KULLANICI EL KİTABI. AMPLIQUALITY HPV-TİP Kod 03-29A

Transkript

1 KULLANICI EL KİTABI AMPLIQUALITY HPV-TİP Kod 03-29A Allele-özgü reverse hibridizasyon yöntemi ile Human Papillomavirus tarama ve genotipleme kiti (reverse line blot)

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ 1.1 KULLANIM AMACI 2. KİT İÇERİĞİ 4 3. REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ 4. KULLANIM ÖNLEMLERİ 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel güvenlik kuralları 5.2. Kit hakkında güvenlik kuralları 6. GEREKLİ OLAN, KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN MALZEMELER 6.1. Reaktifler 6.2. Cihazlar 6.3. Materyaller 7. GİRİŞ 8. TEST PRENSİBİ 9. ÜRÜN TANIMLAMASI 10. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, İŞLENMESİ VE ÖN-HAZIRLIKLARI Sitolojik örnekler Sitolojik örneklerin ön-hazırlığı Histolojik örnek Taze veya dondurulmuş histolojik örneğin ön-hazırlığı Formalin ile fikse edilmiş veya parafine gömülmüş histolojik örneklerin önhazırlığı 11. PROTOKOL DNA ayrıştırılması DNA çoğaltılması TST gen çoğaltılması HPV DNA 'nın direkt çoğaltılması (1.amplifikasyon) HPV DNA nın nested çoğaltılması (2. amplifikasyon) 1

4 11.3. Reverse hybridization yöntemi ile genotipleme İlk yapılacaklar Denatürasyon ve Hibridizasyon Stringent Wash Boyama protokolü 12. SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ 13. SORUN GİDERME 14. CİHAZ PERFORMANSI Analitik duyarlılık Analitik özgüllük Tanısal duyarlılık Tanısal özgüllük 15. CİHAZ SINIRLARI 16. REFERANSLAR 17. İLİŞKİLİ ÜRÜNLER 2

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ 1.1 Kullanım amacı HPV-TİP kiti bir IVD test olup allele-özgü reverse hibridizasyon (reverse line blot) yöntemi ile Human Papillomavirus ün taranması ve genotiplendirilmesi amacı ile kullanılır. Bu kullanıcı el kitabı ürünün kullanımı için gerekli talimatları içerir. HPV-TİP (kod 03-29A-20) Reverse line blot yöntemi ile çoğaltılmış ürünün görüntülenmesi için gerekli reaktifleri içerir. çoğaltılması ve Kod Ürün Paketleme 03-29A-20 HPV-TİP 20 test 3

6 2. KİT İÇERİĞİ P KUTUSU 30 / 20 C DE SAKLAYINIZ TANIMLAMA ETİKET TÜP (T) veya LID in RENGİ 20 test 5 test Tek doz premiks TST gen tüpü Mavi (T) 20 5 Tek doz premiks direkt HPV tüpü Renksiz (T) 20 5 Tek doz premiks nested HPV tüpü Yeşil (T) 20 5 Thermostable Taq DNA polymerase AB TAQ 5 U/μL Kırmızı 1 x 100 μl 20 μl KÜÇÜK TORBA 30 / 20 C DE SAKLAYINIZ TANIMLAMA ETİKET TÜP (T) veya LID in RENGİ 20 test 5 test Plazmid DNA içeren HPV 54 genom bölümü HPV 54 pozitif kontrol Mavi 1 x 30 μl 1 X 10 μl 4

7 R KUTUSU +2 / +8 C DE SAKLAYINIZ TANIMLAMA Özgül probları içeren naylon stripler Kullanıma hazır <2% NaOH içeren Denatürasyon Soüsyonu Kullanıma hazır Hibridizasyon solüsyonu Kullanıma hazır Stringent Yıkama Solüsyonu Konjugat Dilüenti Alkaline Phosphatase içeren Streptavidin Konjugat Kullanıma hazır Rinse solüsyonu Kullanıma hazır Ön-boyama Solüsyonu Substrat: NBT/BCIP suda eritmek üzere tabletlerde Kullanıma hazır < %0.5 Sitrik asid içeren Stop Solüsyonu Herbiri hibridizasyon ve boyama için olan 8 disposable inkübasyon kanalı içeren çalışma tepsisi Stripi okumak ve sonuçları değerlendirmek için transparan film ETKET TÜP (T) veya LID in RENGİ 20 test 5 test HPV STRIP 20 5 Denatürasyon Solüsyonu Xi: Irritant Hibridizasyon solüsyonu Stringent Yıkama Solüsyonu Konjugat Dilüent Beyaz 1 ml 1 X 1mL 1 x 25 ml 1 X 25 ml 1 x 25 ml 1 X 25 ml 1 x 25 ml 1 X 25 ml Konjugat Sarı 1 x 15 μl 1 x 15 μl Rinse Solüsyonu Ön yıkama solüsyonu 1 x 25 ml 1 X 25 ml 1 x 25 ml 1 X 25 ml NBT/BCIP Renkli şişe 7 tablet 1 tablet Stop Solüsyonu 1 x 25 ml 1 X 25 ml

