PEMFİGUSLU HASTALARIN SAĞLIKLI BİRİNCİ DERECE AKRABALARINDA PEMFİGUS OTOANTİKORLARININ SIKLIĞININ ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DERMATOLOJİ ANABİLİM DALI PEMFİGUSLU HASTALARIN SAĞLIKLI BİRİNCİ DERECE AKRABALARINDA PEMFİGUS OTOANTİKORLARININ SIKLIĞININ ARAŞTIRILMASI Dr. Suhan GÜNAŞTI UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Doç. Dr. Soner UZUN ADANA

2 TEŞEKKÜR Beni yetiştiren, her türlü imkanı sağlayan ve her an destek olan sayın hocalarım Prof. Dr. Hamdi R. MEMİŞOĞLU, Prof. Dr. M. Alpaslan ACAR, Prof. Dr. Varol L. AKSUNGUR, Prof. Dr. Metin ÖZPOYRAZ, Prof. Dr. Y. Gül DENLİ, Doç. Dr. Mehmet KARAKAŞ, Yrd. Doç. Dr. Aydın YÜCEL e, Tez çalışma süresi boyunca yakın desteğini, bilgilerini ve tecrübelerini esirgemeyen ve bana bilimsel çalışma zevkini aşılayan tez hocam sayın Doç. Dr. Soner UZUN a, Verilerin istatistiksel analizlerindeki katkılarından dolayı Biyoistatistik Anabilim Dalı Öğretim Üyesi sayın Prof. Dr. Refik BURGUT a ve araştırma görevlisi sayın Yaşar SERTDEMİR e, Çalışmam boyunca gösterdiği değerli çaba ve emek için laboratuar görevlimiz sayın Gökçen GÖKÇE ye, Tezimin yazımında yardımlarını esirgemeyen Anabilim Dalı sekreterimiz sayın Birsen ÇETGİN e, bana destek olan araştırma görevlisi arkadaşlarıma ve tüm Anabilim Dalı çalışanlarına teşekkürlerimi sunarım. Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu nun desteği ile gerçekleştirilmiştir. Proje No: TF2004LTP7 i

3 İÇİNDEKİLER Sayfa No TEŞEKKÜR i İÇİNDEKİLER ii TABLO LİSTESİ iii ŞEKİL LİSTESİ iv KISALTMA LİSTESİ v ÖZET - ANAHTAR SÖZCÜKLER vi ABSTRACT - KEYWORDS vii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER Sınıflandırma Epidemiyoloji Patogenez Klinik bulgular Pemfigus vulgaris Pemfigus foliaseus Paraneoplastik pemfigus IgA pemfigusu İlaca bağlı pemfigus Histopatoloji İmmünofloresan yöntemler Pemfigusta direkt immünofloresan tetkiki Pemfigusta indirekt immünofloresan tetkiki Pemfigusta ELİSA Tedavi Genel tedavi prensipleri Pemfigusta yardımcı ve destekleyici tedaviler Prognoz GEREÇ VE YÖNTEM BULGULAR TARTIŞMA SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ 47 ii

4 TABLO LİSTESİ Tablo no Sayfa no Tablo 1 Pemfigusun sınıflandırılması 2 Tablo 2 Desmozomal proteinler 4 Tablo 3 Pemfigus antijenleri 8 Tablo 4 Pemfigus tedavisi 17 Tablo 5 Hasta akrabalarının sıçan ve maymun özefagusu 23 substratları kullanılarak yapılan indirekt immünofloresan test sonuçları Tablo 6 Kontrol grubunun sıçan ve maymun özefagusu substratları 25 kullanılarak yapılan indirekt immünofloresan test sonuçları Tablo 7 Hasta akrabalarının ELİSA sonuçları 26 Tablo 8 Akraba grubu ile kontrol grubunun sıçan özefagusu 27 substratında elde edilen titrasyonların karşılaştırılması Tablo 9 Akraba grubu ile kontrol grubunun maymun özefagusu 28 substratında elde edilen titrasyonların karşılaştırılması Tablo 10 Akraba ve kontrol grubunun sıçan özefagusu substratında 28 elde edilen 1/10 ve üzeri titrasyonlarının karşılaştırılması Tablo 11 Anne-baba, kardeş ve çocuklarda sıçan özefagusu 29 substratında elde edilen pozitiflik oranları Tablo 12 Sıçan ve maymun özefagusu substratlarında akraba ve kontrol gruplarında elde edilen sonuçların değerlendirilmesi 30 iii

5 ŞEKİL LİSTESİ Şekil no Sayfa no Şekil 1 Hedef antijenlerin yer aldığı desmozomal model 5 Şekil 2 Desmozomdaki olası düzeni ve protein etkileşimini gösteren 5 spekülatif model Şekil 3 Pemfiguslu bir hastada gövde ve ekstremitelerde erozyonlar 9 Şekil 4 Pemfiguslu bir hastada oral mukozada erozyonlar ve bül atığı 9 Şekil 5 Pemfigus vulgaris histopatolojisi; suprabazal bül, süperfisiyal 13 perivasküler infiltrasyon, bazal keratinositlerde mezar taşı sırası görünümü (HE,X150) Şekil 6 Pemfigus vulgariste sitolojik bulgular; akantolitik hücreler 13 (Tzanck smear, Giemsa boyası.) Şekil 7 Pemfigusta direkt immünofloresan bulguları 14 Şekil 8 Paraneoplastik pemfigusta immünofloresan bulguları 15 Şekil 9 Pemfigus eritematozusda direkt immünofloresan bulguları 15 Şekil 10 Pemfigusta indirekt immünofloresan (substrat: maymun 16 özefagusu) Şekil 11 Pemfigusta indirekt immünofloresan (substrat: sıçan özefagusu) 16 Şekil 12 İndirekt immünofloresan yönteminin uygulanışı 20 Şekil 13 ELİSA yönteminin uygulanışı 21 Şekil 14 Direkt immünofloresan yönteminin uygulanışı 22 Şekil 15 Akraba grubu ile kontrol grubunun sıçan özefagusu 27 substratında elde edilen titrasyonların karşılaştırılması Şekil 16 Akraba ve kontrol grubunun maymun özefagusu substratında 28 elde edilen titrasyonların karşılaştırılması Şekil 17 Akraba ve kontrol grubunun sıçan özefagusu substratında elde 29 edilen 1/10 ve üzeri titrasyonlarının karşılaştırılması Şekil 18 Sıçan özefagusunda anne-baba, kardeş ve çocuklarda pozitiflik oranları 30 iv

6 KISALTMA LİSTESİ C3 : Kompleman 3 DİF : Direkt immünofloresan Dsg1 : Desmoglein 1 Dsg3 : Desmoglein 3 ELİSA: Enzim linked immunosorbent assay İEN : İntraepidermal nötrofilik IgA dermatozu İİF : İndirekt immünofloresan İSA : İntersellüler aralık PNP : Paraneoplastik pemfigus PF : Pemfigus foliaseus PV : Pemfigus vulgaris SPD : Subkorneal püstüler dermatoz benzeri v

