Uzm. Bio. Gamze Çağatay ATLAS BİYOTEKNOLOJİ

Transkript

1 Uzm. Bio. Gamze Çağatay ATLAS BİYOTEKNOLOJİ

2 APOPTOZ Apoptoz, kısaca programlı hücre ölümü (Hücresel oto yıkımın fizyolojik sürecidir) Apoptoz terimi: ilk kez 1972 yılında, KERR ve ark. APO= ayrı PTOSİS=düşen Apoptozun ilk biyokimyasal kanıtı, 1987 yılında Duke ve ark. tarafından bulunmuştur. Glukokortikoidlere maruz kalan timüs hücreleri üzerinde yapılan deneysel bir çalışma ile gösterilmistir. (DNA nın inter nükleozomal bölgelerinden kırılması ve bu bölgelerin Agaroz Jel Elektroforezinde merdiven görüntüsü oluşturması)

3 Apoptoz Nedir? Apoptoz; inflamasyon olmaksızın hücrelerin kendi kendilerini yok ettikleri, genlerle düzenlenen, programlı, RNA, protein sentezi ve enerjiye gereksinim duyan, organizmada homeostazı koruyan bir olaydır.

4 Apoptoz yaşamın ayrılmaz bir parçası olup, hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda gerçekleşebilmektedir. Her saniye yaklaşık bir milyon hücre, Apoptoz ile uzaklaştırılmakta ve bunların yerine yenileri yapılmaktadır.

5 Yapım (Mitoz) ile yıkım (Apoptoz) arasında kontrollü bir denge vardır. Söz konusu olan bu dengenin Apoptoz lehine veya aleyhine bozulması bir çok önemli hastalığın patogenezine katkıda bulunur.

6 Hücre Neden apoptozu seçer? FİZYOLOJİK Embriyonun Gelişimi Doku Modellenmesi İmmun Hücre Seleksiyonu PATOLOJİK DNA hasarı İskemi, Enfarkt Viral enfeksiyonlar Otoimmünite Kemoterapi Nörodejenerasyon Karaciğer hasarı Otoimmun has.

7 Hücre apoptoza nasıl karar verir? 1-Pozitif uyaranların kesilmesi ile, Büyüme faktörlerinin yokluğunda 2-Negatif uyaranların alınması ile Hücre yüzey reseptörlerin ebağlanan moleküller TNF Limfotoksin Fasligandı(FasL) DNA hasarına neden olan faktörler UV x-ışınları kemoterapi ajanları Serbest radikaller

8 APOPTOZUN GENEL ÖZELLİKLERİ Ölüm reseptörlerinin aktivasyonu Bcl-2 ailesi üyelerinin dimerizasyonu Sitokrom c nin serbestleşmesi Kaspazların aktivasyonu Dnaz aktivasyonu

9

10 Apoptoza uğrayan hücrelerde karakteristik morfolojik değişimler gözlenir; Plazma membran tomurcuklanması, Hücre gövdesi büzülmesi, Membrana bağlı apoptotik cisimlerin oluşumu gibi morfolojik değişimler sonucu komşu sağlıklı hücreler tarafından hızlıca yutulurlar(fagositoz). Böylece apoptoz esnasında intraselüler içerik serbestleşmesi ve muhtemelen zararlı inflamatuar yanıtlar önlenir.

11

12 Apoptoz süreci Apoptoz sürecinde belli başlı 3 anahtar bileşen vardır bunlar; Bcl-2 ailesi proteinleri Kaspazlar Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) proteinidir.

13 Apoptoz mekanizmasi

14 Hastalıklar ve apoptoz Apoptozun artmasıyla; Nörodejeneratif bozukluklar (Alzheimer gibi) Hematolojik Bozukluklar (Aplastik anemi vb) Otoimmun Bozukluklar (insüline bağlı diyabet) İskemik yaralanma (miyokardial enfarktüs) Toksinlere Bağlı Hastalıklar (alkole bağlı hepatit) Bakteriyal ve viral enfeksiyonlar (AIDS)

15 Apoptozun belirlenmesinde kullanılan yöntemler 1. Morfolojik görüntüleme yöntemleri, 2. İmmuno histokimyasal yöntemler, 3. Biyokimyasal yöntemler, 4. İmmunolojikyöntemler, 5. Molekülerbiyolojiyöntemleri.

16 Apoptozun saptanmasında kullanılan yöntemler Morfolojik Görüntüleme Yöntemleri Işık Mikroskopu ile Floresan Mikroskobu ya da Lazerli Konfokal Mikroskop ile Faz kontrast mikroskopu ile

17 Morfolojik Görüntüleme Yöntemleri Giemsa ve hematoksilen kullanılarak boyama yapılır Hematoksilen boyası kromatini boyadığından apoptotik hücreler nukleus Morfolojisine göre değerlendirilir.