8 3. REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ Kitin her bir komponenti özellikle aşağıdaki gibi olmak üzere her bir pakette gösterilen şekle uygun olarak saklanmalıdır: P kutusu Küçük torba R kutusu 30 C / 20 C de saklayınız 30 C / 20 C de saklayınız C de saklayınız Eğer önerilen ısıda saklanırlarsa, tüm test reaktifleri etiketleri üzerinde belirtilen son kullanma tarihlerine kadar stabildirler. 4. KULLANIM ÖNLEMLERİ Bu ürün sadece IN VITRO kullanım içindir; Kit, moleküler biyoloji tekniklerini tanı alanında uygulayan, eğitim almış yetkin araştırıcılar tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce eğitim el kitabını dikkatle ve tamamen okuyunuz; Ürünü sıcaktan koruyunuz; Kitin herhangi bir kısmını son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü veya yöntemin uygulanması ile ilgili herhangi bir şüphe olduğunda AB ANALITICA teknik servisi ile temas kurun: laboratorio@abanalitica.it Tüm prosedürler esnasında oda ısısı +15 C ve +28 C arasında; ortam nemi ise % 20 ile % 80 arasında olmalıdır. Isı ve nem bu sınırlar içerisinde olmadığında geçersiz sonuç alınabilir. Bu durumlarda test tekrarlanmalıdır; Her bir deneyde negatif ve pozitif kontrolün olması gerektiği unutulmamalıdır; 6

9 Yöntemden iyi bir performans sağlayabilmek için her bir aşamada reaktiflerin miktarının kesinlikle doğru dozda olması gereklidir.çoklu örneklerde total karışım miktarının doğru olduğundan emin olunuz; Nükleik asidler, çevrede ve teknisyenin cildinde bulunan nükleazlar tarafından kolaylıkla parçalanabilirler: bu nedenle daima laboratuvar önlüğü ve eldiveni kullanınız; Steril filtreli pipet ucu kullanınız; Farklı lot numaraları olan mikst veya reaktifleri kullanmayınız; Her bir komponenti iyice eritiniz; komponentler, 30 C / 20 C dan alındıktan sonar eritilmelidir, gerekli malzemeyi aldıktan sonra da gerekli ısıyı koruyarak reaktifin bozulmasından sakınmak için hızla geri koyunuz; bu komponentleri 1 saatten daha uzun sure C de tutmayınız; Farklı alanları organize ediniz: ekstraksiyon, amplifikasyon, ve saptama; cihazları ve sarf malzemelerini (pipetler, pipet uçları, tüpler, vb) paylaşmayınız ; Reaktifleri daha önceden ekstrakte edilmiş DNA örneklerinden uzak tutunuz; Reaktifleri mikrobiyal kontaminasyondan koruyunuz; Tüm çalışma yüzeylerini %5 sodyum hipoklorid ile yıkayınız; BCIP/NBT direct ışığa maruz kalmamalıdır, zira kolaylıkla parçalanabilir. 7

10 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel güvenlik kuralları Reaktifleri ve klinik örnekleri tutmak için tek kullanımlık eldivenler kullanınız ve çalışma sonunda ellerinizi yıkayınız; Ağzınızla pipetleme yapmayınız; Enfeksiyon etkeninin olmadığından emin olmamızı sağlayacak herhangi bir tanı yöntemi olmadığından, her bir klinik örneği potansiyel olarak enfeksiyöz kabul ederek öyle davranmak gerekmektedir; Klinik örneklere direct olarak değen tüm cihazlar kontamine olmuş olarak kabul edilmeli ve böyle atılmalıdırlar. Örneklerin kazaen saçılması durumunda, %10 sodyum hipoklorid ile yıkayınız. Materyaller özel taşıyıcı taşıyıcılar içerisnde atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller, ve kontamine ürünler aşağıdaki gibi dekontamine edildikten sonre atılmalıdırlar: VEYA 30 dakika sure ile ( her 10 hacim için 1 hacim) %5 sodyum hipoklorid solüsyonuna daldırma. 121 C de en az 2 saat otoklavlama (NOT: Sodyum hipoklorid içeren solüsyonları otoklavlamayın!!) 8

11 5.2. Kit hakkında güvenlik kuralları Bu üründen kaynaklanan riskler tek bir komponente bağlıdır. Tehlikeli komponentler: DENATÜRASYON SOLUSYONU: <%2 NaOH içerir. Risk tanımı: Şiddetli yanıklara neden olabilir RİSK İBARELERİ VE S İBARELERİ R 36/37/38 S 26 S S45 Göz, solunum sistemi, ve deri irrite edici; Göze değdiğinde, yoğun su ile hemen yıka ve bir hekime danış; uygun eldivenler kullan ve göz/yüz koruması uygula; Kaza durumunda hemen bir hekime danış ( eğer mümkünse etiketi göster). Kitin materyal güvenlik bilgi formu (MSDS) istendiğinde elde edilebilir. 9

