INNO-LiPA HLA-C. Vurgulanan değişiklikleri not edin. Üretici:

Transkript

1 INNO-LiPA HLA-C KOD: FRI INNO-LiPA HLA-C v p 1/13 Türkçe Üretici: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belgium Tel BTW BE RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Europe N.V. Tel Fax customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel Fax germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel Fax france@fujirebio-europe.com Fujirebio Italia S.r.l. Tel Fax italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel Fax spain@fujirebio-europe.com Vurgulanan değişiklikleri not edin. EUROPE GR IS LT RO SK TR LI MT EE AVRUPA-dışı US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

2 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 2/13 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 4 Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 5 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 6 Örnekler... 7 Manipülasyon prosedürleri... 7 Strip kullanımı... 7 Manuel inkübasyon talimatları... 7 Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar... 8 Uyarılar ve önlemler... 8 Manual test prosedürü... 9 Numuneler... 9 Denatürasyon ve hibridizasyon... 9 Stringent wash Renk gelişimi Otomatik test prosedürü: Sonuçlar Okuma Onaylama Sonuçların yorumlanması Yorumlama yazılımı: LiRAS Prosedür sınırlamaları Test performansı Performans Prob reaktivitesi Çözünürlük (Kullanılan tiplendirme tablosu: K1073/v.1.0/ ) Tekrarlanabilirlik Uyuşum Lisanslar Ticari markalar Kullanılan Semboller Üretici In vitro diagnostik medikal ürün Parti kodu Katalog numarası Tarafından kullanım Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması <n> testleri için yeterli içerik Conjugate 100x

3 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 3/13 Conjugate diluent Denaturation solution (Denatürasyon Solüsyonu) Hybridization solution (Hibridizasyon Solüsyonu) Rinse solution 5x (Rinse Solüsyonu) Stringent wash solution Stripler Substrate BCIP/NBT 100x Substrate buffer (Substrat tamponu) Tehlike Uyarı Line Probe Assay Kullanım amacı INNO-LiPA HLA-C, insan lökosit antijeni (HLA) C alellerinin allel grup düzeyinde moleküler tiplendirmesi için tasarlanmış, sadece in vitro kullanım amaçlı bir line probe assay'dir. Test prensibi INNO-LiPA HLA tiplendirme testileri, ters hibridizasyon esasına dayanmaktadır. Amplifiye biotinlenmiş DNA materyali kimyasal olarak denatüre edilir ve ayrılan iplikçikler, membran bazlı stripler üzerine paralel çizgiler halinde sabitlenmiş spesifik oligonükleotidler ile hibridize olur. Bu işlemi, uyuşmayan amplifiye materyalleri uzaklaştırmak için yapılan stringent wash adımı takip eder. Stringent wash'tan sonra, alkalin fosfataz ile konjüge edilmiş streptavidin eklenir ve daha önceden oluşan herhangi bir biyotinilize hibrid'e bağlanır. Kromojen içeren substrat çözeltisi ile inkübasyon mor/kahverenkli bir çökelti ile sonuçlanır. Reaksiyon yıkama adımı ile durdurulur ve probların reaktivite şablonu kaydedilir. INNO-LiPA HLA-C kiti ile biyotinlenmiş amplifiye materyalin standardize edilmiş preparasyonu için bir amplifikasyon kiti (INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyonu) bulunmaktadır. Bu amplifikasyon