düzeyinde doğruluk alternatif DNA testleri ile gözlenen uyum yüzdesi olarak hesaplanmıştır (Biotest ELPHA HLA-AB LowRes Typing kit, Dynal SSP, LiPA HLA-A, sequencing, Micro SSP, OLERUP SSP, Biotest HLA-A SSP). İki sonuç aynı ise, INNO-LiPA HLA-A Update sonuçları referans sonucundan daha spesifik ise veya INNO-LiPA HLA-A Update sonuçları daha düşük çözünürlük ancak referans yöntemleri ile karşılaştırıldığında doğru sonuç göstermişse INNO-LiPA HLA-A Update sonuçları referans test sonucuyla uyumlu olarak kabul edildi. İç doğruluk %99.1(342/345) idi. Çelişki testi % 99.7 (344/345) bir doğruluk ile sonuçlandı. Çalışma sırasında bir örnekte oluşan yanlış tiplemenin gelecekte görülmemesi için gereken önlemler alındı. Çözünürlük (tipleme tablosu sürüm v1.0/ ) INNO-LiPA HLA-A Update HLA-A allellerini allellik grup seviyesinde aydınlatmak için tasarlanmıştır, örneğin: serolojik eşdeğeri düzeyinde. Allel grubu standart HLA isimlendirmesinde (örneğin HLA A * 32) yıldız işaretini takip eden ilk iki basamağın atamasıdır. Ayrıca, kit aşağıdaki sıfır allel tespit etmek için tasarlanmıştır: A*0232N (exon 3), A*0303N (exon 3), A*2409N (exon 4), A*2611N (exon 3) and A*6811N (exon 1). Düşük ifade seviyesine sahip A* L allelide tespit edilebilir (intron 2).

14 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 14/15 Allel grup seviyesindeki teorik çözünürlük ( 2 basamak) % 99.5 olarak hesaplanmıştır. Bu çalışma sırasında gözlenen allel grubu düzeyinde çözünürlük, tutarsızlık analizleri sonucunda, % 99.4 (343/345) idi. Başlangıçta, bir belirsizlik gözlenmiştir (A*02 x A*66 veya A*02 x A*26). Sonuçların tipleme tablosuna adaptasyonunda ikinci bir belirsizlik gözlenmiştir (A*3201 x A*3201 veya A*3201 x A*7403). Referans yöntemi ile gözlenen 5 belirsizlik (14 örnek) INNO-LiPA HLA-A Update testi kullanılarak tek bir belirgin tipleme sonucuna düşürüldü. Bu klinik değerlendirme boyunca iki sıfır allel gözlendi: A*0303N ve A*6811N. Numune reaktivitesi Klinik deneme boyunca bir veya daha fazla durumda on prob yalancı pozitif ve altı prob zayıf yalancı negatif sonuç vermiştir. Bu bilgi, henüz mevcut değil ise, gelecek tiplemelere yardımcı olmak için yazılıma ve/veya rehbere eklenmiştir. Biri hariç bütün yalancı reaktivitelerin, allel grup seviyesinde uyumlu tiplenmesi LiRAS yorumlama yazılımı kullanılarak başarılmıştır. Yalancı negatif reaksiyonunun sebep olduğu yanlış tipleme riski tipleme tablosuyla adapte edilerek ele alınmıştır. Probe reaktivitesi üzerine spesifik bilgi için rehbere başvurun. Prob ve primer özgüllüklerin tam bir listesi mevcuttur. Tüm problar liste içinde, aksi belirtilmedikçe, bir uyumsuzluk seviyesinde tamamlayıcı sekansı ile spesifik olarak melezleşmesi şekilde tasarlanmıştır. Duyarlılık 3 DNA örneğinin 0.01 μg/μl ile 2 μg/μl arasında değişen dilüe serisinin iç değerlendirmesi göstermiştir ki, bütün örnekler agaroz jelde görünürdür ve doğru tiplenmiştir µg/µl - 2 µg/µl, tüm örneklerin agaroz jelde görünür olduğunu ve doğru şekilde tiplendirildiğini gösterdi. Harici performans değerlendirmesi 20 ng/µl ve 1500 ng/µl arasında konsantrasyona ve 1.5 saflığa (A260nm/A280nm) sahip 346 DNA örneği içerdi. Bu DNA amplifikasyon öncesi 20 ng/μl ve 250 ng/μl arasında bir konsantrasyona dilüe edilmiştir. Tekrar testine bir örnek için ihtiyaç duyulmasına rağmen amplifikasyon başarısızlıklarına rastlanmamıştır. Kesinlik İç veri: Üç numune manuel yöntem kullanılarak, iki farklı kişiler tarafından, dört kez test edilmiştir veya iki farklı Auto-LİPA çihazlar ile bir kişi tarafından. 2 örnek 3 farklı lot ile 2 farklı çalışmada analiz edilmiştir. Sonuçların yorumlanması bütün örnekler için aynıdır. Prob reaktivitesi bütün durumlarda karşılaştırılabilirdir. Dış doğrulama: - Lotlar arası değişkenlik ürünün iki farklı grubuna sahip bir yeterlilik paneli analiz edilerek değerlendirildi.(bilinen reaktivite ve yorumlanma ile 5 numune). Her bir numune için kullanılan gruptan bağımsız olarak aynı tipleme sonucu elde edildi. - Laboratuarlar arası değişkenlik dört merkez tarafından test edilen aynı yeterlilik paneli kullanılarak değerlendirildi. Her merkez beş örnek için aynı tiplemeyi elde etti.

15 80332 INNO-LiPA HLA-A Update / v1 / ANAHTAR KODU:FRI47554 p 15/15 Ticari markalar - INNO-LiPA, dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de. - LiPA Benelux da tescili ticari markadır ve dünyanın geri kalanında bir ticari markadır (ABD dahil). - Auto-LiPA dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de. - LiRAS Avrupa da tescilli markadır ve dünyanın geri kalanında bir markadır (ABD dahil). - GeneAmp ve MicroAmp Applied Biosystems, LLC tescilli ticari markalarıdır. - QIAamp ve Puregene QIAGEN Group tescilli ticari markalarıdır.