TÜBİTAK BİDEB LİSE ÖĞRETMENLERİ-FİZİK, KİMYA, BİYOLOJİ, MATEMATİK- PROJE DANIŞMANLIĞI EĞİTİMİ ÇALIŞTAYI (LİSE-4 [ÇALIŞTAY 2014]) BİYOLOJİ PROJE RAPORU

Transkript

1 TÜBİTAK BİDEB LİSE ÖĞRETMENLERİ-FİZİK, KİMYA, BİYOLOJİ, MATEMATİK- PROJE DANIŞMANLIĞI EĞİTİMİ ÇALIŞTAYI (LİSE-4 [ÇALIŞTAY 2014]) BİYOLOJİ PROJE RAPORU GRUP ADI YAŞAM İKSİRİ PROJE ADI Ev Yapımı Kefir ve Endüstriyel Kefirin Escherichia coli ile Staphylococcus aureus Bakterilerine Etkisinin Karşılaştırılması PROJE EKİBİ KÜBRA KESKİN NİHAL KUZU PROJE DANIŞMANLARI DOÇ.DR. MURAT TOSUNOĞLU PROF.DR. GÜVEN ÖZDEMİR TEKNİSYEN NURSEL HASANOĞLU ÇANAKKALE 25 OCAK 2 ŞUBAT 2014

2 PROJE ADI: Ev Yapımı Kefir ve Endüstriyel Kefirin Escherichia coli ile Staphylococcus aureus Bakterilerine Etkisinin Karşılaştırılması. PROJENİN AMACI: Projemizin amacı; endüstriyel olarak üretilen Kefir ile ev yapımı Kefirin patojen E. coli ve Staphylococcus aureus bakterilerine karşı mikro dilusyon ve disk difüzyon yöntemleri ile etkinliğinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. 1. GİRİŞ: Kefir tanelerinin süte ilave edilmesiyle elde edilen kefir, asidik ve alkolik fermantasyonların bir arada oluştuğu ve geçmişi olan kültüre edilmiş bir süt ürünüdür (1-3). Wiese (1986), kefir kelimesinin Türkçe "keyif veren, sarhoş eden, coşturan, mest eden", "kef" sözcüğünden türediğini bildirmiştir. Klupsch (1984) ise, bu kelimenin Kafkasya orijinli "en iyi yapıldı" anlamına gelen "keyf" sözcüğünden türediğini bildirmiştir (5). Kefirin önceleri Güneybatı Asya' da Türkler tarafından yapıldığı, alkol ve asit fermantasyonlarıyla meydana gelen hafif alkollü, ekşi ve köpüklü bir süt içkisi olduğu bilinmektedir. Ayrıca Kafkasya' da "Kyppe" adı verilen, yağlı veya yağsız sütlerden (inek, koyun, keçi, kısrak), peynir altı sularından yapıldığından söz edilmektedir. Kefirin bileşiminde, %0,5-1,5 etil alkol, yaklaşık %0,7 kadar süt asiti ve %3,2 yağ olduğu tespit edilmiştir (7-9). Kefir taneleri beyaz-sarımtırak renkte, çapı 1-2 mm' den 3-6 mm' ye kadar değişen, karnabahara benzer yapıda, bezelye veya fındık büyüklüğündedir. Şekilleri düzgün olmayan kefir taneleri, suda erimez. Süte katıldıkları zaman ise şişerler ve renkleri beyazlaşır (Şekil 1-6) (10-12). Şekil 1: Kefir mayası Şekil 2: Kefir mayalanması

