ENSTRÜMENTAL GIDA ANALİZLERİ

Transkript

1 1. ENSTRÜMENTAL GIDA ANALİZLERİ Yrd. Doç. Dr. Cemalettin BALTACI Doç. Dr. Ali GÜNDOĞDU 2012

2 GENEL BİLGİLER Bir gıda numunesinde kimyasal bir analizin sonuçlandırılması maddenin bir fiziksel özelliğinin ölçülmesiyle olur. Ölçülen özellikler başlıca; kütle, basınç, yoğunluk, optik, özellikler, radyasyon kapasitesi, potansiyel ve iletkenlik olarak belirlenebilir. Analitik kimya, maddelerin kimyasal bileşimlerini ve bileşenlerin miktarlarının belirlenmesi için yöntem ve alet geliştirilmesini amaçlar. Geniş anlamda bir kimyasal analiz cihazı, doğrudan doğruya saptanamayan bir sinyali kişilerin anlayabileceği bir şekle dönüştürerek veren bir enstrümandır. Yani bir cihaz, incelenen sistem ile kişi arasındaki iletişimi sağlayan bir aracıdır. Enstrümantal analizin gelişmesi elektronik bilgisinin ilerlemesiyle paralellik gösterir; çünkü bir sinyalin üretilmesi, yükseltilmesi ve görüntülenmesinin hızla gerçekleştirilmesi ancak elektronik çevrimlerle mümkündür. Kimyasal sinyalleri elektrik sinyallerine çeviren çok sayıda transduserler vardır; keza elde edilen elektrik sinyallerini yükselten amplifikatör çeşitleri de çok fazladır. Modern analizci bir analiz cihazının en yüksek verimle kullanılabilmesi için ne derecede elektronik bilgiye gereksinimi olduğu sorusu ile karşı karşıyadır. Görünen şudur ki analizcinin elektronik devrelerin çalışması hakkında kalitatif düzeyde bir bilgiye sahip olması istenir. 1.1 Nitel (qualitative)(kalitatif) analiz; karışımda neler olduğunu anlamak için yapılan analizdir. 1.2 Nicel (quantitative)(kantitatif) analiz, bir karışım içerisindeki maddelerin miktarlarını ölçmek için yapılan analizdir. Genelde bu iki kavram, benzer kelimelerle ifade edildiği için kolaylıkla karıştırılabilir. Nitel analizde, maddelerin niteliği yani ne kadar içerdiği bakılırken, nicel analizde, maddelerin niceliği yani ne oldukları incelenir gibi bir mantık yürütmek sanırım bu karışıklığı engeller. Nicel analiz yöntemleri olarak; gravimetrik, volumetrik, spektroskopik yöntemler (atomik soğurma, Fluorometri, UV-VIS vs. ), kromatografik yöntemler, refraktometri ve ismini simdi sayamayacağım birçokları söylenebilir. Nitel analiz yöntemleri olarak da, katyon ve anyon analizleri, TLC (hoş aslında nicel analiz olarak sayılır ama nicelden çok nitel amaçlı kullanılır), kütle spektroskopisi gösterilebilir. Bir de bu iki analiz türünün birlikte kullanıldığı yöntemler vardır ki en kralı bunlardır. GC-MS (Gaz kromatografisi üstüne kütle spektroskopisi) karışımı önce ayırıp neyden ne kadar olduğunu bulup sonradan da bu ayrılanların ne olduğunu anlamamız için kütle spektroskopisine bakar ki oldukça kullanışlı bir analiz yoludur. 1.3 Kimyasal Analiz a- Numune alma, b-ayırma, c- Yöntem Seçimi, d- Ölçme, e-değerlendirme basamaklarından oluşur. Analitik yöntemler klasik veya aletli yöntemler olarak sınıflandırılabilir. Sayfa 2 / 94

3 1.4 Klasik (yaş) yöntemler Gravimetrik, volumetrik analiz gibi yöntemleri içerir. Kimyasal maddeler, terazi, kalibre edilmiş cam malzeme, ısıtıcı gibi basit laboratuvar malzemelerinin kullanıldığı ve genelde analitin (tayin edilecek madde) daha fazla bulunduğu numunelerin analizinin yapıldığı yöntemlerdir. 1.5 Aletli Analiz Yöntemleri Genel laboratuvar cihazlarının yanı sıra, çeşitli analitik cihazların kullanıldığı yöntemlerdir. Analitik cihazlar, maddenin, iletkenlik, elektrot potansiyeli, ışın absorpsiyonu veya emisyonu, kütle yük oranı, floresans gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerini ölçer. Numuneyi analiz etmek amacıyla bazı bileşenleri ayırmak için kullanılan kromatografik, elektrolitik, elektroforetik yöntemler de aletli analiz yöntemlerindendir. Aletli yöntemler genellikle, zamandan tasarruf etmek, birçok kimyasal ayırmalardan kaçınmak ve çoğu kez daha duyarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için kullanılır Enstrümental Analiz: Bir örnekteki herhangi bir bileşenin cinsi veya derişimiyle orantılı sinyal üreten cihazlarla yapılan analize Enstrümental Analiz denir. Gıda analizlerinde aletli analiz yöntemleri başlıca 5 grupta toplanır. Spektroskopik Metotlar Elektrokimyasal Metotlar Kromotografik metotlar Termal analiz metotları Refraktometrik ve Polarimetrik metotlar Enstrümantal Metotlar 1920 li yıllara kadar analizlerin kütle ve hacim özelliklerine göre yapılıyordu. Bu nedenle gravimetrik ve volumetrik analizler "klasik yöntemler" olarak tarif edilir. Diğer yöntemlere ise (spektroskopik, elektroanalitik, kromatografik vb). "enstrümantal analiz yöntemleri" denilmektedir. Aşağıda analitik uygulamalarda kullanılan ve çok bilinen bazı sinyallerle bu sinyal ölçümüne dayanan analitik metotlar verilmiştir. Sayfa 3 / 94

4 Ölçülen Özellik Işın Absorpsiyonu Aletli Analiz Yöntemi Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisi Işın Emisyonu Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans, Fosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi Işın Saçılması Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi Işın Kırılması Işın Difraksiyonu Işın rotasyonu Elektrik potansiyeli Elektrik yükü Elektrik akımı Elektriksel direnç Kütle Kütle/yük Tepkime Hızı Termal Özellikler Refraktometri, interferometri X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri Polarimetri, dairesel dikroizm Potansiyometri, Kronopotansiyometri Kulometri Amperometri, Polarografi Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü) Gravimetri Kütle spektroskopisi Kinetik yöntemler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik, DSC Radyoaktivite Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri Tablo 1.1 Bazı aletli analizlerin dayandığı yöntemler Birbirine çok benzeyen maddelerin ayrılması için yukarıda verilen yöntemlerden başka analitik ayırma yöntemleri de vardır. Kromatografi, destilasyon, ekstraksiyon, iyon değiştirme, fraksiyonlu kristalizasyon, ve seçimli çökeltme işlemleri çeşitli ayırma ve saflaştırma yöntemleridir. Sayfa 4 / 94

5 Enstrümantal tekniklerin çoğu klasik yöntemler kadar hassas değildir. Karışımların analizlerinde ise enstrümantal yöntemler daha başarılıdır. Enstrümantal veya klasik analizler için doğruluk, uygunluk ve harcanan zaman gibi kıstaslara göre genel bir sınıflama yapılamaz. Hatta kullanılan cihazlar yönünden bile, daha pahalı veya daha karmaşık, gibi bir ayırım bile doğru olmaz; örneğin, gravimetrik bir analizde kullanılan modern bir terazi bazı enstrümantal analiz cihazlarından daha karmaşık ve pahalı bir cihazdır Analiz Cihazları (Enstrümanlar) Bir cihazın temel kısımları çoğunlukla dördü aşmaz. Şekilde şematik olarak görüldüğü gibi bu kısımlar: Sinyal jeneratörleri Dedektörler (giriş dedektörleri) Sinyal prosesörleri (devreler ve elektrik aletleri) Veri okuma aletleri Sinyal Jeneratörleri Sinyal jeneratörleri örnekteki maddelere ait analitik sinyaller üretirler. Jeneratör örneğin kendisi olabilir. Analitik bir terazinin sinyali tartılan örneğin kütlesidir; bir ph metre için ise sinyal, çözeltideki hidrojen iyonlarının aktivitesidir. Diğer cihazların çoğunda sinyal jeneratörü çok ayrıntılıdır. Örneğin, IR Spektrofotometrede sinyal jeneratörü, ışın kaynağı, monokromatör, ışın chopperi (kesici), ayırıcı, örnek tutucu ve ışın aftenuatörü (zayıflatıcı) gibi kısımlardan oluşur. Diğer bazı örnekler: Fotometre: Tungsten lamba, cam filtre, örnek Atomik Emisyon Spektrometre: Alev, mono-kromatör, kesici, örnek Sayfa 5 / 94

6 Kulometre: DC kaynak, örnek ph Metre: Örnek/cam elektrot X-Işını Toz Difraktometre: X-ışını tüpü, örnek Renk Komparatörü: Güneş ışını, örnek Giriş Transduserleri veya Dedektörler Transduser bir tip sinyali başka bir sinyal tipine çeviren bir alettir. Örneğin, ışığın ısısını elektrik voltajına çeviren termokupl bir transduserdir; kadranlı bir barometredeki körükler basınç sinyalini mekanik bir hareket sinyaline dönüştürürler. Enstrümental analiz cihazlarında karşılaşılan transduserlerin pek çoğu analitik sinyalleri elektrik voltajı, akım, veya dirence dönüştürürler; çünkü elektrik sinyalleri yükseltilebilir ve kaydedicide çizim veya yazım şeklinde alınabilirler. Fotosel: Elektrik akımı Fotomultiplier tüp: Elektrik potansiyeli Elektrotlar: Elektrik akımı Cam-kalomel elektrolar: Elektrik potansiyeli Fotoğraf filmi: Görüntü Göz: Optik sinyal Sinyal Prosesörleri Sinyal prosesörü dönüştürülmüş sinyali, okuma aletine en uygun olacak şekilde değiştirir. En fazla karşılaşılan değiştirme sinyalin kuvvetlendirilmesidir (amplifikasyon). Bunun için sinyal 1 den büyük bir sabitle çarpılır. İki kefeli bir analitik terazide kolun hareketi, bir gösterge ile kuvvetlendirilmiş olarak iletilir. Bir fotoğraf filmi tarafından yapılan kuvvetlendirme çok daha büyüktür; burada tek bir foton 1012 tane gümüş atomu üretir. Elektrik sinyalleri de keza 106 kat veya daha fazla kuvvetlendirilebilirler. Elektrik sinyallerinin kuvvetlendirilmesi yanında, zayıflatılmasına (attenuasyon) da gereksinim olur; bu durumda sinyal, prosesörde 1 den küçük bir sabitle çarpılır, integre edilir, ayrılır, eklenir veya çıkarılır. Bundan sonraki uygulamalarda sinyal önce alternatif akıma ve sonra da doğru akıma çevrilerek bir standartla kıyaslama yapılabilir. Böylece akımdan voltaja (veya tersine) bir geçiş sağlanmış olur. Sayfa 6 / 94

7 Veri Okuma Sistemi Veri okuma sisteminde, prosesörden yükseltilerek gelen sinyali kişinin okuyabile-ceği bir sinyale dönüştüren bir transduser bulunur. Bunlar metreler, şerit kağıtlı kaydediciler, osilaskoplar, işaretli cetveller, ve digital (rakamlı) göstergeler olabilir Analitik Metot Seçimi Problemin tanımı: İstenilen doğruluk ve hassasiyet nedir? Elimizdeki örnek ne kadardır? Analitin konsantrasyon aralığı nedir? Örnekte girişime yol açacak bileşenler nelerdir? Örnek matrisinin fiziksel ve kimyasal özellikleri nelerdir? Kaç örnek analizlenecektir? Analitik metot seçimi için sayısal kriterler: Kullanılacak cihazların performansının metot için yeterli olup olmadığı doğrulanır. Kullanılacak maddelerin (kimyasal, standartlar) kalitesi belirlenir. Validasyonu yapılacak metot performans parametreleri metodun uygulama amacına ve kapsamına bağlı olarak belirlenir. Metot validasyonuna başlamadan önce kullanılacak cihazın performansının test edilmesi ve uygunluğunun saptanması da gerekir Metot Validasyonu Metot validasyonu, bir analitik metodun ilgilenilen amaç için kabul edilebilirliğini sağlama işlemidir. Metot problemlerini en aza indirmek için en iyi yol, geliştirme esnasında uygun validasyon deneylerini gerçekleştirmektir. Metot validasyonu; metodun amaç için uygun olduğunu kanıtlamayı içerir. İlaç analiz metotları için, Birleşik Devletler Farmakopisi (USP), Uluslararası Harmonizasyon Konferansı (ICH), Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) nin verdiği talimatlar böyle bir validasyonu gerçekleştirmek için bir çerçeve sunar. Ne tür bir çalışma yapılması gerektiği konusunda genel bir uyum varsa da, nasıl yapılacağı konusunda büyük farklılıklar bulunmaktadır. Analiz edilecek aktif maddeye, örnek matriksine ve bu analizleri yapacak gruba bağlı olarak validasyon ihtiyaçları sürekli değişir Metot Validasyonunun Gerekli Olduğu Durumlar Herhangi bir metodun laboratuvarda ilk defa kullanılacağı zaman, Bir analiz için yeni metot geliştirildiğinde, Kullanılmakta olan metotta değişiklik yapıldığında, Valide bir metodun başka bir laboratuvarda kullanılacağı durumlarda, Sayfa 7 / 94

8 Yeni personel tarafından metodun ilk defa kullanılması durumunda, Yeni cihazlar devreye girdiğinde, Temel kimyasallarda önemli bir değişiklik yapıldığında (metot Modifiye edildiğinde), Uzun süredir kullanılmamış bir valide yöntemin yeniden kullanıma alınması durumunda, Laboratuvarda yapılan ve sonuçları etkileyebileceği düşünülen değişiklikler olduğunda, İki metodun karşılaştırılması amacıyla ve Kalite kontrol testleri sonucunda metodun performansında zamanla bir değişme olduğu anlaşıldığında metot validasyonu / verifikasyonu yapılır Metot Validasyon Parametreleri Metot geçerliliği, herhangi bir analitik metodun hedeflenen amaca göre kabul edilip edilemeyeceğini açıklayan performans kriterlerinin istatistiksel değerlendirilmesidir. Enstrümental cihazlarla yapılan analizlerde, metot validasyonu belirli bir örnek veya örnek matriksleri için geliştirilen metodun, geçerliliğinin ya da çalıştığının sağlamasının yapılmasıdır. GLP ye uygun çalışan laboratuvarlar sadece geçerliliği onaylanan metotları uygularlar. Geçerliliği kanıtlanmış metotlarla çalışmak laboratuvarda analiz süresince karşılaşılabilecek problemlerin çoğunun ortadan kaldırılmasını sağlar. Bir çok metot performans kriterleri vardır: gerçeğe yakınlık (accuracy), kesinlik (precision) doğrusallık (linearity), kalibrasyon, geri alım (recovery), LOD (dedeksiyon limiti), LOQ (hesaplama limiti), hassasiyet (sensitivity), hedef (scope), özgülük (specifity). Fakat çoğu araştırıcılar bu kriterlerden doğruluk, kesinlik (repeatability, reproducubility, robustness), kalibrasyonun doğrusallığı değerlendirmelerine önem vermektedirler. Bazen validasyon çalışmalarının sonucu uygulanan analiz prosedürünün değiştirilmesini gerektirebilir, bunun için de metodu tekrar valide etmek gerekir. Metot validasyonunun birçok seviyesi vardır. En düşük seviyeli olanı bir analizcinin bir tek laboratuvarda örneklerini fortifiye etmesi gerekli verileri toplaması ve istatistiksel değerlendirme yapmasıdır. En yüksek seviyeli olanı ise konsantrasyonu bilinmeyen analit içeren örneklerle birçok laboratuvarın ortaklaşa çalışması ve verilerin toplanması ve değerlendirilmesidir. Metod performance parametrelerini United States Pharmacopeia (USP), Inernational Conference on Harmonisation (ICH) ve Food and Drug Administration (FDA) gibi uluslararası kuruluşlar bir rehber yada kılavuz olarak açıklamışlardır. Doğruluk (Accuracy) o Gerçeklik (Trueness) ve Sistematik Hata (Bias) Kesinlik (Precision) o Tekrarlanabilirlik (Repeatability) Sayfa 8 / 94

9 o Tekrarüretilebilirlik (Reproducibility) Tayin Limiti (LOD-Limit of detection) Ölçüm Limiti (LOQ-Limit of quantitation) Doğrusallık / Ölçüm Aralığı (Linearity / Reportable Range) Lineer Aralık (Linear Range) Sağlamlık (Robustness / Ruggedness) Geri Kazanım Oranı (Recovery) Spesifiklik (Specifity) Selektivite / Seçicilik (Selectivity) Hassasiyet / Duyarlılık (Sensitivity) Stabilite Ölçüm belirsizliği 1.6. Kalibrasyon Tüm analitik metotlar kantitatif analiz amacıyla kullanıldıklarında kalibrasyona gereksinim vardır. Kalibrasyon, bir enstrüman çıkışında ölçülen analitik sinyalin analitin konsantrasyonuyla olan ilişkisinin doğru olarak saptanması amacıyla yapılan bir işlemdir. Sinyalin (veya responsun) kalibrasyonu yapılmadan bir örnek için alınan verilerle konsantrasyon bağıntısı elde edilemez. Bir kalibrasyon metodunun özgünlüğü kesinlik, doğruluk, bias, hassasiyet, algılama sınırları, seçicilik ve uygulanabilir konsantrasyon aralığına bağlıdır. Bu kavramlar aşağıda kısaca açıklanmıştır Kesinlik (Precision) Metodun tekrar üretilebilirliğinin (reproduciblility) bir ölçüsüdür; aynı şekilde elde edilen sonuçlar birbirlerine ne kadar yakın değerlerdedir? Rastgele (random) hatalar standart sapmayla izlenebilir; genellikle % relatif sapma değeriyle ifade edilir. Sayfa 9 / 94