7 ÖZET Pemfiguslu Hastaların Sağlıklı Birinci Derece Akrabalarında Pemfigus Otoantikorlarının Sıklığının Araştırılması Pemfigus epidermal hücre yüzey antijenlerine karşı otoantikorların gelişimi ile karakterize otoimmün büllöz bir hastalıktır. Etyopatogenezde genetik ve çevresel faktörlerin rol oynadığına dair kanıtlar vardır. Hastalığın HLA ile ilişkisi gösterilmiştir. Bildirilen ailesel olguların yanı sıra farklı popülasyonlarda yapılan çalışmalarda pemfigusa ait otoantikorlar hastaların sağlıklı birinci derece akrabalarının serumlarında da saptanmıştır. Bu çalışmada bölgemizdeki pemfiguslu hastalarda herediter faktörlerin rolünü belirleyebilmek amacıyla immünofloresan ve ELİSA gibi otoantikor testleri kullanarak, pemfiguslu hastaların sağlıklı birinci derece akrabalarında dokuda ve serumda pemfigus otoantikorlarının varlığı ve sıklığı araştırıldı. Çalışma kapsamına alınan 29 pemfiguslu hastanın, 68 sağlıklı birinci derece akrabasından alınan serum ve deri örnekleri immünofloresan ve ELİSA yöntemleri ile çalışıldı. Serumda dolanan otoantikorların varlığı, sıçan özefagusu substrat olarak kullanıldığında hasta akrabası grubunda 1/20 ve üzeri titrasyonlarda sağlıklı kontrol grubuna oranla istatistiksel olarak anlamlı bulunmasına karşın, maymun özefagusu substrat olarak kullanıldığında her iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı. ELİSA metodunu uyguladığımız 32 hasta akrabasından sadece birinde spesifik otoantikorlar saptandı. Serumlarında antikor saptanan 13 hasta akrabasına aynı zamanda direkt immünofloresan testi uygulandı ve hiçbirisinin derisinde antikor depolanması gözlenmedi. Çalışma grubumuzdaki pemfiguslu hastaların sağlıklı birinci derece akrabalarında pemfigus otoantikorlarının bulunma sıklığı yüksek saptanmamıştır. Pozitif saptanma sıklığı sağlıklı hasta akrabalarında ancak belirli substratlarda ve titrasyonlarda sağlıklı kontrol gruplarına göre anlamlı farklılıklar gösterebilmiştir. Bu bulgular ile bölgemizde görülen pemfigusun etyopatogenezinde herediter faktörlerin etkisinin sınırlı olabileceği sonucuna varılmıştır. Anahtar sözcükler: Ailesel, herediter, otoantikor, pemfigus vi

8 ABSTRACT Investigating of the Frequency of Pemphigus Autoantibodies in the First-Degree Healthy Relatives of Patients with Pemphigus Pemphigus is an autoimmune blistering disease characterized by circulating autoantibodies against the keratinocyte cell surface. The evidences indicate that genetic and environmental factors may play a role in the aetiopathogenesis of the disease. Pemphigus is associated with alleles of HLA. The pemphigus autoantibodies were also demonstrated in the sera of the first-degree healthy relatives of patients with pemphigus in previous studies in different populations In this study to determine role of the hereditary factors in aetiopathogenesis of the disease in our region, frequency and existence of pemphigus autoantibodies were investigated in sera and in skin in the first-degree healthy relatives of the patients with pemphigus by using autoantibody tests such as immunofluorescence and ELISA. Sera and skin samples which were obtained from 68 first-degree healthy relatives of the 29 patients with pemphigus were examined by using ELISA and immunofluorescence tests. The titers of 1/20 and above of circulating antibodies in sera were found as statistically significant between healthy relatives and healthy controls in rat esophagus substrates. But there were no significant differences between titers of both groups in the substrates of monkey esophagus. ELISA was performed to 32 healthy relatives. The antidesmoglein 3 antibodies were detected only in one relative. Direct immunofluorescence test was performed to 13 healthy relatives. All samples were determined as negative. As a result of our study the frequency of the pemphigus autoantibodies was not high in the first-degree healthy relatives of the patients with pemphigus. It was only found to be statistically significant in certain substrates and titers. By considering these findings, we concluded that the hereditary factors seem to effect to aetiopathogenesis of the pemphigus in limited degree in our region. Keywords: Autoantibodies, familial, hereditary, pemphigus vii

9 1. GİRİŞ Pemfigus, epidermal hücre yüzey antijenlerine karşı gelişen otoantikorların etkisi ile deri ve müköz membranlarda epidermal ayrışma, yani klinik olarak bül ve/veya erozyonlar oluşumu ile karakterize, hayatı tehdit eden otoimmün bir hastalıktır 1. Söz konusu otoantikorların epidermal ayrışmaya nasıl yol açtıkları konusunda pek çok bilgi vardır 2-5. Ancak, etyopatogenezde özellikle üzerinde durulan genetik ve çevresel karşılıklı etkileşimin, hastalarda otoantijenlere karşı nasıl duyarlanma yarattığı ve bunun sonucunda da patojen otoantikorların nasıl geliştiği konusunda henüz yeterli bilgiye sahip değiliz. Pemfiguslu hastalarda otoantikor gelişiminde herediter faktörlerin rol oynadığı bilinmektedir. Genetik predispozisyonun hastalığın etyopatogenezine olan etkisi ile ilgili düşünceler ilk kez Japon ve Yahudi pemfigus vulgarisli hastalarda HLA-A10 insidansının arttığının tespiti ile gündeme gelmiştir 6,7. Sonraki çalışmalarda Yahudi pemfigus vulgarisli hastalarda HLA-DR4 ve HLA-DR6 insidansının %90 gibi oldukça yüksek düzeylerde olduğu ortaya konmuştur 8. Ayrıca bugüne kadar genetik predispozisyonu çağrıştıracak biçimde 25 tane ailesel pemfiguslu tanımlanmıştır Tüm bu mevcut bilgiler pemfigus patogenezinde genetik yatkınlığın ne kadar rol oynadığı, bunun hasta popülasyonumuzdaki etkisinin ne olduğu ve bu etkinin hastalık gelişmeden önce tespit edilebilir olup olmadığı sorularını akla getirmektedir. Bu soruları temel alan çalışma amacımız doğrultusunda pemfiguslu hastalarımızın birinci derece akrabalarında otoantikor testleri olan immünofloresan ve ELİSA testlerini kullanarak dokuda depolanmış olan ve serumda dolanan otoantikor düzeylerinin bakılması ve yine akrabalarındaki spesifik otoantikor düzeylerinin varlığının ve sıklığının araştırılması planlandı. 1

10 2. GENEL BİLGİLER Pemfigus, Yunanca bül, balon anlamına gelen pemphix kelimesinden köken alır. Wichman tarafından 1791 de isimlendirilmiş olup, kronik büllöz dermatozların en önemli grubu olarak tanımlanır 20. Pemfigus epidermal hücre yüzeylerindeki desmoglein (Dsg) 1 ve desmoglein 3 gibi adezyon moleküllerine karşı IgG otoantikorlarının gelişmesi sonucu deri ve müköz membranların bül ve erozyonları ile karakterize otoimmün büllöz bir hastalıktır. Histolojik olarak intraepidermal bül ve akantolizis, immünolojik olarak ise kanda dolanan ve keratinositlerin hücre yüzey antijenlerine karşı gelişen IgG otoantikorları ile karakterizedir Sınıflandırma Pemfigus intraepidermal ayrışmanın anatomik lokalizasyonuna göre pemfigus vulgaris (PV) ve pemfigus foliaseus (PF) şeklinde iki ana gruba ayrılır. PV suprabazal ayrışma gösterirken, PF granüler tabaka ve subkorneal bölgede ayrışma gösterir. İmmünolojik özellikler klinik ve histopatolojik bulgular ile birlikte değerlendirildiğinde ise pemfigus grubu hastalıklar dört ana gruba ayrılır 1 (Tablo1). Tablo 1. Pemfigusun sınıflandırılması 1 Tip Alt tipleri Pemfigus vejetans Pemfigus vulgaris İlaca bağlı Pemfigus eritematozus Pemfigus foliaseus Fogo selvagem (Endemik PF) İlaca bağlı Paraneoplastik pemfigus - Subkorneal püstüller dermatoz benzeri Ig A pemfigusu İntraepidermal nötrofilik IgA dermatozu 2