3 Şekil 3: Ev yapımı kefir Şekil 4: Kefir mayası Şekil 5: Kefir mayası Şekil 6: Ticari kefir Duitschaever ve arkadaşları (1987), taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile kefir tanesinde yer alan mikroorganizmaları incelediklerinde, mikroorganizmalarda en zengin koloniyi oluşturan kısmın, dışa yakın kısmı olduğunu bildirmişlerdir. Bu kısımda başlıca bakteriler ve çok az sayıda mayalar bulunurken, tanenin merkezine yakın kısımlarda ise mayalar miktarca artarken bakterilerin azaldığını tespit etmişlerdir. Görünüm olarak kefir tanesinin ağ gibi ince-levhamsı bir yapı ile süngerimsi ve lifsi bir yapıya sahip olduğu, özellikle tanenin merkezindeki lif kütlesinin dallanma ve uzun bağlar gösterdiği belirtilmiştir. Tanenin merkezinde, mayalar ve bakterileri birlikte tutan ağın, mayalar tarafından üretildiği, tanenin kenar yapısının daha düz olmasının da mikroorganizmaların taneden süte geçişini kolaylaştırdığı ileri sürülmüştür (14). Kefir tanelerinin laktozu fermente eden ve etmeyen mayalar ile homofermentatif ve heterofermentatif laktik asit bakterileri ve asetik asit bakterilerinin farklı türlerini içeren kompleks bir mikrofloraya sahip olduğu tespit edilmiştir (15-19). Kefir tanesi içerisinde mikroorganizmaların simbiyoz halde yaşadığı belirtilmiştir (20,21).

4 Kefir tanesindeki mikroorganizma grupları aşağıdaki gibidir (21). Mezofil homofermentatif streptokoklar: Streptococcus lactis subsp. cremoris, S. durans. Laktobasiller: Lactobacillus brevis, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. kefir, L. casei. Lökonostoklar: Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum. Mayalar: Kluyveromyces marxianus subsp. marxianus, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces cerevisiae, Candida sp. Kefir içindeki dost bakteriler olan probiyotikler insan sağlığı için önemlidir. Kelime anlamı olarak probiyotik; Probiotika: Yunanca Yaşam için anlamına gelmektedir. Probiyotik Ölçütleri; Kullanımlarının güvenilir olması için insan kaynaklı olmalı Mide asitine ve safraya dayanıklı olmalı (Bağırsaklara canlı ulaşabilmesi için) Bağırsak epiteline tutunabilmeli (Koloni oluşturabilmeli) Antimikrobiyal maddeler ve bakteriosin yapmalı İmmün yanıtı ayarlayabilmeli Besinlerin fermente edilmeleri, daha uzun süre saklanabilmelerini sağlamaktadır. Besleyici özelliklerini artırmakta, sağlık için daha yararlı hale gelmesini sağlar. Yaygın ve ark.(1995), kefirde oluşan asetik asit, H 2 O 2 (Hidrojen Peroksit) gibi antibakteriyal maddeler ile antibiyotiklerin E. coli ve Staphylococcus gibi patojen bakterilere antibakteriyal etki yaptığını, ayrıca asetik asit bakterilerinin bağırsaktaki bakterilere karşı antibakteriyal etki gösterdiğini ve bu nedenlerle kefirin bazı rahatsızlıkları iyileştirdiğini bildirmiştir. Bu nedenle endüstriyel olarak üretilen Kefir ile ev yapımı Kefirin patojen olan E. coli ve Staphylococcus aureus bakterilerine uygulanan disk difüzyon ve mikro dilusyon yöntemleri ile bakterilere karşı etkisi karşılaştırılacaktır. 2. MATERYAL VE YÖNTEM: 2.1. KULLANILAN MATERYALLER ml steril MHB (mueller-hinton broth) 2. 2,1 g MHB/100 ml 3. Mikroplate 4. 0,5 O.D lik = 10 8 bakteri (E. coli, S. aureus) 5. 3 tüp 10 ar ml steril su

5 6. 2 x 50 ml MHA 7. Steril disk 8 adet 8. Steril otomatik pipet ucu 9. Mikropipet ( µ l ve µl) 10. Petri kapları 11. Öze 2.2. YÖNTEM DİSK DİFÜZYON Çalışmada kefirin antimikrobiyal aktivitesi Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile araştırılmıştır. Kefir suyu 6 mm çaplı steril kağıt disklere emdirilmiştir ve diskler hazırlanmıştır. Çalışmada kullanılan bakteri suşlarından serum fizyolojik içerisinde bakteriler için 10 8 kob/ml süspansiyonlar hazırlanmıştır. Bu süspansiyonlar Mueller-Hinton Agar besiyerlerine steril eküvyonlar kullanılarak ekilip prediffüzyon sağlanması için bir süre beklenildikten sonra ekstre içeren diskler besiyerine yerleştirilmiştir (Şekil 7 a, b) C de 24 saatlik inkübasyondan sonra inhibisyon zon çapı oluşup oluşmadığı kontrol edilmiştir ve oluşan zon çapları ölçülerek kaydedilmiştir. Pozitif kontrol olarak da 10 mcg Ampicillin (Oxoid) diskleri ve 30 mcg Oxytetracyclin kullanılmıştır. (22).