10 Analitik Metotların Kesinlik (Precision) Tanımları Doğruluk (Accuracy) Ölçülen değer gerçek değere ne kadar yakındır? Normal olarak % relatif hata (mutlak hata olabilir) ile tanımlanır; Gerçek değer ile bulunan ortalama değerin farkının gerçek değere bölümünün % dir Bias Bir ölçmenin sistematik hatasının göstergesidir; enstrümantal, personel ve metot hatalarından kaynaklanır. Mutlak hata olarak ifade edilir. µ, tüm değerlerin ortalaması; xi, gerçek değeri gösterir. bias = µ - xi Hassasiyet (Sensitivity) Hassasiyet iki faktöre bağlıdır; kalibrasyon eğrisinin eğimi (eğimin dikliğiyle artar) ve ölçümlerin birbirine yakınlığı. Metodun herhangi bir interferens olmadan gerçek olarak analiti belirleme yeteneğidir. Örnek matrisinde bulunabilecek diğer bileşiklerin (componentlerin) olması durumunda analiz edilen analit doğru ve spesifik olarak analiz edilebilmelidir. Diğer etkili maddeler, katkı maddeleri, safsızlık veren maddeler ve parçalanma ürünleri ile karışabilmesinin (interference) ölçümüdür. Böylece kromatogramdan alınan pikin sadece tek bir analite ait olduğu (co-elutions olmadığı) teyit edilmiş olur. Özgülük için solvent, blank ve örnek matriksi blankleri farklı deneme koşullarında (2 farklı analitik koşullarda, 2 farklı dedeksiyon tekniği ile test edilmelidir. Sayfa 10 / 94

11 S = mc + Sşahit S = ölçülen sinyal, C = analitin konsantrasyonu, Sşahit = şahidin sinyali, m = kalibrasyon eğrisinin eğimi, Si = analitik sinyal. Kalibrasyon eğimi = m Analitik hassasiyet = γ = Seçicilik (Selectivity) Uygulanan metodun örnek matrisindeki diğer maddelerden etkilenmemesini belirten bir derecedir. S = analitik sinyal, Sşahit = şahidin sinyalini gösterdiğinde, S = maca + mbcb + mccc + Sşahit CA, CB, CC = A, B ve C konsantrasyonları; ma, mb, mc = A, B ve C maddelerinin kalibrasyon eğrisi eğimindeki değerleridir. kb,a = kc,a = kb,a = B için seçicilik faktörü (A ya göre), kc,a = C için seçicilik faktörü (A ya göre), S = ma (CA + kb,a CB + kc,a CC) + Sşahit Seçicilik faktörleri 0 ile 1 arasındadır; girişimler gözlenen sinyali azaltırsa negatif olabilir Uygulanabilir Konsantrasyon Aralığı Bir kalibrasyon eğrisi grafiği; cihaz responsu-konsantrasyon değişimi Teorik olarak absorbansın konsantrasyonla orantılı olması gerektiği halde çoğu zaman doğrusallıktan sapmalar olur. Bu nedenle kalibrasyon eğrilerine gereksinim vardır. Ayrıca, analizin yapıldığı zaman en az bir standardın absorbansı tekrar ölçülerek atomik buhar elde edilirken kontrol dışı kalan değişkenlerin neden olduğu hatalar saptanır. Böylece standardın orijinal kalibrasyon eğrisinden gösterebileceği sapma, örnek için elde edilen sonuçların düzeltilmesinde kullanılır. Sayfa 11 / 94

12 1.6.6 Dinamik Aralık: Eğrinin doğrusal olan kısmının kullanılması tercih edilir; bu bölümde analitik sinyal, analitin miktarıyla doğru orantılıdır. Dinamik aralığın üs-tündeki analit konsantrasyonlarında respons değerinde yükselme görülmez Algılama Sınırı (Limit of Detection, LOD): Bir örnekte herhangi bir analitin, background seviyesi üzerinde, belirlenebildiği en düşük konsantrasyondur. Değişik hesaplama yöntemleri vardır. a) Blank (kör) örnek (n 20) okumalarının standart sapmasının (s) 3 ile çarpılması ile bulunur. LOD= 3 x s (mg/kg). b) formülü ile bulunur. k burada 3 Sşahit kör okuma(blank) c) LOD; 2:1 veya 3:1 lik signal/noise oranı genellikle enstrümental analiz için kabul edilir. LOD= 2 x 1.645xs = 3.29 x s d) Bravenboer in pratik çözümü; örnek matriksi ile yapılan kalibrasyon kurvesinin eğimi (B), (y=a+bx, b=eğim) ve kurvenin relatif rezidual standart sapması (Sres) hesaplanır LOD, Cdet = 3 x Sres/B e) TLC olduğu gibi, görsel, enstrümental olmayan metotla da LOD belirlenir. Şöyle ki; Kantitatif Ölçme Sınırı (Limit of Quantitative Measurement, LOQ): Bir örnekte herhangi bir analitin, kabul edilebilir gerçeğe yakınlık (accuracy) ve doğru tam (precise) parametreleri ile belirtilen metot koşullarında belirlenebildiği en düşük konsantrasyondur. Değişik hesaplama yöntemleri vardır. a) Blank örneklerin (n 20) SD sinin 10 ile çarpılması ile bulunur. LOQ, Cquan = 10*s (mg/kg). b) formülü ile bulunur. k burada 10 Sşahit kör okuma(blank) c) Bravenboer e göre LOQ, 2* Cdet = 6* Sres/B e) TLC de u formül uygulanır: LOQ= LOD (ng/mg) / Q(tahmini geri alım, 0,70) =ng/mg Piklerin ekli S/N oranını etkiler. Keskin pikler yüksek S/N oranı verir, bu da daha düşük LOD ve LOQ ile sonuçlanır. LOQe <MRL ilişkisi her zaman olmalıdır. Analiz limiti MRL den fazla ise o metotla çalışmanın anlamı yoktur Doğrusal Respons Sınırı (Limit of Linear Response, LOL): Bir entrümant dedektörünün doygunluk noktasıdır; bu noktadan sonra sinyalde doğrusal bir respons üretemez. 1.7 Kalibrasyon Metotları Sayfa 12 / 94

13 En çok uygulanan bazı kalibrasyon yöntemleri: Kalibrasyon eğrisi metodu Standart ilavesi metodu İç standart metodu Alan normalizasyonu metodu Kalibrasyon Eğrisi Metodu Kalibrasyon eğrilerinin doğrusal (lineer) olması, yani cihaz responsuyla hemen hemen orantılı olması istenir. Kalibrasyon eğrisi kullanabilmek için analitin konsantrasyon aralığı tahmin edilebilmeli, örneğin matriks koşulları değerlendirilmelidir. Örneğin matriks koşullarına benzer koşullarda bir takım standart hazırlanır; standartlar, tahmin edilen konsantrasyon aralığını kapsayacak seviyelerde olmalıdır. Analit içermeyen bir şahit hazırlanır. Standartlar ve şahit analiz cihazında ölçülür ve elde edilen değerlerle bir kalibrasyon grafiği çizilir. Bir kalibrasyon eğrisinin çizilebilmesi için, normal olarak, en az 3 standart ve bir şahit kullanılır. Örneğin (analit konsantrasyonu bilinmiyor) ölçümü yapılır; alınan respons kalibrasyon eğrisinin dinamik aralığı içindeyse, konsantrasyon hesaplanır. Örnek Ultraviyole ve Görünür Spektrofotometrede Co +2 Tayini Analiz edilecek örneğe (bilinmeyen) uygun analiz koşulları saptandıktan sonra bir seri standart çözelti kullanılarak kalibrasyon eğrisi hazırlanır. Standartlar, örneğin konsantrasyonuna yakın değerlerde olmalıdır. Kobalt iyonu (Co +2 ) miktarının tayini için spektrumda çalışma dalga boyu saptanır; ~500 nm. Beş adet konsantrasyonu bilinen standart ve analit içermeyen bir şahit çözelti hazırlanır ve 520 nm deki absorbans değerleri okunur. AS değerlerine karşı konsantrasyonu gösteren kalibrasyon grafiği çizilir. Sayfa 13 / 94

14 Tablo 2 Co +2 Analizi verileri Grafik bir doğru şeklindedir. Örneğin absorbans değeri okunur. Ax = (beş okumanın ortalaması) Doğrunun eğimi (m), enstrüman responsunun konsantrasyonla ilişkisini; y eksenini kestiği değer (b) ise, şahidin, veya enstrümanın analit bulunmadığı haldeki responsudur. Bu değerin her ölçme sonucundan çıkarılması gerekir. m = b = y=0,0456*x+0,0096 m ve b için standart sapma ne kadardır? Sayfa 14 / 94

15 Transfer fonksiyonu için kalibrasyon hassasiyeti (m) nedir? m kalibrasyon eğrisinin eğimidir. m = Analitik hassasiyet nedir? Bu değer konsantrasyonla değişir; dolayısıyla eğri üzerindeki her değer için hesaplanır. Analitik hassasiyet = γ = Algılama sınırı (limit of detection, LOD) nedir? Kantitatif ölçme sınırı (limit of quantitative measurement, LOQ) nedir? Örnekteki analit konsantrastonu (CX) ne kadardır? Örneği ölçmenin standart sapması ne kadardır? (ölçme sayısı = 5)) Bu ölçme için %95 güvenilirlik sınırı ne kadardır? Örnek için 5 ölçme yapılmıştır. 5 değer için %95 güvenilirlik sınırında, t = 2.78 (tablolardan) Sayfa 15 / 94

16 CX = 9.3 ± 0.2 ppm, (95% güvenirlilikle) Standart Katma Metodu Standart katma yöntemi, çoğu zaman örneğin içeriğinin bilinmediği veya kompleks bir karışım olduğu ve analit dışındaki diğer başka maddelerin (safsızlıklar) de sinyali etkilediği durumlarda uygulanan bir kalibrasyon işlemidir. Böyle hallerde matriks, örnek içinde bulunan analitten başka diğer her şeydir; responsu değiştiren bu tür etkilere matriks etkisi denilir. Örnekte bulunan safsızlıklar analitle etkileşerek cihaz responsunu değiştirirler veya kendi başlarına özel cihaz responsları üretirler. Bu gibi durumlarda saf analit örneklere göre hazırlanan bir kalibrasyon eğrisi yanlış sonuç verir. Örneğin, aşağıdaki şekilde, kütle spektrometreyle yapılan, matriksin saf su ve yer altı suyu olması hallerinde perklorat kalibrasyon eğrilerinin ne kadar farklı oldukları açıkça görülmektedir. En ideal durum kalibrasyon standartlarının örnek matriksindeki hem analit hem de diğer maddelerin konsantrasyonlarına yakın miktarlarda bileşen içermesidir; böylece, örnekteki diğer maddelerin, ölçülen analit absorbansına etkisi en aza indirilmiş olur. Örneğin, renkli pek çok metal iyonu komplekslerinin absorbansı ortamda sülfat veya fosfat iyonlarının varlığında azalır; çünkü bu iyonlar metal iyonlarıyla renksiz kompleksler oluştururlar. Böyle bir durumda elde edilen absorbans değeri gerçek değerinden düşük olur. Sülfat veya fosfatın matriks etkisi standartlara, bu iyonlardan örnekte bulundukları miktara yakın miktarlarda ilavesiyle yenilir. Perkloratın farklı matriksler için kalibrasyon eğrileri Sayfa 16 / 94

17 Ancak, topraklar, mineraller, ve fabrika külleri gibi örneklerin analizinde, örneğe benzer bileşimde standartların hazırlanması olanaksız veya çok zordur. Bu gibi durumlarda matriks etkisini yok edebilmek için "standart ilavesi yöntemi" uygulanır. Standart katma birkaç şekilde yapılabilir. Zaman kazanmak veya az miktarda örnekle çalışılması gerektiğinde standart ilavesi örneğin sadece iki versiyonu ile yapılabilir. Örneklerde birine VS ml standart konulur, diğerine konulmaz. Her iki balon da seyreltilerek sabit hacme tamamlanır. Bu yöntem voltametrik ve potansiyometrik ölçmelerde çok kullanılır. Fotometrik ve spektrofotometrik çalışmalarda en çok uygulanan yöntem ise, aynı miktardaki örneklere standart bir çözeltiden artan miktarlarda ilaveler yapılmasıdır. İlavelerden sonra çözelti sabit bir hacme tamamlanır ve absorbansları saptanır İki Ölçmeyle Yapılan Hesaplama Yöntemi Örnekten volumetrik bir balona bir miktar (VX) alınır ve gerekli maddeler (ph tampon, kompleks yapıcı, v.s. gibi) ilave edilir, seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Buna (1) diyelim. Diğer bir volumetrik balona aynı şekilde örnek ve gerekli maddeler konulur; ilave olarak 5.00 ml analit standart çözelti ilave edildikten sonra seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Buna (2) diyelim. (1) ve (2) nin sinyalleri ölçülür; A1 ve A2. Sinyaller analit konsantrasyonuyla orantılıdır. k orantı sabitini, CX örnekteki analit konsantrasyonunu gösterdiğine göre: Bu iki eşitlikten örnekteki analit konsantrasyonu hesaplanır. Sayfa 17 / 94

18 Örnek 2 Sodyum iyonu içeren gıda numunesi, atomik emisyon analizinde 4.27 mv sinyal vermektedir. Bu örnekten 95.0 ml alınarak, 2.5 ppm Na + çözeltisinden 5.00 ml ilave edilmiştir; hazırlanan bu standardın sinyali ise 7.98 mv olarak ölçülmüştür. Gıdadaki sodyum iyonu konsantrasyonu ne kadardır? [Na + ]? ppm. Sinyaller analit konsantrasyonuyla orantılıdır. Hazırlanan standart (100 ml) karışımdaki Na + konsantrasyonu, 95 ml gıdadaki ve ilave edilen 5 ml 2.5 ppm çözeltideki Na + iyonları toplamına eşittir. Atomik emisyon spektrumunda okunan sinyaller. Gıda örneği için A1 : 4.27 mv Vx = 95 ml CS=2.5 ppm 100 ml standart için. A2: 7.98 mv VS= 5 ml Sinyal ve konsantrasyonlar orantılı olduğundan, aşağıdaki eşitlikle gıdadaki Na + konsantrasyonu aşağıda verilen formülle hesaplanır. Cx= = ppm gıda numunesindeki Na + miktar Çok Sayıda Ölçmeyle Yapılan Hesaplama Yöntemi Çok sayıda ölçmeyle yapılan standart ilavesi kalibrasyon metoduyla daha hassas sonuçlar alınır Örnekten volumetrik bir balona bir miktar (VX) alınır ve gerekli maddeler (ph tampon, kompleks yapıcı, v.s. gibi) ilave edilir, seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Diğer bir seri volumetrik balona aynı şekilde örnek ve gerekli maddeler konulur; ilave olarak sırasıyla 5.00, 10.00, 15.00, 20.00, ml analit standart çözelti ilave edildikten sonra herbiri seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Standardın konsantrasyonu 8.7 ppm dir. Hazırlanan beş standardın ölçümü yapılır; her biri kendine özgü sinyal değeri verir (Sİ). Sinyal değerleri, ilave edilen standardın hacimlerine karşı grafiğe alınır; grafik bir doğrudur. Elde edilen grafiğin eğimi ve y eksenini kestiği noktadaki sinyal değeri saptanır; bu değerler numunedeki analit miktarını hesaplamada kullanılır. Hazırlanan çözeltilerin her birindeki analit konsantrasyonu enstrümantal yöntemle ölçülür. Sayfa 18 / 94

19 yazılabilir. Şekil 1.1 Enstrümanın responsu (A) analit konsantrasyonuyla orantılı ise aşağıdaki eşitlik VX=örneğin hacmi, = 25 ml olduğu varsayılsın VS = standardın hacmi = değişken (5, 10, 15, 20 ml, gibi) VT = balonun toplam hacmi = 50 ml CS = standardın konsantrasyonu CX = alınan örnek içindeki analitin hacmi (burada 25 ml) k = orantı sabiti A nın VS nin fonksiyonu olarak çizilen grafiği düz bir doğrudur. Sayfa 19 / 94

20 Elde edilen grafik kullanılarak örnekteki analit konsantrasyonunun (CX) saptanması için iki yol izlenebilir CX in Tayini İçin Birinci Yol: Doğrumun eğimi m, y eksenin kestiği nokta b ile gösterildiğinde, A = m VS + b Eğim, Kesim noktası, CX in Tayini İçin İkinci Yol: CX in tayini için başka bir yol da izlenebilir. Ölçme sonuçlarıyla çizilen doğru ekstrapole edilerek X eksenini kestiği nokta saptanır. VS = 0 noktası enstrüman responsudur. Doğrunun X eksenini kestiği nokta ilave edilen analit miktarı bilinir (içsel). Veya bu noktada A = 0 olduğundan (enstrüman responsu yok) örnekte analit bulunmaz. A = 0 olduğunda, Sayfa 20 / 94

21 Örnek 3 5 ml numune çözeltisi alınarak sırasıyla 5ml artırılmak suretiyle 8.7 ppm standart ilave edildi ve ölçümleri elde edildi. Çok sayıda ölçmeyle yapılan kalibrasyon işleminde bir örnek için aşağıdaki verilerin elde edildiği varsayılsın. Örnekteki analit konsantrasyonu CX ne kadardır? Yukarıdaki grafikten, m = b = değerleri okunur. CX in hesaplamayla bulunması için daha önce verilen, eşitliğinden CX = örnekteki analit konsantrasyonu CS = standarttaki analit konsantrasyonu Eğim (m) ve kesişme noktası değerindeki (b) hata hesaplanabilir; böylece, elde edilen sonucun ne kadar sağlıklı olduğu görülür. SC = 12.7 x = 0.16 ppm Bu ölçme için %95 güvenilirlik sınırı ne kadardır? Örnek için 5 ölçme yapılmıştır. 5 değer için %95 güvenilirlik sınırında, t = 2.78 (tablolardan) Sayfa 21 / 94

22 CX = 12.7 ± 0.2 ppm, (95% güvenirlilikle) Standart ilavesi yönteminde yukarıda görüldüğü gibi hesaplamayla değil grafikteki değerlerde yapılan okumalar daha kolaydır. Bir doğru şeklinde elde edilen grafikteki doğru ekstrapole edilerek x-eksenini kestiği, yani sinyalin sıfır olduğu nokta saptanır. Bu nokta, örnekteki (bilinmeyen) analit miktarıyla aynı miktarda analit içeren Standard çözeltinin hacmini tanımlar İç Standart Metodu Bir iç standart, bilinmeyen örneğe ilave edilen ve analitten farklı olan, miktarı bilinen bir bileşiktir. İç standartlar çeşitli rastgele ve sistematik hataları dengeler. Bir iç standart, örnek, şahit ve kalibrasyon standartlarına aynı miktarda ilave edilen bir maddedir. Standartlardan alınan ölçme sonuçları, analit sinyali / iç standart sinyali değerleri standartlardaki analit konsantrasyonlarına göre grafiğe alınır. Örnek için elde edilen analit sinyali / iç standart sinyali oranından, kalibrasyon eğrisi kullanılarak analitin konsantrasyonu bulunur. Analit sinyalinin iç standart sinyaline oranı analitik parametre olarak kullanılır. Yöntemin başarılı olabilmesi için iç standart sinyalinin örnekteki diğer maddelerin piklerinden uzakta (RS > Sayfa 22 / 94