12 6. GEREKLİ OLAN, KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN MALZEMELER 6.1. Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler; Steril DNase ve RNase içermeyen su; Distile su; Ksilol (parafine gömülü örnekler için); Steril PBS (sitolojik örnekler için) Cihazlar Laminar flow kabin (use is recommended while adding TAQ polymerase to the amplification premix to avoid contamination; it would be recommended to use another laminar flow cabinet to add the extracted DNA); Micropipetler ( µl; 2-20 µl; µl; µl); Thermalcycler; Mikrosantrifüj(maksimum 12,000-14,000 rpm); Otomatik pipetör ve steril ayarlanabilir pipetler; Hibridizasyon banyosunda sıvılar için aspirasyon sistemi; Orbital ajitatör Thermoshaker veya thermobath (Dubnoff) 42 C ± 0.5 C Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık steril filtreli pipet uçları ( µl; 2-20 µl; µl; µl); 1.5 ml Eppendorf-tipi tüpler; Reverse hibridizasyon basamaklarında solüsyonları hazırlamak için 50 ml Falcon-tipi tüpler. 10

13 7. GİRİŞ Human Papillomavirus infeksiyonu ile uterus boyun kanseri arasındaki ilişki uzun zamandan beri bilinmektedir. Günümüzde, yaklaşık yüz farklı HPV genotipi tanımlanmıştır. Bunlar arasında, 35 ten fazlası ano-genital traktusu enfekte eder (condyloma) ve yaklaşık 20 si genital karsinoma ile birliktedir. HPV sekanslarının varlığı skuamöz hücreli invaziv servikal karsinomaların %90 dan fazlasında, kondilomalarda ve intraepitelyal servikal karsinomaların çoğunda tanımlanmaktadır (Broker TR et al., 1986). Patolojik olarak (benign veya malign); en sık görülen HPV tipleri düşük, ara değer ve yüksek ( low, intermediate ve high) malign risk taşıyan HPV genotipleri olarak ayrılabilirler.bunlar içerisinde 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 69, 70, ve 74 düşük risk içerenler, genotip 16, 18, 31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, ve 68 ise yüksek risk içerenlerdir. Üç HPV genotipi de; 26, 53 ve 66 son zamanlarda olası yüksek risk içerenler arasında değerlendirilirler (Munoz et al., 1996). Avrupa da, HPV tip 16 ile olan servikal karsinomalar, vakaların %50 den fazlasını oluşturur, HPV tip 18 ile olan vakaların %10-15 i, HPV tip 31 ile olan vakaların 57-8 i, kalan %20 ise daha az görülen tiplerledir. HPV tip 6 ve 11 düşük riskli olarak tanımlanmıştır. Uterus boynu karsinomasının erken tanısı için temel yöntem daima PAP testidir, mutlaka ileri moleküler biyoloji testleri ile birlikte yapılarak sitolojik tanının özgüllük ve duyarlılığı artırılmalıdır,ayrıca HPV tiplendirmesine de olanak sağlar (Consensus Guidelines Bethesda 2001). Kalıcı ASCUS (Atypical Squamous Cell Undetermined Significance) lu hastalarda veya düşük grade li lezyonlarda,moleküler biyoloji testleri kullanılarak viral DNA varlığının gösterilmesi gereklidir. Bu kadınlarda, yüksek onkojen riskli viral alt-tipin varlığı veya yokluğunun gösterilebilme imkanı hastalığın olası ilerlemesi veya spontan remisyonundan hangisi olacağını öngörmemizi sağlar. Örneğin düşük veya yüksek onkojen risk grubundaki HPV suşlarının pozitifliğini ayırabilecek yüksek duyarlılıkta basit ve etkin bir tanısal testin kullanılması oldukça önemlidir. 11

14 8. TEST PRENSİBİ PCR yöntemi (Polymerase Chain Reaction) literatürde tanımlanmış ilk DNA çoğaltma yöntemidir (Saiki RK et al., 1985). DNA nın özgül bir parçasının (hedef sekans) bir termostabil DNA polimeraz ile in vitro çoğaltılması reaksiyonu olarak tanımlanır. Üç nükleik asid segmenti reaksiyonda yer alır: çift iplikçikli DNA (hedef DNA) çoğaltılabilir ve daha önceden dizayn edilmiş iki tek-iplikçikli oligonükleotid primer in hedef DNA ya özgül olarak bağlanmaları sağlanır. DNA polimeraz primerler tarafından işaretlenmiş bölgeden sentez işlemine başlar ve yeni çift iplikçikli DNA molekülü sentezlenir.bu yeni çift iplikçikli DNA molekülü original çift iplikçikli hedef DNA bölgesi ile aynıdır. Serbest solüsyon halinde tamamlayıcı nükleotidlerin (dntp) eklenmesi bağlanmayı kolaylaştırır. Pek çok siklustan sonra hedef sekansı temsil eden milyonlarca DNA molekülü elde edilir. Bu testin duyarlılığı laboratuvar tanıda uygulanabilirliği için özellikle uygundur. Çoğaltılan ürünün hibridizasyonunu takiben ( özgül probların bağlanması temelinde- Allele Specific hybridization/reverse Line Blot) farklı viral genotipler tanımlanabilir. Çoğaltılan ürünün işaretlenmesi için radyoaktif, digoxigenin veya biyotinillenmiş nükleotidler gibi pekçok yöntem vardır. Bu nükleotidler reaksiyon miksine eklenebilirler veya basit olarak primerlerde yer alırlar. The allele-özgü hibridizasyon tekniği solid fazda olan bir hibridizasyon tekniğidir ve hybridize edilmiş nükleik asidlerin görüntülenmesi için en uygun yöntemdir. (Meinkoth e Wahl, 1984). Nükleik asidlerin immobilizasyonu için piyasada pek çok filter tipi bulunabilir: nitrosellüloz, yüksek kapasitede çift iplikçikli DNA bağlayabilen (kovalent olmayan) (500 den daha uzun iplikçikli nükleotidler için80 µg cm -2 ) ancak alkali ve asidlerin varlığında frajildir; naylon, yüksek kapasitede tek ipliçikli DNA bağlayabilme kapasitesindedir (kovalent ve non-kovalent) (> 400 µg cm -2 ), ancak aynı zamanda çift iplikçikli DNA ve oligonükleotidleri de bağlayabilir; positife yüklü naylon, kuarterner amonyum grupları ile (pozitif yük) kovalent bağlanma avantajı vardır ve alkali ortamlarda denature DNA ile geri dönüşsüz olarak bağlanabilir. 12