6 A 10 : Ampicilin 10 mcg/disc O 30 : Oxytetracyclin 30 mcg/disc a

7 A 10 : Ampicilin 10 mcg/disc O 30 : Oxytetracyclin 30 mcg/disc b Şekil 7: a. Esherichia coli b. Staphylococcus aureus disk difüzyon testinin şematik görüntüsü MİKRO DİLUSYON (MİNİMAL İNHİBİTOR KONSANTRASYON)

8 Çalışmada, kefirin belirlenen suşlar üzerine minimal inhibisyon konsantrasyon (MIC) değerleri mikro dilusyon yöntemi ile belirlenmiştir. Kefirin 10 mg/ml lik konsantrasyonu steril tüpte hazırlanmıştır. Her bir kuyucuk hacmi 250 µl olup toplam 200 µl dolum yapılmıştır. Toplamda 96 kuyucuk bulunan mikro dilusyonda 84 kuyucuk kullanılmıştır. Steril mikroplaklara her bir kuyucuğa 95 µl Nutrienth broth (MHB) ve 5 µl mikroorganizma süspansiyonu (0,5 O.D.= 10 8 bakteri) konulmuştur. 10 mg/ml konsantrasyon içeren kefirden birinci kuyucuğa 100 µl eklenmiş olup 7. kuyucuğa kadar da 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 ve 1/64 seri seyreltmelerden 100 er µl aktarılmıştır (Çizelge 1) (Şekil 8). Plakların üstü kapatılarak 37 0 C de 24 saat süre ile inkübasyonu gerçekleştirilmiştir. Süre sonunda MIC değerlerine bakılmıştır (23). Şekil 8: Mikropipet ile örneklerin mikroplate e aktarılması Çizelge 1: Kullanılan Mikroplate deki seyreltmelerin yerleşiminin gösterimi.

9 3. BULGULAR Escherichia coli ye uygulanan deney bulguları; Ev yapımı kefir uygulanan zon çapı: 12 mm + 11 mm + 10 mm = 11 mm Ticari kefir uygulanan zon çapı: 7 mm + 6 mm + 6 mm = 6,3 mm A 10 uygulanan zon çapı: 20 mm O 30 uygulanan zon çapı: 20 mm Staphylococcus aureus e uygulanan deney bulguları; Ev yapımı kefir uygulanan zon çapı: 15 mm + 11 mm + 15 mm = 13,6 mm Ticari kefir uygulanan zon çapı: 6 mm + 6 mm + 6 mm = 6 mm A 10 uygulanan zon çapı: 30 mm O 30 uygulanan zon çapı: 20 mm 4. SONUÇ VE TARTIŞMA Şekil 9 ve 10 da görüldüğü üzere yapılan denemede mikroplatelerin kapağı olmadığı için cam kapak kullanılmış bu durum denemenin hassasiyetini düşürmüştür. Kontaminasyon riski öngörüsü deneme sırasında da varsayıldığı için disk difüzyon denemesine girilmiştir ve burada ev tipi kefir ile ticari kefir arasındaki antimikrobiyal etkinlik farkı ortaya konmuştur. Şekil 9: Mikroplate in üstten görünüşü. Şekil 10: Mikroplate in alttan görünüşü Disk difuzyon yöntemi ile MHA (Muller Hinton Agar ) ortamına ekim yapılan Escherichia coli ve Staphylococcus aureus bakterisine karşı kefir organizmalarının baskılama