23 1.25), analit pikinin yakınında olması tercih edilir. Uygun bir iç standart kullanıldığında relatif hata % civarındadır. Respons faktörü, RX/S: Bilinen miktarlarda analit ve standart içeren bir karışım hazırlanır. Dedektör, genellikle, karışımdaki her bir madde için farklı responslar verir; böylece analit için bir respons faktörü saptanır. Hacim sabit olduğundan, Sayfa 23 / 94

24 AX, AİS analit ve iç standart için responslar mx, mis enjekte edilen analit ve iç standardın kütleleri CX, CİS enjekte edilen analit ve iç standardın konsantrasyonları Örnek 4 İç standart yöntemi kromatografik analizlerde yaygın olarak uygulanan bir kalibrasyon yöntemidir Tek Enjeksiyonla Hesaplama Yöntemi Tek enjeksiyonla hesaplamada, örneğe bilinen miktarda bir iç standart ilave edilir. Analit için saptanan respons faktörden örnekteki analit miktarı hesaplanır. Standardın analizi için X maddesinden ve İS (iç standard) maddesinden, 1 ng enjekte edilir, ölçüm yapılır; standart için elde edilen değerler: Örneğin analizi için, örneğe 1.00 ppm iç standart ilave edilir ve ölçüm yapılır; elde edilen değerlerden analit miktarı (CX) hesaplanır Kalibrasyon Eğrisiyle Hesaplama Yöntemi İç standart miktarı sabit, analit miktarı değişken olan (farklı mx/ms değerlerinde) bir seri standart hazırlanır, her birinin kromatogramları alınır. Standartların kromatogramlardan hesaplanan AX/AS değerlerinin mx/ms değerlerine karşı grafiği çizilir; eğri, eğimi respons faktörü olan bir doğrudur. Örnekteki analitin miktarının bulunması için, örneğe, bilinen miktarda iç standart maddesi ilave edilir. Örnek + iç standart karışımının kromatogramından AX/AİS değeri bulunur ve kalibrasyon eğrisinden analit konsantrasyonu (CX) hesaplanır. Sayfa 24 / 94

25 Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi için, aşağıdaki tabloda görüldüğü gibi, dört standart hazırlanmıştır; Her standartta 5 00 mg/ml iç standart vardır. AX/AİS değerleri CX/CİS değerlerine karşı grafiğe alınır. Kalibrasyon eğrisi, eğimi respons faktörü olan bir doğrudur. Örneğin analizi için örneğe bilinen miktarda iç standart (CİS) ilave edilir ve hazırlanan karışım cihaza enjekte edilir. AX/AİS değeri ölçülür. Kalibrasyon verilerinden CX/CİS değeri tayin edilir ve CX hesaplanır Alan Normalizasyonu Metodu Örnek enjeksiyonundaki düzensizliğin yarattığı hata alan normalizasyonu ile de giderilebilir. Bu yöntemde örnekteki tüm maddelerin kolondan çıkması gerekir. Kromatogramdaki tüm piklerin alanları hesaplanır ve her madde için bilinen detektör algılama faktörü ile çarpılarak düzeltilir. Analitin konsantrasyonu, analit pikine ait alanın toplam pik alanlarına bölünmesiyle hesaplanır. Sayfa 25 / 94

26 Örnekte bulunan her bir analit için bir standart hazırlanır ve kromatogramı alınır, relatif dedektör responsu hesaplanır. relatif respons = pik alanı /enjekte edilen miktar Bir seri analit için relatif dedektör responslar normalize edilerek istenilen respons faktörlere dönüştürülebilir; örneğin, her bir değer en büyük değere bölünür. respons faktörü = relatif respons /en büyük değer Elde edilen alan değerleri (ham veriler), respons faktörlere bölünerek indirilmiş alanlar bulunur, bu değerler miktarla orantılıdır (%kütle, %hacim, %ağırlık, ). indirilmiş alan = alan /respons faktörü Her bir bileşenin % değeri bulunur. ağırlık,% = Örnek 5 Butil-alkoller karışımı bir örneğin kromatogramının alan normalizayon yöntemine göre incelenmesi. Detektör hassasiyeti düzeltme faktörleri bilinen miktarlarda saf alkoller kullanılarak ayrı deneylerde saptanmıştır. RF (respons faktör) = normalize edilmemiş relatif respons/listedeki en büyük değer; bunlar, enjekte edilen eşit miktarlardaki analitin, en büyük değer için 1 e normalize edilmesiyle bulunan alanlardır. Standartlar için elde edilen veriler Örnekler için elde edilen veriler: Elde edilen alan değerleri (ham veri), respons faktörlere bölünerek indirilmiş alanlar bulunur, bu değerler % ağırlıkla orantılıdır. Sayfa 26 / 94

27 1.7.5 Elektrot Kalibrasyonu Cam ph Elektrodun Kalibrasyonu Bir ph ölçmesinde dikkat edilmesi gereken hususlar: 1. En az iki standart tampon seçilerek ölçülecek ph değerinin bu tamponların ph değerleri arasında bulunması gerekir: Örneğin ph değeri 5 dolayında ise, standartların ph larının, ph = 4 ve ph = 7 olması önerilir. Örneğin ph değeri 3 dolayında ise, standartların ph larının, ph = 2 ve ph = 4 olması önerilir. 2. Cam elektrodun responsu daima voltj veya mv olarak kaydedilir. 1. algılama kısmı; hazne özel bir camdan yapılmıştır 2. az miktarda AgCl (bazen konur) 3. iç çözelti (ph için 0.1 M HCl) 4. iç çözelti (genellikle AgCl elektrot veya kalomel elektrot) 5. elektrot bedeni (iletken olmayan camveya plastik) 6. referans elektrot (genellikle AgCll elektrot veya kalomel elektrot) 7. örnek çözeltisiyle bağlantı (genellikle seramik veya kapiler asbest veya kuvartzfiber) Cam Elektrodun Responsu (Algılaması) Elektrot kalibre edilirken ph değeri değil, cam elektrodun voltaj değeri ölçülür. Yeni bir elektrot, ortam koşullarında, 60 mv/ph dolayında bir respons verir. ph = 7 4 arasında elektrot potansiyeli +180 mv kadar yükselir. ph = 7 10 arasında elektrot potansiyeli +180 mv kadar düşer. Sayfa 27 / 94

28 Elektrot yaşlandıkça kalibrasyon doğrunsun eğimi azalır, respons zamanı da uzar; yani, elektrodun cevap vermesi yavaşlar. Reasponsun 60 mv un önemli derecede altına düşmesi ve respons zamanının da çok yavaşlaması durumunda elektrot kullanılamaz hale gelmiş demektir. Cam elektrodun responsunun yavaşlaması kalibrasyon doğrusunun eğiminin düşmesiyle de kendini gösterir. Yaşlanan elektrodda gözlenen bu durumun nedeni, zamanla elektrodun organik ve inorganik iyonlarla kirlenmesidir. Organik iyonlar membranda adsorblanır, Na + ve K + gibi inorganik iyonlar ise jel tabakasına girerler ph Ölçmelerinde Hatalar Yanlış kalibrasyon: Ölçülen ph değeri standartlardan daha doğru olamaz (±0.01 ph). Kalibrasyonda kullanılacak tamponun hatalı hazırlanması veya hazır-lanmış tamponun bekleme nedeniyle bileşiminin değişmesi (organik kısımlar bak-teriler tarafından etkilenerek tamponun zamanla kirlenmesine neden olur) ph ölçümünde hatalı sonuçlara yol açar Sodyum (alkali) hatası: Yüksek ph değerlerinde elektrodun Na+ iyonlarını algılamasından kaynaklanır; okunan ph değeri, gerçek değerden daha düşüktür. Herhangi bir cam elektrot ph > 9 'da alkali metal iyonlarına karşı kısmen duyar olmaya başlar Asit hatası: Çok düşüş ph değerlerinde ortaya çıkar. ph < 0.5 in altındaki değerlerde cam elektrotlarla elde edilen sonuçlar gerçek değerlerden bir miktar yüksektir Sıcaklık değişikliğinin etkisi ph metrede normal sıcaklık düzeltmesi sadece ph elektrodundan algılanan mv değerinde yapılır, fakat çözeltideki sıcaklık değişiklikleri cihaz tarafından düzeltilemez. Çözeltide ph ın sıcaklıkla değişimini düzeltebilmek için, çalışılan çözeltiyle bir ph-sıcaklık kalibrasyonu yapılır; deney sonuçları bu kalibrasyon değerlerine göre düzeltilir. Modern ph metrelerde, hazırlanan ph-kalibrasyon değerleri cihazın programına girilerek düzeltmenin cihaz tarafından yapılması sağlana-bilmektedir. Aşağıdaki tabloda bir ph-sıcaklık düzeltme kalibrasyon değerleri verilmiştir. Sayfa 28 / 94

29 (Temas potansiyelindeki değişiklikler ve elektrot neminin kaybolması da elektrotlarda karşılaşılan diğer hata kaynaklarıdır.) 1.8. Enstrümental Analizde Çözeltiler Konsantrasyon Birimleri ve Seyreltme Derişim Bir çözeltinin bilinen bir hacimdeki çözünen madde miktarı derişim (konsantrasyon) olarak tanımlanır. Derişim yüzde derişim, molarite, normalite, ppt, ppb, ppm, µg/kg ve mg/kg cinsinden ifade edilebilir. Bunlardan başka mol kesri, mol yüzdesi ve molalite gibi kavramlar da kullanılabilir Yüzde Derişim Bir çözeltinin konsantrasyonu yüzde olarak birkaç şekilde ifade edilir. Karışıklıkları önlemek için yüzde konsantrasyon mutlaka açık olarak belirtilmelidir. Eğer bu bilgi olarak verilmemiş ise çözeltinin türünden çıkarılmaya çalışılmalıdır. Bu ifadelerin belirtilmesinin ne denli önemli olduğunu en iyi anlatacak örnek; ağırlıkça (m/m) % 50 lik NaOH çözeltisi, 1 litresinde 763 g NaOH içeriyor demektir. Bu da hacimde ağırlıkça yüzde (m/v) olarak % 76.3 demektir Ağırlıkça Yüzde (m/m) Ağırlıkça yüz birim çözeltide bulunan çözünenin ağırlıkça kesridir. Genellikle ticari sulu reaktifler için kullanılır. Örneğin Hidroklorik asit % 37 lik (m/m) çözeltisi halinde satılır. %(m/m) = çözünen maddenin ağırlığı(g)/[çözünen madde(g)+çözücünün ağırlığı(g)]x100 Örnek : 500 g %50 lik (m/m) NaOH çözeltisi nasıl hazırlanır. % 50 = [X/(X+(500-X)]x100 X= 250 g çözünen O halde bu çözeltinin hazırlanmasında 250 g NaOH alınır ve üzerine 250 ml saf su eklenir Hacimce Yüzde (v/v) Hacimce yüz birim çözeltide bulunan çözünenin hacimce kesridir. Saf bir sıvının başka bir sıvı içinde seyreltilmesi ile hazırlanan çözeltiler için kullanılır. %(v/v) = çözünen maddenin hacmi(v)/[çözünen madde(v)+çözücünün hacmi(v)]x100 Örnek : 150 ml % 28 lik (v/v) sulu etil alkol çözeltisi nasıl hazırlanır. % 28= (X/150)x100 X= 42 ml 42 ml etil alkol alınır ve son hacim saf su ile ml ye tamamlanır. Sayfa 29 / 94

30 Hacimde Ağırlıkça Yüzde (m/v) Hacimce yüz birim çözeltide bulunan çözünenin ağırlıkça kesridir. Katı maddelerin seyreltik sulu çözeltilerinin hazırlanmasında çözeltiler için kullanılır. Sulu reaktifler için kullanılır. %(m/v) =[çözünen maddenin ağırlıkça(g)/çözeltinin hacmi] x100 Örnek : 250 ml % 20 lik NaCl çözeltisini hazırlamak için kaç g NaCl gerekir? % 20 = (m/250)x100 m= 50 g Bu durumda 50 g NaCl tartılarak suda çözülüp son hacmi saf su ile 250 ml ye tamamlanır Molarite Molarite, bir litre çözeltide çözünen maddenin mol sayısını gösterir. M harfi ile gösterilir. M=n(mol)/V(L) Örnek : 500 ml 0.1 M NaOH çözeltisi için kaç g NaOH tartılmalıdır. MA(Molekül ağırlığı NaOH) = 40 g/mol M=n/V 0.1 mol/l= n/0.5 (L) n= 0.05 mol N=m/MA 0.05 mol = m/40 (g/mol) m= 2 g 2 g NaOH tartılarak son hacim dikkatlice 500 ml ye tamamlanır Normalite Çözeltinin 1 ml sinde bulunan çözünen maddenin mili eşdeğer gram sayısıdır. Aynı ifade Çözeltinin 1 L sinde bulunan çözünen maddenin eşdeğer gram sayısı olarak ifade edilir. N=(m/eşdeğer gram sayısı)/v Eşdeğer gram sayısı= Molekül ağırlığı/tesir değerliliği Tesir Değerliliği (TD): Asitlerin ortama verdiği H + iyonu sayısı, bazların ortama verdiği OH - sayısı, tuzların ortama verdiği veya aldığı elektron sayısına tesir değerliliği denir. Örneğin H2SO4 için bu değer 2 dir. Çünkü sülfürik asit 2 tane H + iyonunu sulu çözeltisine verebilir. NaOH, HNO3, HCL için bu değer 1 dir. Fakat tesir değerliliği hesaplanırken, tesir değerliliği bulunacak maddenin reaksiyona girdiği madde ile verdiği tepkimeye göre tesir değerliliğinin değişebileceği unutulmamamladır. Bu nedenle son zamanlarda normalite kavramı yerine maddenin reaksiyonu yazılarak stokiyometrik oran üzerinden hesaplama yapılmaktadır. Molarite ve normalite arasında N= MxTD bağlantısı vardır ppt (binde bir), ppm (milyonda bir) ve ppb (milyarda bir Hesaplamalar Eser miktarda çözeltilerin derişimlerini belirtmek amacıyla kullanılır. Sayfa 30 / 94

31 ppt = (g çözüne / kg veya litre çözelti) ppm = (mg çözüne / kg veya litre çözelti) ppb = (µg çözüne / kg veya litre çözelti) Not: Bazen ppt ifadesi part per thousand (binde bir) olarak kullanıldığı gibi bazende part per trilion (trilyonda bir) olarak ifade edilebilir. Bu nedenle hangi ifade için kullanıldığına dikkat edilmelidir. Örnek: Bir su örneğinin analizi sonucunda bulunan Na + derişimi 200 ppm olarak bulunmuştur. Sudaki sodyum kaynağının NaCl olarak düşünülmektedir. NaCl ün derişimini hesaplayınız. Bu durumda çözeltinin litresinde 200 mg Na + vardır. N (mol) = m(g)/ma (g/mol) formülüden önce mol sayısı bulunur. nna + = (200x/10-3 )g)/23/mol)=8.70x(10-3 ) mol, V= 1 L olduğu için n=m [Na] 8.70x (10-3 ) M Sayfa 31 / 94

32 3. ENSTRÜMENTAL GIDA ANALİZLERİNDE ÖN HAZIRLIK 2.1 Gıdalarda Yapılan Enstrümental Analizler Klasik kantitatif analiz metotları dediğimiz gravimetrik analizler bileşenin kütlesi, titrimetrik analizde ise bileşenle reaksiyona giren standart bir numunenin hacmi tayin edilir. Ve bu hacimden yararlanılarak analizi yapılmak istenen maddenin kütlesi bulunur. Eskiden analizler sadece bu metotlarla yapılırdı. Ancak, 1930 lu yıllardan sonra analizler için cihaz kullanılmaya başlanmıştır li yıllardaysa cihazlarda ve kullanımlarında anormal bir artış göstermiştir. Bu cihazları kullanarak yapılan analizlere de enstrümental analizler denmiştir. Enstrümental analizlerin kullanılması, o tarihten günümüze kadar artarak devam etmiştir. Buna bakarak enstrümental analizlerin bir gün gelecekte tamamen klasik metotların yerini alacağı fikrine kapılmamak gerekir. Her enstrümental analizin temelinde genellikle klasik analiz işlemleri (numune alma, tartma, ayırma, ph ayarlama, hacim ölçme vb.) yatar. Klasik analizlerin sayısı belki biraz azalacak ama yine de devam edecektir Enstrümental analiz metotlarının klasik analiz metotlarına göre avantajları şunlardır: Enstrümental analiz metotları, çok düşük konsantrasyonlarda bile iyi sonuç vermektedir. Klasik analiz metotlarında bu kadar düşük konsantrasyonlar tayin edilemezler. Enstrümental analiz metotları, klasik metotlardan daha hızlıdır ve kısa sürede sonuçlar alınabilir. Enstrümental amaçla kullanılan bir cihaza mikrobilgisayar bağlanarak, analiz sonuçları otomatik olarak kaydedilebilir. Kısacası enstrümental analiz metotları otomasyona uygundur Enstrümental analiz metotlarının klasik analiz metotlarına göre dezavantajları Enstrümental analizde kullanılan cihazlar laboratuvarda özel bir yer isteyen, pahalı ve bakıma ihtiyaç gösteren cihazlardır. Enstrümental analizde elde edilen sinyallerin değerlendirilmesi iyi yetişmiş insan gücüne ihtiyaç gösterirken klasik analizde ise buna gerek duyulmaz. Enstrümental metotların öğretilmesi ve öğrenilmesi güç iken klasik analizinki kolaydır. Enstrümental analizler, konsantrasyonları yüksek olan maddelerde uygulanamazken klasik metotlar çok kolay uygulanır. Enstrümental metotlarda cihazlar kullanılmadan önce kalibre edilmek için standart maddelere ihtiyaç duyulurken klasik analizlerde böyle bir işleme gerek yoktur. Sayfa 32 / 94