kiti, polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) esasına dayanmaktadır. Amplifikasyon ürünleri daha sonra, 28 sekans spesifik DNA prob çizgisi ve 2 kontrol çizgisi sabitlenmiş olan 1 tiplendirme stribi kullanılarak hibridize edilir (Şekil 1, Bkz. "Sonuçlar"). INNO-LiPA HLA-C: ilgili adımlar Adım 1 Adım 2 Adım 3 Adım 4 1 HLA-C lokusunun 2 ve 3. exonlarının amplifikasyonu. Bir INNO-LiPA HLA-C stribindeki sabit z 28 probla hibridizasyon ve stringent wash Renk gelişimi. Prob reaktivite şablonunun yorumlanması. INNO-LiPA HLA-C allel grup seviyesinde (standart HLA terminolojisi izlendiğinde allel ismindeki, yıldızdan sonraki ilk iki hane ile belirtilir) ters hibridizasyon testi formatını kullanarak mümkün olan en iyi çözünürlüğü vermek üzere tasarlanmıştır. Allellik

4 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 4/13 seviyenin çözünürlüğü (allel ismindeki yıldızdan sonra ilk 4 basamak ile belirlenir) bazı allel kombinasyonları için mümkün olabilir. Reaktifler Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları. - Açılmamış ve orijinal şişelerinde 2-8 C de saklanmış, reaktifler kitin son kullanım tarihine kadar stabildir. Reaktifleri dondurmayın. Reaktifleri, son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. - Kit herhangi bir kontamine DNA kaynağından özellikle de amplifiye ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - Tüm reaktifler kullanımdan yaklaşık 60 dakika önce oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmeli ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına konulmalıdır. - Kit bileşenlerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler kararsızlık veya bozulma belirtisi olabilir. - Striplerin kullanımdan önce kıvrılma ihtimalini en aza indirmek için, tüpün yatay olarak saklanması önerilir. Sağlanan Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Stripler 1x Turuncu işaret çizgili 20 INNO-LiPA HLA-C stribi içerir. Denaturation solution (Denatürasyon Solüsyonu) 1x 1 ml EDTA içeren alkali solüsyon Bu şişe kullanımdan hemen sonra kapatılmalıdır; Bu solüsyonun havaya uzun süre maruz kalması, denatüre etme kuvvetinin hızlı bir şekilde bozulmasına neden olur. Hybridization solution (Hibridizasyon Solüsyonu) 1x 80 ml Stringent wash solution 1x 200 ml % 0.5 SDS içeren, en az 37 C'ye en fazla 56 C'yi aşmayacak şekilde önceden ısıtılacak olan SSPE tamponu (tüm kristaller kullanılmadan önce çözünmelidir) % 0.1 SDS içeren, en az 37 C'ye en fazla 56 C'yi aşmayacak şekilde önceden ısıtılacak olan SSPE tamponu (tüm kristaller kullanılmadan önce çözünmelidir). Conjugate 100x 1x 0,8 ml Protein stabilizatörleri ve koruyucular içeren bir tamponda alkalin fosfataz etiketli streptavidin, kullanılmadan önce konjugat dilüent ile 1/100 oranında dilüe edilir. Her test oluğu için 2 ml Konjugat çalışma solüsyonu hazırlayın; manuel test için.+ 2 ml fazla (Konjugat çalışma solüsyonu, stringent wash esnasında hazırlanabillir) Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Konjugat çalışma solüsyonu karanlıkta ve oda sıcaklığında (20-25 C) saklandığında 24 saat stabildir. Conjugate diluent 1x 80 ml NaCl, Triton, protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren fosfat tamponu.