15 Filtrede nükleik asid hibridizasyonunda şu aşamalar izlenebilir: 95 C de veya kimyasal denatürasyonda işaretli amplifikasyon ürününün denatürasyon u. Hibridizasyon: membrane, işaretli amplifikasyon ürününü içeren solüsyon ile özel koşullar altında çalkalanarak ve yeterli ph da inkübe edilir. Yıkamalar: işaretli ürünün fazlasının uzaklaştırılması için gereklidir, hibridizasyonun yeterince bağlanmasını sağlar. Oluşan hibrid formun saptanması. 9. ÜRÜN TANIMI Bu kitin tarama stratejisi viral genomun L1 bölgesinin amplifikasyonu, ve bunu takiben biyotinillenmiş polimerler ile bir nested amplifikasyonunu öngörür. L1 bölgesi HPV genomunda iyi korunmuştur. Çok sayıda farklı viral genotipin primerler aracılığı ile saptanmasını sağlar (Karlsen F. et al., 1996). Nested amplifikasyon ayrıca duyarlılığı ve taramanın etkinliğini artırır, ve özellikle formalin ile fikse edilmiş veya parafine gömülmüş örneklerde uygundur. Bu yöntem, sitolojik örneklerden (servikal swablar, oral hücreler) ve doku örneklerinden (taze, donmuş veya formalinle fikse edilmiş ya da parafine gömülmüş biyopsiler) ekstrakte edilmiş DNA ile kullanılabilir. Biyotinillenmiş amplifikasyon ürünü naylon striplerde allele-özgü inverse hibridizasyon ile genotiplendirilir. Kit, ayrıca TST (thiosulfate sulfurtransferase) geninin amplifikasyonu ile (biyotinillenmiş primer ile) çoğaltılan ekstrakte edilmiş DNA yı değerlendirebilir.tst gen amplifikasyonundaki negative bir sonuç ekstrakte edilmiş DNA da amplifikasyon reaksiyonu inhibitörlerinin varlığını veya DNA nın yüksek düzeyde yıkıldığını gösterir. Bu yöntem teknisyene yanlış negative sonuçları tanımlamaya yardımcı olur. Bunun için fazla zaman harcanmasına gerek yoktur, zira HPV nin ilk amplifikasyonunda görülebilir, amplifikasyon ürününün görülmesi ile viral genotiplendirme eş zamanlı olarak uygulanabilir. Amplifikasyon için pozitif kontrol ve HPV DNA 54 için tiplendirme kontrolü kit içerisinde hazır bulunmaktadır. Bu control teknisyen için tehlikeli değildir, zira plazmidik DNA sadece viral genomun bir parçası olarak bulunabilir. Pozitif kontrolün başarılı amplifikasyonu reaksiyonun doğru olduğunu garanti eder. 13

16 Kit, HPV nin direkt ve nested ve TST geninin de direkt amplifikasyonu için premiks formatta hazırlanmıştır: amplifikasyon için gerekli tüm reaktifler premiks olarak hazırlanmış ve tek kullanım amacı ile test tüplerine eşit miktarda adğıtılmışlardır, Taq polimeraz ve ekstrakte edilmiş DNA eklenecektir Bu şekilde pre-miks format sayesinde ön-çoğaltma işlemindeki manüplasyon basamakları azaltılmış olur, teknisyen için zaman tasarrufu sağlar, reaktiflerin dondurma/eritme işlemleri tekrarlanmaz (ürün performansı değişmez) ve tüm bunlar nedeniyle kontaminasyon riski ve yalancı pozitiflik önemli ölçüde azalır. Bu amaçla, amplifikasyon kontrollerinin devamlı kullanılması tavsiye edilir. Bu yöntem aşağıdaki değişik onkojenik riskli viral genotiplerin de tanımlanmasına yardımcı olur. Düşük onkojenik riskliler: HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 Yüksek onkojenik riskliler: HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82. Strip üzerinde bir universal HPV sekansı bulunur, listede bulunmayan başka bir HPV genotipi olduğunu gösterir. Stirp üzerinde TST geninin amplifikasyonunu saptayan bir prob bulunur, bu da örneğin amplifiye olduğunu gösterir. Boyama kontrolü Amplifikasyon kontrolü HPV Universal Sequence HPV 6 HPV 11 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44 HPV 54 HPV 61 HPV 70 HPV 72 HPV 81 HPV 16 HPV 18 HPV 26 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 73 HPV 82 14