33 Enstrümental metotlar arada bir yapılacak analizler için uygun değildir. Zira bu analizlerde kalibrasyon eğrisi oluşturmak hem pahalı hem de çok zaman alıcı bir işlemdir. Klasik analizde kalibrasyon eğrisine ihtiyaç yoktur. Zamanımızda klasik metotlarla yapılamayan pek çok analiz enstrümental analizle yapılmaktadır ve nerdeyse, maddenin her fiziksel özelliği üzerine bir enstrümental analiz metodu geliştirilmiştir. Örneğin, madde ışın enerjisini absorpluyorsa absorptimetri, floresans özelliği gösteriyorsa spektroflorimetri, renkliyse kolorimetri, elektrik akımı geçiriyorsa kondüktometri vs. metotları ortaya konmuştur. Bunlarla ilgili geniş bilgi Tablo 1.1 de verilmiştir. Tabloda fiziksel özellik yerine sinyal kullanılmasının nedeni kullanılan cihazın kalitatif veya kantitatif olarak belirtilmek istenen özelliği bir sinyal olarak vermesidir. Bu sinyaller bu konuda bilgili kişiler tarafından incelenerek söz konusu madde hakkında yeterli bilgi elde edilir. Günümüzde enstrümental analiz yöntemleri birçok alanda olduğu gibi gıda kontrolünde ve gıda araştırmalarında çok önemli bir yer tutmaktadır. Her geçen gün yeni enstrümental analiz yöntemleri uygulamaya katılmakta, eski yöntemler ise geliştirilmektedir. Teknolojik gelişime paralel olarak cihazların duyarlılıkları ve seçicilikleri de artmaktadır. Bir analiz, proses veya kalite kontrolü için yapılıyorsa, analiz sonucunun yapılan işe esas olan standardın şartlarını karşılayıp karşılamadığına bakılır ve bu gibi durumlarda analizlerin çok süratli yapılması istenir. Bu nedenle de enstrümental analiz metotları kullanılır ve otomasyona uygun metotlardır. Enstrümental analiz metotları ile birçok gıda örneğinde hızlı bir şekilde otomatik olarak tayin yapılabilmektedir. Bu da hem zamandan kazanıma hem de anında müdahaleye olanak sağlamakta ve gıda kontrolünde enstrümental analiz metotlarının kullanılmasının yaygınlaştırma zorunluluğunu da ortaya koymaktadır. Enstrümental analizler metotları, örneği oluşturan bileşenlerin verdiği sinyalleri değerlendirme prensibine bağlı olduğundan bu metotların anlaşılması kolay değildir. İstek, sabır, bilgi ve tecrübe birikimi gerektirdiği asla unutulmamalıdır. Enstrümental gıda analiz metotları şu şekilde gruplandırılabilir: Spektroskopi Moleküler Spektroskopi Atomik Spektroskopi Polarimetri Refraktometri Kromatografi Sıvı Kromatografisi Gaz Kromatografisi Sayfa 33 / 94

34 Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC) Kağıt ve ince Tabaka Kromatografisi Potansiyometri Gıda analizlerinde enstrümental analiz yöntemlerinden fotometrik analiz yöntemleri tercih edilir. Çözeltilerin ışığı absorbe (soğurma) etme, ışığı geçirme veya kırma gibi özelliklerinin ölçülmesi esasına dayanan yöntemlere fotometrik yöntemler denir. Bu analiz yöntemlerinde şunlar yapılır: Analiz edilecek örnek çözelti haline getirildikten sonra üzerine belli bir kimyasal ilave edilir. Böylece elde edilen sistemin ışığı absorbe etme, ışığı çevirme veya ışığı kırma dereceleri ölçülür. Ölçüm değerleri aynı koşullarda hazırlanmış ve içerisine belli miktarda madde bulunan bir standart seri ile karşılaştırılarak sonuca gidilir. Fotometrik analiz yöntemlerinin en büyük avantajı seri çalışmaya ve çok az madde miktarlarının bile belirlenmesine imkân sağlamasıdır. Başlıca fotometrik analiz yöntemleri şunlardır: Spektrofotometri Kolorimetri Refraktometri Türbidometri Fluorometri Bu enstrümental analiz metotlarından gıda analizlerinde en çok kullanılan spektroskopi, refraktometri, polarimetri, kromatografi ve potansiyometri ile ilgili detaylı bilgiler ilgili kısımlarda verilecektir. Sayfa 34 / 94

35 Gıdalarda yapılan enstrümental analizlerden bazıları Tablo 2.1 de verilmiştir Analiz 1.BESİN ETİKETİ ANALİZLERİ Nişasta (kantitatif) tayini C Vitamini analizi 2. GENEL ANALİZLER Briks tayini (Kuru Madde) Kırılma indisi Suda çözünen madde tayini Kırılma indisi tayini ph tayini Metod Polarimetrik yöntem Spektrofotometrik yöntem Refraktometrik yöntem Refraktometrik yöntem Refraktometrik yöntem Refraktometrik metot Potansiyometrik yöntem 3. KATKI MADDELERİ VE KONTAMİNANT ANALİZLERİ Aflatoksin (B1, B2, G1, G2), Okratoksin Benzoat tayini Boya tayini (kalitatif) Nitrit/nitrat tayini Spektrofotometrik yöntem 4. YAĞ ANALİZLERİ Yağ asitleri kompozisyonu UV ışığında özgül soğurma Kolestrol, steroller Bazı hormonlar 5. SÜT VE SÜT ÜRÜNLERİ ANALİZLERİ Glikomakropeptid analizi (PAS analizi) 6. ET VE ET ÜRÜNLERİ ANALİZLERİ Hidroksiprolin miktarı Nitrit/nitrat tayini HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) yöntemi Spektrofotometrik yöntem Kağıt Kromatografisi Spektrofotometrik yöntem Spektrofotometrik yöntem Gaz Kromatografisi Spektrofotometrik yöntem Gaz Kromatografisi Gaz Kromatografisi 7. MEYVE-SEBZE VE ÜRÜNLERİ ANALİZLERİ Benzoik asit tayini Briks tayini Hidroksimetil furfural tayini Laktik asit tayini Meyve oranı HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) yöntemi HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) yöntemi Spektrofotometrik yöntem Spektrofotometrik yöntem Refraktometrik yöntem Spektrofotometrik yöntem Spektrofotometrik yöntem Spektrofotometrik ve mineral analiz Sayfa 35 / 94

36 Tablo 2.1 devamı Prolin tayini Salçada likopen tayini Sirkede yapaylık tayini Suda çözünen madde miktarı Boya maddeleri tayini (kalitatif) Fenolik madde profili 8. TAHIL VE TAHIL ÜRÜNLERİ Aflatoksin analizi Nişasta tayini Lipoksigenaz aktivitesi tayini 9. KURU BAKLAGİL ANALİZLERİ Izoflavon miktarı Lipoksigenaz aktivitesi tayini Spektrofotometrik yöntemi Spektrofotometrik yöntem Kolorimetrik yöntem Refraktometrik yöntem Kağıt Kromatografisi HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) yöntemi HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) ile analiz Polarimetrik yöntem Spektrofotometrik yöntem HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) yöntemi Spektrofotometrik yöntem 10. ŞEKERLİ/ÇİKOLATALI ÜRÜNLER ANALİZLERİ Boya tayini (kalitatif) Kağıt Kromatografisi Diyastaz tayini Hidroksimetil furfural tayini Nişasta miktarı Şeker kompozisyonu analizi HPLC 11. ÇAY ANALİZLERİ Boya tayini (kalitatif) Antioksidan aktivitesi tayini Fenolik madde profili Kafein Kolorimetrik yöntem Spektrofotometrik yöntem Polarimetrik yöntem HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) yöntemi Kağıt Kromatografisi Spektrofotometrik yöntem HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) yöntemi HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) yöntemi Sayfa 36 / 94

37 2.2 Enstrümental analizlerde ön hazırlıklar Yapılacak enstrümental analiz metoduna göre öncelikle ön hazırlıkların yapılması gerekir. Bu analiz yöntemlerinde analiz edilecek örnek çözelti haline getirilmelidir. Bunun için örneklerin analiz yöntemlerinde belirtildiği şekilde çözeltiler ve kimyasal maddeler hazırlanmalıdır. Daha sonra bu örneğe ölçüm yapmadan önce ilave edilecek kimyasal maddeler analiz yönteminde belirtilen şekilde hazırlanmalıdır. Analiz öncesi sistemin ışığı absorbe etme, ışığı çevirme veya ışığı kırma dereceleri ölçümü için cihazlar kullanım talimatlarında belirtilen şekillerde çalıştırılarak kullanıma hazır hale getirilmeleri gerekmektedir. Bunun için her cihaz için ayrı işlemler yapılmaktadır. Bu konular ilgili faaliyetlerde ayrıntılı olarak anlatılacaktır. Ölçüm değerlerinin aynı koşullarda ve içerisine belli miktarda madde bulunan bir standart seri ile karşılaştırılması için analiz öncesi standart seri çözeltilerinin hazırlanması çözeltileri belirlenip, çözelti hazırlama esasları uygulanarak hazırlanır. Bu standart seri çözeltilerden bazıları analiz kitleri olarak hazır halde de bulunmaktadır. Bu kitler bulunuyorsa standart seri çözeltilerinin hazırlanmasına gerek yoktur. Enstrümental gıda analiz yöntemlerinde analiz öncesi hazırlıklar değişmekle birlikte genel olarak analiz föyü dikkatlice okunmalı ve aşağıdaki işlemler yapılmalıdır. Analiz için gerekli kimyasal çözeltilerinin listesi çıkarılmalıdır. Listelenen çözeltiler usulüne uygun olarak teker teker hazırlanmalıdır. Standart seri çözeltileri hazırlanmalı ya da analiz kitleri tedarik edilmelidir. Örnek, analiz için, analiz föyünde belirtilen şekilde hazırlanmalıdır. Kulanım talimatlarına uygun olarak cihaz çalışmaya hazır hale getirilmelidir. Sayfa 37 / 94

38 3. ALETLİ ANALİZLERİN SINIFLANDIRILMASI Aletli analizleri başlıca üç grupta toplayabiliriz: 3.1 Optik Yöntemler Optik yöntemleri dört ana başlık altında toplayabiliriz. Bütün optik yöntemlerde ışının madde ile etkileşimi incelenir. Bu etkileşim sırasında soğuran veya yayılan ışının özellikleri veya ışının uğradığı diğer değişiklikler ölçülür. Bu tür ölçüm yöntemlerine genel olarak spektroskopi denir. Bu yöntemleri anlayabilmek için ışınla ilgili bilgileri bilmek gerekir Işın ve Özellikleri Işın foton adı verilen enerji paketlerinden meydana gelmiş bir dalga hareketi olarak kabul edilir. Bir başka deyişle ışın içinde enerji paketlerinin taşındığı bir dalga hareketidir. Dolayısıyla bir enerjisi ve bir dalga boyu vardır. Fotonların enerjisi E=hγ =hc/λ = hcγ eşitliği ile ifade edilir. Burada h Plank sabiti, γλ frekansı, c ışının boşluktaki hızını λ dalga boyunu. -γ ise dalga sayısını belirtir. Enerji frekans ile doğru, dalga boyu ile ters orantılıdır. Işının spektrumu, bütün dalga boyu sistemini ihtiva eder. Analizlerde, kullanılacak ışının dalga boyuna göre ölçülecek özellik dolayısıyla kullanılacak yöntem farklıdır Işının Madde ile Etkileşimi Bir madde üzerine gönderilen ışın, bu maddenin atom veya molekülleri ile etkileşime girer. Etkileşim, maddenin ve gönderilen ışının özelliklerine göre farklı şekilde olur. Sonuç olarak ışın ya maddeden geçerek ilerler ya da madde tarafından soğurulur, yansır veya saçılır Işının Soğurulması Bir ışın; geçirgen bir katı, sıvı veya gaz içinden geçirilirse bazı dalga boylarının yok olduğu görülür. Bu durum, ışın enerjisinin maddedeki atom veya moleküllere aktarılmasının bir sonucudur. Bu olaya soğurma denir. Böylece kararlı durumda yani en düşük enerji düzeyinde bulunan tanecikler bu şekilde kalmayı istemezler ve soğurdukları enerjiyi geri vererek yaklaşık 10-8 λ saniyede ilk durumlarına göre dönerler. Bu olayda çıkan enerji çoğunlukla ısı şeklinde görülür. Enerjinin geri verilmesi bazı hallerde uyarılmış olan tanecikler kimyasal değişmeye uğrayarak enerji soğururlar bazı hallerde de soğurulan enerji çoğunlukla daha uzun dalga boyunda olmak üzere geri verilir. Bazı hallerde ise olaylar bir arada olur. Atom molekül veya iyonların belli sayıda enerji düzeyleri vardır. Işının soğurulması için maddenin kararlı düzeyi ile uyarılmış düzeyi arasındaki enerji farkı, ışının enerjisine eşit olmalıdır. Bu sebeple soğurulan ışının özelliklerinin ölçülmesiyle soğurucu madde hakkında bilgi edinir. Soğurma; atom veya moleküller tarafından olabilir. Atomik soğurmada, bir ışık kaynağından analiz edilecek maddenin buhar fazındaki atomları üzerinde belli dalga boyunda ışın gönderilir. Örneğin bir sodyum analizinde, örnek alevde Sayfa 38 / 94

39 buharlaştırılır ve buhar içine belli dalga boyunca ışın gönderilirse 3s yörüngesindeki elektron 3p yörüngesine geçtiğinden ışının soğurulduğu görülür. Soğurma miktarı ortamdaki sodyum atomlarının derişimi ile orantılı olduğundan bu şekilde nicel tayin yapılabilir. Yalnız elektron geçişleri sebebiyle değil molekül hareketleri sebebiyle de soğurma olabilir. Bilindiği gibi bir molekülün enerjisi elektronik, dönme ve titreşim enerjilerinin toplamına eşittir. E Toplam = E Elektronik + E Titreşim + E Dönme Toplam enerji içindeki elektronik enerjinin payı diğerlerine oranla oldukça fazladır. Elektron geçişi, dönme ve titreşimden başka çekirdek veya elektronların kuvvetli bir manyetik alanda enerji düzeyleri değiştirilebilir ve radyo dalgaları düzeyinde ışının soğurulmasına sebep olunabilir Işının Yayılması Gaz halinde iken belli bir enerji ile uyarılmış olan atom veya moleküllerdeki elektronlar bu halde kalmaz ve hemen ilk durumlarına döner. Bu dönüş sırasında belli bir ışın yayar. Yayılan bu ışının enerjisi uyarılmış elektronun bulunduğu yörüngeç ile ilk yörüngeç arasındaki enerji farkına eşittir. Yayılan ışının şiddeti ortamda bulunan atomların derişimine bağlı olduğundan bu ışının özelliklerinin ölçülmesiyle nicel analizler yapılabilir. Gönderilen enerjinin şiddeti çok fazla olursa içteki elektronlar daha yüksek enerji düzeylerine çıkar veya atomlardan tamamen uzaklaşır. Elektronun uzaklaşmasıyla meydana gelen boşluk daha üst yörüngeçlerdeki elektronlardan biri tarafından doldurulur ve iki yörüngeç arasındaki enerji farkı ışın olarak dışarıya verilir. Yayılan bu ışın X- ışınıdır. Yüksek enerjiye sahip olan bu ışının dalga boyu elemente ve elektronun hangi yörüngeçten geldiğine göre değişir Işının Maddeden Geçmesi Gözlemler, saydam bir ortamdan geçen ışının hızının boşluktakinden daha az olduğunu ve ayrıca saydam ortamdaki atom, iyon veya moleküllerin derişimine bağlı olarak değiştiğini göstermiştir. Bu gözlemler ışının madde ile etkileşimine girdiğini ancak gecen ışının frekansında bir değişiklik olmadığından bu etkileşim sırasında bir enerji aktarımının olmadığını göstermektedir. Işının ortam ile etkileşimi kırılma indisi ile ölçülür ve Ni =C/ Vi Vi şeklinde ifade edilir. Burada λ belli bir i frekansındaki ışının kırılma indeksini, Vi bu ışının saydam ortamdaki hızını, C ise boşluktaki hızını belirtir. Bir ortamdan yoğunluğu farkı başka bir ortama geçerken ışının yönünün değiştiği görülür. Buna ışının kırılması denir. Sayfa 39 / 94

40 Şekil 3.1 Gelen ışın, kırılan ışın ve normal aynı düzlemde bulunur.belirli ortamlar için geliş açısının sinüsünün kırılma açısının sinüsüne oranı sabittir. Sin i / sin r = a Snell kanunu Işık yoğunluğu az ortamdan, yoğunluğu fazla olan ortama girdiğinde hem daha fazla acıyla kırılır hem de hızı azalır Lambert-Beer Yasası Io şiddetinde, paralel bir ışın demeti b kalınlığında ve C derişiminde absorplayıcı bir tabakadan geçirilirse, gelen ışının gücü veya şiddeti azalır. Bu yasa, ışımanın absorplanan miktarı, çözeltinin derişimine ve izlediği yolun uzunluğuna bağlıdır. Eşitlik aşağıda verilmiştir. Ölçülen absorbansla derişim arasındaki ilişkinin geçerli olması bazı koşullara bağlıdır. Bu koşullar olmadığı takdirde Lambert-Beer yasasından sapmalar meydana gelir. Bu sapmaların en büyük nedenlerinden birisi derişimdir M daha derişim çözeltilerde moleküller arası etkileşim nedeniyle Lambert-Beer yasasından negatif yönde sapmalar meydana gelir. Bundan başka çözelti ortamında ayrışma, polimer oluşturma, sıcaklık değişimi vs bu yasadan sapmalara neden olur. Şekil 3.2 Sayfa 40 / 94

41 Geçirgenlik (T) Geçen ışın şiddetinin gelen ışın şiddetine oranıdır. Genellikle yüzde geçirgenlik olarak ifade edilir Absorbans (A) Gelen ışık şiddetinin geçen ışın şiddetine oranın logaritmasıdır. Absorbans ile geçirgenlik ters orantılıdır Absorptivite (a) Birim derişimde birim kalınlıktaki numunenin absorbansıdır. A α b C yani A= a x b x C Burada a orantı katsayısı olup, absorptivite dir. Çözeltinin derişimi Molarite Çinsinden verilmişse, absorptiviteye molar absorptivite katsayısı adı verilir. Bu durumda, A= ε x b x C olur Işının Soğurulması Temeline Dayanan Aletli Analizler Soğurma temeline dayanan aletli analizler kullanılan ışının dalga boyuna göre üç ana grupta incelenir: Mor ötesi ve görünür ışınlarla yapılan soğurma analizleri Kızıl ötesi ışınlar ile yapılan soğurma analizleri Radyo dalgaları ile yapılan soğurma analizleri Mor ötesi veya görünür bölge ışınları ile daha çok çözeltilerdeki örneklerin analizi yapılır. İçi sıvı ile doldurulmuş bir kap içindeki bir ışın geçirilirse diğer tarafa geçen ışının gücünde bir azalma olduğu görülür. Işının gücündeki azalma bir oranda maddenin yüzeyinden yarısına veya madde içinde asılı parçacıklara çarpma sonucu saçılma da olabilir; ancak bu sebeplerle azalma oldukça önemsizdir. Işının gücündeki azalmanın asıl sebebi ışının madde tarafından soğurulmuş olmasıdır. Bir çözeltinin görünen bölgede hangi dalga boyundaki ışınları soğurduğu çözeltinin rengine bağlıdır. Beyaz ışıktaki belli dalga boyundaki ışınlar soğurulursa veya bir başka deyişle belli renkteki ışınlar soğurulursa görünen ışık beyaz değil farklı bir renkte olur. Mesela bir çözelti sarı renkte ise dalga boyu o A arasındaki ışınlar yani mavi ışınları soğurur. Aşağıdaki çizelgede çeşitli renklerdeki çözeltilerin soğurdukları ışınlar ve bunların dalga boyları verilmiştir. Sayfa 41 / 94

