INNO-LiPA HLA-C. KEY-CODE: FRI INNO-LiPA HLA-C v p 1/8 Türkçe

Transkript

1 INNO-LiPA HLA-C KEY-CODE: FRI INNO-LiPA HLA-C v p 1/8 Türkçe Üretici: Fujirebio Avrupa N.V. Technologiepark Gent Belçika BTW BE RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Almanya GmbH Hans-Böckler-Allee Hannover Almanya Fujirebio İtalya S.r.l. Via Vaccareccia 39/A Pomezia (Roma) İtalya Fujirebio Avrupa N.V. Technologiepark Gent Belçika Fujirebio Fransa SARL Les Conquérants, Bât. Le Kilimandjaro 8/10, avenue des Tropiques Les Ulis Fransa Fujirebio Iberia S.L. Calle Tarragona 161, Planta Barselona İspanya Diğer dillere bakın / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: AVRUPA GR IS LT RO SK TR LI MT non-avrupa US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Avrupa N.V.

2 80342 INNO-LiPA HLA-C / v0 / KEY-CODE: FRI21163 p 2/8 İÇERİK TABLOSU Kullanılan semboller... 2 Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 3 Tanım, kullanım için hazırlama ve önerilen saklama koşulları... 3 Gerekli ama sağlanmayan materyaller... 4 Güvenlik ve çevre... 4 Numuneler... 5 Manipülasyon prosedürleri... 5 Strip kullanma... 5 Manuel inkübasyon için talimatlar... 5 Oluklarda manuel sıvı değişimi için talimatlar... 5 Açıklamalar ve önlemler... 6 Manuel test prosedürü... 6 Örnekler... 6 Denatürasyon ve hibridizasyon... 6 Sıkı yıkama... 6 Renk gelişimi... 7 Otomatik test prosedürü: Auto-LiPA... 7 Sonuçlar... 7 Okuma... 7 Validasyon... 7 Sonuçların yorumlanması... 8 Yorumlama yazılımı: LiRAS... 8 Prosedür sınırlamaları... 8 Test performansı... 8 Performans... 8 Prob reaktivitesi... 8 Çözünürlük (Kullanılan tiplendirme tablosu: K1073/v.1.0/ )... 8 Tekrarlanabilirlik... 8 Uyum... 8 Ticari markalar... 8 Kullanılan semboller Üretici In Vitro Diagnostik Medikal Cihaz Grup kodu Katalog numarası Tarafından kullanılır Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması <n> test için yeterli Konjugat 100x Konjugat Seyreltici Denatürasyon Solüsyonu Hibridizasyon Solüsyonu Durulama Solüsyonu 5x

3 80342 INNO-LiPA HLA-C / v0 / KEY-CODE: FRI21163 p 3/8 Sıkı Yıkama Solüsyonu Stripler Substrat BCIP/NBT 100x Substrat Buffer Kullanım amacı INNO-LiPA HLA-C, in vitro kullanım için, insan lökosit antijeni (HLA) C allelinin, allel grup seviyesinde moleküler tiplemesi için tasarlanmış çizgi prob testidir. Test prensibi INNO-LiPA HLA tipleme testi, ters hibridizasyon temeline dayanmaktadır. Amplifiye biotinlenmiş DNA materyali kimyasal olarak denatüre edilir ve ayrılan iplikler, membran temelli stripler üzerine paralel şekilde sabitlenmiş spesifik oligonükleotidler ile hibridize olur. Bu işlemi, yanlış eşleşmiş amplifiye materyalleri uzaklaştırmak için yapılan sıkı yıkama basamağı izler. Sıkı yıkamadan sonra alkalin fostatazlı streptavidin konjugat eklenir ve önceden şekillenmiş herhangi bir biotinlenmiş hibrite bağlanır. Kromojen içeren substrat çözeltisi ile inkübasyon mor/kahve rengi çökelti ile sonuçlanır. Reaksiyon yıkama basamağı ile durdurulur ve probların reaktivite örüntüsü kaydedilir. INNO-LiPA HLA-C kiti ile biyotinlenmiş amplifiye materyalin standardize edilmiş hazırlığı için bir amplifikasyon kiti (INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyonu) bulunmaktadır. Amplifikasyon kiti polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanmaktadır. Amplifikasyon ürünleri sonradan 28 sekans-spesifik probe çizgisi ve 2 