17 10. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, İŞLENMESİ VE ÖN HAZIRLIKLARI Sitolojik örnek Servikal swablar, oral hücreler gibi örnekler sitolojik örneklerdir. Örnek bir kazıyıcı veya steril cyto-brush (hücre alma fırçası) kullanılarak alınabilir.toplanan hücreler uygun bir transport sıvısı ile sulandırılır (1X PBS, serum fizyolojik veya başka bir benzeri). Örnek +2/+8 C de en fazla 48 saat saklanabilir;daha sonar nükleik asid ekstraksiyonu için işleme almak uygundur. Eğer örneğin kısa sure içerisinde ekstrakte edilmesi mümkün değilse örnek -30 C / -20 C de saklanabilir. %95 ethanol, methanol, ve/veya formalin gibi fiksatiflerle de saklanabilir, ve thin substates gibi toplama sistemleri ile de alınan örnekler saklanabilir (örn. THIN PREP). AB ANALITICA, HPV-SCK (kod 03-33R) kitini sitolojik örnek toplamak üzere kullanımını önerir Sitolojik örneklerin ön-hazırlığı Örneğin hücresel yapısı düşük ise DNA ekstraksiyonuna başlamadan once farklı santrifüj basamakları ile örneğin konsantre edilmesinde yarar vardır. Örenğin tekrar suspense edilebilmesi için steril PBS kullanılmalıdır. Bu, aynı zamanda eğer ortamda varsa mucus ve eritrositlerin de uzaklaştırılmasını sağlar. 15

18 10.2. Histolojik örnek Taze, donmuş veya formalin ile fikse edilmiş ya da parafine gömülmüş biyopsiler gibi histolojik örnekler. Taze biyopsi örneği alındıktan sonar birkaç dakika içerisinde çalışılabilir veya hızla sıvı azotta dondurulmalı ve -80 C de saklanmalıdır. Sonrasında mekanik parçalama için steril bir kesici kullanılmalı veya Proteinaz K ile parçalama kullanılmalı Taze veya dondurulmuş histolojik örneklerin ön-hazırlığı Taze veya dondurulmuş histolojik örnek olduğunda (50 mg dan fazla), steril bir kesici kullanılarak örneğin hızla mekanik parçalaması yapılmalı.bu işlem camda yapılmalı ve parçalanana doku bir test tüpüne aktarılmalı.daha sonar Proteinaz K ile doku parçalama işlemi uygulanmalı. Histolojik örnek formalinde fikse edilmiş veya parafine gömülmüş ise öncelikle paraffin uzaklaştırılmaya çalışılmalı, daha sonar örneğin parçalama işlemine geçilmelidir Formalin ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş histolojik örneklerin ön-hazırlığı Biyopsi örneği fikse edildiğinde veya parafine gömüldüğünde ph 7 de %10 sodyum ve potasyum tuzu içeren (Lilie formülü) formalin tamponu kullanılması gerekir. Bouin, Holland veya diğer asidik fiksatiflerin (osmik asid gibi) kullanıldığı yöntemlerde tamponlanmamış formalinli doku fiksasyonu nedeniyle DNA ekstraksiyonu yapılamaz, parçalanma tam olmaz ve ürün, doku ile çapraz pozitif reaksiyon verir. 16

19 11. PROTOKOL DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonu tam ve saf DNA elde edebilecek herhangi bir yöntemle yapılabilir. AB ANALITICA yöntemi ile ekstrakte edildiğinde sağlanan ürünü yansıtabilmek için paragraf 11.2 deki TST ve HPV amplifikasyonu (10 μl) ekstraksiyon hacimlerini hatırlamak gerekir, Alternatif bir ekstraksiyon yöntemi kullanılırsa, çoğaltılacak olan DNA miktarı 10 μl den az olursa su ekleyerek amplifikasyon hacmi artırılabilir DNA çoğaltma TST gen çoğaltma Her bir premiks test tüpüne ekle (mavi tüpler): AB Taq 0.5 µl DNA 10 µl V FINALE 50 µl HPV DNA nın direkt çoğaltılması (1. amplifikasyon) Her bir premiks test tüpüne ekle (renksiz tüpler): AB Taq 0.5 µl DNA 10 µl V FINALE 50 µl DİKKAT: Eğer thermal cycler için gerekli ise 2 damla mineral yağ (kit içeriğinde bulunmaz) her bir premiks için ekle. 17