11 2.2 Epidemiyoloji Pemfigus en sık 5. ve 6. dekadlarda, kadın ve erkeklerde eşit sıklıkla görülür. Çocuklarda nadir olmakla beraber genç insanlarda nadir değildir 21. Pemfigus insidans ve prevelansı coğrafik bölgelere göre farklılık göstermektedir. Mevcut yayınlara baktığımızda PV nin Yahudi ve Akdeniz ırkında insidansının daha yüksek olduğunu görmekteyiz. Genel olarak dünyadaki insidansı / arasındadır Endemik PF, fogo selvagem ise Brezilya nın bazı bölgelerinde %3.4 e kadar çıkan sıklıkta görülmektedir 1. Ülkemizde Akdeniz bölgesinde insidansı 0.24/ dir. En çok PV görülmektedir. Hastalığın görülme yaşı ortalama 43 tür ve erkek/kadın oranı 1/1.35 tir Patogenez Mevcut bilgilerimiz pemfigusun otoimmün bir hastalık olduğunu göstermektedir. İndükleyen olaylar bilinmemekle beraber ototantikorlar epidermal keratinositler üzerindeki desmozomal glikoproteinler olan desmogleinlere karşı gelişmektedir. Otoantikorların tipleri klinik formların farklılaşmasını da etkilemektedir. Klasik pemfigusun klinik tipleri olan PV ve PF li hastaların serumlarında antidesmoglein otoantikorları bulunmaktadır. Sadece anti-dsg3 IgG içeren serum, sınırlı cilt lezyonu ile mukozal baskın PV ye neden olmaktayken, anti-dsg3 ve anti- Dsg1 in birlikte bulunduğu serum, müköz membran ve deri lezyonlarının ikisine birden neden olmaktadır. Sadece anti-dsg1 içeren serum mukozal tutulum olmadan deriyi etkileyen PF ye yol açmaktadır 31. Hedef antijenler desmozomlarda bulunan hücreler arası adezyon molekülleri olan Ca ++ bağımlı, kaderin ailesinden desmoglein (Dsg) 1 ve 3 tür (Şekil 1 ve Şekil 2). Desmogleinler desmozomların iç kısmının transmembran glikoprotein parçasıdır 2. Otoantikor Dsg nin ekstrasellüler kısmının uzak bölgesine (EC1-5) bağlanır ve epidermal hücrelerin ayrılmasına neden olur 3 (Şekil 2). Bu antikorların hastalığın 3

12 patogenezindeki rolünü destekleyen bulgular şu şekilde sıralanabilir; i) hastalığın aktivitesiyle dolanan pemfigus otoantikorlarının seviyelerinin ilişkili olması, ii) aktif pemfiguslu anneden otoantikorların bebeğe transplasental geçişi ile yenidoğanda büllerin olması, iii) PF ve PV hastalarındaki IgG otoantikorlarının insan deri kültürlerine eklenmesi ile epidermisin subkorneal ve suprabazal alanlarında ayrışma gözlenmesi, iv) PF, PV ve paraneoplastik pemfigustaki (PNP) IgG lerin yenidoğan farelere pasif transferi ile pemfigus hastalarındakine benzer intraepidermal büllerin oluşturulması 2. Hücreler arası bağlantıyı sağlayan desmozomlar, epidermisin tüm tabakalarında keratinositlerde bulunurlar. Ancak farklılaşma sırasında önemli yapısal ve sayısal değişikliğe uğrarlar. Bazal tabaka üzerinde birkaç adet varken, stratum spinozum ve granülozumda sayıları artar, stratum korneumda tekrar sayıları azalır. Dsg1 epidermisin üst tabakalarında daha yoğun bulunur. Mukozalarda çok az sayıda saptanır. Dsg3 ise özellikle epidermisin alt tabakalarında daha fazladır 4. Transmembran desmozomal kadherinler desmoglein ve desmocollini içeren glikoproteinlerdir. Plak proteinler ise glikolize olmamış proteinlerdir ve plakin ailesi ve armadillo benzeri proteinler olarak ikiye ayrılır 4 (Tablo 2). Tablo 2. Desmozomal Proteinler 4 Kadherinler Armadillo ailesi üyeleri Plakin ailesi üyeleri Desmoglein Desmocollin Plakoglobulinler Plakophilin Plectin Desmoplakin Envoplakin Periplakin 4

13 Şekil 1. Hedef antijenlerin yer aldığı desmozomal model. Desmozomal plak Keratinosit membran Desmoglea Keratin IFs Şekil 2. Desmozomdaki olası düzeni ve protein etkileşimini gösteren spekülatif model 4. Pl:Plektin, Dp:Desmoplakin Pkp:Plakophilin, Pkg:Plakoglobin Env:Envoplakin Per:Periplakin Dsc:Desmocollin Dsg:Desmoglein IFs:Intermediate filaments Pemfigus otoantikorlarının keratinositlerden, plazminojen aktivatörlerine benzer biçimde proteaz salınımını indükleyerek de indirekt olarak bül oluşturduğu öne sürülmüştür 32. Farelerde Dsg3 geninde oluşturulmuş mutasyon sonucunda pemfigus 5

14 antikorlarının Dsg lerin adezive fonksiyonlarını bozarak doğrudan bül oluşturduğu gösterilmiştir. Dsg3 geni harap edilen farelerde PV nin karakteristik lezyonları ile beraber müköz membranlarda ve deride travma bölgelerinde suprabasal akantolizis gözlenmiştir 33. Sonuç olarak pemfigusta akantolizis yani epidermal ayrışma desmogleinlerdeki yapısal bozukluğa ikincil olarak otoantikorların direkt etkisiyle veya desmogleinler ile otoantikorlar arasında immünolojik etkileşme ile meydana gelmektedir. Otoreaktif T hücrelerinin de PV patogenezinde kritik rol oynadığı düşünülmektedir. Çünkü; i) antikor üretimi T hücre yardımını gerektirir, ii) PV de CD4+ T hücrelerinin bulunması farklı HLA class II alellerinin güçlü ilişkisi nedeniyle öne sürülmüştür ve iii) Dsg epitoplarını T hücrelerinin tanıması, B hücreleri tarafından Dsg3 spesifik otoantikorlarının üretimini başlatma ve sürdürmede çok önemli rol oynayabilir. Dsg3 ün ekstrasellüler kısmının farklı epitoplarını tanıyan otoreaktif T hücreler tanımlanmıştır. Bu otoreaktif CD4+ T hücreler IL-4 ve IL-10 gibi Th2 sitokinleri üretirler. Th2 bağımlı IgG4 alt tipi otoantikorlar PV li hastaların aktif döneminde baskın görülürken, Th1 bağımlı IgG1 alt tipi otoantikorlar PV li hastaların remisyon döneminde baskındır. PV li hastalardakine benzer ya da aynı HLA class II allelerini taşıyan sağlıklı bireylerde de Dsg3 e karşı otoreaktif T hücre yanıtı geliştiği gözlenmiştir. PV li hastalardaki otoreaktif T hücreleri Th1 ve Th2 sitokinlerinin ikisini birden üretirken sağlıklı kişilerdeki otoreaktif T hücrelerinden sadece Th0 üretimi gözlenir 3. Nguyen et al. PV nin patogenezinde desmoglein dışında alfa9-asetilkolin reseptörlerine ve pemphaxine karşı da otoantikorlar tanımlanmıştır. Dsg3-/- farelere PV hasta serumu verildiğinde Dsg dışındaki hedef antijenlerin varlığını destekler nitelikte intersellüler boyanmalar saptamışlardır 34. Paraneoplastik pemfigusta sitoplazmik proteinler olan plakin ailesinin (desmoplakin, BPAG1, envoplakin, periplakin ve plectin) tüm üyelerine karşın otoantikorlar vardır 31. Epitelyal proteinlere karşı tümörün otoimmüniteyi nasıl indüklediği bilinmemektedir. Bir hipoteze göre anti-tümör immün yanıt, konağın 6

15 normal epitelyal proteinleri ile çapraz reaksiyon göstermektedir. Ayrıca otoimmüniteyi tümör hücreleri tarafından üretilen disregüle sitokinlerin geliştirdiğine dair kanıtlar da vardır. PNP li hastalarda IL-6 seviyeleri belirgin olarak yükselmiş saptanır. PNP ile en çok birlikteliği olan non-hodgkin lenfoma, kronik lenfositer lösemi, Castelman tümöründe in vitro olarak tümör hücrelerinin yoğun miktarda IL-6 salgıladıkları gösterilmiştir. IL-6 ise B hücrelerinin farklılaşmasını ve immünglobulin üretimini desteklemektedir. Buna uyar biçimde mystenia gravis, otoimmüm sitopeni gibi diğer otoimmün hastalıklarda da, hastaların serumlarında IL-6 seviyeleri yüksek bulunur 1. İlaca bağlı pemfigus en sık penisilamin ve kaptopril ile gözlenmiştir. Penisilamin ve kaptoprilin sülfidril grupları desmoglein 1 ve 3 ün sülfidril gruplarıyla etkileşir. Bu etkileşim sonucunda ya direkt olarak adezyon molküllerine karışarak (intefering) ya da bu molekülleri antijenik hale getirerek pemfigusa neden olurlar 1,35. IgA pemfigusu klinik ve histolojik görünümlerine göre subkorneal püstüler dermatoz benzeri (SPD) ve intraepidermal nötrofilik IgA dermatozu (IEN) olarak ikiye ayrılır. Subkorneal püstüler dermatoz tipinde desmokollin 1 e karşı, intraepidermal nötrofilik IgA dermatozu tipinde ise Dsg1 ve Dsg3 e karşı otoantikorlar saptanmıştır. Ishii et al. yaptığı bir çalışmada intraepidermal nötrofilik IgA dermatozu tipi IgA pemfiguslu hastalarda keratinosit hücre membranının ekstradesmozomal bölgesinde keratinositler arasındaki intersellüler alanda da elektronmikroskobik olarak boyanmalar tespit etmişlerdir. Bu çalışma hastalığın patogenezinde rol alabilecek desmozomal olmayan transmembranöz glikoproteinlere karşı da otoantikorların gelişebileceğini 36 göstermektedir. 36 7