5 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 5/13 Bileşen Miktar Ref. Açıklama Substrate BCIP/NBT 100x 1x 0,8 ml Kullanımdan önce substrat buffer içinde 1/100 oranında dilüe edilecek olan 5-Bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate p-toluidine tuzu (BCIP) ve 4-nitroblue tetrazolium (NBT) dimethylformamide (DMF): her test oluğu için 2 ml substrat çalışma solüsyonu hazırlayın + manuel test için 2 ml fazladan. Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Substrat çalışma solüsyonu, karanlıkta ve oda sıcaklığında (20-25 C) saklandığında, 8 saat stabildir. Substrate buffer (Substrat tamponu) 1x 180 ml NaCl, MgCl 2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren Tris buffer. Rinse solution 5x (Rinse Solüsyonu) Incubation trays (İnkübasyon tepsileri) Reading card (Okuma kartı) 1x 80 ml Kullanımdan önce distile suda 1/5 dilüe edilecek olan NaCl, Triton ve koruyucu olarak 0.05% MIT/0.5% CAA içeren fosfat buffer: her test oluğu için 8 ml rinse çalışma solüsyonu hazırlayın + manuel test için 10 ml fazladan. Auto-LiPA için, test oluğu başına 12 ml rinse çalışma solüsyonu hazırlayın (+20 ml fazladan olmak üzere) Rinse çalışma solüsyonu 2-8 C de 2 hafta stabildir Pozitif probların tanımlanması için. Veri raporlama sayfası 2 - Kullanılan striplerin saklanması için. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyonu. - Çalkalayıcı platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapaklı; sıcaklığı 56 C ± 0.5 C ye ayarlanabilen). - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre. - Orbital, karşılıklı (çift taraflı) veya sallanan platform çalkalayıcı Öneriler Orbital çalkalayıcı için: Dairesel hareket çapı 13 mm 'ye eşit ya da daha üst olmalıdır 13 mm dairesel hareket için önerilen hız 160 rpm dir. Karşılıklı çalkalayıcı için: İleri geri hareket için önerilen hız dakikada 80 harekettir. Sallanan platform çalkalayıcı için: Sallama açısı, sıvının dökülmesini önlemek amacıyla,13 'yi geçmemelidir. Önerilen hız 50 rpm dir. - Vorteks mikser veya eşdeğeri. - Dereceli silindirler (10, 25, 50, ve 100 ml). - Distile veya deiyonize su. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Strip çalışması için forseps µl, µl, ve µl dağıtımı için ayarlanabilir pipetler. - Dağıtım için Multipipet (Eppendorf, isteğe bağlı).

6 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 6/13 - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). Güvenlik ve Çevre Koşulları Potansiyel olarak tehlikeli bileşenler hakkında bilgi için lütfen Güvenlik Bilgi Formuna (SDS) ve ürün etiketine bakın. En yeni SDS versiyonu te mevcuttur. Tehlike Uyarı Tehlike Sodyum hidroksit içerir H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 2-Kloroasetamid içerir H317 P280 P261 P362+P364 P333+P313 P302+P352 N,N-Dimethylformamide, 5,5'-diphenyl-3,3'-bis (4-nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride ve metanol içerir H312 H332 H319 H360D P261 P280 P201 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P308+P313 EUH208 EUH210 Tehlike İfadeleri EUH208 EUH210 H312+H332 H314 H317 H319 H360D Önlem ifadeleri P201 P260 P261 P280 2-methyl-2H-isothiazol-3-one içerir. Alerjik reaksiyona neden olabilir. Güvenlik bilgi formu istek üzerine temin edilebilir. Yutulduğunda ya da cilt temasında edildiğinde zararlıdır. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur. Allerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. Ciddi derecede göz tahrişine neden olur. Fetüse zarar verebilir. Kullanmadan önce özel talimatları elde edininiz. Duman/buhar/spreyi solumayın. Duman/buhar/spreyi solunmaktan kaçının. Koruyucu eldiven/koruyucu giysi/göz koruyucusu/yüz koruyucusu kullanın. P302+P352 CİLT İLE TEMAS HALİNDE: Bol su ile yıkayın/... P303+P361+P353 Cilt temasında(veya saç): Kontamine olan tüm giysileri derhal çıkarın. Cildi su / duş ile yıkayın. P305+P351+P338 GÖZ TEMASINDA: Birkaç dakika su ile dikkatlice yıkayın. Varsa ve kolayca çıkarılabiliyorsa, kontakt lensleri çıkarın. Yıkamaya devam edin. P308+P313 P310 Maruz kaldığınızda veya endişenlendiğinizde: Tıbbi yardım/destek alın. Hemen bir ZEHİR MERKEZİ/doktor/... a başvurun