18 Morfolojik Görüntüleme Hoechst boyası, Yöntemleri DAPI 4,6-diamidine-2 -phenylindole, Propidium iyodür, Akridin orange, Etidyum bromür, FITC fluoresce inisothiocyanate gibi floresan maddelerin kullanılmasıyla yapılan bir boyama şeklidir

19 Morfolojik Görüntüleme Yöntemleri Hücre kültürü çalışmalarında,canlı hücre ile yaşayan hücrenin ayırımına olanak tanırlar. Canlı ve ölü hücre ayrımını yapabilmek için, canlı veya ölü tüm hücreleri boyayabilen bir boya(örn.hoechstboyası)ile sadece ölü hücreleri boyayabilen bir başka boya (örn.propidiumiyodür)beraber kullanılır.

20 Immunohistokimyasal yontemler Annexin V yöntemi TUNEL yöntemi M-30 yöntemi Kaspaz 3 yöntemi

21 Immunohistokimyasal yöntemler Anneksin V Yöntemi: Normal hücrelerde hücre zarının sitoplazmik yüzünde bulunan fosfatidilserin (PS), Hücre apoptoza gittiğinde hücre zarının dış yüzüne transloke olurlar. Dış yüze transloke olan PS ler, floresan bir madde (örn. FITC) ile işaretlenmiş Anneksin V kullanılarak görünür hale getirilirler.

22 TUNEL (TdT-dUTP nick-end-labelling) DNA kırıklarının in situ olarak tanınmasını sağlar. Parafin bloklar, donmuş kesitler, kültürü yapılmış solüsyon halinde veya platelere ekilmiş ya da lameller üzerinde büyütülmüş hücrelerde apoptoz varlığı saptamakta kullanılır. Kırılan DNA parçalarnın 3 OH uçları, Terminal deoksi-nükleotidil transferaz (Tdt) enzimi kullanılarak, digoksigenin işaretli dutp ile işaretlenir. İşlem sonunda işaretlenmiş apoptotik hücreler diaminobenzidine (DAB) kromogeni ile boyanır mikroskopta görünür hale getirilir. Bu nedenle yönteme in situ DNA uç işaretleme yöntemi adı verilmiştir

23

24 TUNEL BOYAMA YÖNTEMİ ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit Peroksidase kiti (S7101-KIT), Millipore Parafini giderme ve suya indirme (Amaç: Doku içindeki Toluolu (Xylene) uzaklaştırmak ve doku içine yavaşça su verip boya girişine hazırlamak) 3x5 dk. Toluol 2x5 dk. Absolut alkol 3 dk. %95 alkol 3 dk. %70 alkol Kesitler 5 dk. PBS ile çalkalandı.

25 TUNEL BOYAMA YÖNTEMİ ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit Peroksidase kiti (S7101-KIT) Proteinlerin sindirilmesi (3 -OH uçlara ulaşmak için hücre zarlarında porlar açılır) 15 dk Kesitler Proteinaz K (20µg/ml) ile oda ısısında inkübe edildi. *(stok içinden 50 μl Proteinase K al, 50 ml PBS e tamamla) 2x2 dk. distile su ile çalkalanır. Endojen Peroksidazın bloke edilmesi 5 dk Kesitler endojen peroksidazın maskelenmesi için PBS ile hazırlanmış %3 H 2 O 2 ile Oda ısısında muamele edilir. (3 ml H 2 O 2 / 27 ml PBS= 30 ml) 2x5 dk PBS ile çalkalandı. Dengeleme Buffer in kullanımı Lamların etrafı dikkatlice kurulanır, kesitlerin üzerine 75µl 1xDengeleyici Buffer konulup, plastik lameller ile kapatılır. 30 dk. oda ısısında inkübe edilir.

26 TUNEL BOYAMA YÖNTEMİ ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit Peroksidase kiti (S7101-KIT) Tdt Enziminin uygulanması (Tek yada çift iplikli DNA nın 3 -OH uçlarına NTP ların eklenmesini katalizler) Plastik lameller kaldırılıp etrafı kurulanır ve her lam üzerine 55µl Tdt Enzimi konulur ve plastik lameller ile kapatılır. Nemli ortamda 37 C etüvde 1 saat inkübe edilir. *Negatif kontrol olarak kullanılan kesitin üzerine Tdt Enzimi yerine distile su damlat. Tdt nin hazırlanışı (Kullanmadan önce hazırlanmalı) 77 μl Reaksiyon Buffer 33 μl Tdt Enzimi μl Durdurma/Yıkama Plastik lameller kaldırılıp kesitler Durdurma/Yıkama Buffer ı ile oda ısısında 10 dk. Yıkanır. *Bu aşamada kesitler %70 alkol içinde 3 gün -20 de saklanabilir. Tekrar işleme başlamadan önce kesitler 5dkX3 kez PBS ile yıkanmalı. STOP/WASH Buffer 1 ml Wash Buffer 34 ml Distile Su + 35 ml