42 Soğurulan ışının ölçülmesine dayanan kimyasal analizlere genel olarak soğurma ölçümlü denir. Renkölçümü(kolorimetri) sözcüğü ise yalnız görünür bölge ışınları ile yapılan soğurma analizleri amaçlanır. Mor ötesi ve görünür bölge ışınları ile yapılan analizlerde derişimi bilinen çözeltinin soğurduğu ışın ile bilinmeyen çözeltinin soğurduğu ışın miktarı karşılaştırılır. karşılaştırma işlemi ya doğrudan göz ile yapılır ya da elektronik almaçlar kullanılır. Çizelge 3.1: Çeşitli renkli çözeltiler ve bunların soğurdukları ışınlar Soğurulan ışının ölçülmesine dayanan kimyasal analizlere genel olarak soğurma ölçümlü denir. Renkölçümü(kolorimetri) sözcüğü ise yalnız görünür bölge ışınları ile yapılan soğurma analizleri amaçlanır. Mor ötesi ve görünür bölge ışınları ile yapılan analizlerde derişimi bilinen çözeltinin soğurduğu ışın ile bilinmeyen çözeltinin soğurduğu ışın miktarı karşılaştırılır. Karşılaştırma işlemi ya doğrudan göz ile yapılır ya da elektronik almaçlar kullanılır. Görsel Renk Ölçümü Görsel renkölçümünde derişimi bilinen çözeltinin rengi ile derişimi bilinmeyen çözeltinin rengini göz karşılaştırır. Görsel renk ölçümü için değişik yöntemler uygulanabilir. Nessler Yöntemi Bu yöntemde derişimi bilinen bir dizi çözelti hazırlanır ve bunlar aynı büyüklükteki tüplere konur. Derişimi bilinmeyen çözelti bu tüplerden birine konur ve renk şiddetleri karşılaştırılır. Rengi uyan tüpün derişimi bulunması istenen derişime eşit olur. A1 = a1 b1 c1 ve A2 = a2 b2 c2 eşitliklerinde A1 = A2 a1 =a2 b1=b2 c1= c2 olur. Bu amaçla kullanılan belli çap ve uzunluktaki tüplere Nessler tüpü denilir. Bu yönteme de Nessler yöntemi denir. Sayfa 42 / 94

43 3.1 Refraktometrinin İlkesi '''Refraktometri''', her ortamın kırılma indisinin farklı olması prensibini kullanarak, konsantrasyon ve madde miktarı gibi tayinleri yapmaya yarayan bir yöntemdir. Kırılma indisi her maddeye özgü bir fiziksel özelliktir, bu sebeple kalitatif ve kantitatif analizlerde kullanabileceğimiz bir metottur. Günümüzde organik bileşiklerin kantitatif analizinde NMR, infrared spektroskopisi gibi yöntemler daha çok tercih edilmektedir. Saydam bir ortamdan gelen bir ışının diğer bir saydam ortama geçerken doğrultusunu değiştirmesine ışığın kırılması denir. Bir ortamın kırılma indisi, ışığın boşluktaki hızının bu ortama giren ışık demetinin düşey düzlem ile meydana getirdiği havada ve bu ortamdaki açıların sinüslerinin oranı olarak ölçülür. Gelme açısının sinüsünün kırılma açısının sinüsüne oranına kırılma indisi denir. Bir ortamın kırılma indisine n, elektromanyetik ışımanın vakumdaki hızına c, elektromanyetik ışımanın bu ortamdaki hızına da v dersek, şöyle bir bağıntı elde edilir: n = c / v Benzer maddelerin kırılma indisleri birbirine çok yakın olduğundan ( arası) ±0.001 duyarlılıkla ölçüm yapabilir. Şekil 3.1 Işının bir ortama geliş açısına i, yansıma açısına da r dersek eğer, Snell Yasasına göre şöyle bir bağıntı yazılabilir: v1: Işının 1. ortamdaki hızı v2: Işının 2. ortamdaki hızı n1: 1. ortamın indisi n2: 2. ortamın indisi Işının geliş açısı, ışının hızı ve ortamın indisi ile orantılıdır. Işının geliş ve yansıma açılarının bilinmesi halinde, iki ortamın kırılma indislerinin oranları da bulabilinir. Ya da bir Sayfa 43 / 94

44 ortamın indisini biliniyorsa, diğer ortamın indisini de bu bağıntı sayesinde hesaplanabilinir. Kırılma indisleri farklı olan bölgelerde ışının hareketi iki şekilde gerçekleşir: n2 > n1 koşulunda, α geliş açısı, β yansıma açısından daha büyük olacaktır. Geliş açısı büyüdükçe, kırılma açısı da büyür. Buna rağmen geliş açısı, kırılma açısından her zaman daha büyüktür. n1 > n2 koşulunda, yüksek yoğunluklu ortamdan düşük yoğunluklu ortama geçiş sırasında yansıma açısı, geliş açısından daha büyüktür. Geliş açısı büyüdükçe, yansıma açısı da 90º ye yaklaşır. Işımanın 90º lik bir açı ile kırılmasını sağlayan geliş açısına kritik açı denir. Işının kritik açıdan daha küçük bir değerle gelmesi halinde, yansıma sonucu aydınlık bölge oluşur. Eğer ışın iki ortam arasındaki yüzeye kritik açıdan daha büyük bir açıyla gelirse, ışın kırılmaya değil, yansımaya uğrar. Yoğunluğu büyük ortama kritik açıyla gelen bir ışın, 90º lik bir açı ile kırılır. Yoğunluğu küçük ortama 90º lik açı ile gelen bir ışın ise yoğunluğu büyük olan ortama kritik açı ile girer. Snell yasasından yararlanarak şöyle bir bağıntı yazılabilir: Refraktometre cihazının içerisinde prizmalar kullanılır. Gönderdiğimiz ışın örnekten geçip prizmaya değişik açılarla gelir. Eğer; Geldiği açılar kritik açıdan küçükse, aydınlık bölge oluşur. Geldiği açılar kritik açıdan büyükse, karanlık bölge oluşur. Karanlık ve aydınlık bölgenin sınırı kritik açıya karşılık gelir. Şekil 3.2: Refraktometrede karanlık ve aydınlık bölgelerin oluşumu Sayfa 44 / 94

45 Şekil 3.3: Refraktometrede karanlık ve aydınlık bölgelerin oluşumu Bir maddenin kırılma indisi şunlara bağlıdır: Kullanılan ışımanın dalga boyuna Sıcaklığa Derişime Bunun dışında sıkıştırılabilen maddelerin kırılma indisi, basınca bağlı olarak da değişir. Dalga boyunun kırılma indisine etki etmesinden dolayı, kullanılan ışımanın dalga boyu da belirtilmelidir. Ticari refraktometrelerde genellikle sodyumun atomunun yaydığı yaklaşık eşit şiddetlerdeki, ve nm deki hatları kullanılır. Bu hatlar sodyum D hatları olarak adlandırılır Refraktometre ve Çeşitleri Refraktometreler, katı (Abbe tip modellerde) veya sıvılarda katı madde miktarı, kırılma indisi, şeker miktarı, refraktif indeks ve briks (Brix) aralıklarını ölçme amacıyla kullanılan cihazlardır. Piyasada gıda, kimya, ilaç vb. alanlarda kullanılmaktadır. Özellikle de gıda alanında şarap, meşrubat, reçel, bal, meyve suları, yemeklik yağlar gibi birçok üretim alanında kullanılmaktadır. Örneğin, çözünebilir yağlar ve yemeklik yağların kırılma indisleri ölçülerek, bunların saflık dereceleri ve acılık dereceleri tespit edilebilmektedir( Bir sıvı yağın acılaşma derecesi artıkça kırılma indisi de artar). Refraktometre çeşitleri şunlardır: Abbe refraktometreleri ( Dijital ve manuel) El refraktometreleri (Dürbün ve Dijital ) Sıcaklık ayarlamalı dijital refraktometreler Daldırma Refraktometresi Abbe Refraktometresi Genellikle Abbe refraktometresi şu kısımlardan oluşur: Sayfa 45 / 94

46 Prizma haznesi Su giriş ve çıkış kısımları Termometre haznesi Oküler Vidalar (makro ve mikro vidalar) Abbe refraktometresi ile ölçüm yapabilmek için aşağıdaki işlem basamakları takip edilir: Önce cihaz gün ışığına yönlendirilir (ya da ışık kaynağına bağlanır). Cihazın aynasını sağa sola çevirerek okülerden bakan göze ışığın en fazla gelmesi sağlanmalıdır. Prizmaların temiz olup olmadığı kontrol edilir. Temiz değilse alkolle ıslatılmış, yumuşak bir bezle temizlenir ve kurulanır. Bunun için cihazın orta kısmındaki kilitleme düğmesi açılır ve prizmalar birbirinden ayrılıp, temizlenip tekrar eski haline getirilir. Termometresi yerine takılır. Prizmaların etrafında sıcaklığı sabit olan su dolaştırmak suretiyle sabit bir sıcaklık (20 ºC) elde edilir. (bazılarında termostat bulunmaktadır. Bu durumda termostat 20ºC a ayarlanır.) Saf su ile 0 ayarı yapılır. Bunun için; Önce birkaç dakika prizmaların etrafında su dolaştırılarak prizmaların sıcaklığı 20ºC ye getirilmesi sağlanır. Resim 3.1: Abbe refraktometresi Sonra alttaki prizmaya birkaç damla saf su damlatılır. Alttaki prizmaya su damlatılınca üsteki prizma özel düğmesi ile suyu sıçratmayacak şekilde yavaşça kapatılır. Kırılma indisinin 20ºC de olup olmadığı kontrol edilir. Değilse cihazın skalası yaklaşık 1.33 kırılma indisine ayarlanır. Ayarlamada önce, okülerden bakıldığında skalanın üzerinde ayrı olarak görülen görüş alanındaki karanlık ve aydınlık alanların birbirinden net olarak ayrılmasını sağlamak, sonra da karanlık ve aydınlık alanları eşitlemek gerekir.bu işlem bunları birbirinden ayıran çizgiyi, çapraz Sayfa 46 / 94

47 çizgilerin kesiştiği nokta ile çakıştırarak yapılır. Netleştirme işlemi cihazın sağ yanında bulunan prizmaya kumanda eden küçük vida ile, çakıştırma ise örneğin konulduğu prizma ile birlikte skalayı da hareket ettiren büyük vida ile yapılır. Gerekirse oküler sağa sola döndürülerek göze göre ayarlanır. Saf su ile ayarlama yapılırken netleştirme işleminden sonra büyük vida ile sıcaklık 20ºC de iken skalanın üst bölümünde kırılma indisi rakamlarında değerine ait taksimat çizgisi, skala görüş alanının artasında skalaya dik kesen sabit çizgi ile üst üste getirilir. Böylece kuru madde değeri de 0 (sıfır) gösterir. 20ºC nin dışındaki sıcaklıklarda yapılan ayarlamalarda sıcaklığa karşı gelen kırılma indisi ile sabit çizgi çakıştığında % kuru madde sıfırdan farklı değer gösterebilir. Eğer örneğin kırılma indisi okunacaksa; önemli olan belli sıcaklıkta saf suyun kırılma indisini ayarlamaktır. Eğer % kuru madde miktarı okunacaksa saf su ile % 0 kuru maddeye ayarlamaktır. Bu durumda karanlık ve aydınlık sahayı ayıran net çizgi çapraz çizgilerin kesiştiği noktadan geçiyorsa cihaz ayarlanmış demektir. Aksi halde skalanın ayarı değiştirilmeden aletin sağ yanında ve en üstte bulunan üzeri kertikli kapak açılarak altındaki vida tornavida ile döndürülerek çakıştırma yapılır. Böylece refraktometre ayarlanmış olur. Bu vida karanlık ve aydınlık sahaların oranlarını değiştirdiği halde skalayı hareket ettirmez El Refraktometresi Bahçede, tarlada veya işletmenin herhangi bir yerinde kullanılabilir. El refraktometresi sıvı solüsyonların kırılma indislerini ölçen bir cihazdır. El tipi refraktometreler küçük hacimli, hafif olması nedeniyle, meyve suyu, süt, salça, reçel gibi çeşitli gıda endüstrilerinde rahatlıkla kullanılmaktadır. El Refraktometrelerinin Çeşit Ölçüm Aralığı Çözünürlük 0-18% % 0-32% 0.2% 0-80% 0.2% 45-82% 0.5% 0-90% 0.2% Sayfa 47 / 94

48 Resim 3.2: El refraktometresi Örnek Hazırlanması Refraktometre ile berrak yani süspansiyon halinde katı parçacıklar içermeyen örnekler incelenmelidir. Bulanık çözeltiler refraktometre deki aydınlık ve karanlık bölgeyi ayıran hattın belirgin ve kesin olarak oluşmasını engeller ve analiz sonucu hatalı bulunur; bu nedenle örneğin berrak olmasını sağlayacak şekilde hazırlanmasına dikkat edilmelidir Refraktometre ile Ölçümde İşlem Basamakları Uygun ve yeterli ışık kaynağı ile gerekli ışıklandırma sağlanır. Prizma kapağı açılır ve temiz olup olmadığı kontrol edilir. Gerekirse prizmasaf su ile yıkanır ve yumuşak kâğıt mendille silinerek kurulanır. Temiz ve kuru prizma yüzeyine oda sıcaklığındaki örnekten 2 3 damla sıkılır. Örnek prizma yüzeyine değdirilmeden yukarıdan damlatılır. Örnek konduktan sonra prizma kapağı kapatılır. Ayar vidaları ile aydınlık ve karanlık bölge netleştirilir. Karanlık ve aydınlık bölgenin kesiştiği noktadaki rakam okunur. Okuma yapıldıktan sonra prizma yüzeyi önce doğrudan sonra saf su ile silinir ve kurulanır. Özel ambalajını kaldırmadan prizma ve kapak arasına yumuşak kâğıt konur. Refraktometre kullanılmadan önce, ayarlı olup olmadığı kontrol edilmelidir. Prizmaya saf su damlatıldığında 0 okunuyorsa refraktometre ayarlıdır Daldırma Refraktometresi Daldırma tipi refraktometreler, cihazın bünyesinde bulunan su banyosu ile çalışır. Ölçüm yapabilmek için 3-5 ml örnek gereklidir. Bu tip cihazların okuma aralıkları arasındadır. Cihazın okuma hassasiyeti ± civarında olduğundan Abbe refraktometrelerine göre daha hassas ölçüm yapılabilir. Bu cihazların temel özelliği; ölçme yaparken alet prizmalarının ölçümü yapılacak sıvının içine daldırılması ve su içinden yansıyan ışının kullanılmasıyla ölçümün yapılması şeklinde olur. Abbe refraktometresi ile daldırma refraktometresi arasındaki fark; daldırma tipinde cihaz sudan gelen ışığı kullanır. Abbe refraktometresinde ise cihaz havadan gelen ışığı kullanır Dijital Refraktometreler Basit ölçüm yöntemiyle kullanım kolaylığı sağlayan, yüksek hassasiyetli, güvenilir ölçümler için tasarlanmış refraktometrelerdir. Bu refraktometrelerde ölçüm sonuçlarının kolay okunabilmesini sağlayan dijital okuma alanı bulunmaktadır. Sayfa 48 / 94

49 Resim 3.3: Dijital refraktometre 3.3 Refraktometrik Analizler Refraktometrik analizler nitel ve nicel olmak üzere iki amaçla yapılır Nitel Analizler Her maddenin ışığı kırma özelliği farklı olduğundan kırılma indisleri de farklıdır. Bu nedenle maddeler için kırılma indisleri ayırt edici bir özelliktir. Saflığından emin olunan bir örneğin refraktometre de kırılma indisi ölçülerek okunan değer kırlma indislerine ait tablo ile karşılaştırılır. Böylece bilinmeyen örneğin hangi madde olduğu tespit edilir. Ya da ne olduğu bilinen bir maddenin, saf olup olmadığını belirlemek veya yabancı madde katılıp katılmadığını belirlemek amacıyla kırılma indisinden faydalanılır. Örneğin, yemeklik yağların kırılma indisleri ölçülerek, bunların saflık dereceleri ve acılık dereceleri tesbit edilebilmektedir( bir sıvı yağın acılaşma derecesi artıkça kırılma indisi de artar). Maddenin yoğunluğu ile kırılma indisinin arasındaki ilişkiden faydalanılarak molar kırılma değeri (R) bulunur. Molar kırılma değeri, maddenin saflık derecesinin bir ölçüsüdür. Tablo 3.1: Bazı maddelerin kırılma indisleri Molar kırılma değerini bulmak için aşağıdaki eşitlikten faydalanılır. Sayfa 49 / 94

50 R: Özgül (spesifik) kırılma değeri n = Kırılma indisi M = Örnek maddesinin molekül ağırlığı d = Yoğunluk tur. Ölçülen kırılma indisi ve örnek yoğunluğu şüphe edilen bileşiğin molekül ağırlığı değeri ile birlikte yukarıdaki eşitliğe konularak R değeri bulunur. Bulunan bu R değeri bilinen bileşiklerin R' değerleri ile karşılaştırılır Nicel analizler İkili karışımların tayininde en kolay ve çabuk yöntem; çözeltilerin kırılma indislerinden faydalanmaktır. Düşük konsantrasyonlarda (seyreltik çözeltilerde), kırılma indisi ve derişim arasında lineer bir bağıntı vardır. Bu bağıntıdan faydalanarak bir dizi % çözeltiler hazırlanarak saf su ile refraktometrenin 0 ayarı yapıldıktan sonra bu çözeltilerin kırılma indisleri okunur. Kırılma indisleri ordinata, çözelti % derişimleri ise apsise yerleştirilerek konsantrasyon-kırılma indisi değeri grafiği çizilir. Numunenin % konsantrasyonu hesaplanır. Şekil 3.2: Örnek% konsantrasyon-kırılma indisi grafiği Refraktometrik Analizlerde Numunenin (Örnek) Hazırlanması Refraktometrik metot genellikle sıvı gıdalar veya çözeltilerde kullanılmaktadır. Bu nedenle numune, analizden önce homojen hale getirilir. Eğer çok kıvamlı ise belli oranlarda seyreltme yapılır ve bu da hesaba katılır. Burada önemli olan numunenin okuma sıcaklığıdır. Bu nedenle ölçüm yapılmadan önce numune sıcaklığı 20 ºC de ayarlanmalıdır. Bu işlem genellikle su banyosunda veya abbe refrakrometresi kullanılarak çözümlenir. Eğer bu sıcaklıkta okuma yapılmamışsa gerekli düzeltme işlemleri yapılarak gerçek sonuç verilir. Sayfa 50 / 94