kontrol çizgisi bulunan 1 tipleme stripi kullanılarak hibridize edilir (şekil1, Sonuçlar a bakın). INNO-LiPA HLA-C: ilgili basamaklar basamak 1 HLA-C lokusunun 2 ve 3. ekzonlarının amplifikasyonu. basamak 2 INNO-LiPA HLA-C strip üzerindeki 28 probun hibridizasyonu ve sıkı yıkanması. basamak 3 Renk geliştirilmesi. basamak 4 Prob reaktivite modelinin yorumlanması INNO-LiPA HLA-C allel grup seviyesinde (standart HLA terminolojisi izlendiğinde allel ismindeki, yıldızdan sonraki ilk iki hane ille belirtilir) ters hibridizasyon testi formatını kullanarak olası en iyi çözünürlüğü vermek üzere tasarlanmıştır. Allellik seviyenin çözünürlüğü (allel ismindeki yıldızdan sonra ilk 4 basamak ile belirlenir) bazı allel kombinasyonları için mümkün olabilir. Reaktifler Tanım, kullanım için hazırlama ve önerilen saklama koşulları C de ve kendi şişelerinde tutulduğu sürece, açılmamış reaktifler kitin son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Reaktifleri dondurmayın. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. - Kit herhangi bir kontamine edici DNA kaynağından özellikle amplifiye ürünlerden ayrı saklanmalıdır. - Bütün reaktifler kullanılmadan yaklaşık 60 dakika önce oda sıcaklığına getirilmelidir ve kullanıldıktan sonra derhal buz dolabına kaldırılmalıdır. - Kit bileşenlerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler kararsızlık veya bozulma belirtisi olabilir. - Striplerin kullanımdan önce kıvrılmasını önlenmesi için tüpün yatay olarak saklanması önerilir. Verilen reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Tanım Stripler 1x Turuncu marker çizgili 20 INNO-LiPA HLA-C stribi içerir. Denatürasyon Solüsyonu 1x 1 ml EDTA içeren alkalin çözeltisi. Kullanıldıktan sonra şişe derhal kapatılmalıdır; çözeltinin havaya uzun süre maruz kalması denatürasyon gücünde hızlı bir gerilemeye sebep olur. Hibridizasyon Solüsyonu 1x 80 ml % SDS içeren SSPE buffer, en az 37 C ye ön ısıtma olacak, ve 56 C yi aşmamalıdır (kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır). Sıkı Yıkama Solüsyonu 1x 200 ml % SDS içeren SSPE buffer, en az 37 C ye ön ısıtma olacak ve 56 C yi aşmamalıdır (kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır). Konjugat 100x 1x 0.8 ml protein stabilizörleri ve koruyucular içeren buffer içinde alkali fosfataz ile etiketli streptavidin, kullanmadan önce konjugat dilüentinde 1/100 seyreltilecek. Her test oluğu için 2 ml Konjugat çalışma solüsyonu + 2 ml fazladan (Konjugat çalışma solüsyonu sıkı yıkama Esnasında hazırlanabilir) manuel test için. Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Konjugat çalışma solüsyonu karanlıkta saklanadığında oda sıcaklığında (20-25 C) 24 saat stabildir Konjugat Seyreltici 1x 80 ml NaCl, Triton, protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/ <0.1% CAA içeren fosfat buffer Substrat BCIP/NBT 100x 1x 0.8 ml Dimetilformamit (DMF) içinde 5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat p-toluidin tuzu (BCIP) ve nitroblue tetrazolium (NBT), kullanımdan önce Substrat Tamponu içinde 1/100 seyreltilir. Manuel testte her test küveti için 2 ml Substrat Çalışma Çözeltisi hazırlanır + 2 ml fazladan. Auto-LİPA için fazladan 10 ml hazırlanır. Substrat karanlıkta saklanadığında oda sıcaklığında (20-25 C) 24 saat stabildir Substrat Buffer 1x 180 ml NaCl, MgCl 2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren Tris buffer.