7 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 7/13 P333+P313 P362+P364 P363 Ciltte tahriş veya kızarıklık oluşursa: Tıbbi yardım/destek alın. Kontamine giysileri çıkartın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. Tekrar kullanmadan önce kontamine olmuş giysileri yıkayın. - Bu test, sadece eğitilmli personel tarafından yapılmalıdır. - Örnekler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenlerinin ve biyolojik materyallerin potansiyel olarak bulaşıcı olduğu düşünülmeli ve bu şekilde ele alınmalıdır. - Tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller, belirlenmiş emniyet prosedürlerine uygun olarak atılmalıdır. 121 C de minimum 15 dakika otoklavlanmalıdır. Tek kullanımlık malzemeleri yakınız. Sıvı atığı, son konsantrasyon ±% 1 sodyum hipokloritl olacak şekilde, sodyum hipoklorit ile karıştırın. Atmadan önce bir gece bekletin. DİKKAT: Sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atığı nötralize edin. - Kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar ile çalışılırken, eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık imha etme esaslarına göre işleme tabii tutulmalıdır. Ayrıca tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnekler INNO-LiPA HLA-C testinde, biyotinlenilize amplifiye DNA materyali kullanıldığı için, örnekten ilgili DNA'nın amplifikasyonu için INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon amplifikasyon kiti de mevcuttur: asit-sitrat-dekstroz (ACD) - veya etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) - antikoagüle edilmiş tam kan örnekleri. Manipülasyon prosedürleri Strip kullanımı - Stripler sadece bir kez kullanılmak üzere tasarlanmıştır! - Striplere çıplak elle dokunmayın, temiz forseps kullanın. - Test striplerini tanımlamak için kurşun kalem kullanın. Tükenmez kalem vs kullanmayın. ID yi striplerin üzerindeki işaret çizgisinin üstüne yazın. - Test striplerini oluklara, kaplı membrabları yukarı bakacak şekilde yerleştirin (bu taraf işaretlenmiştir). - Farklı inkübasyon adımları esnasında, test stripleri daima aynı olukta kalmalıdır. - Kullanılmamış veya geliştirilen stripler yoğun ışık ve ısıdan uzak tutulmalıdır. - Yorumlama, kaplama ve saklamadan önce, striplerin tamamen kurumasını bekleyin. - Renklenmiş kuru stripler tercihen oda ısısında ( C) ve karanlıkta saklanmalıdır. - Olukları tekrar kullanmayın. Manuel inkübasyon talimatları - Hibridizasyon ve stringent wash esnasında inkübasyonun 56 C ± 0.5 C'de tutulması, yanlış pozitif (çok düşük sıcaklık) veya yanlış negatif / çok zayıf sinyallerin ( çok yüksek sıcaklık) önlenmesi adına en kritik adımlardır. Eğimli kapaklı bir çalkalamalı su banyosu, sıcaklık değişimlerinin iyi kontrol edilmesini sağlar.. Sıcaklığın iyi bir şekilde kontrol edilmesi için, kalibre edilmiş termometre kullanılmalıdır.

8 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 8/13 - Yanlış pozitif sinyallerden kaçınmak için inkübasyon sırasında daima su banyosunun kapağını kapalı tutun. - Hibridizasyon ve stringent wash için sıcak hava karıştırıcısı kullanmayın! - Hibridizasyon ve stringent wash için oluklar, su banyosunun sallanan platformuna yerleştirilmelidir. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Olukların suyun üstünde kalmadığından emin olun. Su oluklar ile doğrudan temas halinde olmalıdır. - Renk gelişimi için inkübasyon adımları C arasında yapılmalııdır. Sıcaklık 20 C'nin altındaysa, zayıf sonuçlar elde edilebilir. Sıcaklık 25 C'nin üstünde ise, yüksek arka plan ve / veya yanlış pozitif sinyalleri alınabilir. - Hem sallanan (hibridizasyon prosedürü) hem de çalkalayıcısu banyosu (renk geliştirme prosedürü) tarafından oluşturulan hareket genliği, maksimum hassasiyet ve homojen boyama sağlamak için kritik önem taşır. Strip yüzeyi tamamen suya batmış olmalıdır. Genlik mümkün olduğu kadar yüksek olmalıdır. Bununla birlikte, olukların kenarlarından sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! Bu çapraz kontaminasyon ave geçersiz sonuçlara yol açabilir. - Stiplerin inkübasyonu sırasında çalkalama işlemi, hem sıvı hem de test striplerinin, oluk kenarından sıvı dökülmeden, olukta ileri geri hareket edecek şekilde gerçekleştirilmelidir. - Tepsiyi kapatmayın. Hibridizasyon ve stringent wash inkubasyonları esnasında, oluklar su banyosunda açıkta kalabilir. Mikroplak kapağı ile olukların kapatılması, çapraz kontaminasyona neden olabilir. Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar - Sıvı oluktan, tercihen vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile aspire edilir. Tepsi, tüm sıvının oluğun bir ucuna akmasına izin verecek bir açıyla tutulur. - Her oluğa uygun solüsyondan 2 ml ekleyin ve protokolu izleyin. Dağıtma işlemi için bir multipipet (Eppendorf) kullanılması yararlı olacaktır. - Bu adımı, test prosedüründe belirtildiği kadar tekrar edin. NOT: İki adım arasında striplerin kurumasına izin vermeyin. Aspirasyon yaparken striplerin yüzeylerinin zarar görmediğinden emin olun. Sıvıyı, stripin üst kısmından işaret çizgisine kadar aspire edin. Stribin tamamının solüsyonun içine tamamen daldırarak, tamamen yıkanmış olduğundan emin olun. Gerekirse çalkalayıcının hızını ayarlayın. Uyarılar ve önlemler - Sadece profesyonel kullanım içindir. - DNA kontaminasyonunu önlemek için, pre- ve post- amplifikasyon aşamaları arasında maksimum fiziksel ayrım yapılması önerilir: ayrı odalar, ayrı pipetler ve başka laboratuar malzemeleri, ayrı laboratuar giysileri ve eldivenler (ve stokları) iyi laboratuvar uygulaması için gereken minimum önlemlerdir. - Post amplifikasyon odasından pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüş yapmayın. - Otoklavlanmış tek kullanımlık laboratuar malzemesi kullanılması tavsiye edilir. - Tek kullanımlık laboratuar malzemelerini tekrar kullanmayın. - Her bir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın.

9 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 9/13 - Reaktifleri, son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. - Bileşenleri aynı lot numarasına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın. - Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçının. Manual test prosedürü NOT: Farklı inkübasyon adımları boyunca, test stripleri hep aynı oluk içinde kalmalıdır. İnkübasyon öncesinde kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin ve gerekliyse sıcaklığı tepsiyi su banyosuna yerleştirmeden önce ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Numuneler 1. HLA-C amplifiye ürün (otomatik test için 10 µl kullanın ve manuel test için 20 µl). Numunenin hazırlanması: INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon kullanım talimatlarına bakın. NOT: Amplifiye numunenin belirtilen tam miktarının eklendiğinden emin olun. Gereğinden fazla veya az örnek yanlış tiplemeye sebep olabilir. 2. Amplifiye kontrol numunesi körü (negatif kontrol;otomatik test için 10 µl kullanın ve manuel test için 20 µl). Denatürasyon ve hibridizasyon 1. Çalkalayıcılı su banyosunu 56 C ± 0.5 C ye ısıtın. Sıcaklığı kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Belirtilen sıcaklığı aşmayın. Hibridizasyon ve stringent wash solüsyonunu en az 37 C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın, sıcaklık 56 C'yi geçmemelidir. Solüsyonları kullanmadan önce karıştırın. Bütün kristaller çözünmüş olmalıdır. 2. Forseps kullanarak tüpten gerekli miktarda INNO-LiPA HLA-DRB dekoder stribi alın ( bir örnek başına bir strip). Kör (Blank) amplifiye kontrol numunesi için de bir strip ekleyin. Kurşun kalem ile strip üzerindeki turuncu işaret çizgisinin üstüne bir kimlik numarası yazın. 3. Gereken sayıda test oluğu alın ve tepsiye yerleştirin ( her strip için bir oluk). 4. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denaturation Solution pipetleyin. NOT: Kullandıktan sonra şişenin kapağını derhal kapatın. 5. Otomatik test için 10 µl ve manuel test için 20 µl numune ekleyin. Yukarı-aşağı pipetleyerek, dikatlice karıştırın. Her zaman steril pipet ucu kullanın. Denatürasyonun gerçekleşmesi için C de 5 dakika bekletin. 6. Önceden ısıtılmış Hibridizasyon Solüsyonunu çalkalayın ve her oluğa yavaşça 2 ml denatüre amplifiye ürün ekleyin. Yavaşça çalkalayarak karıştırın. Pipetleme sırasında komşu olukları kontamine etmemeye özen gösterin. 7. Stripleri derhal işaretli membran tarafı yukarıyaca bakacak şekilde oluklara yerleştirin. Stripler solüsyona tamamen batırılmış olmalıdır. NOT: Tek kullanımlık eldiven giyin ve forseps kullanın. 8. Tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin (80 rpm; Manuel inkübasyon için talimatlara bakın), kapağı kapatın ve 30 dakika inkübasyona bırakın. NOT: Suyun, banyosundan oluklara sıçramasını önleyin. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Tepsinin kaymasını engellemek için iki ağırlık arasında sabitleyin.