20 Bir negatif kontrol (steril su) ve pozitif kontrol (10 μl pozitif control kit içerisinde bulunur) amplifikasyonda bulunmalıdır. Kısa bir santrifüjden sonar tüpler (HPV ve TST) aşağıdaki programa uygun olarak thermal cycler içerisinde inkübe edilmelidir: 1 siklus 95 C 5 dakika 35 siklus Çoğaltma ürününün uzunluğu: TST: 202 bp Direkt HPV: bp 95 C 56 C 72 C 30 saniye 30 saniye 60 saniye ÖNEMLİ: TST geninin çoğaltma ürünü kullanılacağı zamana kadar 30 C / 20 C de saklanmalıdır HPV DNA nın Nested amplifikasyonu (2. amplifikasyon) Her bir premiks test tüpüne ekle (yeşil tüpler): AB Taq 0.5 µl Direkt amplifikasyon ürünü 1 µl V FINALE 50 µl DİKKAT: Eğer thermal cycler için gerekli ise 2 damla mineral yağ (kit içeriğinde bulunmaz) her bir premiks için ekle. HPV nin direkt çoğaltılmasında kullanılan pozitif ve negatif kontroller de tekrar çoğaltılır. Kısa bir santrifüjden sonra test tüplerini aşağıdaki programa gore thermal cycler cihazına yerleştirin: 18

21 1 siklus 95 C 5 dakika 35 siklus 94 C 45 C 72 C 30 saniye 30 saniye 30 saniye 1 siklus 72 C 5 dakika Çoğaltma ürünü uzunluğu: Nested HPV bp ÖNEMLİ: Nested HPV çoğaltma ürünü stripte hemen kullanılmalı veya 30 C / 20 C de saklanmalıdır. 19

22 11.3. Reverse hibridizasyon ile genotipleme İlk yapılacaklar Kullanmadan once kiti birkaç dakika oda ısısında bekletiniz; Sıcak su banyosunun ısısını 42 C ye ayarlayınız ve ısının +/- 0.5 C sınırlar içerisinde kalacağından emin olunuz; Stringent Wash ve Hybridization Solution u sıcak su banyosunda önceden ısıtınız; Her bir stripi siyah bölümün arka kısmında bir kalemle numaralandırınız Denatürasyon ve hibridizasyon Bir tüpte karıştırın: TST çoğaltma ürünü Nested HPV amplifikasyon ürünü Denatürasyon solüsyonu 20 ul 20 ul 20 ul Beş dakika oda ısısında inkübe edin. Bir pensle stripleri uzaklaştırın ve arkalarına bir kalemle numaralarını yazın. Stripleri ellerken mutlaka her zaman eldiven giyin. Çalışma tepsisini sıcak su banyosuna yerleştirin, köpük oluşmamasına dikkat edin. Su, tepsi içerisine girmemelidir. Önceden ısıtılmış Hibridizasyon Solüsyonudan 1 ml herbir kanala ekleyin ve herbirine pens yardımı ile birer strip yerleştirin. Stripler solüsyona tamamen batmalıdır, ayrıca probların temas edebilmesi için siyah çizginin olduğu tarafları yüzeyde olacak şekilde yerleştirilmelidirler. Eğer strip ters konulmuş ise mutlaka bir pens yardımı ile doğru şekilde yerleştirilmelidir. Her bir kanala denature olmuş çoğaltma ürününden 60 μl ekleyin 60 dakika 42 C de çalkalayarak inkübe edin 20

23 Bağlayıcı (Stringent) Yıkama Tüm hibridizasyon sıvısını aspire edin, 1 ml önceden ısıtılmış Stringent Wash Solution ekleyin., Çalışma tepsisini 42 o C deki sıcak su banyosuna 15 dakika süre ile yerleştirin. Bu yıkama ile inkübasyon bitmeden önce aşağıdaki gibi sulandırın: N sayıdaki örnek için sulandırma: N x 0,5 μl konjugat + N x 1 ml konjugat dilüenti Boyama Protokolü Boyama prosedürü oda ısısında, bir çalkalayıcı kullanılarak çalışma tepsisinde yapılmalıdır. Bağlayıcı yıkama sonunda tüm solüsyon aspire edilmeli ve daha önceden sulandırılmış 1 ml konjugat eklenmeli, oda ısısında 30 dakika ajitasyon halinde inkübe edilmelidir. Bu esnada, aşağıda tarif edildiği gibi Boyama Solüsyonu hazırlanmalıdır: 1 tablet NBT/BCIP 10 ml distile su içerisinde eritlimelidir Dikkat: NBT/BCIP nin bir tabletinden sağlanan eriyikteki boyama solüsyonunun miktarı sadece 10 strip için yeterlidir! Hazırlanan boyama eriyiği karanlıkta saklanmalıdır. Tercihan taze eriyik kullanınız, ancak bu olası değilse 30 C / 20 C deki derin dondurucuda 3 aydan daha uzun süreli olmamak ve kesinlikle karanlıkta kalmak üzere dondurarak saklayabilirsiniz (alüminyum bir folyo ile sarılarak saklanması önerilir!). Dondurulmuş eriyik sadece bir kez dondurma/eritme işlemi ile kullanılabilir. Boyama eriyiğini hazırlarken formamide el değmemesine dikkat ediniz (sıvı haldeki kromojenlerde bulunan toksik bir yapıdır). İnkübasyonun sonunda tüm sıvı aspire edilmeli ve 2 dakika boyunca 1 ml Rinse Solution ile yıkanmalıdır. Tüm sıvı aspire edilmeli ve 2 dakika boyunca 1 ml Prestain Solution ile yıkanmalıdır. 21