10 görüntüleri Şekil 11 ve 12 de görülmektedir. Şekil 11 ve 12 de görüldüğü gibi ev yapımı kefirin içerisindeki mikroorganizmaların canlılığı ve stabilitesi devam ettiği görülmektedir ve kullanılan test mikroorganizmalara karşı baskılayıcı özellik gösterdiği kanıtlanmıştır. Marketlerden satın alınan ticari kefirin tüketimi ile evde mayalanan kefirin tüketimi arasında kıyaslamayı amaçladığımız bu projede uyguladığımız yöntemlerden biri olan Disk difüzyon yönteminde şu bulgulara varılmıştır. Ticari kefirin bağırsak florasında patojen bakterilere karşı herhangi bir baskınlık göstermediğine sadece gıda tüketiminde rol aldığının düşünülmesine yol açmıştır. Şekil 11: E. coli bakterisine karşı kefir mikroorganizmalarının ve standart antibiyotik disklerinin etkinliğinin gösterilmesi

11 Şekil 12: S. aureus bakterisine karşı kefir mikroorganizmalarının ve standart antibiyotik disklerinin etkinliğinin gösterilmesi Kefir tüketimi ile probiyotik alımı yapılmaktadır. Normal olarak probiyotikler bağırsak iç duvarına yerleşerek patojenlerin buraya tutunmasını engellemektedirler. Biyolojik değeri yüksek süt ve süt ürünleri tüketilip, probiyotik içeren besinlerden yararlanılması, bağışıklık sistemini güçlendirmektedir. Aksi durumda patojenler bağırsak iç cidarına yerleşeceklerdir ve bunun sonucunda çeşitli enterik hastalıklar oluşacaktır( Kolera, tifo, dizanteri vb ). Günlük tempo değiştikçe vücudumuzdaki probiyotiklerin de sayısı azalmaktadır. Bu da sindirim sistemini olumsuz yönde etkilemektedir. Oysa, azalan probiyotik miktarını dışarıdan alacağımız probiyotik besinlerle desteklemeniz mümkündür. Peki son zamanlarda moda haline gelen market raflarında gördüğünüz probiyotik içeren gıdalar ne kadar faydalıdır? TEŞEKKÜR Çalıştay koordinatörü Prof.Dr Mehmet AY a, danışmanlarımız Prof.Dr. Güven Özdemir ve Doç.Dr. Murat Tosunoğlu na, Temel Endüstriyel Mikrobiyoloji alanında araştırma görevlisi olan Dr. Nurcihan Hacıoğlu na, proje teknisyeni Nursel Hasanoğlu na, tüm çalıştay ekibine ve Çanakkale 18 Mart Üniversitesi ne çalışmamıza yaptıkları katkı ve desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. KAYNAKÇA

12 1. Merin, U. and Rosenthal, I., 1986, Production of kefir from UHT milk, Milchwissens., 41(7), Karagözlü, C., 1990, Farklı Isıl İşlem Uygulanmış İnek Sütlerinden Kefir Kültürü ve Tanesi ile Üretilen Kefirlerin Dayanıklılığı ve Nitelikleri Üzerine Araştırmalar, Yüksek Lisans Tezi, E. Ü. Fen Bil. Enst. Tarım Ürünleri Tekno., İzmir. 3. Kneifel, W. and Mayer, H.K., 1991, Vitamin profiles of kefirs made from milk of different species, Int. J. Food Scien,. and Technol., 26(4), Klupsch, H.J., 1984, Produktverbesserung am beispiel kefir, Deut-Mol-Zeit., 15, Wiese, W., 1986, Kefir, ein Sauermicherzeugnis im wiederstreit Zwieschen hersteller, Lebensmittelüberwachung und nerbraucher, Deut-Mol-Zeit, 9, Adam, R.C., 1971, Süt III, E. Ü. Ziraat Fak. Yayınları, No: 170, 43-50, Bornova- İzmir. 7. Ergüllü, E. ve Üçüncü, M., 1983, Kefir mikroflorası üzerine bir araştırma, Gıda, 8(1), Krukowski, K. and Rusiecki, M., 1963, Influence of some factors involved in the culture of grains on the organoleptic and chemical properties of kefir, Przegl. Mlecz., 11(10), 0-11, Alınmıştır, D.S.A., 1965, 27(5), Niketic, G. and Vukenovic, D., 1975 Technology of kefir manufacture in Tetra Pak cotainers, Mijekarstvo, 25(5), Kwak, H.S., Park, S.K. and Kım, D.S., 1996, Biostabilization of kefir with a nonlactose-fermenting yeast, J. Dairy Scien., 79(6), Koçak, C. ve Gürsel, A., 1981, Kefir, Gıda, 6(4), Yokoi, H., Watanabe, T. and Fujii, Y., 1990, Isolated and characterization of polysaccharide-producing bacteria from kefir grains, J. Diry Scien., 73(7), Duitschaever, C.L., Kemp, N. and Emmons, D., 1987, Pure culture formulation and procedure for the production of kefir, Milchwissens., 42(2), Konar, A. ve Şahan, N., 1989, İnek, keçi ve koyun sütlerinden üretilen kefirlerin özellikleri ve bu özelliklere olgunlaştırma süresinin etkisi üzerine bir araştırma, Bursa I. Uluslararası Gıda Sempozyumu, Marshall, V.M., Cole, W.N. and Brooker, B.E., 1984, Observations on the structure of kefir grains and the distribution of the microflora, J. Appl. Bacteriol., 57(3),