16 Tablo 3. Pemfigus Antijenleri 4 Glikolize olmayan plak proteinleri Proteinler Moleküler Ağırlık (kda) Pemfigus Tipi Desmoplakin Paraneoplastik pemfigus Desmoplakin Paraneoplastik pemfigus Plektin 300 Paraneoplastik pemfigus Envoplakin 210 Paraneoplastik pemfigus Periplakin 195 Paraneoplastik pemfigus Desmozomal Kadherinlerin transmembran kor glikoproteinleri Proteinler Moleküler Ağırlık (kda) Pemfigus Tipi Desmoglein Pemfigus foliaseus Jeneralize pemfigus vulgaris Pemfigus herpetiformis Paraneoplastik pemfigus Desmoglein Mukozal pemfigus vulgaris Pemfigus vulgaris Pemfigus foliaseus Pemfigus herpetiformis Paraneoplastik pemfigus İEN Ig A pemfigus Desmokolin SPD Ig A pemfigus Pemfigus vulgaris Pemfigus foliaseus Desmocolin Pemfigus vulgaris Pemfigus foliaseus IEN: İntraepidermal nötrofilik SPD: Subkorneal püstüler dermatoz 8

17 2.4. Klinik bulgular Pemfigus vulgaris Pemfigus vulgarisin primer lezyonu gevşek büllerdir. Genellikle normal görünümlü deriden ortaya çıksa da eritemli derinin üzerinden de gelişen büllerin kolay rüptürü sonucu ağrılı erode alanlar meydana gelir. Bülün çevresindeki normal görünümlü deriye basınç uygulandığında epidermisin ayrıştığı gözlenir ki buna Nikolsky belirtisi denir. En çok tutulan bölgeler oral mukoza, saçlı deri, yüz, sırt, göğüs ön duvarı, göbek, aksilla ve inguinal bölgelerdir (Şekil 3). Hastaların yarıdan fazlasında tutulum oral mukozadan başlar ve konjuktiva, larinks, farinks, özefagus, vulva ve üretra gibi mukoz membranlar da da lezyonlar görülebilir (Şekil 4). Lezyonlar genellikle kaşıntısızdır, ağrılı olabilirler; ancak hiperpigmentasyon ile iyileşirler 1. Bazı hastalarda erozyonlar içerisinden üzerinden püy sızıntısı olan yoğun granülasyon dokusu ve krut geliştirme eğilimindedir. Buna PV nin bir alt klinik formu olarak pemfigus vejetans denir. Söz konusu vejetasyonlar sıklıkla başta aksilla ve inguinal bölge olmak üzere intertriginöz alanlar, saçlı deri ve yüze yerleşme eğilimindedirler. Neuman tipinde vejetasyonlar PV nin erode lezyonları üzerinde gelişirken, Hallopeau tipinde lezyonlar püstüller şeklinde başlayıp hızla vejetasyonlara dönüşür 1,37. Şekil 3. Pemfiguslu bir hastada gövde ve ekstremitelerde erozyonlar Şekil 4. Pemfiguslu bir hastada oral mukozada erozyonlar ve bül artıkları 9

18 2.4.2 Pemfigus foliaseus Eritemli zeminde skuamlı, krutlu erozyonlar ile karakterizedir. Akantolizis subkorneal alanda veya stratum granülosum tabakasında olduğu için gelişen büller kolayca rüptüre olurlar. Sınırlı ve başlangıç lezyonları yüz, saçlı deri, gövde üst kısım gibi seboreik bölgelerde lokalizedir ve oral mukoza tutulumu nadirdir. Hastalık yıllarca lokalize kalabilir veya hızla ilerleyerek bazen eksfoliyatif eritrodermiye neden olabilir. Güneşe ve/veya sıcağa maruziyet hastalık aktivitesini şiddetlendirebilir. Güney Amerika da görülen endemik formuna fogo selvagem denir 1. Senear-Usher sendromu olarak ta bilinen pemfigus eritematozus (p. eritematozus) PF nin lokalize varyantıdır ve daha benign seyirlidir. Lezyonlar eritemli, kalın krutlu, büllöz ve hatta hiperkeratotiktir. Genellikle lupus eritematozusta olduğu gibi yüz, çene, ve kulaklar tutulur. Hastaların %80 inde lupus band testi pozitif iken (bazal membranda band tarzı en az iki immünoreaktanın granüler depolanması) %30 unda antinükleer antikor düşük titrede pozitiftir Paraneoplastik pemfigus Paraneoplastik pemfigus hemen her zaman altta yatan bir neoplaziye ve genellikle de bir lenfoproliferatif hastalığa bağlı gelişen otoimmün mukokutanöz bir sendrom olarak değerlendirilmektedir. Başta oral mukozada olmak üzere müköz membranlarda inatçı erozyon ve ülserasyonla, deride büller, erozyonlar, likenoid papüller, bazen target benzeri lezyonların da eşlik ettiği polimorf bir deri döküntüsü ile karakterizedir. Gastrointestinal ve respiratuvar epitel de tutulabilir. Yaklaşık hastaların 2/3 ünde deri lezyonları, neoplazm ile birlikte gözlenirken, 1/3 ünde neoplastik lezyonlar, mukokütanöz hastalık oluştuktan sonra saptanır 38. Paraneoplastik pemfigus ile en sık ilişkili maligniteler non-hodgkin lenfoma, kronik lenfositer lösemi, Castelman tümörü, timoma, Waldenström makroglobulinemisi, inflamatuar fibrosarkom, bronkojenik skuamöz hücreli kanserdir 1,38. 10

19 2.4.4 IgA pemfigusu Vezikülopüstüler döküntü, nötrofilik infiltrasyon ve akantolizis ile karaterize otoimmün intraepidermal büllöz bir hastalıktır. Subkorneal püstüler dermatoz benzeri ve intraepidermal nötrofilik IgA pemfigusu olarak ikiye ayrılır. Her iki tipin kliniğinde eritemli veya normal deri üzerinde gevşek vezikül ve/veya püstüller vardır. Püstüller orta kısımda krutla beraber annüler veya sirsine desen oluşturma eğilimindedirler. En sık tutulan yerler aksiler bölge ve kasıklardır ancak gövde, proksimal ekstremite ve alt abdominal bölgede de lezyonlar gelişebilir. Kaşıntı belirgindir İlaca bağlı pemfigus İlaçların indüklediği pemfigus thiol grubu içeren ve thiol grubu içermeyen ilaçlara bağlı olarak iki gruba ayrılır. Thiol grubu içeren ilaçlar (penicillamin, kaptopril, pyritinol, thiopronine, piroksikam vs.) nedeniyle gelişen pemfigus klinik olarak PF ye benzemektedir. Thiol grubu olmayan ilaçlar (antibiyotikler, penisilin ve türevleri, sefalosporinler, rifampisin, pyrazolon türevleri, aminopirin, azoprozon vs.) ise PV tipine benzer tablolar oluşturmaktadır. Eritemli, skuamlı, krutlu papüller, morbiliform erüpsiyonlar, ürtikeryal lezyonlar ve ardından herpetiform küçük veziküller ve erozyonlar gözlenebilmektedir. Oral lezyonlar thiol grubu içeren ilaçlarda gözlenmezken; thiol grubu olmayan ilaçlara bağlı gelişen pemfigusta gözlenir 20, Histopatoloji Pemfigusta ana patolojik bulgu akantolizise sekonder gelişen intraepidermal ayrışmadır. Bu ayrışma PV ve onun varyantı olan pemfigus vejetansta hemen bazal tabakanın üzerindedir; yani suprabazaldir. Bazal keratinositler üst ve yanlardaki diğer keratinositlerle bağlantılarını kaybederler; ancak bazal membrana tutulu olarak kalırlar. Bu görünüm karakteristik mezar taşı sırası görünümü meydana getirir; bül boşluğu içerisinde diğer keratinositler ile bağlantılarını kaybetmiş poligonal görünümünü kaybederek yuvarlak bir şekil almış nukleus sitoplazma oranının hiperkromatik nukleus lehine bozulduğu akantolitik hücre diye tanımlanan karakteristik morfolojiye 11