10 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 10/13 Stringent wash 1. Hibridizasyonun ardından tepsiyi su banyosundan çıkarın. 2. Tepsiyi düşük açıda tutun ve sıvıyı tercihen vakum aspiratöre bağlı bir pipetle oluktan aspire edin. Her oluk içine 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin ve tepsiyi C de (10-20 saniye) kısaca sallayarak yıkayın. Her oluktan solüsyonu aspire edin. Bu kısa yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın (ayrıca "Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar"a bakınız). 3. En son, solüsyonu aspire edin ve her stribi 2 ml önceden ısıtılmış stringent wash solüsyonu içinde 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcı su banyosunda 10 dk inkübe edin. Su banyosun kapağını kapatın. İnkübasyondan önce kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin, gerekli ise sıcaklığı ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. NOT: Stringent wash esnasında konjugat ve rinse konsantratını dilüe edin. Bkz. Reaktifler Renk gelişimi Sonraki tüm inkübasyonlar, çalkalayıcıda C de gerçekleştirilir. İnkübasyon sırasında, sıvı ve test stripleri, homojen bir boyama için oluk içinde ileri ve geri hareket ettirmelidir. 1. Her bir stribi 2 ml rinse solüsyonu kullanarak 1 dakika boyunca iki kez yıkayın (Bkz. "Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar"). 2. Her oluğa 2 ml konjugat çalışma solüsyonu (bkz. "Reaktifler") ilave edin ve çalkalayıdaki tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. NOT: Konjugat inkübasyonunun bitiminden yaklaşık 10 dakika önce BCIP/NBT Substrat Solüsyonunu dilüe edin. Bkz. Reaktifler 3. Her bir stribi, 2 ml rinse solüsyonu kullanarak 1 dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından 2 ml'lik substrat buffer ile bir kez daha yıkayın. 4. Her oluğa 2 ml dilüe substrat çalışma solüsyonu (bkz. "Reaktifler") ilave edin ve çalkalayıcı üstünde tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. 5. En az 3 dakika çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 2 ml distile su içinde iki kez stripleri yıkayarak renk gelişimini durdurun. 6. Forseps kullanarak, stripleri oluklardan çıkarın ve kurutma kağıdı üzerine koyun. Sonuçları okumadan önce stripleri tamamen kurutun. Renklenmiş ve kurumuş stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürü: Dökümanlar ve ilişkili protokoller Fujirebio Avrupa N.V. den edinilebilir (Bkz. Sonuçlar Okuma Şekil 1 INNO-LiPA HLA-C stribinde farklı oligonükleotit problarının pozisyonunu göstermektedir. Test prosedürünün sonunda net bir mor / kahverengi bant göründüğünde,bu bant/çizgi pozitif olarak kabul edilir.