4 80342 INNO-LiPA HLA-C / v0 / KEY-CODE: FRI21163 p 4 Bileşen Miktar Ref. Tanım Durulama Solüsyonu 5x 1x 80 ml NaCl, Triton ve koruyucu olarak 0.05% MIT/0.5% CAA içeren fosfat buffer, kullanımdan önce distile suda 1/5 seyreltilecek: manuel test için her test oluğu için 8 ml durulama çalışma solüsyonu 10 ml fazladan. Auto-LiPA için, her test oluğu için 12 ml Durulama Çalışma Solüsyonu + 20 ml fazladan. Durulama çalışma solüsyonu 2-8 C de 2 hafta stabildir. Inkübasyon tepsileri 3 - Okuma kartı 1 - pozitif probların belirlenmesi için Veri rapor kağıtları 2 - gelişmiş striplerin saklaması için Gerekli ama sağlanmayan materyaller - INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon. - Çalkalayıcı platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapaklı; sıcaklığı 56 C ± 0.5 C de ayarlanabilen). - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre. - Orbital, karşılıklı veya sallanan bir platform çalkalayıcı Öneriler Orbital çalkalayıcı için: Dairesel hareket çapı 13 mm'ye eşit ya da daha üstün olması gerekmektedir 13 mm dairesel hareket için tavsiye edilen hız 160 rpmdir. Karşılıklı çalkalayıcı için: İleri geri hareket için önerilen hız dakikada 80 harekettir. Sallanan bir platform çalkalayıcı için: Sallama açısı sıvı dökülmemesi için 13 'yi geçmemelidir Önerilen hız 50 rpmdir. - Vorteks karıştırıcı veya eşdeğeri. - Dereceli silindir (10, 25, 50, ve 100 ml). - Distile veya deiyonize su. - Tek kullanımlık eldivenler. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Strip işleme için Forseps µl, µl, ve µl dağıtmak için ayarlanabilir pipetler. - Dağıtım multipipet (Eppendorf, isteğe bağlı). - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). Güvenlik ve çevre Potansiyel tehlikeli bileşenler hakkında bilgi için lütfen Güvenlik Veri Kağıdına (SDS) ve ürün etiketlemesine bakın. En son SDS versiyonu website da mevcuttur. Tehlike DENAT SOL H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 Uyarı, 2-Chloroacetamid içerir: DURULAMA SOL 5x H317 P261 P280 P333+P313 P302+P352 P363 Tehlike, N,N-Dimethylformamide, 5,5 -diphenyl-3,3 -bis(4-nitrophenyl)-2,2 -(3,3 - dimethoxybiphenyl-4,4 -ylene)ditetrazolium dichlorid içerir: SUBS BCIP/NBT 100x H312 H319 H332 H360D P201 P261 P280 P281 P305+P351+P338 P308+P313 Tehlike ifadeleri H312 H314 H317 H319 H332 H360D Önlem ifadeleri P201 P260 P261 P280 P281 P303+P361+P353 Cilt ile temasta zararlıdır. Ağır cilt yanıklarına ve göz hasarına sebep olur. Alerjik cilt reaksiyonuna sebep olabilir. Ciddi göz tahrişine sebep olur. Solunduğunda zararlıdır. Doğmamış çocuğa zarar verebilir. Kullanımdan önce özel talimatları edinin. Duman/buhar/sprey solumayın. Duman/buhar/sprey solumaktan kaçının. Koruyucu eldivenler/koruyucu giysi/göz koruyucu/yüz koruyucu kullanın. Gerektiği gibi kişisel koruyucu ekipman kullanın. CİLTTE (veya saç): Tüm kontamine giysiyi hemen çıkarın/kaldırın. Su/duş ile cildi durulayın.