20 dönüşürler (Şekil 5 ve Şekil 6). Ayrışma ve akantolizise eşlik eden eozinofilik spongiozis tablosu görülebilir 40. Pemfigus vejetans lezyonları bu histolojik morfolojiye ilaveten papillamatoz, akantoz ve hiperkeratoz gösterirler. Bazı lezyonlarda ise eozinofilden zengin intraepidermal apseler saptanabilir. PF ve onun varyantı olan pemfigus eritematozusta ise ayrışma intraepidermal ancak subkornealdir. Granüler tabaka altındaki epidermis sağlamdır. Bül boşluğu içerisinde nötrofillerden meydana gelen subkorneal püstüller ve seyrek akantolitik hücreler gözlenebilir; eozinofilik spongioz eşlik edebilir 1,40. PNP de lezyonlar çok polimorfik olduğudan histopatolojisi PV ve PF den farklıdır ve spesifik değildir. Deri biyopsisi değerlendirilirken alınan materyalin klinik morfolojisi de göz önünde bulundurulmalıdır. İnflamatuar olmayan kutanöz büller suprabazal akantolizis, interface ve likenoid değişiklikler açısından baskınken, eritematöz papül ve maküler lezyonlarda interface ve likenoid değişikliklerle beraber tek hücre nekrozları, diskeratotik keratinositler, lenfositlerin ekzositozu ve bazal hücre dejenerasyonu gözlenmektedir 1,40. IgA pemfigusun histopatolojisi çoğunlukla PF ye (subkorneal tip) bir kısmı da PV ye (intraepidermal tip) benzemektedir. İlaca bağlı pemfigusun histopatolojisi klinik görünümü ile ilişkilidir. PF ye benzer lezyonlarda epidermal akantolizis, PV ye benzer lezyonlarda ise suprabazal akantolizis gözlenir. Her iki duruma da eozinofilik spongiozis eşlik edebilir. İdiopatik ve ilacın başlattığı pemfigusu histopatolojik olarak ayırmak mümkün değildir

21 Şekil 5. Pemfigus vulgaris histopatolojisi; suprabazal bül, süperfisiyal perivasküler infiltrasyon, bazal keratinositlerde mezar taşı sırası görünümü (HE,X150) Şekil 6. Pemfigus vulgariste sitolojik bulgular; akantolitik hücreler (Tzanck smear, Giemsa boyası.) 2.6 İmmünofloresan yöntemler Flourescein ile işaretli antikorların dokudaki hedef antijene bağlanıp floresan mikroskobik inceleme ile görünebilir hale gelmesine dayanan bir testtir. Pemfigusun kesin tanısı otoantikorların gösterilmesi ile konulmaktadır. Tek başına tanı koydurabileceği gibi klinik ve histolojik olarak konulmuş tanıyı değiştirebilmekte veya tamamen farklı bir tanının konmasını sağlayabilmektedir. Günümüzde ototantikor testleri içerisinde en sık kullanılandır. Başlıca serumdaki otoantikorları göstermeye yönelik indirekt (İİF) ve dokudaki otoantikorları göstermeye yönelik olarak direkt immünofloresan (DİF) tetkikler şeklinde 2 yöntem uygulanır Pemfigusta direkt immünofloresan tetkiki Keratinosit hücre yüzeyindeki desmozomal proteinlere antikorların bağlanmasıyla intersellüler aralıkta (ISA) balık ağı deseni oluşur (Şekil 7). Aktif hastalığı olan kişilerden perilezyonel alandan alınan biyopsi de DİF testinin sensitivitesi %100 civarındadır. DİF pemfigus tanısı koydurur ancak pemfigusun varyantlarını birbirinden ayırt ettiremez. Genellikle tüm epidermisi kaplayacak şekilde (full thickness) depolanma saptanmakla birlikte, PV de daha suprabazal, PF de ise daha subkorneal depolanma eğilimi olabilir. Floresanın epidermisin farklı tabakalarında 13

22 değişik yoğunlukta depolanmasının nedeni hedef desmozomal proteinlerin PF için Dsg1, PV için ise Dsg3 olmasına bağlı olabilir. Depolanan antikor IgG dir; ancak erken pemfigus lezyonlarından alınan örneklerde IgG ye benzer paternde, daha az şiddette ve sıklıkta kompleman 3 (C3) depolanması da gözlemlenebilir. PNP de İSA depolanması zayıf olabilir veya spesifik olmayan diffüz boyanma paterni gözlemlenebilir. IgA pemfigusunda ise İSA da depolanan antikor IgA dır 42. PNP ve p. eritematozusta hem İSA da hem de bazal membran zonunda immünoreaktan depolanması görülebilmektedir (Şekil 8 ve 9). İlaca bağlı pemfigusta depolanma paterni heterojendir. Bu hastaların 2/3 ünde Dsg1 e karşı antikor vardır ve klinik ve histolojisi PF ye benzer; 1/3 ünde ise Dsg3 e karşı antikor vardır ve bu hastaların klinik ve histolojisi ise PV ye benzemektedir. DİF testinin pozitif prediktif değeri, yani testin pozitif olduğu kişilerin pemfigus olma olasılığı yaklaşık %100 iken negatif prediktif değeri, yani testin negatif olduğu kişilerin pemfigus olmama olasılığı ise %85-90 dır. Negatif prediktif değerin daha düşük olmasının nedeni ise inflame veya büllöz alanlardan alınan biyopsilere bağlı yalancı negatifliktir 42. DİF İntersellüler alanda IgG %100 Genellikle C3 de pozitif IgM ve IgA daha az Floresan paterni: tüm epidermis boyunca keratinositlerin etrafında, kesintisiz Balıkağı Şekil 7. Pemfigusta direkt immünofloresan bulguları 14

23 Şekil 8. Paraneoplastik pemfigusta immünofloresan bulguları Şekil 9. Pemfigus eritematozusda direkt immünofloresan bulguları Pemfigusta indirekt immünofloresan tetkik İİF tetkiki şüpheli tanıları doğrulamak amacıyla kullanılabileceği gibi, diğer büllöz hastalıklardan pemfigus grubu hastalıkları ayırmak amacıyla da kullanılmaktadır. Ayrıca serumdaki otoantikorların titrasyonunu belirleyebildiği için ve bu titrasyonun hastalık aktivitesi ile korelasyon gösterebilmesi nedeniyle hastalığın monitorizasyonunda ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde kullanılabilmektedir 41. Substrat olarak maymun, sıçan özefagusu, insan meme dokusu kullanılmaktadır (Şekil 10, Şekil 11). Sensitiviteyi arttırmak için ise 2 substrat birlikte kullanılabilir. PF de sıçan, PV de maymun özefagusu, PNP de ise sıçan mesanesi kullanılarak testin sensitivitesi arttırılabilmektedir. Eğer maymun ve sıçan özefagusu ya da insan derisi ve maymun özefagusu birlikte kullanılırsa sensitivite %100 ü bulmaktadır. İİF ile; yanıklarda, penisiline bağlı ilaç erüpsiyonlarında, deri grefti söz konusu olduğunda, büllöz ve skatrisyel pemfigoidde, toksik epidermal nekrolizisde, SLE de yalancı pozitiflik görülebilmektedir