11 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 11/13 Şekil 1: INNO-LiPA HLA-C stribinde markır çizgisi (turuncu çizgi), konjugat kontrol çizgisi, INNO-LiPA HLA-C kontrol çizgisi ve 28 sequence-specific DNA probunun konumu. Onaylama - Her test çalışmasına bir negatif kontrol dahil edin. Her yeni test prosedüründe olduğu gibi, test prosedürünü doğru bir şekilde yapıldığından emin olunana kadar, test prosedürüne ilave pozitif ve negatif kontroller dahil edilmesi önerilir. Uygun test koşullarının oluşturulduğunu doğrulamak için referans DNA'nın kullanılması önerilmektedir. - INNO-LiPA HLA-C stribindeki en üstteki çizgi, işaret çizgisidir (turuncu çizgi). Bu çizgi, stribin doğru oryantasyonda olmasını sağlar. - Sonraki çizgi tespit prosedürü sırasında Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonunun eklenip eklenmediğini kontrol eder. Bu çizgi, plastik okuma kartındaki konjugat kontrol çizgisi ile hizalanmalıdır. Bu çizgi daima pozitif ve aynı test çalışmasında her strip yaklaşık aynı yoğunluğa sahip olmalıdır. - Sonraki çizgi hibridizasyon için uygun miktarda HLA-C amplifiye materyalin eklenip eklenmediğini gösteren HLA-C pozitif kontrol çizgisidir (okuma kartında HLA-C kontrol). Bu çizgi aynı zamanda hibridizasyon koşullarının da kontrolüdür. Negatif kontrol haricinde bu çizgi daima pozitif olmalı, ancak yoğunluğu örnekler arasında değişiklik gösterebilir. - Her bir negatif kontrolün tahlil sonucu, konjugat kontrol çizgisi haricinde stripteki herhangi bir çizgi için belirgin bir sinyal vermemelidir. - Strip üzerindeki probların renk yoğunlukları, bir çizgiden diğerine farklılık gösterebilir. Sonuçların yorumlanması - Stripteki konjugat kontrol çizgisi, plastik okuma kartındaki konjugat kontrol çizgisi ile hizalanmalıdır. - Her bir stribi doğrulamak için öncelikle kontrol çizgilerinin pozitifliğini kontrol edin (ilk iki çizgi) (bkz. "Onaylama"). - INNO-LiPA HLA-C stribindeki pozitif olan tüm prob numaralarını belirleyin ve INNO- LiPA HLA-C tiplendirme tablosunu veya LiPA yorum yazılımının bir versiyonunu kullanarak HLA-C tipini bulun (bkz. "Yorumlama yazılımı; LiRAS" ). Yazılım sıklıkla kullanım amacından daha fazla sayıda sonuç verir; allel grubundaki yorumlamaların yanı sıra bütün muhtemel allel kombinasyonları. Bu kit allelleri, allelik seviyede spesifik olarak tiplendirmek üzere tasarlanmadığından, bu bilgiler ekstra sayılmalı ve karar aşamasında kullanılmamalıdır.

12 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 12/13 - Tiplendirme sonuçları sadece kitteki probların reaktivitesine dayanırmaktadır. Prob özelliklerinin bir listesi vardır. Yorumlama yazılımı: LiRAS INNO-LiPA HLA için LiRAS yazılımı LİPA sonuçlarının yorumlanmasına yardımcı olmak üzere tasarlanmıştır. En son güncellenen versiyonu edinmek için lütfen yerel distribütörünüz ile temasa geçin. Prosedür sınırlamaları - Bu ürün sadece amplifikasyon ve hibridizasyon teknikleri konusunda eğitim almış personel tarafından kullanılmalıdır. - Spesifik hibridizasyon ve hedef DNA'nın doğru tiplendirilmesi, iyi laboratuar uygulamaları ve belirtilen prosedürlerin dikkatli bir şekilde uygulanması ile sağlanır. - INNO-LiPA HLA-C stripleri allel grup seviyesinde çözünürlük vermek üzere tasarlanmıştır (Cw*01 ila Cw*18). En az 28 sekansa özgü prob kullanıldığından, allelik seviyesinde orta derecede