27 TUNEL BOYAMA YÖNTEMİ ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit Peroksidase kiti (S7101-KIT) Anti-Digoksigenin-Peroksidaz kullanımı PBS ile 3x5 dk. yıkanır. Her lam üzerine 65µl. Anti-Digoksigenin-Peroksidaz ile oda ısısında 30 dk. muamele edilip, üzerlerine plastik lameller tekrar kapatılır. PBS ile yıkama Plastik lameller kaldırılır ve kesitler PBS ile 3x5 dk. Yıkanır. Renk reaksiyonu Kesitlerin çevresi kurulandıktan sonra her kesit üzerine 75µl. DAB (diaminobenzidine) substrat solusyonu damlatılır. 3-6 dk. arasında pozitif renk reaksiyonu mikroskop altında tespit edilir. DAB SUBSTRATI 147 μl DAB Dilüsyon Buffer 3 μl DAB Substtratı μl

28 TUNEL BOYAMA YÖNTEMİ ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit Peroksidase kiti (S7101-KIT) Örnekleri yıkama Renk reaksiyonunun oluşmasından hemen ardından kesitler distile su ile 3x1 dk. yıkanır. Kesitler distile su ile 5 dk. tekrar yıkanır. Zıt boyama %0.5 lik MetilGreen kesitlerin üzerine damlatılıp 1 dk. (20 sn) beklenir. Distile su ile 30 sn. çalkalanır. Boya giderimi 2x10 sn. %100 Alkol ile yıkanır, ardından 30 sn. %95 Alkol ile çalkalanır. Kapatma Kesitler en fazla 30 sn. Toluolde tutulur. Daha sonra Entellan/Mounting Medium kullanılarak lamelle daimi preparat haline getirilir.

29 TUNEL BOYAMA YÖNTEMİ ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit Peroksidase kiti (S7101-KIT) Boyama Özgüllüğü Kontrolleri: 1. Pozitif kontrol olarak, 5 mg/kg dozunda Deksametazon uygulanmış erişkin sıçana ait timus dokusu ve kit içinden çıkan doku kesiti kullanılır. 2. Negatif kontrol olarak kullanılan kesitin üzerine Tdt Enziminin uygulandığı aşamada Tdt Enzimi yerine distile su damlatılır.

30

31 Immunohistokimyasal yöntemler M30 Yöntemi: Sitokeratin 18 in kaspazların etkisiyle kırılması sonucu ortaya çıkan antijenik bölgenin Immunohistokimyasal yöntemle boyanması yöntemidir. Sadece Cytokeratin 18 i eksprese eden dokularda kullanılması mümkündür. Kaspaz-3 Yöntemi: Sadece apoptotik hücrelerde oluşan aktif kaspaz-3 İHC metoduyla belirlenebilir. Bunun için, dokunun kaspaz-3 eksprese ettiğinin bilinmesi ya da çalışılan dokuda apoptoza yol açan ajanın kaspaz- 3 ü kırıp kırmadığının bilinmesi gerekir. Ancak bu bilgiler ışığında caspase-3 yöntemi ile apoptotik hücreler tespit edilebilir.

32 Biyokimyasal yöntemler Agaroz Jel Elektroforezi: DNA kırıklarının gösterilebildiği bir başka yöntemdir. Apoptozda DNA, 180 baz çifti ve bunun katlarına karşılık gelen noktalardan kırıldığı için merdiven görüntüsü ladder pattern oluşur. Bu bulgu apoptozun karakteristik özelliğidir ve nekrozda görülmez. Western Blotting: Apoptoza özgü bazı proteinlerin eksprese olup olmadıklarının (örn. bcl-2) ya da kırılıp kırılmadıklarının (örn. kaspaz-3) saptanması mümkündür. Flow Sitometri: Floresan bir madde ile işaretlenmiş antikor kullanılarak apoptozda eksprese olduğu bilinen herhangi bir hücre yüzey proteininin saptanması mümkündür. Böylece apoptotik hücreler belirlenebilir. Floresan bir madde olan propidium iyodür kullanılarak, Anneksin V kullanılarak.

33 İmmunolojik yöntemler ELISA: DNA fragmentasyonunu tespit etmek ve aynı şekilde M30 düzeylerinin ölçümü de mümkündür. Fluorimetrik Yöntem: Ortamdaki kaspaz aktivitesiyle orantılı olarak ortaya çıkan floresans şiddeti fluorimetre ile ölçülerek kaspaz aktivitesi saptanır.

34 Moleküler biyoloji yöntemleri DNA Microarrays: Gen ekspresyon derecelerinin (mrna) araştırılması esastır. Comet Yöntemi: Tek bir hücredeki DNA hasarını göstermeye yönelik kullanılan bir mikro elektroforez yöntemidir. DNA hasarlarının daha kolay, daha kısa sürede ve in vitro olarak incelenmesine olanak sağlayan bir yöntemdir. Küçük fragmentlere ayrılmış DNA elektrik alana maruz bırakılır. Küçük parçalar, elektrik alanda daha hızlı hareket etmeleri nedeni ile hücre çekirdeği etrafında kuyruklu yıldız görünümü oluştururlar ve fluoresan bir boya ile görünür hale getirilir.

35 Apoptoza müdahale edilerek geliştirilen tedavi örnekleri

36 TEŞEKKÜRLER..