24 PEMFİGUS VULGARİS İİF Dolanan IgG antikorları %80-%90 olguda! Sensitivitesi substrata bağlıdır! Yalancı pozitiflik olabilir! Antikor titrasyonları klinik aktivite ile korelasyon gösterir! Hastalığın şiddetini göstermesi bakımından güvenilir değildir! Şekil 10. Pemfigusta indirekt immünofloresan bulguları (substrat: maymun özefagusu) Şekil 11. Pemfigusta indirekt immünofloresan bulguları (substrat: sıçan özefagusu) 2.7 Pemfigusta ELİSA Pemfigusta spesifik antikorların ortaya konmasına yönelik olarak western immünoblotting, immünopresipitasyon ve ELİSA testleri kullanılmaktadır. Bunlar içerisinde en sık kullanılanı ELİSA testidir. Pemfiguslu hastaların serumlarındaki Dsg1 ve Dsg3 e karşı bulunan spesifik otoantikorlar ELİSA yöntemi ile semi-kantitatif olarak saptanabilmektedir. Amagai et al. yaptıkları çalışmada PF hastaları için Dsg1 sensitivitesini %97.9 PV li hastalar içinse Dsg3 sensitivitesini %97.5 olarak saptamışlardır Tedavi Pemfigusun tedavisi diğer otoimmün hastalıklarda olduğu gibi kortikosteroid merkezlidir. Glukokortikoid tedavisinden önce PV li hastaların çoğu, PF li hastaların ise yaklaşık %60 ında hastalık ölümle sonuçlanıyordu 1, Genel tedavi prensipleri PV de tedavi hastalık sınırlı bir bölgede lokalize bile olsa başlanmalıdır, çünkü hastalık jeneralize olma eğilimindedir ve tedavi başlanmadığı takdirde prognozu kötüdür. PF ise yıllarca lokalize kalma eğilimindedir; sistemik tedavi olmadan da prognoz iyidir ve bu tip pemfigusu olan hastalara her zaman sistemik tedavi gerekmeyebilir. 16

25 Tedavi rejimi sıklıkla hastalığın aktivitesine bağlı olarak düşük- orta doz prednizolonla beraber immünosupresif ajandır. Glukokortikoid kullanımında kontrendikasyon varsa, glukokortikoidler hastalığı kontrol altına alamıyorsa ya da steroid komplikasyon riskini minimalize eden doz hastalıkta etkili değilse hasta genellikle immünosupresif ajanlardan (azatiopurin, siklofosfamid, altın, dapson, mikofenolat mofetil) oluşan adjuvan tedavi almalıdır 1,44 (Tablo 4). Tablo 4. Pemfigus tedavisi Kortikosteroidler 2. İmmünosüpresif ilaçlar 3. Anti-inflamatuar ilaçlar 4. İmmünomodülatörler Topikal ve intralezyonel kortikosteroidler Oral kortikosteroidler Pulse IV kortikoseroid Azatiopurin Siklofosfamid Siklosporin Mikofenolat mofetil Klorambusil Metotreksat Altın Dapson Nikotinamid Tetrasiklin Plazmaferezis Ekstrakorporal fotoferezis İntravenöz immünoglobulin Kortikosteroid tedavisinin başarısı yeterli dozda başlanmasına ve uygun dozlarda yeterli sürede verilmesine dayanmaktadır. Kortikosteroid artmış kapiller permeabiliteyi düzelterek, polimorfnükleer lökositleri süprese ederek inflamasyonu azaltır; lizozomal membranları stabilize eder, lenfositleri ve antikor yapımını baskılar. Topikal ve oral yollarla uygulanabilmektedir. Tedavi dozunu ayarlamada klinik şiddet birinci derece göz önünde bulundurulmakla beraber antikor titrasyonları da yardımcı olmaktadır 1,45. 17

26 2.8.2 Pemfigusta yardımcı ve destekleyici tedaviler Kortikosteroid tedavisinde mideyi korumak, peptik ülser gelişimini önlemek amacıyla antiasitler, H2 reseptör blokerleri, prostoglandin E analogları, proton pompa inhibitörleri; osteoporoz gelişimini önlemek için ise kalsiyum ve D vitamini verilir. Hastalarda kilo alımını, ödemi engellemek için proteinden zengin karbonhidrattan fakir diyet önerilir. Topikal olarak antiseptik ve antienfektif tedaviler uygulanır. Sınırlı, tedaviye yanıt vermeyen lokal lezyonlara ve inatçı oral ülserlere intralezyonel kortikosteroid tedavisi uygulanır. 2.9 Prognoz Glukokortikoid tedavisinden önce PV li hastaların çoğu, PF li hastaların ise yaklaşık %60 ında hastalık ölümle sonuçlanıyordu. Kortikosteroidlerin sistemik uygulanması ile beraber adjuvan tedavi olarak immünosupresif ilaçların kullanılması pemfiguslu hastaların prognozunu dramatik olarak düzeltmiştir. Günümüzde mortalite %5-10 arasındadır 30. Bu tedavilerle 4 ile 10 yıl arası izlenen PV li hastalarda mortalite (hastalıktan veya tedaviye bağlı) yaklaşık %10 ve altında iken PF de bu oran daha da azdır. Eskiden enfeksiyon, protein kaybı ve elektrolitlerdeki dengesizlik nedeniyle ölüm görülürken; günümüzde tedaviye bağlı başta enfeksiyon olmak üzere, diabet, osteoporoz, hipertansiyon en önemli mortalite ve morbitide nedenleridir 1. PV nin seyri lezyonların vücuttaki yaygınlığına, tanı konuluncaya kadar geçen süreye, uygun tedavi uygulanıp uygulanmamasına ve hasta yaşına göre değişmektedir. İleri yaş, yaygın lezyonlar ve yüksek doz kortikosteroid verilmesi kötü prognostik kriterlerdir 1. 18

27 3. GEREÇ VE YÖNTEM Mayıs 2004-Ocak 2005 tarihleri arasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Dermatoloji Anabilim Dalı Kliniğine başvuran ve klinik, histolojik ve immünolojik olarak pemfigus tanısı almış hastaların birinci derece gönüllü akrabaları; yani biyolojik annesi, babası, aynı anne babadan olma kardeşleri veya kendi çocukları çalışmaya dahil edildi. Çalışma ile ilgili olarak Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi etik kurulundan onay alındı. Çalışmaya katılan gönüllü hasta akrabalarının her birinin çalışmaya katılımlarıyla ilgili yazılı onayları alındı. Herhangi bir otoimmün veya büllöz hastalığı olan, bir sebepten dolayı medikal tedavi alan (immünosupresif, sistemik kortikosteroid vb.) hasta akrabaları çalışmaya dahil edilmedi. Kontrol grubu için sağlıklı, ailesinde otoimmün ve büllöz hastalığı olmayan herhangi bir medikal tedavi almayan 40 kişi alındı. Çalışmaya katılan gönüllülerden 10 cc periferik kan İİF yöntemiyle serum antikor titrasyonu bakılması için alındı. İİF yöntem şu şekilde uygulandı (Şekil 12); 1) Antikoagülan kullanılmadan alınan kanın santrifüj ile serumu ayrıldı. 2) Hasta serumlarından 1mg/ml sodyum azid eklenmiş PBS solüsyonu ile 1/10 dan başlayarak ve her basamakta dilüsyonu 2 kat arttırarak, 1/80 e kadar seri dilüsyonlar yapıldı. 3) Substrat olarak sıçan ve maymun özefagusu kullanıldı. Sıçan özefagusu lümeni görülecek şekilde 1/3 orta parçasından 4µm kalınlığında kriyokesitler yapıldı. Maymun özafagusu için hazır kesitler kullanıldı (The Binding site limited Birmingham, UK). 4) Kesitler 30 dakika kurutulduktan sonra hazırlanan seri dilüsyonlar sıra ile damlatıldı, nemli ve kapalı bir ortamda 30 dakika enkübe edildi. 5) Enkübasyon tamamlandıktan sonra PBS-T ile yıkandı ve kurutuldu. 6) PBS-T ile 1/150 oranında seyreltilen floresan işaretli anti-human IgG ile 30 dakika süre ile enkübe edildi. 7) PBS-T ile tekrar yıkandı ve propidium iodid içerisinde 5 dakika bekletilip, tekrar PBS-T ile yıkanarak kurutuldu. 8) En son lam üzerine DABCO (1,4 diazabicyclo, 2.5g/100ml) + sodyum azid (1mg/ml) eklenmiş %90 gliserin damlatılarak üzeri lamelle örtüldü. 9) Lamlar floresan mikroskopta incelendi. İntersellüler depolanmanın en son pozitif olduğu titrasyon not alındı. Sonuçlar negatif ve pozitif kontrol ile birlikte değerlendirildi. 19