5 80342 INNO-LiPA HLA-C / v0 / KEY-CODE: FRI21163 p 5 P305+P351+P338 P308+P313 P310 P333+P313 P302+P352 P363 GÖZLERDE: Birkaç dakika su ile dikkatlice durulayın. Varsa ve kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Durulamaya devam edin. Maruz kaldı veya ilgiliyse: Tıbbi yardım/tavsiye alın. ZEHİR MERKEZİ veya doktor/hekime hemen başvurun. Cilt tahrişi veya kaşıntı oluşursa: Tıbbi yardım/tavsiye alın. CİLTTE: Bol sabun ve su ile yıkayın. Tekrar kullanımdan önce kontamine giysiyi yıkayın. - Numunelerin bulaşıcı olma olasılıkları vardır. Bü yüzden bütün kan bileşenleri ve biyolojik materyaller olası bulaşıcı sayılmalı ve ona göre işlem görmelidirler. Test sadece eğitimli personel tarafından çalışılmalıdır. Bütün kan bileşenleri ve biyolojik materyaller güvenlik prosedürüne uygun olarak atılmalıdır. 121 C de en az 15 dk otoklavlayın. Tek kullanımlık malzemeleri yakın. Sıvı atıkları nihai konsantrasyon ±% 1 sodyum hipoklorit olacak şekilde sodyum hipoklorit ile karıştırın. Atmadan önce bir gece bekletin. DİKKAT: Sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atıkları nötralize edin. - kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: tehlikeli veya bulaşıcı maddeleri işlerken eldiven ve koruyucu gözlük. - Atık kurumun atık kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevre düzenlemeleri de dikkate alınmalıdır. Numuneler INNO-LiPA HLA-C testi numune olarak biotinlenmiş amplifiye DNA materiyali kullandığından, bir amplifikasyon kiti, INNO- LiPA HLA-C Amplifikasyonu, beraberinde bir araç olarak mevcuttur. Manipülasyon prosedürleri Strip kullanma - Stripler tek kullanımlıktır! - Striplere çıplak elle dokunmayın, temiz forcep kullanın. - Test striplerinin tanımlaması için kurşun kalem kullanın. Tükenmez kalem vs kullanmayın. Striplerin üzerindeki marker çizgisine ID yazın. - Kaplı membran side-up ile oluklarda test striplerini yerleştirin (bu side işaretlenir). - Farklı inkübasyon aşaması boyunca, test stripleri hep aynı oluk içinde kalmalıdır. - Kullanılmayan veya gelişmiş stripler yoğun ışık ve ısı kaynaklarından uzak tutulmalıdır. - Geliştirilen striplerin yorumlamadan, kaplamadan ve saklamadan önce tamamen kurumasına izin verin. - Geliştirilen kuru stripler tercihen karanlıkta oda sıcaklığında saklanmalıdır (20-25 C). - Olukları tekrar kullanmayın. Manuel inkübasyon için talimatlar - Hibridizasyon ve sıkı yıkama basamakları esnasında 56 C ± 0.5 C'de inkübasyon, yalancı (sıcaklık çok düşük) pozitif veya yalancı negatif / çok zayıf sinyallerden (sıcaklık çok yüksek) kaçınmak için en kritik basamaktır. Eğimli kapaklı bir çalkalamalı su banyosu sıcaklık değişimleri üzerinde iyi bir kontrol sağlar. Kalibrasyonlu bir termometre ile sıkı bir sıcaklık kontrolü gereklidir. - Yalancı pozitif sinyalleri önlemek için inkübasyonlar sırasında su banyosunun kapağını her zaman kapalı tutun. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için, tüp kabı su banyosunda çalkalayıcı platformun üzerine konulmalıdır. Su seviyesini küvetlerin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Küvetin su üzerinde yüzdüğünden emin olun. Su küvet ile doğrudan temas halinde olmalıdır. - Renk gelişimi için inkübasyon basamakları 20 ila 25 C arasında olmalıdır. Sıcaklık 20 C altında ise, zayıf sonuçlar elde edilebilir. Sıcaklık 25 C'nin üzerinde olursa yüksek bir arka plan ve / veya yalancı pozitif sinyaller elde edilebilir. - Çalkalamalı su banyosu (hibridizasyon prosedürü) ve çalkalayıcı (renk geliştirme prosedürü) tarafından üretilen hareket genliği maksimum hassasiyet ve homojen boyama için kritiktir. Strip yüzeyi tamamen daldırılmış olmalıdır. Genlik mümkün olduğu kadar yüksek olmalıdır. Bununla birlikte, çukurların kenarları boyunca sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! Bu çapraz kontaminasyon ve geçersiz sonuca yol açabilir. - Striplerin inkübasyonu sırasında çalkalanması, sıvı çukurların kenarlarından dökülmeden, hem test striplerinin hem sıvının küvet içinde ileri ve geri hareket etmesi şekilde yapılmalıdır. - Tepsileri örtmeyin. Hibridizasyon ve sıkı yıkama inkübasyonları sırasında, oluklar su banyosu içinde sarılmadan bırakılabilir. Mikroplate kapağı ile küvetlerin kaplanması çapraz kontaminasyona neden olabilir. Oluklarda manuel sıvı değişimi için talimatlar - Sıvı tercihen bir vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile oluktan aspire edilir. Tepsi tüm sıvının oluğun bir ucuna akmasına izin veren bir açıya getirilir. - Her oluğa uygun çözeltiden 2 ml ekleyin ve protokolü izleyin. Dağıtım Multipipet (Eppendorf) bu amaç için yararlıdır. - Bu basamakları test prosedüründe belirtildiği kadar tekrarlayın.