51 3.3.4 Okuma Yapma ve Sıcaklık Düzeltmesi Homojen hale getirilmiş ve sıcaklığı 20 ºC olan numuneden bir damla alınır. Refraktometrenin okuma haznesine aktarılır ve hava kabarcığı kalmayacak şekilde kapak kapatılır ve okuma yapılır. Okumalar 20 ºC de yapılmalıdır. Eğer bu sıcaklık sağlanamazsa sıcaklık düzeltmesi yapılır. Sıcaklık 20 ºC den yukarıda ise her bir derece için ilgili çizelgede belirtilen miktar ilave edilir, Sıcaklık 20 ºC den aşağıda ise her bir derece için ilgili çizelgede belirtilen miktar eksik alınır Refraktometre ile Hesaplama Herhangi bir sulandırma yapılmamış örnekte, refraktometrede okunan değer, doğrudan yüzde çözünür kuru madde oranını verir. Herhangi bir hesaplama yapmaya gerek yoktur. Marmelat, örneğinde olduğu gibi zorunlu olmadıkça sulandırma işlemi uygulanmamalıdır. Sulandırma yapıldığında aşağıdaki formül kullanılarak hesaplama yapılır. B: Seyreltilmiş örnekte saptanan briks derecesi V: Örneğin seyreltildiği hacim ( ml ) M: Örnek miktarı ( g ) Örnek problem: 50 g marmelat örneği 100 ml lik ölçü balonuna aktarılarak hazırlanmış ve briks değeri 16 olarak okunmuştur. Marmelattaki % suda çözünür kuru madde miktarını hesaplayınız. Sayfa 51 / 94

52 3.4 Polarimetri Optikçe aktiflik, kiral moleküller tarafından sergilenen fiziksel bir özellik olup düzlem polarize olmuş ışığın polarizasyon düzlemini çevirme kabiliyetidir. Aynı bir molekülün enantiyomerlerinden her biri düzlem polarize ışığın polarizasyon düzlemini eşit miktarda ama zıt yönlü çevirirler. Enantiyomerlerinden eşit miktarda içeren bir karışım optikçe aktiflik göstermez ve rasemik karışım olarak adlandırılır. Akiral moleküller de optikçe aktiflik göstermez. Polarimetre, optikçe aktif bilenenlerin polarize ışık düzlemini ne kadar sağa veya sola çevirdiğini ölçmek için yararlanılan bir aygıttır. Kiral bir maddenin bir enantiyomerini içeren bir çözelti içerisinden düzlem polarize olmuş bir ışık demeti geçirildiğinde ışığın, polarizasyon düzlemini; açısı kadar sağa/sola çevirdiği gözlenir. Polarimetre öğelerinin şematik gösterilisi Polarimetre cihazı parçalarının çalışma prensibi ve açıklaması aşağıdaki gibidir; Işık kaynağı: Asimetrik karbon atomuna sahip maddeler aynı zamanda optikçe aktiftir. Optikçe aktiflik, bir cismin polarize ışığı kendi düzleminden saptırma kabiliyetidir. Eğer bir karbonhidratta asimetrik karbon atomu varsa, polarize ışık düzlemini sağa ya da sola çevirir. Sağa çevirirse (+), tersine çevirirse (-) şeklinde gösterilir. D-Glukoz polarize ışığı sola çevirirse D(-)Glukoz şeklinde, sağa çevirirse D(+)Glukoz şeklinde gösterilir. Bir şekerin (+) ve (-) formundan eşit oranda alıp karıştırırsak, ışık ne sağa ne de sola çevrilir. Böyle karışımlara rasemik karışım denir. Polarimetre, optik aktif maddelerin polarize ışığı saptırma özelliklerine dayanarak bu maddelerin bir çözeltideki miktarlarını tayin etmeye yarar. Bu aletle aynı zamanda spesifik çevirme açısı ölçülerek saf optik aktif maddelerin tanınması da mümkündür. Polarize ışık bir düzlem üzerinde dalgalanan ışıktır. Adi ışık bazı maddelerden geçirilirse tek bir düzlem içinde çıkar. Bu düzleme polarize düzlem, ışığa polarize ışık denir. Adi ışığı polarize ışık haline çevirmek için genel olarak kalsit yani kristal kalsiyum karbonat kullanılır. İki kalsit kama şeklinde birbirine kanada balması ile yapıştırılarak Nicoll prizması elde edilir. Böyle bir Nicoll prizmasından adi ışık geçirilirse birbirine dikey iki düzlemde ışığı polarize eder. Polarimetre molekül boyutlarının tayininde, konsantrasyon miktarının (derişikliğin) tayininde ve gıda maddelerinin kontrollerinde kullanılır. Hassas polarimetrelerde polarizöranalizör arasına, polarizör küçük bir açı yapacak şekilde üçüncü bir kristal kutuplayıcı konur. Böylece gözleme bölgesinde en karanlık durum aydınlanma ile mukayese edilerek daha kolay incelenir. Elektronik kontrollü otomatik polarimetreler halihazırda en hassas ölçmeyi yapabilen aletlerdir. Sadece şeker için kullanılan polarimetrelere sakarimetre de denir. Titreşim düzleminin dönmesini tayf analiziyle grafik halinde veren polarimetrelere de spektropolarimetre cihazları denir. Polarimetre, maddelerin optikçe aktifliklerini ölçen cihazdır. Optikçe aktiflik, kutuplanmış, Sayfa 52 / 94

53 (polarılmış) ışığın, kutuplanma düzlemini değiştirmek demektir. Kuvarts, şeker eriyiği ve bazı yağlar optikçe aktiftir (organik maddelerin çoğu optikçe aktiftir). Bazı maddelere ait optikçe aktiflik dış kuvvetlerin meydana getirdikleri gerilme ile değişmektedir. Cam selüloit, pleksi camı gibi maddeler, gerilimler sebebiyle çift kırıcı hale gelir. Statik hesaplamalarda gerilime maruz kalacak elemanların yukarıdaki maddelerden yapılmış küçük modelleri, jips tabakaları arasında iki kutuplayıcı arasına konarak küçük kuvvetlerle gerdirilir. Gerilen bölgeler çift kırıcı durumuna geçtiklerinden, modelin fotoğrafında gerilen bölgeler meydana çıkar görülür. Bu tekniğe, foto esneklikle gerilim çözümleme denir Polarimetrenin Çalışma Prensibi Işık kaynağından çıkan monokromatik ışık yani belirli bir dalga uzunluğuna sahip ışık olmalıdır. Bu amaçla çoğunlukla D sodyum ışığı kullanılır. Monokromatik ışık süzgeçten geçtikten sonra toplayıcı merceğe gelir. Bu mercekten çıkan ışınlar birbirine paraleldir Işık kaynağı: Bir bileşiğin polarize ışığın düzlemini çevirmesi, diğer öğeler yanında ışığın dalga boyuna da bağlıdır. Bu nedenle sabit dalga uzunluğunda monokromatik bir ışık kullanılması zorunludur. Her yerde kolaylıkla elde edilebilen monokromatik ışık, sodyumun 589 nm dalga uzunluğunda olan sarı ışığıdır. Polarizör: Işık kaynağından yayılan bayağı ışığı polarize ışığa dönüştürür. Genelde turmalin mineralinden yapılmış özel prizmalar seklindedir. Polarizör, ışık kaynağının hemen karsısında bulunur ve konumu sabittir Numune tüpü: Ölçülecek sıvı numunenin içine konulduğu silindir seklinde cam bir tüptür. Her iki ucunda yine camdan yapılmış ve sıvı sızdırmayacak şekilde tıraşlanmış iki Sayfa 53 / 94

54 pencere bulunur. Bu camlardan biri çıkarılarak tüpe numune konur ve hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerine yerleştirilir Analizör: Analizör, Polarizör gibi, bir nicol prizmasıdır. Ancak sabit olmayıp, diskin merkezinde bulunur ve onunla birlikte döner. Çevresinde açı bölmeleri bulunan ve ekseni çevresinde dönebilen bir sistemdir. İzomer polarize ışığı saat yönünde çevirirse, d veya + (dexter = sag), saat yönünün tersine çevirirse l veya - (laevus = sol) olarak ifade edilir Polarimetrenin Ayarı Polarimetre tüpüne distile su konur. Hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilmelidir, kalmışsa aşağı yukarı uygun hareketlerle çıkarılır. Tüp yerine konur. Dürbünden bakılır ve dürbünün yan kısmındaki vida ile dürbünden görünen iki yarım dairenin renkleri eşit olacak şekilde ayarlanır. Bu sırada dürbünün üst kısmındaki göstergede ibre sıfır noktasını göstermelidir. Distile su ile sıfır ayarı yapıldıktan sonra polarimetre tüpüne numune konur ve dürbünden görünen iki yarım dairenin renkleri eşitlenir. Göstergeye bakılarak okunur. Polarimetrelerde genel prensip aynıdır. Tüp uzunlukları ve gösterge kısımlarındaki farklılıklarla birbirlerinden ayrılırlar. Tüp uzunluğu mm veya bunun yarısı olan 94.7 mm uzunluğunda olanlara sakkarimetre de denir Spesifik Çevirme Açısı 100 ml sinde 100 g optik aktif madde ihtiva eden bir solüsyonun 100 mm boyundaki bir polarimetre tüpünde, 20 o C oda ısısında ve D sodyum ışığında okunan açı spesifik çevirme açısı olarak bilinir. Bu sayı saf maddeler için sabittir. Glukoz için dir. Çevirme açısı molükülün yapısına, sıcaklığa, ışığın dalga boyuna, ışık yolu üzerindeki molekül sayısına (konsantrasyona) ve bazı durumlarda çözücüye bağlıdır. Sayfa 54 / 94

55 Resim : Değişik polarimetreler [α]d20 = a x 100 / L x C α : spesifik çevirme derecesi a : okunan çevirme açısı L : tüp uzunluğu (dm) C : konsantrasyon (g/100 ml) 20: çözelti sıcaklığı D : ışık kaynağının sodyum olduğunu (sodyum lambası) gösterir Sütte Polarimetrik Laktoz Tayini Süt teknolojisinde özellikle laktoz analizinde polarimetre kullanılır. Polarimetre cihazını kullanmak suretiyle sütte laktoz analizi şu şekilde yapılmaktadır. 100 ml lik balonjojeye 75 g süt numunesi tam olarak tartılır. Proteinleri çöktürmek için 2 ml Karrez I ve 2 ml Karrez II çözeltilerinden ilave edilir. 1 ml laktik asit ilave edilip destile su ile hacmi 100 ml ye tamamlanır. İyice karıştırıldıktan sonra süzgeç kâğıdından süzülür. Süzüntü tamamen berrak olmalıdır. Süzüntü 200 mm boyundaki polarimetre tüpüne konur. Sıcaklık 20 0 C olması gerekir. Polarimetrede çevirme açısı okunur. Hesaplamada; saf laktozun ortalama 52,53 o olan spesifik çevirme açısı kullanılır. a= okunan çevirme açısı Bulunan sonuç 100 g süt için hesaplanmalıdır. Protein çökmesiyle hacim değişmesinden ileri gelen hatanın giderilmesi için sonuç tam yağlı sütte 0,94 ve yağsız sütte 0,97 ile çarpılır Unda Nişasta Tayini %4 lük Amonyum Molibdat Çözeltisi: 4 gram Amonyum Molibdat tartılarak 100 ml saf suda çözülür. %1 lik HCl Çözeltisi : 3,1 ml %33 lük HCl 100 ml saf su ile seyreltilir. Cihaz analize başlamadan yarım saat önce açılmalıdır. 5 gr numune tartılır. Üzerine %1 lik HCl çözeltisinden 50 ml eklenir. Kaynayan suda 1-2 dak karıştırılarak tutulur ve dak. Bekletilir. Üzerine 25 ml saf su eklenerek çeşme altında soğutulur. Soğutulduktan sonra üzerine 10 ml Amonyum Molibdat çözeltisi eklenir, karıştırılır. 100 ml tamamlanana kadar saf su eklenir Sayfa 55 / 94

56 karıştırılır. Süzgeç kağıdı ile süzülür. Süzüntü polarimetre tüpüne konularak ölçüm yapılır. Hesaplama yapılır. A = Spesifik çevirme derecesi Buğday Nişastasında : 182,7 Yulaf Nişastasında : 181,3 Mısır Nişastasında : 184,6 Çavdar Nişastasında : 184 Arpa Nişastasında : 181,5 Pirinç Nişastasında : 185,5 Patates Nişastasında : 204,5 tir Sakarimetre Sakarimetre doğrudan doğruya % şeker miktarını ölçmek için özel olarak yapılmış cihazdır. Değişik ülkelerde farklı bölmeleri olanları kullanılmaktadır. Bunlardan en yaygın olanı Almanya da Wentzke sakarimetresidir. 1 Wentzke= 0,34657 Polarimetre derecesi 1 Polarimetre=2,8854 Wentzke derecesi Polarimetre cihazının kullanımı: Cihazda kullanılan tüplerin çok temiz olmasına dikkat edilir. Önceden herhangi bir kalıntı bulunmaması gerekir. Cihazın 0 ayarını yapmak için saf su kullanılır. Bunun için polarimetre tüpü saf su ile doldurularak tüpün içinde herhangi bir hava kabarcığının olmamasına dikkat edilir. Tüp cihazdaki yerine yerleştirilir. Üç defa okuması yapılıp ortalaması alındıktan sonra cihaz 0 lanır. Cihazın 0 noktası belirlendikten sonra analizi yapılacak çözelti polarimetre tüpüne konur. Hava kabarcığı olmamasına dikkat edilir. Üç defa okuması yapıldıktan sonra okumaların ortalaması alınır. Hesaplamalarda yapılacak analizlerle ilgili metotta verilen formüller kullanılır. Örneğin Beyaz şekerin polarizasyon değerinin bulunmasında analiz metoduna göre yapılan işlem sonucunda cihazdan okunan çevirme açısı 2,889 ile çarpılarak beyaz şekerin polarizasyon değeri bulunmuş olur. Sonuç Türk Gıda Kodeksi Beyaz Şeker tebliğine uygun olup olmadığına bakılır. Sayfa 56 / 94

57 4. UV GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTROSKOPİSİNİN UYGULAMALARI Bir örnekteki atom, molekül veya iyonlardaki elektronların bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın, ölçülmesi ve yorumlanmasına spektroskopi denir. Atom, molekül veya iyonun elektromanyetik ışıma ile etkileşimi sonucu dönme, titreşim ve elektronik enerji seviyelerinde değişiklikler spektroskopinin temelini oluşturur. Işın veya elektromanyetik dalga uzayda çok büyük hızla hareket eden bir enerjidir. Diğer enerjilerde olduğu gibi bu enerjinin de çeşitli şekilleri vardır. En çok bilinenleri ışık, ısı, radyo dalgaları ve X ışınlarıdır. Bu enerjilerden gözle görülebileni sadece ışıktır. Elektromanyetik spektrumda gözle algılanan elektromanyetik radyasyon ışık adını alır. Işının uzaydaki hareketi dalgalar halinde olur. Seste uzayda dalgalar halinde yayıldığı halde ışından farklıdır. Işın boşlukta enerjisinden bir şey kaybetmeden büyük hızla yayıldığı halde, ses yayılamaz. Örneğin, havası boşaltışmış fanustaki zilin sesi duyulmaz. Işığın manyetik ve elektriksel iki bileşeni (alanı) bulunur. Bu iki bileşen sinüzoidal özellikte olup, yayılma yönüne ve birbirine dik konumdadır. Şekil 4.1: X yönünde yol alan elektromanyetik dalganın elektriksel ve manyetik bileşenleri, dalga boyu ( ) Işının tanecik ve dalga olmak üzere iki özelliği bulunmaktadır. Elektromanyetik ışın, dalga boyu, frekans, hız ve genlik gibi parametreleri içeren sinüs dalga modeli ile açıklanabilir. Sayfa 57 / 94

58 4.1 Dalga boyu ( ) Bir ışının dalga hareketinin ard arda gelen iki maksimumu veya minimumları arasındaki doğrusal uzaklıktır ve ile gösterilir. Dalga boyu metre, santimetre, milimetre, mikrometre, nanometre, angstron gibi çeşitli birimlerle verilebilir. 1 cm = 10 mm = 10 4 µm =10 7 nm = 10 8 Å 4.2 Frekans (ʋ):bir ışının saniyedeki periyot sayısı olup birimi s -1 veya buna eşdeğer Hertz (Hz) dir. Frekans, dalga boyu ve ışının yayılma hızı arasında, ʋ= v bağıntısı vardır. Bir ışının frekansı içinden geçtiği ortama bağlı değildir. Sadece kendini meydana getiren kaynağa bağlıdır. Kaynağın sıcaklığı yükseldikçe ışının frekansı da yükselir. Şekil 4.2 Tayfın dalga boylarına göre dizilen bileşenleri şunlardır: 4.3 Işının havadaki hızı, her çeşit ışının vakumdaki hızı aynıdır ve c ile gösterilir. Dolayısıyla yukarıdaki eşitlik, c = ʋ = cm/s şeklinde yazılabilir. Bir ışın saydam ortamlardan (maddelerden) geçer ve hızında azalma olur. Bu azalma ortamın kırma indisiyle ilgilidir ve ortamda ışının hızı ne kadar azalırsa kırma indisi o kadar büyür. Örneğin, ışının vakumdaki hızı c, ortamdaki hızı c1, ise, kırma indisi (n1): Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir. Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir. Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar. Maddenin ışığı absorplamasını incelemek için kullanılan düzeneğe absorpsiyon spektrometresi veya absorpsiyon spektrofotometresi adı verilir. Bir spektrofotometre düzeneği, başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi (monokromatör), dedektörden oluşur; dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür. Sayfa 58 / 94