bir çözünürlük elde edilebilir. Bununla birlikte, iki allelin bir kombinasyonu benzersiz olmayan bir prob kombinasyonuna ve dolayısıyla iki veya daha fazla olası allelik kombinasyonun şüpheli bir cevabına neden olabilir. - Yeni alleller, tiplendirme sonucunu etkileyebilecek polimorfizmlere sahip olabilir. Sonuçların yorumlanmasında bu dikkate alınmalıdır. - Tüm alleller için, primer bağlanma bölgesindeki sekans bilinmemektedir. Primer bölgedeki uyumsuzluk riskinin, primer başarısızlık görülmediği için çok düşük olduğu kabul edilmektedir, tüm grupları kapsayan önemli sayıda allel test edilmiştir. Buna rağmen, homozigot sonuçlarda allelik drop-out durumu göz önüne alınmalıdır. - HLA-C kontrol çizgisinin kodon 54 ve 55'deki özgüllüğü - GAC AC - dir. Bu sekans ayrıca bazı HLA-A ve HLA-B için de spesifiktir. Bu sebeple HLA-C kontrol çizgisi HLA-C amplifiye ürünü ve bazı HLA-A ve HLA-B amplifiye ürünleriyle reaksiyona girer. Test performansı INNO-LiPA HLA-C rutin tiplendirme örnekleri kullanılarak, yedi Avrupa doku tiplendirme labaratuvarında değerlendirilmiştir. Performans Çalışma boyunca LiPA HLA-C ile toplam 269 örnek test edilmiştir. Çalışma boyunca bütün örnekler tatmin edici amplifiye ürün vermişlerdir. Örnekler Auto-LiPA cihazı kullanılarak içalışılmıştır. Sonuçlar, bilinen DNA tabanlı tiplendirme teknikleriyle (PCR SSP ve PCR SSOP) karşılaştırıldı. Prob reaktivitesi Çalışma boyunca, toplamda iki yanlış negatif ve dört yanlış pozitif reaksiyon raporlanmıştır. Bunların tümü tanımlanmıştır ve LiPA-Expert raporlama yazılımı kullanıldığında uyumlu tipleme elde edilmiştir. Probe reaktivitesi üzerine spesifik bilgi için rehbere başvurun. Prob ve primer özelliklerini tam bir listesi mevcuttur. Tüm problar, aksi belirtilmediği sürece, bir uyumsuzluk seviyesinde spesifik olarak tamamlayıcı sekansları ile hibridleşecek şekilde tasarlanmıştır. Çözünürlük (Kullanılan tiplendirme tablosu: K1073/v.1.0/ )

13 80342 INNO-LiPA HLA-C / v5 / KOD:FRI53859 p 13/13 INNO-LiPA HLA-C, HLA-C lokus allellerini allel grubuna indirgemek üzere tasarlanmıştır. Bu çalışma sırasında gözlenen allel grup düzeyindeki çözünürlük% 95.5 (257/269) idi. 12 şüpheli sonuç aşağıdaki gibidir: Cw*0707/0709 x Cw*0802/0804 veya Cw*0701/0706 x Cw*0501/0502 olarak dokuz, Cw*0707/0709 x Cw*16041 or Cw*0701/0706 x Cw*1205 olarak bir, 1 tanesi Cw*1601 x Cw*1801 veya Cw*0708 x Cw*1205 ve 1 tanesi Cw*12041/12042 x Cw*0802/0804 veya Cw*1203/1206 x Cw*0501/0502. Tekrarlanabilirlik Çalışma boyunca klinik örneklerden türetilen DNA kullanılarak yapılan LiPA HLA-C'nin iki partisi arasında tekrarlanan tiplendirme, tek istisna olmak üzere tekrarlanabilir tiplendirme ile sonuçlanmıştır. Numune tekrar test edildiğinde, her iki grupta da benzer ve doğru tiplendirme sonuçları vermiştir. Uyuşum Toplamda 269 numune, HLA-C için alternatif bir DNA testi kullanılarak tiplendirilmiş ve LiPA HLA-C ile% 100 (269/269) korelasyon göstermiştir. Lisanslar Bu ürünün satın alınması, alıcının insan in vitro teşhislerinde, teşhisin gerçekleştirilmesi için kullanıma olanak sağlar. Satın alma yoluyla kullanıma ilişkin bu özel kullanım hakkı dışındaki herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir lisans verilmemektedir. Ticari markalar INNO-LiPA, LiRAS ve Auto-LiPA USA ve diğer ülkelerde tescilli olan, Fujirebio Europe N.V. ticari markalarıdır.