28 İNDİREKT İMMÜNOFLORESAN TETKİK (İİF) 1:10 1:20 1:40 1:80 1: seri serum dilüsyonları Epitelyal substrat + serum dilüsyonlarından biri Yıkama Floresan ile işaretlenmiş antihuman immünoglobulin + Epitelyal substrat Yıkama UV Mikroskop Şekil 12. İndirekt immünofloresan yönteminin uygulanışı Spesifik antikorların tespiti için ELISA yöntemi kullanıldı. Bu yöntemde sırasıyla şu işlemler uygulandı (Şekil 13); 1) Dsg kaplı 48 adet çukurcuğun 46 sına 1/101 oranında sulandırılan serumlardan ve ilk ikisine pozitif ve negatif kontrolleri oluşturmak üzere kalibratör 1 ve kalibratör 2 den 100 er µl eklendi ve oda sıcaklığında 60 dakika enkübe edildi. 2) Sodyum dihidrojen fosfat+ sodyum klorid+ Tween-20 içeren yıkama solüsyonu ile 10 kat sulandırılıp 4 kez otomatik olarak yıkandı. 3) Fare kaynaklı peroksidaz ile konjuge monoklonal anti-human IgG, bromphenol blue, p- hidroksifenilasetik asit, proclin150, HEPES, BSA içeren dilüent ile 100 kat sulandırıldıktan sonra 48 çukurcuğa 100 er µl ilave edilerek 60 dakika enkübe edildi. 4) 2 de anlatıldığı şekilde yıkandı. 5) Kullanıma hazır substrat solüsyonu yani trimetilbenzidin/hidrojen peroksit (TMB/H2O2) den 48 kuyucuğa da 100 er µl ilave edilip 30 dakika enkübe edildi. 6) Kullanıma hazır durdurma solüsyonu yani 1.0 N sülfirik asit solüsyonu ilave edildi ve reaksiyon durduruldu. 7) Enzimin etki ettiği substrat kromojenden oluşan renk indeksi fotometrik olarak 450 nm dalga boyunda ölçüldü, anti-dsg otoantikoru çukurcuktaki Dsg antijenine bağlanınca son aşamada sarı renk görüldü. 8) İndex değerleri hesaplandı. 20

29 ELİSA 1 antijen çukurlu tablaya tespit edilir 2 yıkanır 3 test antikoru (hasta serumu) eklenir enzim kısmı 4 yıkanır 5 enzim ile işaretli antihuman Ig (ligand) eklenir ligand 6 yıkanır 7 kromojen substrat eklenir kromojen 8 renk indeksi fotometrik olarak ölçülür Şekil 13. ELİSA yönteminin uygulanışı İİF yöntemle serumlarında antikor saptadığımız hasta akrabalarından alınan deri biyopsi örnekleri DİF ile incelendi. DİF yönteminde sırasıyla şu işlemler uygulandı (Şekil 14); 1) biyopsi örnekleri likid nitrojenle ani dondurma işlemine tutuldu ve kesitler yapılana kadar -30 derecede saklandı. 2) dokular derin dondurucudan çıkarılıp embedding solüsyonu içerisine yerleştirilerek kriyotom ile 4 µm kalınlığında kriyokesitler yapıldı. 3) örnekler kurutulduktan sonra 1/70 oranında PBS-T [fosfatla tamponlanmış solüsyona (PBS, ph 7.2) nonspesifik bağlanmaları ve arka plan boyanmasını azaltmak amacıyla Tween 20 (0.5ml/lt) eklendi] ile sulandırılmış, flourescein isothiocyanate (FITC) ile işaretlenmiş keçi kaynaklı anti-human immünoglobulinler (IgG, IgA, IgM, C3 ve fibrinojen) kesitler üzerine damlatılıp oda sıcaklığında karanlık ve nemli bir ortamda 30 dakika enkübe edildi. 4) PBS-T solüsyonu ile örnekler yıkandı ve ardından kurutuldu. 5) Kurutulan kesitler üzerlerine floresanın çabuk solmasını önlemek için DABCO (1,4 diazabicyclo, 2.5g/100 ml) ve sodyum azid (1mg/ml) eklenmiş %90 lık gliserin ilave edilerek lamelle kapatıldı. 6) Hazırlanan preperatlar floresan mikroskop altında incelendi. 21

30 DİREKT İMMÜNOFLORESAN TETKİK (DİF) Deri kesitlerine floresan işaretli antikorların damlatılması Dokunun antikor ile enkübasyonu Yıkama Floresan mikroskop ile inceleme Şekil 14. Direkt immünofloresan yönteminin uygulanışı 22

31 4. BULGULAR Çalışmaya 27 si PV, 2 si PNP li olmak üzere toplam 29 hastanın (22 kadın 7 erkek) toplam 68 birinci derece akrabası (36 erkek 32 kadın) dahil edildi (Tablo 5). Grubun yaş ortalaması 34.24± olarak saptandı. Tablo 5. Hasta akrabalarının sıçan ve maymun özefagusu substratları kullanılarak yapılan indirekt immünofloresan test sonuçları Yaş Cins Tanı Akrabalık Sıçan derecesi özefagusu 1 Tacim Güler 15 E PV çocuğu 20 (-) 2 Doğan Bektaş 23 E PNP çocuğu (-) (-) 3 Ayşe Akın 52 K PV kardeşi (-) (-) 4 Şule Ateş 22 K PV çocuğu 10 (-) 5 Ali Arslan 21 E PV kardeşi (-) (-) 6 İbrahim Kaygısız 56 E PV kardeşi (-) (-) 7 Müslüm Kaygısız 40 E PV kardeşi 20 (-) 8 Veli Kaygısız 48 E PV kardeşi (-) (-) 9 Cengiz Kaygısız 30 E PV çocuğu (-) (-) 10 Ayhan Korkmaz 42 E PV çocuğu 10 (-) 11 İlkay Şanlı 14 K PV çocuğu (-) (-) 12 Hasan Korkmaz 45 E PV çocuğu (-) (-) 13 Mehmet Şanlı 17 E PV çocuğu (-) (-) 14 Fadime Bülbül 30 K PV çocuğu (-) (-) 15 Fuat Kılıçkaya 60 E PV kardeşi (-) (-) 16 Raşit Yılmaz 55 E PV babası (-) (-) 17 Medine Kırmızı 31 K PV kardeşi (-) (-) 18 Ali Karaöz 50 E PV kardeşi 40 (-) 19 Gizem Sakınç 8 K PV çocuğu (-) (-) 20 Ahmet Keskin 18 E PV çocuğu (-) (-) 21 Serdar Şanlı 12 E PV çocuğu (-) (-) 22 Coşkun Kılıçkaya 63 E PV kardeşi (-) (-) 23 Dudu Yüzgeç 31 K PV çocuğu 20 (-) 24 Bedia Keskin 40 K PV kardeşi 20 (-) 25 Doğa Sönmez 11 K PV çocuğu 10 (-) 26 Hande Ünal 18 K PV çocuğu (-) (-) 27 Hasibe Aköz 51 K PV kardeşi (-) Semiha Turhan 58 K PV annesi (-) (-) 29 Şerife Yılmaz 23 K PV kardeşi 10 (-) 30 İbrahim Şanlı 10 E PV çocuğu (-) (-) 31 İrem Sakınç 12 K PV çocuğu (-) (-) 32 Furkan Tahta 15 E PV çocuğu (-) (-) 33 Sabriye Kahraman 31 K PV çocuğu (-) (-) Maymun özefagusu 23