24 Tepsiyi boşaltın ve önceden hazırlanmış olan Boyama Eriyiğinden 1 ml ekleyin. Karanlık ortamda ve oda ısısında 5-8 dakika inkübe edin. İnkübasyon süresi çevresel şartlara (örn.yerel ısı) ve çoğaltılan ürünün miktarına göre değişebilir. Uzamış inkübasyon süresi arka planın boyanması nedeni ile sonuçların değerlendirilmesinde karışıklıklara yol açabilir. Tepsiyi boşaltarak 2 dakika süre ile 1 ml Stop Solüsyonu kullanarak boyama reaksiyonunu durdurun. Sıvıyı aspire edin ve 2 dakika distile su ile yıkayın. Stripleri tepsiden penset kullanarak alın ve kağıt havlu arasında kurutun. Kurutulmuş olan stripler karanlıkta yıllarca saklanabilirler. 12. SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ Herbir stripi transparan bir film ile kaplayın (kit içeriğinde bulunur), ve stripteki Boyama Kontrolü ile aynı hizaya getirin Boyama Kontrolünün varlığı konjugatın bağlandığını ve substratın reaksiyon gösterdiğinden emin olmamızı sağlar. TST bandının varlığı, çoğaltılabilecek örneğin var olduğunu gösterir: DNA ekstraksiyonunu doğru olarak gerçekleşmiştir. Bu bandda herhangi bir sinyal yok ise örnek uygun değildir: bu durumda ekstraksiyonun tekrarlanması önerilir. Universal Sequence Band ının varlığı HPV pozitif örneğin dokümante edilemsini sağlar. Eğer bu band ve boyama bandı görülüyor, ancak diğer bandlar görülmüyor ise genotip varlığını tanımlamak için sekanslama gibi diğer başka yöntemlerin kullanılması önerilir. Bu durumda AB ANALITICA teknik servisi ile temas kurulması önerilir: laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) , veya tel. (+39) Test edilen genotipi temsil eden bir veya birden fazla band varlığında özgül genotip veya genotiplerin in analiz edilen örnekte mevcut olduğu anlaşılır. 22

25 RAPOR: Düşük viral yükü olan örnekler, özgül band var olsa da Üniversal Sekans Bandı çok zayıf veya hiç olmayabilir. HPV 81, 73, ve 53 gibi bazı genotiplerde Universal Sekans Bandı görülmeyebilir. Universal Sekans Bandı çok koyu ancak özgül band çok zayıf boyanmış ise agaroz jelde görülen amplifikasyon ürünü ile karşılaştırılmalıdır. Bu durumda alternatif bir genotipleme yöntemi (sekanslama) kullanılabilir. Böyle olgularda AB ANALITICA teknik servisi ile temas kurulması önerilir: faks (+39) , veya tel. (+39) YÜKSEK ONKOJENİK RİSKLİ GENOTİPLER: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 MUHTEMEL YÜKSEK ONKOJENİK RİSKLİ GENOTİPLER: 26, 53, 66 DÜŞÜK ONKOJENİK RİSKLİ GENOTİPLER: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 (Munoz et al., 2003) 23

26 13. SORUN GİDERME Boyama Kontrolü dışında band yok Hibridizasyon aşamasında bazı sorunlar oluşabilir: Çoğaltılmış TST varlığını ve HPV ürününü %3 agaroz jel elektroforezi ile doğrulaeğer varsa, paragraf 11.4 te anlatıldığı gibi reverse hibridizasyon testini tekrarla, eğer yok ise aşağıdaki noktaları takip et: Çoğaltma aşamasında bazı sorunlar oluşabilir: Pipet ve uçlarını uygun hacimlarde kullanın (pipet aralığı μl uygun pipet uçları ile-); DNA polimerazın premikste dağıldığını gözle kontrol edin: Enzim yüksek dansitede olduğundan gliserolde dağılımı kolayca görülebilir ; Alternatif olarak, DNA polimeraz damlasını tüp duvarına koyun ve daha sonra kısaca santrifüj ederek gözle kontrol edin. Thermal cycler programını ve ısı profilinin kullanım klavuzuna uygun olarak yapıldığını kontrol edin. Daha sonra doğru program ile çoğaltma işlemini tekrarlayın; Çoğaltma premikslerini, enzimleri ve pozitif kontrolleri 30 C / 20 C de saklayın. Premiks ve reaktiflerin tekrarlayan dondurma/eritme işleminden kaçının. Çoğaltma reaksiyonu inhibe olmuş Başlangıç örneği distile su veya TE ile sulandırın. DNA ekstraksiyonunu daha küçük bir klinik örnekten tekrarlayın. Ekstraksiyon kitinin uygunluğundan ve doğru yapıldığından emin olun, DNA ekstraksiyonunu aynı örneğin yeni bir parçasından tekrarlayın. Band yok veya zayıf (Boyama Kontrolü dahil). Konjugat veya substrat yetersiz miktarda veya yok. Boyama homojen değil İnkübasyon aşamasında stripler tamamen sıvıya batmamış. Tepsi yeterince ajite olmamış. 24