6 80342 INNO-LiPA HLA-C / v0 / KEY-CODE: FRI21163 p 6 NOT: Striplerin iki basamak arasında kurumasına izin vermeyin. Aspire ederken striplerin yüzeyine zarar vermemeye dikkat edin. Markır çizgisinin üstünde stribin en üstündeki sıvıyı aspire edin. Bütün stribin solüsyon içine tamamen batarak yıkandığından emin olun. Gerektiğinde çalkalayıcının hızını uyarlayın. Açıklamalar ve önlemler - Sadece profesyonel kullanım içindir. - DNA kontaminasyonundan kaçınmak için pre ve post amplifikasyon basamakları arasında maksimum fiziksel ayırım b önerilmektedir; ayrı odalar, ayrı pipetler ve diğer laboratuvar malzemeleri, ayrı laboratuvar önlükleri ve eldivenler (ve stokları) iyi laboratuvar uygulamaları için alınabilecek minumum tedbirlerdir. - Post amplifikasyon odasından pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüşten kaçının. - Otoklavlanmış tek kullanımlık laboratuar malzemesi kullanılması tavsiye edilir. - Tek kullanımlık laboratuar malzemelerini tekrar kullanmayın. - Her alikotlanmış numune için yeni bir steril pipet ucu kullanın. - Son kullanma tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın. - Reaktiflerin mikrobiyal kirlenmesinden kaçının. Manuel test prosedürü NOT: Farklı inkübasyon basamakları boyunca stripler hep aynı oluk içinde kalmalıdır. İnkübasyon öncesinde kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin ve gerekliyse sıcaklığı tepsiyi su banyosuna yerleştirmeden önce ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Örnekler 1. HLA-C amplifiye ürün (10 µl kullanın). Örnek hazırlığı için: INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyonu kullanım talimatlarına bakın. NOT Tam olarak 10 µl amplifiye örnek eklendiğinden emin olun. Gereğinden fazla veya az örnek yanlış Tipleme sonucuna sebep olabilir. 2. Blank amplifiye kontrol örneği (negatif kontrol;10 µl kullanın) Denatürasyon ve hibridizasyon 1. Çalkalayıcılı su banyosunu 56 C ± 0.5 C ye ısıtın. Sıcaklığı kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin ve eğer gerekirse ayarlayın. Belirtilen sıcaklığı aşmayın. Hibridizasyon Çözeltisi ve Sıkı Yıkama Çözeltisini en az 37 C ye ayarlanmış su banyosunda ön ısıtın ve 56 C yi geçmeyin. Kullanmadan önce karıştırın. Bütün kristaller çözünmüş olmalıdır. 2. Forsep kullanarak tüpten gerekli miktarda INNO-LiPA HLA-C Stribi alın (bir test örneği için bir strip). Blank amplifiye kontrol örneği için strip dahil edin. Stripte turuncu marker çizgisinin üzerinde kimlik numarası yazın. 3. Gerekli sayıda test oluğu alın ve tepsiye yerleştirin (test örneği başına bir oluk) ve tepsiye yerleştirin. 4. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denatürasyon Çözeltisi pipetleyin. NOT: Kullandıktan sonra şişeleri derhal kapatın µl örnek ekleyin ve pipet ile dikkatlice çekip bırakarak karıştırın. Her zaman steril pipet ucu kullanın C de 5 dakika denatürasyon sürecine izin verin. 6. Önceden ısıtılmış Hibridizasyon Çözeltisini çalkalayın ve her oluğa denatüre olmuş amplifiye ürüne 2 ml ekleyin, yavaşça çalkalayın. Pipetleme sırasında olukları kontamine etmemeye özen gösterin. 7. Membran up markır kenarı ile stribi hemen oluğa yerleştirin. Stripler çözeltiye tamamen batmalıdır. NOT: Tek kullanımlık eldiven giyin, forsep kullanın. 8. Tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin (80 rpm; Manuel inkübasyon için talimatlara bakın), kapağını kapatın 30 dakika inkübasyona bırakın. NOT: Su banyosundan oluklara su sıçramasından kaçının. Su seviyesini olukların üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Tepsinin kaymasını engellemek için iki ağırlık arasında sabitleyin. Sıkı yıkama 1. Hibridizasyonun ardından tepsiyi su banyosundan kaldırın. 2. Tepsiyi düşük bir açı ile tutun ve oluklardaki sıvıyı tercihen vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile aspire edin. Her oluğa 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin ve tepsiyi C de (10-20 saniye ) hafifçe sarsın. Her oluktan solüsyonu aspire edin. Bu kısa yıkama aşamasını bir kez tekrarlayın (oluklardaki manuel sıvı değişimi için talimatlar kısmına bakın). 3. En son, çözeltileri aspire edin ve her stribi 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi içinde çalkalayıcı su banyosunda 56 C ± 0.5 C de 10 dakika boyunca inkübe edin. Su banyosunun kapağını kapalı tutun. İnkübasyona başlamadan önce su banyosunun sıcaklığını kalibre edilmiş bir termometre kullanarak ölçün, gerekliyse sıcaklığı ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. NOT: Konsantre Durulama Çözeltisi ve Konjugatı sıkı yıkama sırasında dilüe edin. Reaktiflere bakın.

7 80342 INNO-LiPA HLA-C / v0 / KEY-CODE: FRI21163 p 7 Renk gelişimi Takip eden bütün inkübasyonlar C'de bir karıştırma cihazı üzerinde yürütülür.inkübasyonlar sırasında, homojen bir boyama için stripler ve sıvılar oluk içinde ileri geri hareket etmelidir. 1. Durulama çalışma çözeltisinden 2 ml kullanarak bütün stripleri her sefer 1 dakika boyunca olmak üzere iki kez yıkayın (Reaktifler ve Oluklarda sıvı değişimi için talimatlar ksımına bakın). 2. Her oluğa 2 ml konjügat çalışma çözeltisi ekleyin (Reaktiflere bakın) ve çalkalayıcı üstünde tepsiyi çalkalayarak 30 dk inkübe edin. NOT: Konjugat inkübasyonunun sonundan önce yaklaşık 10 dakika BCIP/NBT Substrat Solüsyonunu seyreltin. Reaktifler bakın. 3. Her stribi 2 ml durulama çalışma çözeltisi kullanarak her biri bir dakika olmak üzere 2 kere yıkayın ve 2 ml Substrat Buffer kullanarak bir kez daha yıkayın. 4 Her oluğa 2 ml seyreltilmiş substrat çalışma çözeltisi ekleyin (Reaktiflere bakın) ve çalkalayıcı üstünde tepsiyi çalkalayarak 30 dk inkübe edin. 5. En az 3 dk çalkalayıcı üstünde tepsiyi çalkayarak 2 ml distile su içinde stripleri iki kez yıkayarak renk gelişimini durdurun. 6. Forseps kullanarak, stripleri oluklardan çıkarın ve emici kağıt üzerine koyun. Sonuçları okumadan önce striplerin tamamen kurumasını bekleyin. Gelişmiş ve kuru stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürü: Auto-LiPA LİPA test prosedürü otomasyon için çok uygundur. Bu nedenle, Auto-LİPA hibridizasyon, sıkı yıkama ve renk gelişimi basamaklarını gerçekleştirmek için tasarlanmıştır. Auto-LİPA otomatik ısıtma ve soğutma ve otomatik aspirasyon ve pipetleme özellikleri ile öne geçmiş sistemdir. Auto-LİPA hakkında daha fazla bilgi ve spesifik protokoller için, lütfen yerel dispiritörünüzle temasa geçin. Sonuçlar Okuma INNO-LiPA HLA-C stribinin üzerindeki farklı oligonükleotit probların