32 Tablo 5. Hasta akrabalarının sıçan ve maymun özefagusu substratları kullanılarak yapılan indirekt immünofloresan test sonuçları (Devamı) 34 Mustafa Kahraman 27 E PV çocuğu (-) (-) 35 Ayşe Kahraman 34 K PV çocuğu (-) (-) 36 M. Ali Arslantaş 65 E PV babası (-) (-) 37 İlhan Arslan 4 E PV çocuğu (-) (-) 38 Cemal Bektaş 53 E PNP kardeşi 20 (-) 39 Abdullah Sakak 32 E PV kardeşi Mehmet Kahraman 24 E PV çocuğu (-) (-) 41 Ümmühan Arslantaş 61 K PV annesi (-) (-) 42 Eren Aysalan 32 K PV çocuğu Handan Ertürk 34 K PV çocuğu (-) (-) 44 Ümmügülsüm Nü 68 K PV kardeşi 40 (-) 45 Ayla Orhan 40 K PV kardeşi (-) (-) 46 Hasan Büyük 56 E PV kardeşi (-) (-) 47 Başak Kalkanlı 14 K PV çocuğu (-) (-) 48 Kübra Turunç 13 K PV çocuğu (-) (-) 49 Remzi Eyidoğan 43 E PV kardeşi 20 (-) 50 Yusuf Kaya 48 E PV babası Yağmur Kalkanlı 16 K PV çocuğu (-) (-) 52 Fatma Büyük 20 K PV çocuğu Murat Çavdar 44 E PV kardeşi (-) (-) 54 Bahtiyar Kaya 40 K PV annesi Ayşe Eren 41 K PV kardeşi (-) (-) 56 Belgin Görgülü 55 K PV çocuğu (-) (-) 57 Kazım Erol 29 E PV kardeşi (-) (-) 58 Belgin Açıleter 37 K PV çocuğu (-) (-) 59 Abdullah Büyük 51 E PV kardeşi (-) (-) 60 İsmail Turunç 16 E PV çocuğu (-) (-) 61 Selma Özkızılbulut 34 K PV kardeşi (-) (-) 62 Ertuğrul Eyidoğan 48 E PV kardeşi (-) (-) 63 Kemal Erol 26 E PV çocuğu Hüseyin Eren 43 E PV kardeşi (-) (-) 65 Aylin Eraslan 38 K PV kardeşi (-) (-) 66 Suzan Kaygısız 33 K PV kardeşi (-) (-) 67 Ziya Sakak 35 E PV çocuğu 20 (-) 68 Mustafa Büyük 32 E PV kardeşi (-) (-) Kontrol grubu ise 26 sı kadın 14 ü erkek olmak üzere toplam 40 sağlıklı bireyden oluşturuldu. (Tablo 6). Kontrol grubunun yaş ortalaması 28.20±5.16 olarak tespit edildi. 24

33 Tablo 6. Kontrol grubunun sıçan ve maymun özefagusu substratları kullanılarak yapılan indirekt immünofloresan test sonuçları Kontrol Grubu Yaş Cins Sıçan özefagus Maymun özefagusu 1 Melike Akan 18 K (-) (-) 2 Gülruh Tahmiscioğlu 30 K 10 (-) 3 İrfan Uzun 28 E (-) (-) 4 Talip Kaya 26 E (-) (-) 5 Ertuğrul Yalım 29 E (-) (-) 6 Kadir Aydın 18 E (-) (-) 7 Merve Şimşek 22 K (-) (-) 8 Hüsne Yaltı 26 K (-) (-) 9 Mümine Gökçe 27 K (-) (-) 10 Ercüment Polat 29 E (-) (-) 11 Ayşe Kaya 22 K (-) (-) 12 Ahu Özbilen 28 K (-) Habbaş Fırıncı 31 E (-) (-) 14 Ahmet Uçar 24 E 10 (-) 15 Selma Uçar 37 K 10 (-) 16 Selçuk İlarslan 25 E 10 (-) 17 Ayşe Yaltı 28 K (-) (-) 18 Gökçen Gökçe 25 K (-) (-) 19 Fadime Doğruer 22 K (-) (-) 20 Figen Dermirkıran 36 K (-) (-) 21 Orkide Şenur 30 K (-) Mutlu Uzel 27 K (-) (-) 23 Hakan Ferüç 35 E (-) (-) 24 Osman Sarıkalı 40 E (-) (-) 25 Gülden Erdoğan 22 K (-) (-) 26 Dilek Akile 28 K (-) Sevgi Ferda 34 K 20 (-) 28 Adalet Sağlam 32 K 10 (-) 29 Birsen Çetgin 38 K (-) (-) 30 Nuray Kalkadelen 37 K (-) (-) 31 Iraz Tufan 25 E (-) (-) 32 Emine Üstüay 28 K (-) (-) 33 Ebru Yelti 28 K (-) (-) 34 Gürkan Çilek 30 E (-) (-) 35 Mustafa Demir 23 E (-) (-) 36 Gizem Yaltı 22 K (-) (-) 37 Nurhan Dimli 30 K (-) (-) 38 Murat Durdu 30 E (-) (-) 39 Melda Akyılmaz 28 K 20 (-) 40 Suhan Günaştı 31 K (-) (-) 25

34 Çalışma grubundaki hasta akrabalarına ait 68 serumda sıçan ve maymun özefagusu substratları ile İİF çalışıldı. Sıçan özefagusu substratı ile İİF testleri pozitif saptanan 19 hasta akrabasına ve daha önce ELİSA yapılarak spesifik antikorlar saptanmış hastaların 13 akrabasına yani toplam 32 hasta akrabasına ait serumlarda ELİSA yöntemiyle anti-dsg1 ve anti-dsg3 otoantikorları çalışıldı. ELİSA yapılan 19 hasta akrabasının sadece birinde Dsg3 e karşı otoantikor saptandı (Tablo 7). Tablo 7. Hasta akrabalarının ELİSA sonuçları. İndeks değerleri Dsg1 Dsg3 1 Bahtiyar Kaya Ayhan Korkmaz Remzi Eyidoğan Yusuf Kaya Fatma Büyük Cemal Bektaş Doğa Sönmez Dudu Yüzgeç Ali Karaöz Şule Ateş Kemal Erol Müslüm Kaygısız Abdullah Sakak Bedia Keskin Ümmügülsüm Nü Tacim Güler Eren Aysalan Şerife Yılmaz Medine Kırmızı Ümmühan Arslantaş Hande Ünal Mehmet Ali Arslantaş Serdar Şanlı Mehmet Şanlı Ayşe Akın Hasibe Aköz Aylin Eraslan Belgin Görgülü İlkay Şanlı Ziya Sakak Furkan Tahta İbrahim Şanlı

35 Sıçan özefagusu substratları ile İİF testleri pozitif saptanan ve kendilerine ulaşılıp bilgilendirildikten sonra onam veren 13 hasta akrabasının gövde derisinden alınan insizyonel biyopsi materyallerinde DİF incelemeler yapıldı. Substrat olarak sıçan özefagusu kullandığımızda 19 hasta akrabasında (9 kadın, 10 erkek) 1/80 e kadar yüksek titreler elde edildi (Tablo 8, Şekil 15). Pozitiflik akrabalarda daha sık olmasına karşın (akraba=%28 kontrol=%17.5) uygulanan Fisher exact testte aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0.05). Tablo 8. Akraba grubu ile kontrol grubunun sıçan özefagusu substratında elde edilen titrasyonların karşılaştırılması Titrasyon Akraba (n=68) Kontrol (n=40) 0 49(%72) 33(%82.5) 10 5(%7.3) 5(%12.5) 20 9(%13.2) 2(%5) 40 3(%4.4) (%2.9) 0 Toplam 19(%28) 7(%17.5) 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Akraba 72% 7% 13% 4% 3% Kontrol 83% 13% 5% 0 0 Şekil 15. Akraba grubu ile kontrol grubunun sıçan özefagusu substratında elde edilen titrasyonlarının karşılaştırılması 27

36 Substrat olarak maymun özefagusu kullandığımızda 1/10 dan yüksek titreler elde edilemedi (Tablo 9, Şekil 16). Maymun özefagusunda pozitiflik açısından akraba ve kontroller hemen hemen birbirine eşitti (akraba =%10.3 kontrol=%7.5) Tablo 9. Akraba grubu ile kontrol grubunun maymun özefagusu substratında elde edilen titrasyonlarının karşılaştırılması Titrasyon Akraba Kontrol 0 61(%89.7) 37(%92.5) 10 7(%10.3) 3(%7.5) Akraba 61 7 Kontrol 37 3 Şekil 16. Akraba ve kontrol grubunun maymun özefagusu substratında elde edilen titrasyonların karşılaştırılması 1/20 ve üzeri titreler akrabalarda kontrollere göre çok daha sık rastlandı (Tablo 10, Şekil 17). Aradaki farkı saptamak için fisher exact test uygulandı. Sonuç istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0.05). Tablo 10. Akraba ve kontrol grubunun sıçan özefagusu substratında elde edilen 1/10 ve üzeri titrasyonlarının karşılaştırılması 10 >10 Akraba 54 (%79) 14 (%21) Kontrol 38 (%95) 2 (%5) 28