27 Beklenmeyen sonuçlar İnkübasyon ısısı hatası; Hibridizasyon eriyiği ve/veya Stringent Yıkama Solüsyonu uygun olarak önceden ısıtılmamış veya karıştırılmamış; Izole edilmiş DNA nın, amplifikasyon ürününün ve/veya çoğaltma reaktiflerinin kontaminasyonu. Kontamine olduklarında, çoğaltma reaktifleri ve negatif kontrol (sadece su eklenmişti) da aynı band paternini gösterirler; İlk yılkama aşamalarında sıçrama nedeni ile komşu kanallarda da kontaminasyon olabilir; Yoğun ve hızlı band gelişebilir, bu da çoğaltılan DNA nın miktarına ve reaksiyonundaki özel şartlara bağlıdır. Bu durumda, substrat inkübasyonunu durdurarak çapraz hibridizasyon reaksiyonlarından kaçınmak gerekir. Herhangi bir sorun veya soruda AB ANALITICA teknik servisi ile temas kurun: faks (+39) , veya tel. (+39) DONANIM PERFORMANSI Analitik duyarlılık Stripteki çoğaltma ürününün saptama duyarlılığı jel elektroforez ile aynıdır. Bu laboratuvar testi farklı HPV genotiplerinin L1 bölgesini içeren plazmidlerin seri sulandırımları ile elde edilebilir. Özellikle HPV 11 için, yöntemin analitik duyarlılığı 100 kopya viral genome/μl ile eşittir Analitik özgüllük Probların dizilimi en sık görülen bilgi bankası verilerini yansıtır, özgül olmayan eşleşmeler bulunmaz. Genomik DNA veya diğer mikroorganizmaların DNA ları ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. Stripte var olan herbir probun özgüllüğü her bir genotip için plazmid klonları ve/veya sentetik DNA ile test edilmiştir. İstenmeyen bandların görülme nedenleri çapraz reaksiyon olayına bağlı olup aşağıda sınıflandırılmıştır.bu 25

28 bandların varlığı veya yokluğu ile stripteki yoğunlukları çoğaltma ürünündeki miktarlarına bağlıdır. Genotip Olası çapraz hibridizasyon HPV 70 HPV 56 HPV 72 HPV 40 HPV 26 HPV 44 HPV 35 HPV 31 HPV 39 HPV 70 HPV 52 HPV 58 ve HPV Tanısal duyarlılık Yöntemin tanısal duyarlılığı pek çok sayıda yüksek ve düşük onkojenik riskli HPV pozitif örnek ile test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre tanısal duyarlılık %100 olarak hesaplanmıştır. Ampliquality HPV TIP ile elde edilen sonuçlar sekanslama ve üçüncü bir moleküler genotipleme yöntemi ile doğrulanmıştır. Bu testler arasında genotipsel uyum >%80 olarak bulundu. Yüksek riskli HPV genotiplerinin saptanmasında herhangi bir hata saptanmadı. Ortaya çıkan genotipleme hataları çoklu enfeksiyonlarda görüldü. Sekanslama yöntemi çoklu enfeksiyonlarda genotiplerin saptanmasında sınırlılık arzeder. bu viral genotiplerin yokluğu ve/veya varlığını önceden gösteremez Tanısal özgüllük Yöntemin tanısal özgüllüğü pek çok sayıda negatif HPV örneği ile test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre tanısal özgüllük %100 olarak hesaplanmıştır. 26

29 15. CİHAZ SINIRLARI Kitin performansı klinik örnek test için ideal olmadığında azalabilir (servikalvaginal swabda kan bulunması, nötral tamponlanmış formalinden başka fiksatiflerin kullanılması, örnek saklama hatası gibi). Bu genotipleme testi tercih edilen probun genetic bölgesinin sınırları içerisinde kuvvetle çalışır, ilave sekanslama çözümsüz örneklerde yapılabilir. Her tanı sisteminde olduğu gibi nükleik asid hibridizasyonu temelli bu yöntemde de bölgedeki genetic sekans mutasyonlarına bağlı önceden öngörülemeyen sonuçlar alınabilir. Bu kit moleküler biyoloji tekniklerini iyi bilen kalifiye personel tarafından kullanılmalıdır. 16. REFERANSLAR Broker TR, Botcham M, DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.17-36, 1985 Consensus Guidelines, Bethesda 2001 Del Mistro A, Frayle Salamanca H, Trevisan R et al. Infectious Agents and Cancer 1, 9, Meinkoth, J. and Wahl, G. In Analytical Biochemistry, 138: 267, Munoz N, Bosch FX, de Sanjosè S et al., N Engl J Med 348, , 2003 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA and Arnheim N, Science 230, ,

30 17. İLİŞKİLİ ÜRÜNLER HPV-SCK HPV analizi için örnek toplama kiti Kod Ürün Paketleme 03-33R HPV-SCK 100 test 28

31 29

32 AB ANALITICA srl Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it