13 16. Toba, T., Arihara, K. and Adachi, S., 1987, Comparative study of polysaccharides from kefir grains, an encaosuled homofermentative Lactobacillus species and Lactobacillus kefir, Milchwissens., 42(9), Pidoux, M., Brilloet, J.M. and Quemener, B., 1988, Characterization of the polysaccharides from a Lactobacillus brevis and from sugary kefir grains, Biotech. Letter., 10(6), Clementi, F., Gobetti, M. and Rossi, J., 1989, Carbon dioxide synthesis by immobilized yeast cells in kefir production, Milchwissens., 44(2), Piodux, M., Marshall, V.M., Zanoni, P. and Brooker, B., 1990, Lactobacilli isolated from sugary kefir grains capable of polysaccharide production and minicell formation, J. Appl. Bacteriol., 69, Leroi, F. and Pidoux, M., 1993, Characterization of interactions between Lactobacillus hilgardii and Saccharomyces florentinus isolated from sugary kefir grains, J. Appl. Bacteriol., 74, Yaygın, H., 1995, Yoğurt, III. Süt ve Süt Ürünleri Sempozyumu 2-3 Haziran İstanbul, Milli Prodüktivite Merkezi Yayınları, No: Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolke R.H:Manual of Clinical Microbiology vol 6 ASM Washington DC Zgoda J.R., Porter J.R : A convinent microdilution method for screening natural products againts bacteria and fungi: Pharm Biol 2001; 39 (3): GRUP ÜYELERİNİN ÖZGEÇMİŞLERİ Nihal KUZU (TED ANTALYA KOLEJİ ÖZEL LİSESİ) 1981 de Antalya da doğdu de Namık Kemal İlköğretim Okulu nu bitirdi da Atatürk Ortaokulunu bitirdi, 1999 da Aldemir Atilla Konuk Süper Lisesi nden mezun oldu de Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü nden mezun oldu den 2011 e kadar Antalya Başarı Dersanesi nde Biyoloji Öğretmeni olarak çalıştı. Bu süre zarfında yılları arasında Akdeniz Üniversitesi nde Tezsiz Yüksek Lisans ile formasyon eğitimini tamamladı den günümüze kadar da TED Antalya Koleji Biyoloji Öğretmeni olarak görev yapmaktadır yılı sömestr döneminde TÜBİTAK Biyoloji olimpiyatları 1. kademe eğitimini tamamlamıştır.

14 Kübra KESKİN (TED ESKİŞEHİR KOLEJİ ÖZEL ANADOLU LİSESİ) 1986 yılında İzmir de doğdu yılında Mithatpaşa İlköğretim Okulundan, 2000 yılında Aliağa İlköğretim Okulundan, 2004 yılında Aliağa Alp Oğuz Anadolu Lisesinden, 2008 yılında Muğla Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümünden mezun oldu yılları arasında Aliağa Uğur Dershanesinde, yılları arasında Muğla Final Dergisi Dershanesinde görev yaptı. Final Dershanesinde görev yaparken Muğla Üniversitesi Ortaöğretim Fen ve Matematik Alanlar Eğitiminde Tezsiz Yüksek Lisans Öğrenimini tamamladı yılında TED Eskişehir Koleji Özel Anadolu Lisesinde Biyoloji Öğretmeni olarak başladığı görevine halen devam etmektedir.