yerleşimini göstermektedir. Test prosedürünün sonunda mor/ kahverengi net bir bant görüldüğünde hat pozitif kabul edilir. Figure 1: INNO-LiPA HLA-C stribi üzerinde markır çizgisi (turuncu çizgi) konjugat kontrol çizgisi,inno-lipa HLA-C kontrol çizgisi, ve 28 sequence-spesifik DNA problarının yerleşimi. Validasyon - Her defasında test bir negatif kontrol dahil edilerek yapılır. Herhangi yeni test prosedürüyle, test prosedürünün doğru bir şekilde uygulanabileceğine dair yüksek derecede güven gelişene kadar pozitif ve negatif kontrolün varlığı dikkate alınmalıdır. Test koşullarının uygunluğunun gösterilmesi için referans DNA kullanılması önerilmektedir. - INNO-LiPA HLA-C stribi üzerinde en üstteki çizgi marker çizgisidir (turuncu renkli çizgi). Bu çizgi striplerin doğru yönlendirilmesine olanak sağlar. - Sonraki çizgi tespit prosedürü sırasında reaktif Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonunun eklenmesini kontrol eder. Bu çizgi plastik okuma kartındaki Konjugat Kontrol çizgisi ile yanyana gelmelidir. Bu çizgi her zaman pozitif olmalı ve yaklaşık olarak aynı test çalışmasında her bir strip üzerinde aynı yoğunluğa sahip olmalıdır. - Sonraki çizgi hibridizasyon için uygun miktarda HLA-C amplifiye materyalin eklenip eklenmediğini kontrol eden HLA-C pozitif kontrol çizgisidir (okuma kartında HLA-C kontrol). Bu çizgi hibridizasyon koşulları için de bir kontroldür. Bu çizgi, negatif kontrol hariç, her zaman pozitif olmalıdır ama yoğunluk örnekler arasında farklılık gösterebilir. - Hiç bir Negatif Kontrol tahlil sonucu konjugat kontrol çizgisi dışında, strip çizgilerinden herhangi biri için belirgin bir sinyal vermemelidir. - Bir stripte probların renklerindeki yoğunluk bir çizgiden diğerine değişiklik gösterebilir.

8 80342 INNO-LiPA HLA-C / v0 / KEY-CODE: FRI21163 p 8 Sonuçların yorumlanması - Stribin üzerindeki Konjugat Kontrol çizgisi ile plastik kartın üzerindeki Konjugat Kontrol çizgisi yanyana gelmelidir. - Her bir özgün stribin geçerlliğini göstermek için (Validasyona bakın) öncelikle kontrol çizgilerinin pozitifliğini kontrol edin (ilk iki çizgi). - INNO-LiPA HLA-C striplerindeki bütün pozitif prob numaralarını belirleyin INNO-LiPA HLA-C tipleme tablosunu kullanarak veya LİPA yorumlama yazılımına verileri girerek HLA-C tiplerini sonuçlandırın (Yorumlama yazılımı: LiRAS bakın). Bu yazılım kullanım amacında önerilenden daha fazla sonuç veriyorsa: tüm olası alel kombinasyonlarının yanısıra alel grupta yorumlama verilir. Bu kit allelleri, allelik seviyede spesifik olarak tiplemek üzerine tasarlanmadığından, bu bilgiler ekstra sayılmalı ve karar aşamasında kullanılmamalıdır. - Tipleme sonuçları, kitteki probların reaktivitesine dayanır. Prob özgüllükleri listesi mevcuttur. Yazılım yorumlama: LiRAS INNO-LiPA HLA için LiRAS yazılımı LİPA sonuçlarının yorumlanmasını desteklemek için tasarlanmıştır. En son yükseltilmiş sürümüne ulaşmak için lütfen yerel distribütörünüzle temasa geçiniz. Prosedür sınırlamaları - Bu ürünün kullanımı hibridizasyon ve amplifikasyon teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. - Sadece iyi laboratuvar uygulamaları ve belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik hibridizasyon ve hedef DNA'nın doğru tiplenmesini sağlar. - INNO-LiPA HLA-C stripleri allel grup seviyesi (Cw*01 - Cw*18) nde çözünürlük vermek üzere tasarlanmıştır. 