59 Şekil 4.3: Basit bir spektrofotometrenin bölümleri 1. Işık kaynağı 2. Mercek 3. Prizma 4. Işık tayfı/kırınım ağı 5. Silit (kırılan ışığın geçtiği aralık) 6. Örnek kabı 7. Detektör (algılayıcı) 8. Gösterge Ana bileşenlere ek olarak spektrofotometrede ışığı toplamak, odaklamak, yansıtmak, iki demete bölmek, ve örnek üzerine belli bir şiddette göndermek amacıyla mercekler, aynalar, ışık bölücüleri, giriş ve çıkış aralıkları vardır. Örnek, kullanılan dalga boyu bölgesinde ışığı geçiren maddeden yapılmış örnek kaplarına (küvet) konularak ışık yoluna yerleştirilir. 4.3 UV Işın Kaynakları: UV-görünür bölgede D2, W, H2, Xe, Civa buhar lambası gibi sürekli ışık kaynakları kullanılır. Tungsten flaman lambası, görünür ve yakın IR bölgede ( nm) ışık yayar. Tungsten lambasının içinde bir miktar iyot veya brom buharı bulunursa lambanın ömrü artar ve bu lamba tungsten- halojen lambası olarak adlandırılır. Ulraviyole bölgede en çok kullanılan lambalar, hidrojen ve döteryum elektriksel boşalım lambalarıdır. Bu lambalar nm arasında ışık yayar. Daha pahalı ve daha uzun ömürlü olan D2 lambasının yaydığı ışığın şiddeti H2 lambasına göre çok daha fazladır. Xe ark lambası, UV-görünür bölgenin tümünde ( nm) kullanılabilecek şiddetli ve sürekli ışık kaynağıdır. Civa buhar lambası, her iki bölgede ışıma yapabilen bir ışık kaynağıdır; sürekli spektruma ek olarak kesikli hatlar da içerir. Sayfa 59 / 94

60 4.5 Dalga Boyu Seçicileri (monokromatörler): Işık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir. Monokromatör, filtreli fotometrelerde ışık filtresidir; spektrofotometrelerde ise ışık prizmasıdır. Örnek üzerine gönderilen ışığın daha monokromatik olmasını sağlamak için bazı spektrofotometrelerde çift monokromatör kullanılır. 4.6 Işık Filtreleri: Camdan yapılmış ve uygun boyalarla boyanmış filtrelerdir. Portatif olup kullanıcı istediği zaman uygun dalga boyundaki filtreyi cihaza takar. Filtrelerin üzerinde geçirdikleri dalga boyu yazılıdır. Filtrenin rengi, ölçüm yapılacak çözeltinin rengine göre seçilir; örneğin, mavi ışığı tutan (sarı) bir maddenin ölçümünde sadece mavi ışığı geçiren filtre kullanılır. 4.7 Işık Prizmaları: Cam veya kuartz olabilir. Özellikle düşük UV ışınları iyi geçirmediğinden cam prizma görünür bölge için uygundur. Kuartz prizmalar ise hem UV ışınlarını iyi geçirir, hem de görünür ışık ve IR e yakın bölgelerde çalışmaya elverişlidir. Kuartz prizmalar pahalı spektrofotometrelerde bulunur. 4.8 Spektrofotometrelerde Dedektör: Maddenin ışığı absorplayıp absorplamadığını anlamak için ışık kaynağından gelen ışığın şiddetinin ölçülmesi amacıyla kullanılan düzenektir. UV-görünür bölgede kullanılabilen üç tür dedektör vardır. Fotovoltaik Dedektör: Işık Se veya Si gibi bir yarıiletken tarafından absorplandığında iletkenlik bandına geçen elektronlar nedeniyle bu yarıiletkenle temasta olan bir metal filmi (Ag) arasında bir gerilim farkı oluşur. Fotoiletken dedektörlerde ise PbS, CdSe, ve CdS gibi yarıiletkenler tarafından ışık absorplandığında iletkenlik bandına çıkan elektronlar ışık şiddeti ile orantılı bir elektrik akımı oluşturur. Fototüp: Alkali metal oksit filmlerden yapılan fotokatodlar üzerine düşen fotonlar bu yüzeyden elektronlar koparır ve elektronlar bir anotta toplanarak elektrik akımına çevrilir. Fotoçoğaltıcı Tüp: Fotokatod yüzeyinden foton çarpması ile fırlatılan elektronlar dinot denilen yüzeylere doğru elektriksel alanda hızlandırılır ve dinoda çarpan her elektron dinot yüzeyinden 3-5 elektron daha koparır. Böylece sayıları giderek artan elektronlar sonunda bir anotta toplanarak elektrik akımına çevrilir. Bu dedektörlerin duyarlı oldukları λ aralığı da farklıdır. Daha hızlı bir dedektör olan fotodiyot dizisi ile birçok λ da aynı zamanda ve çok hızlı bir biçimde ölçüm yapılabilir. Tek ışık yollu spektrofotometrelerde, bileşenlerin tümü aynı ışık yoluna yerleştirilmiştir. Bu aletin başlıca üç ayar düğmesi vardır: Bunlardan biri, alette kullanılan optik ağ veya prizmayı mekanik olarak döndürmeyi sağlayan düğmedir. İkinci düğme, ışık yolunu tamamen kapatarak galvanometre sıfır geçirgenlik ayarını yapmak içindir. Üçüncü düğme, ışığın geçtiği aralığın Sayfa 60 / 94

61 enini değiştirir. Ölçümün yapılacağı dalga boyu birinci düğme ile ayarlandıktan sonra ışık yolu kapatılarak ikinci düğme ile sıfır ayarı yapılır. Daha sonra üçüncü düğme ile ışığın geçtiği aralığın eni değiştirilerek ve örnek kabında sadece çözücü kullanılarak galvanometre 100 değerine getirilir. Sıfır ve 100 ayarları her dalga boyunda yeniden yapılmalıdır. Resim 4.1 : Spektrofotometre Cihazı Çift ışık yollu spektrofotometrelerde, monokromatörden çıkan ışık, eşit şiddette iki demete bölünerek biri örneğe diğeri sadece çözücünün bulunduğu kaba gönderilir. İkiye ayrılan ışık, iki ayrı dedektörle algılanır ve dedektörlerde oluşan sinyallerin oranı ölçülür. Böylece örnekteki geçirgenlik değeri sürekli olarak çözücününki ile karşılaştırılmış olur. Burada iki dedektörün tam uyumlu olması, yani eşit şiddetteki ışık ile aynı sinyali oluşturması gerekir. Çift ışık yollu spektrofotometrelerde, tek dedektör kullanılarak da ölçüm yapmak mümkündür. Örnekten ve çözücüden geçen ışık demetleri dedektör üzerine art arda gelir ve alternatif türden sinyal oluşturur. Işık şiddetleri eşit ise dedektörde herhangi bir sinyal oluşmaz; örnek bölmesinden gelen ışığın şiddeti absorpsiyon nedeniyle azaldığı zaman dedektöre gelen sinyal alternatif sinyal olarak algılanır. Çift ışık yollu spektrofotometrelerin bir başka türü çift dalga boylu spektrofotometrelerdir. Çift dalga boylu spektrofotometrelerde iki farklı monokromatör vardır; iki farklı dalga boyundaki ışık, dönen bir ışık bölücü yardımıyla örnekle art arda etkileştirilir. Bulanık çözeltilerde dalga boylarından biri çözeltideki maddenin absorplayacağı, diğeri ise absorplamayacağı değerlere ayarlanır. Bulanıklıktan dolayı her iki dalga boyunda aynı miktarda ışık kaybı olacağından iki dalga boyunda yapılan ölçümlerin farkı, sadece örneğin absorbansı ile ilişkilidir. 4.9 Kalibrasyon Grafiği: Spektrofotometre ile bir maddenin nicel analizinin yapılacağı dalga boyunu kararlaştırmak için, örneğin absorpsiyon spektrumunu bilmek gerekir. Bunun için, Sayfa 61 / 94

62 maddenin 1 molar çözeltisinin çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. Çözücünün ve çözeltide bulunan başka türlerin ışığı absorplamadığı, Lambert- Beer eşitliğine uyulduğu ve nicel analizin en duyarlı bir biçimde yapılabileceği dalga boyu değeri saptandıktan sonra analizi yapılacak maddeyi içeren ve derişimleri bilinen bir dizi standart çözelti ile bu dalga boyundaki absorbans (A) değerleri ölçülür. A değerleri, standart çözeltilerin bilinen derişimlerine karşı grafiğe geçirilir. Standart çözeltilerin bilinen derişimlerine karşı A değerlerini grafiğe geçirmek suretiyle elde edilen doğruya kalibrasyon doğrusu denir. Nicel analiz, kalibrasyon doğrusunun doğrusal olduğu bölgede yapılır. Derişimi bilinmeyen örneğin A değeri ölçülür ve kalibrasyon doğrusunda bu değere karşılık gelen derişim saptanır. Molar absorpsiyon katsayısının değerinin bilindiği durumlarda, Lambert-Beer eşitliğinin analizde doğrudan kullanılması da mümkündür. Absorbans (A)=ε * c * l 4.10 Küvetler: Spektrofotometrelerde örneğin konulduğu örnek kapları (küvet), yuvarlak bir tüp veya dört köşe olabilir. Soft veya borosilikat camdan, kuartz veya plastikten yapılır. Soft camlar asidik çözeltiler, borosilikat camlar kuvvetli alkali çözeltiler için uygundur. Corex gibi bazı camlar 340 nm de kullanılabilse de kısa UV dalgalar için uygun değildir. Kuartz küvetler hem UV hem görünür dalga boyları için uygundur. Plastik küvetler özel üretilmiş ise nm arasında rahatlıkla kullanılabilir. Küvetlerin temizliği: -Küvetler kullanıldıktan hemen sonra bol çeşme suyu ve ardından distile sudan geçirilmelidir. -Aşırı kirlenen veya koyu renkli reaktiflerin okunduğu küvetler yumuşak deterjanlı su, çeşme suyu ve distile su ile yıkanmalıdır. Kesinlikle fırça kullanmamalıdır. -Deterjanla temizlenemeyen küvetler, %20 lik nitrik asitte bir gece bekletildikten sonra, distile sudan geçirilip kullanılır. -Küvet temizliğinde bikromat solüsyonu kullanılmamalıdır. %10 luk NaOH kullanılabilir; ancak küvetler bu çözeltide uzun süre kalmamalıdır. Spektrofotometrik ölçümlerde kör, standart ve numune olmak üzere üç tüp hazırlanır. Kör, cihazın optik ayarlarının (sıfır ve 100 ayarı) yapılması amacıyla kullanılan çözeltidir. Kör çözeltisi olarak distile su veya reaktifin kendisi kullanılır. Bazı ölçümlerde numune körü de kullanılabilir. Distile su körü, en sık kullanılan kördür; okuma küvetine Distile su konularak hazırlanır. Daima absorbans değerinin sıfırlanması için kullanılır. Reaktif körü, deneyde kullanılan reaktif ile hazırlanan kördür. Deneyde birden fazla reaktif varsa birden fazla reaktif körü de olabilir. Bazen absorbans değerinin sıfırlanması için, bazen de distile Sayfa 62 / 94

63 su körüne karşı numune gibi kullanılır. Numune körü, deneyde kullanılan reaktif/numune oranına uygun olarak distile su veya serum fizyolojik ile numune karıştırılarak hazırlanır. Daima distile su veya reaktif körüyle sıfırlanmış cihazda numune gibi okutulur. Şekil 4.4 : Çeşitli Spektrofotometrik Küvetler Numune gibi okutulan reaktif veya numune körü değerleri numune değerinden çıkarılır. Standart, aranan maddenin bilinen konsantrasyondaki çözeltisidir. Numune, içindeki madde miktarını tayin etmek istediğimiz çözeltidir. Fotometrik ölçümler, esas olarak iki tipte yapılır. Bunlar, end point ve kinetik okumadır. End point okumada fotometrik okuma, reaksiyon tamamlandıktan sonra yapılır. Bunun için reaksiyon karışımı belli bir süre ve belli bir sıcaklıkta inkübe edilir. Reaksiyon tamamlanıp ürünlerin oluşumu ve dolayısıyla renk oluşumu tamamlandıktan sonra okuma yapılır. Kinetik okumada birim zamandaki absorbans değişimi ölçülür. Genellikle enzimlerin katalitik aktivitelerinin tayininde kullanılır. Hesaplama için deney ortamındaki kromojen maddenin molar absorpsiyon katsayısının bilinmesi gerekir. Analiz tüpüne reaktif ve numune konup belirtilen sıcaklıkta inkübasyona bırakılır. Deney metodunda belirtilen bir süre sonra ilk absorbans değerleri okunur. Daha sonra birer dakika aralarla 2, 3 defa daha absorbans değerleri okunur ve birbirini takip eden her iki okumanın farkı alınır (ΔA). Daha sonra bu dakikalık absorbans farkları toplanıp okuma aralığı sayısına bölünerek dakikadaki ortalama absorbans değişimi (ΔA/dakika) bulunur. Dakikadaki ortalama absorbans değişimi (ΔA/dakika), deneyde ölçülen maddenin miktarı reaksiyon sırasında artıyorsa (+), azalıyorsa (-) bir sayıdır; hesaplamada mutlak değer alınır. Eğer reaktifte deney şartlarında numune olmaksızın bir absorbans değişimi oluyorsa bunun tespit edilip numune için bulunan değerden çıkarılması gerekir. Ayrıca ΔA değerlerinin birbirinden çok farklı olması reaksiyonun lineer olmadığını gösterir. Kinetik okumada sonuçlar, ΔA/dakika değerleri bir faktörle çarpılarak bulunur. Sayfa 63 / 94

64 IU/L (μmol/dak/l) olarak enzim aktivitesi hesaplamasında kullanılan faktör (F): F = Total volüm x 106 / ε x ışık yolu x numune volümü Total volüm ml cinsinden deney tüpündeki toplam sıvı miktarı106 sonucu μmol/dak/l = IU/L ye çevirme katsayısı ε L/mol/cm cinsinden molar absorpsiyon katsayısı (ekstinsiyon katsayısı) Işık yolu cm cinsinden okuma küvetinin çapı Numune volümü ml cinsinden reaksiyona katılan numune hacmi Tercih edilen spektrofotometrik ölçüm cihazının özellikleri: -filtreli fotometre değil, spektrofotometre olmalı. -Okuma aralığı nm aralığını kapsamalıdır. -Cihazın küvet okuma kısmı ısıtıcılı olmalıdır. -Optik okuma için gerek duyduğu asgari reaksiyon hacmi küçük olmalıdır. -Cihaz gerekli program bilgilerini hafızasında tutabilmelidir. -Şebeke elektrik akımındaki dalgalanmaların zararlı etkilerinden korunmak için bir regülatörü olmalıdır. -Çift ışık yollu cihaz olmalıdır. -Dijital göstergeli ve ayarlarını otomatik yapmalıdır. -Hafıza sistemi açık olmalıdır; test parametreleri kullanıcı tarafından değiştirilebilmelidir. -Bikromatik (çift dalga boylu) okuma yapabilmelidir. -Dalga boyu geçişleri kesintisiz olmalıdır; her bir nm dalga boyuna ayarlanabilmelidir. -Cihaz, non-lineer testleri çalışıp hesaplayabilmelidir Spektrofotometrelerin Kalibrasyonu: Bir miktar potasyum bikromat (K2Cr2O7), 100 o C de bir saat süre ile kurutulur. Kurutulmuş potasyum bikromattan çok hassas olarak 0,005 g tartılır ve 1 L lik balon jojede 0,005 M sülfürik asit çözeltisinde son hacim 1 L olacak şekilde çözülür. Bu çözeltinin absorbansı, o C aralığında 1 cm lik küvette 350 nm dalga boyunda okunur. Reaktif körü olarak 0,005 M sülfürik asit çözeltisi kullanılır. -Bu şartlarda ölçülen absorbans değeri 0,536±0,005 olmalıdır Otomatik Spektrofotometre: Bu tip spektrofotometreler oto analizördür. Oto analizör, numune ve reaktifleri uygun ölçülerde alıp karıştırır, belirli süre ve ısıda inkübe eder, gerekli sürelerde optik okumaları yapıp sonunda ilgili analiz sonucunu hesaplanmış olarak kullanıcıya sunar Türbidimetri ve Nefelometri: Bulanıklığın ölçümü esasına dayanan yöntemlerdir. Türbidimetride, çözeltiye gelen ışık şiddetinde çözeltideki partiküllerin neden olduğu saçılmadan dolayı ortaya çıkan ışık kaybı ölçülür. Bunun için, absorpsiyonun olmadığı dalga boyundaki ışık ve fotometreler veya kolorimetreler kullanılır. Türbidometri, genellikle numunedeki protein Sayfa 64 / 94

65 yapısındaki maddelerin ölçümünde kullanılır. Değişik yöntemlerde proteinler denatüre edilerek çözünürlükleri ortadan kaldırılır; bulanıklık oluşturulur ve bu ölçülür. Antikorların kullanıldığı deneylere immünotürbidimetri adı verilir. Nefelometride, çözeltideki partiküllerce geliş eksenine göre 90 o açıyla yerleştirilmiş olan fotosele doğru saptırılan ışınlar ölçülür. Çeşitli açılarda saçılan ışınları ölçen farklı tip nefelometreler vardır; spektrofotometreler nefelometri için kullanılamaz Spektrofotometrik Analizler Nitel analizler: Geniş uygulama alanları, yüksek duyarlılık, seçimlilik ve tekrarlanabilirliğin iyi olması, uygulanabilirlik ve hızlılığın iyi olması gibi nedenlerle tercih edilirler. Nitel analizlerde, gıdalardaki saf maddelerin yapılarının saptanmasında, fonksiyonel grubun Nicel analizler: Nicel analizde Lambert Beer kanunundan yararlanılır. Bu kanuna göre, absorbans konsantrasyonla doğru orantılıdır. Tayin tek standartla, kalibrasyon eğrisi ile ve standart katma metodu ile yapılabilir. Bunun için analiz edilecek maddenin absorblayacağı ışığın dalga boyu belirlenir ( bu genellikle maddenin maksimum absorbans gösterdiği dalga boyudur). Belirlenen dalga boyunda hazırlanan standart çözeltilerin absorbansları ölçülür ve konsantrasyona karşı kalibrasyon grafiği çizilir. Kalibrasyon grafiğinde standart çözeltilerin absorbası grafik denkleminde y değeri yerine, konsantrasyonu x değeri yerine konularak çizilir. Sonra bilinmeyenin (örneğin) absorbansı okunarak grafikten absorbansının kalibrasyon eğrisini kestiği yerden x eksenin dikme indirilerek te aynı şekilde bilinmeyenin konsantrasyonu tayin edilir Meyve Sularında Spektrofotometre ile Askorbik Asit (C Vitamini) Tayini Uygulama Alanı Ve Amacı: Meyve sularında Askorbik asit miktarının tespit etmektir Prensip: Askorbik asit, oksidasyon-redüksiyon boyasını (2,6-dikloroindofenol boyasını) renksizliğe indirger. Reaksiyon sonunda, indirgenmemiş boyanın fazlası asidik çözeltide gül pembesi-mor bir renk gösterir. Askorbik asit, otooksidasyonunun engellenmesi ve reaksiyonda uygun asitliğin sağlanması için fosforik asit+asetik asit veya fosforik asit+asetik asit+sülfirik asit veya okzalik asit çözeltisi varlığında boya ile reaksiyona sokulur. Boyanın fazlasından oluşan renk spektrofotometrede 518 nm de okunur Kısaltma Ve Tanımlar: Reaktifler: Sayfa 65 / 94