28 dizi spesifik probdan az olmayan kullanım sebebiyle, allellik seviyede orta düzeyde bir çözünürlük elde edilebilir. Ne var ki, iki allelin kombinasyonu benzersiz olmayan prob kombinasyonuna yol açabilir ve bu iki veya daha fazla muhtemel allelik kombinasyonda belirsiz cevaba sebep verebilir. - Yeni aleller seçilen problar tarafından tespit edilen özgüllükler dışında mutasyonlara sebep olabilir, sonuçları yorumlarken bu dikkate alınmalıdır. - Yeni allel yeni prob kombinasyonlarına sebep verebilir ki bu da yorumlanamayan sonuçlara yol açabilir ve 55. kodonlarda HLA-C kontrol çizgisinin özgünlüğü - GAC AC dır. Bu dizi ayrıca bazı HLA-A ve HLA-B için de spesifiktir. Bu sebeple HLA-C kontrol çizgisi HLA-C amplifiye ürünün yanı sıra bazı HLA-A ve HLA-B amplifiye ürünleri ile de reaksiyon verir. Test performansı INNO-LiPA HLA-C rutin tipleme örneklerinde yedi Avrupa doku tipleme labaratuvarında değerlendirilmiştir. Performans Çalışma boyunca LiPA HLA-C ile toplam 269 örnek test edilmiştir. Çalışma boyunca bütün örnekler tatmin edici amplifiye ürün vermişlerdir. Örnekler Auto-LiPA cihazı kullanılarak işlenmiştir. Sonuçlar belirtilen DNA temelli tipleme teknikleri ile karşılaştırılmıştır (PCR SSP ve PCR SSOP). Prob reaktivitesi Çalışma boyunca toplamda iki yalancı negatif ve dört yalancı pozitif reaksiyon rapor edilmiştir. Bunların tümü LiPA- Expert raporlama yazılımı kullanıldığında tanımlanmış ve uyumlu bir tipleme elde edilmiştir. Probe reaktivitesi üzerine spesifik bilgi için kılavuza başvurun. A complete list of the probe and primer specificities is available. Prob ve primer özgüllükleri tam bir listesi mevcuttur. Tüm problar liste içinde aksi belirtilmedikçe, bir uyumsuzluk seviyesinde tamamlayıcı sekansları ile spesifik olarak melezleşmesi için tasarlanmıştır. Çözünürlük (Kullanılan tiplendirme tablosu: K1073/v.1.0/ ) INNO-LiPA HLA-C alel grup seviyesi için HLA-C lokus alellerinin çözünmesi için tasarlanır. Bu çalışma boyunca gözlenen allel grup seviyesinde çözünürlük %95.5 di (257/269). 12 belirsiz sonuç aşağıdaki gibidir: 9 tanesi Cw*0707/0709 x Cw*0802/0804 veya Cw*0701/0706 x Cw*0501/0502, 1 tanesi Cw*0707/0709 x Cw*16041 veya Cw*0701/0706 x Cw*1205, 1 tanesi Cw*1601 x Cw*1801 veya Cw*0708 x Cw*1205 ve 1 tanesi Cw*12041/12042 x Cw*0802/0804 veya Cw*1203/1206 x Cw*0501/0502. Tekrarlanabilirlik Çalışma esnasında klinik örneklerden elde edilen DNA kullanılarak LiPA HLA-C nin farklı grupları arasında tekrarlanan tiplemeler, bir istisna ile tekrarlanabilir tipleme sonuçları ile sonuçlandı. Örnek tekrar test edildiğinde, her iki grup benzer ve doğru tipleme sonuçları vermiştir. Uyum Toplam 269 örnek HLA-C için alternatif DNA testi kullanılarak ayrıca yazıldı ve LiPA HLA-C ile %100 uyum gösterdi (269/269). Ticari markalar - INNO-LiPA ABD de olduğu gibi dünya çapında bir markadır - LiPA Benelüks te tescilli markadır ve dünyanın geri kalanında markadır (ABD dahil). - LiRAS Avrupa da tescilli markadır ve dünyanın geri kalanında markadır (ABD dahil). - Auto-LiPA ABD de olduğu gibi dünya çapında bir markadır.