66 Stabilizan Çözelti: 4 g Oksalik asit 1 litre soda çözülür. (% 0.4) Stok Askorbik Asit Çözeltisi: 100 mg Askorbik asit 100 ml % 0.4 lük Oksalik asitte çözülür (% 0.1). Çalışma Çözeltisi olarak Askorbik Asit Çözeltisi: Stok Askorbik asit çözeltisinden 100 ml lik balonjojelere 1, 2, 3, 4, 5 er ml konur. Üzerlerine stabilizan olarak % 0.4 lük Oksalik asit çözeltisi ilave edilerek hacim 100 ml ye tamamlanır. Böylece 1 5 mg/100 ml konsantrasyonda çalışma çözeltileri hazırlanmış olunur. Boya Çözeltisi: 12 mg 2,6-dikloroindofenol Na tuzu 1 litre saf suda çözülür Cihaz Ve Malzemeler: Spektrofotometre Analitik terazi İşlem: Standart Kurvenin Çizilmesi için Hazırlıklar: Bir tüpe % 0.4 lük Oksalik 1 ml çözeltisi ve 9 ml saf su konur (Şahit 1 çözeltisi). Diğer 5 adet tüpe sırasıyla standart 1, 2, 3, 4, 5 mg/100 ml çözeltilerinden 1 ml ve 9 ml boya çözeltisi konur bu şekilde kalibrasyon çözeltileri hazırlanır Örnek Çözeltilerinin Hazırlanması: 10 ml meyve suyu 90 ml stabilizan çözeltiyle karıştırılır ve filtre kâğıdından süzülür. Böylece örnek 10 misli seyreltilmiş ve C Vitamini asit ortamda korunmuş olur. Bir tüpe örnek çözeltisinden 1 ml alınır, üzerine 9 ml su konur (Şahit Örnek çözeltisi) Diğer tüpe 1 ml örnek çözeltisi alınır, üzerine 9 ml boya çözeltisi konur. (Örnek çözeltisi) Numunenin Okunması : Cihaza elektrik verilerek cihazın kalibrasyonu ve ısınması için 15 dakika beklenir. Dalga boyu 518 nm ye ayarlanır. Mode tuşu ile Absorbans seçilir. Şahit 1 çözeltisi küvete doldurulur, küvet cihaza yerleştirilir ve absorbans sıfırlanır (0.000 A). Standart 1 çözeltisi küvete doldurulur, küvet cihaza yerleştirilir ve standart 1 çözeltisinin absorbansı okunarak kaydedilir (A STD 1). Benzer şekilde sırasıyla şahit 1, 2, 3, 4 ve 5 çözeltileriyle absorbans sıfırlanarak standart 1, 2, 3, 4 ve 5 çözeltilerinin absorbans değerleri okunur ve kaydedilir (A STD 1, A STD 2, A STD 3, A STD 4, A STD 5). Şahit Örnek çözeltisinden küvete doldurulur, küvet cihaza yerleştirilir ve absorbans değeri okunup kaydedilir (A Örnek).Örneğe ait absorbans değerine (A Örnek) karşılık gelen konsantrasyon standart kurveden okunur. Örnek 10 misli seyreltilmiş olduğundan bulunan konsantrasyon 10 ile çarpılır. Sonuç, meyve suyunda mg/100 ml Askorbik asit olarak verilir. Sayfa 66 / 94

67 Standart Kurvenin Çizimi: A STD 1, A STD 2, A STD 3, A STD 4, A STD 5 değerleri ve C Vitamini konsantrasyonları (1, 2, 3, 4 ve 5 mg/100ml) bir milimetrik kâğıda geçirilerek kalibrasyon eğrisi elde edilir. Buradan y=ax + b denklemi elde edilir. Ayrıca en küçük kareler yöntemi kullanmak suretiyle a, b, r ve R 2 değerleri elde edilir Sonuçların Gösterilmesi: A=Absorbans b= y=ax + b denkleminde b sabiti a= y=ax + b denkleminde eğim sabiti 5. Alev Fotometrisi 5.1 Giriş Alev Fotometrisi, Atomik Emisyon Spoktrometri nin içinde yer alan en basit yöntemdir. Bu yöntemde, alev etkisiyle uyarılmış atomların temel hale dönerken yapmış oldukları emisyon dikkate alınır. Bu yöntemle alkali ve toprak alkali metallerin (Li, Na, K, Mg, Ca, Sr, Ba gibi ) kantitatif (nicel) analizi yapılabilmektedir. Alev fotometresinde alev, çözelti içindeki maddenin buharlaştırılması, maddenin atom veya basit moleküllere ayrıştırılması ve atom veya moleküllerin uyarılması gibi işlevleri yerine getirir. Her element atomlarının uyarılması gibi işlevleri yerine getirir. Her element atomlarının uyarılma sıcaklığı gerekenden az ise uyarılma olayı olmaz yani elektronların bir üst yörüngelere geçmesi sağlanamaz. Eğer sıcaklık gerekenden fazla ise bu kez elektronun bir üst yörüngeye geçmesi değil atomdan tamamen uzaklaşması olur. Bir başka değişle atomun uyarılması değil iyonlaşması olur. Atomdan uzaklaşan elektron tekrar eski yörüngesine gelemeyeceği için ışın yayılması da söz konusu değildir. Sayfa 67 / 94

68 Şekil 5.1. Atomdaki dış yörünge elektronunun temel halden yüksek enerjili uyarılmış hale geçişi Analiz yapılacak örnek, çözelti halinde özel bir kaba konur ve buradan yüksek sıcaklıktaki bir bek alevi üzerine püskürtülür. Bu sıcaklıkta çözücü buharlaşır ve geriye tuzlar kalır. Bu tuzlar da bu kadar yüksek sıcaklıkta parçalanır ve atomlarına ayrılır. Bu iş için kullanılan bek, analizi yapılacak maddenin uyarılma sıcaklığına bağlı olarak çeşitli yakıtlar (hava gazı, propan, bütan, hidrojen ve asetilen gibi) kullanılabilir; ayrıca bu yakıtların yanması için hava veya oksijene ihtiyaç vardır. Bu yöntemde elde edilen sıcaklık 1200 o C civarında olduğundan bu sıcaklıkta ancak alkali ve toprak alkali metallerin uyarılması sağlanabilir. Dolayısıyla uyarılmaları için çok daha yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyulan geçiş metalleri bu yöntemle tayin edilemez. Bu amaçla yine emisyon modunda çalışan ve günümüzde en gelişmiş cihaz olarak ICP-AES (İndüktif eşleşmiş plazma atomik emisyon spektrometresi) kullanılmaktadır. Şekil 5.2. Basit bir Alev Fotometresinin temel kısımları Atomik emisyonda alevin sıcaklığı aynı elementin atomik absorbsiyon spektroskopisi için kullanılan alevin sıcaklığından daha yüksek olmalıdır. Alev üzerine küçük damlacıklar halinde püskürtülen çözelti yakıt ve oksijen veya hava etkisiyle yakılır. Burada alev sıcaklığı 1200 o C nin Sayfa 68 / 94

69 üzerine çıkar. Bu sıcaklıkta çözücü buharlaşır ve içinde bulunan tuzlar atomlarına ayrışır. Bu kadar yüksek sıcaklığa getirilerek uyarılan atomlar ışın yayar. Bu ışınlar bir merceğe ve oradan da diyaframa ve monokromatöre gelir. Monokromatördeki filtre analizi yapılacak elemente göre değişir. Bu filtreden geçen ışınlar bir detektöre gelir ve burada gelen ışınlar elektrik enerjisine dönüştürülür. Son olarak da bir galvanometre yardımıyla akım okunarak kaydedilir Kullanılan Alevin Özellikleri Alevdeki indirgen gazlar ve serbest radikaller, metal iyonlarını nötr iyonlar haline çevirir. Alev, temel durumunda olan elektronları uyarıp daha yüksek orbitallere geçmesi için gerekli olan enerjiyi sağlar. Uyarılmış atomlar kararsız olduklarından stabil duruma (temel hale) geçerlerken karakteristik bir dalga boyunda ışıma yapar. (Bu ışığın dalga boyu her elementten elemente göre değişmektedir, yani her element kendine özgü bir dalga boyunda ışık yayar). İşte bu dönüş sırasında ortaya çıkan ışıma miktarı alev fotometresi ile ölçülür Alev Fotometresinin Diğer Cihazlardan Ayıran Özellikleri Numunedeki parametrelerin ölçülmesindeki temel kavram ışığın absorbe edilmesi değil, numuneden gelen ışımanın ölçülmesidir. Bu yöntem ile sadece saf metal konsantrasyonları tespit edilebilmektedir Alev Fotometresinde Karşılaşılabilecek Problemler Alev ısısı sabit olmalıdır. Numunenin alev içine püskürtülmesi özel olarak kontrol edilmesi gerekmektedir. Aleve çok fazla sıvı numune giderse bu, alevin ısısının düşmesine neden olabilir. Bu sorunun giderilmesi için alev fotometresinin her kullanımdan sonra düzenli temizlenmesi gerekmektedir. Na ve K iyonları ile kirlenmiş su, cam kaplar, standart çözelti yanlış okumalara neden olacaktır. Siyanür gibi radikaller metal iyonlarına benzer bir ışıma yapar. Bu da yanlış okumalara neden olmaktadır. Zamanla serum proteinleri atomlaştırıcının iç yüzeyini kaplar ve alevle birlikte yandığında yanlış pozitif sonuçlar verir Analiz Yöntemleri Direkt Okuma Yöntemi Bazı eski modellerde sodyum ve potasyum standart çözeltileri atomlaştırıldıktan sonra direkt olarak aleve verilir. Daha sonra aynı şekilde numune çözeltileri seyreltilmiş olarak uygulanır. Bu yöntemin bazı sakıncaları vardır. Hava ve gaz basıncındaki hafif oynamalar cihazın okumasında dengesizlik yapabilir. Aynı seyreltmeler için ayrı okumalar gerekebilir. Ayrıca potasyuma ait sinyal numunesi sodyum içeriğine bağlı olarak şiddetlenebilir. Bu olay karşılıklı Sayfa 69 / 94

70 uyarılma şöyle gerçekleşebilir: Uyarılan bir sodyum atomu enerjisini potasyum atomuna transfer edebilir. Buna bağlı olarak daha çok potasyum atomu uyarılır ve ışık emisyonu artar. İdeal olarak standartlardaki sodyum ve potasyum konsantrasyonları bilinmeyen numunedekine yakın olmalıdır Standart Ekleme Yöntemi Standart ekleme yönteminde, eşit hacimli kaplara örnekten eşit miktarlarda konur. Bunlardan birisine hiçbir şey eklenmez ve saf su ile son hacme tamamlanır (Blank ya da kör çözelti). Diğerlerine analizi yapılacak elementin standart çözeltilerinden bilinen miktarlarda ekleme yapılarak son hacme saf su ile tamamlanır. Örneğin tayin edilmek istenen element Na olsun ve bunun derişimine Cx diyelim, Eklenen Na miktarına karşılık emisyon şiddeti grafiğe geçirilir. Standartsız örnekteki sodyumun emisyon şiddeti 30 birimdir. 5 ppm Na eklendiği zaman (Cx+5) emisyon şiddeti 33 birime yükselmiştir. Bu durumda 5 ppm lik Na, 3 birimlik bir artış sağlamıştır. Böylece doğrunun X ekseninin kestiği yer bilinmeyen örneğin derişimini (Cx) verir. Bu yöntemin en önemli avantajlarından biri, örnekte bulunması beklenmeyen bir maddenin girişimini ortadan kaldırmasıdır. Çünkü analite karşı girişim hem örnekteki analite karşı hem de eklenen standarda karşı olacaktır. Kalibrasyon grafiğinde ise girişim sadece örnekteki analite yansımaktadır. Bu da karmaşık numunelerde sonuçların güvenilirliğini etkilemektedir. Şekil 5.3. Standart ekleme grafiği İndirekt Okuma Yöntemi (İç Standart ) Bu yöntemde tüm standart, kör ve numunelere eşit konsantrasyonlarda lityum veya sezyum eklenir. Lityum yüksek emisyon şiddeti gösterir, normalde biyolojik sıvılarda mevcut değildir ve farklı dalga boyunda emisyon yapar. Alev fotometresi incelenen elementin emisyonu ile referans Sayfa 70 / 94

71 lityum elementinin emisyonunu kıyaslamaktadır. Bu şekilde emisyon oranlarının ölçülmesi atomlaştırma hızlarını, alev stabilizesini ve çözelti viskozitesine bağlı farklılıkları kompanse eder. Bu şartlarda lityum standart değil referans elementi olarak fonksiyon görmektedir. Lityum seyreltme çözeltisinde potasyum ve sodyumun değişik konsantrasyonlarda standart çözeltileri hazırlanarak kalibrasyon eğrileri çizilir ve yanıtın doğrusallığı kontrol edilir. Lityumun bir başka fonksiyonu, karşılıklı uyarılma olayının etkilerini minimuma indirerek bir tür radyasyon tamponu görevini yapar. Sodyum ve potasyuma göre lityum konsantrasyonu yüksek ayarlanmaktadır ve böylece sodyum atomlarının konsantrasyonu potasyum atomlarını etkilememekte, sodyuma ait radyasyonu absorblamaktadır Alev Fotometresiyle Sodyum Tayini Metodun Özeti Uygulanabilirliği ve Tayin Sınırı Sodyum doğal sularda fazla miktarda bulunur. Ayrıca tuzlu sular, iyon değiştirme prosesi ile yumuşatılmış sular ve endüstriyel atık sularda da fazla miktarda sodyum vardır. Sodyum oranının yüksek olması toprağın geçirgenliğinde rol oynar. Yüksek basınçlı buhar kazanlarında kullanılan besleme suyundaki sodyumun miktarı 2 3 mg/l limit konsantrasyonu olarak önerilir. Bu metotta numune gaz alevine gönderilir ve sodyum atomları tekrarlanabilir şartlar altında uyarılır. Uyarılan sodyum atomlarının temel hale dönerlerken yaydıkları ışın, filtreler veya prizmalar gibi istenilen dalga boyundaki ışını ayırıcı düzeneklerle diğer atomların yaydıkları ışınlardan ayrılır. Işık şiddeti fototüp potansiyometresi veya diğer uygun devrelerle ölçülür. 589 nm dalga boyunda emisyon şiddeti, sodyumun konsantrasyonuyla doğru orantılıdır. Numune ve standart çözeltilerinin 589 nm dalga boyunda emisyon şiddetleri ölçülerek kalibrasyon eğrisi çizilir. Bu eğriden numunenin sodyum konsantrasyonu tayin edilir. Bu metotla yaklaşık 100 μg/l veya daha düşük miktardaki sodyum, AAS de alev emisyon modunda 589 nm dalga boyunda tayin edilebilir Numunelerin Korunması Alkali numuneler veya az miktarda sodyum ihtiva eden numuneler, cam şişelere etki ederek camın bileşiminde bulunan sodyum iyonunu alarak kirlenebilirler. Kirlenmeyi önlemek için numuneler polietilen şişelerde saklanmalıdır Girişimler ve Giderilmeleri Numunenin içerisinde aleve engel olabilecek partikül halindeki materyaller, 0.45 μm lik membran filtre kağıdından süzülerek giderilmelidir. Aşağıdaki uygulamalarla girişim problemi minimuma indirilebilir: a) İşlemin pratikçe en düşük sodyum aralığında yapılması, Sayfa 71 / 94

72 b) Standard ilave tekniğinin kullanılması, c) Numune içerisinde bulunan girişim yapan safsızlıkların belirli miktarlarının, kalibrasyon standartlarına ilavesi, d) Genel girişim yapan maddelerin belirli konsantrasyonlarını ifade eden bir seri standart eğrinin hazırlanması, e) Tek bir önemli girişim olan numunelerde deneysel olarak tayin edilmiş düzeltmeler yapılması, f) Girişim yapan iyonların giderilmesi, g) Numunedeki alevi engelleyici materyallerin, orta gözenekli fitre kağıdından süzülerek uzaklaştırılması, h) Dahili standart tekniğinin uygulanması. K/Na > 5/1, Ca/Na >10/1, Mg/Na>100 ise kalsiyum, potasyum ve magnezyum dahili standart metodunda girişim yapar. Bunun için önce kalsiyum, potasyum iyonlarının miktarı tayin edilmeli ve gerekirse girişim yapan iyonların yaklaşık konsantrasyonları sodyum standartları içerisine ilave edilmelidir. i) Yüksek miktardaki klorür, sülfat ve bikarbonat alevde yayılmaya sebep olarak girişim yapabilir. İyonlaşma ve anyon girişimini azaltmak için yayılma tamponu eklenmesi, j) Bütün cam kapların (1+15) HNO3 ile çalkalanarak sonra saf su ile yıkanması Standartların Hazırlanması Stok Sodyum Çözeltisi: 140 o C de kurutulmuş g NaCI bir miktar saf suda çözülerek 1000 ml ye tamamlanır (1.0 ml = 1.0 mg Na, 1000 ppm) Ara Standard Sodyum Çözeltisi: 10 ml stok sodyum çözeltisinden alınır, 100 ml ye saf su ile tamamlanır. (1.0 ml = 0.1 mg Na, 100 ppm) İç Standart Çözeltisi (Li): Kurutulmuş LiCl den g tartılır, saf suda çözülür ve hacmi 1000 ml ye tamamlanır. Böylece 100 ppm lik Li çözeltisi hazırlanmış olur. Sodyum tayini 3 farklı yolla yapılabilir: Standart kalibrasyon grafiği yöntemi, standart ekleme yöntemi ve iç standardı yöntemi. Eğer tayini yapılacak numunede matriks girişimi yoksa ya da analit iyonlarının tayinini etkileyecek bir ortam yoksa, kolaylığı bakımından standart kalibrasyon grafiği yöntemi en uygunudur. Ancak analitin tayinini bozabilecek matriks varlığı durumunda diğer iki yöntem seçilir. Standart kalibrasyon grafiği yönteminde; yukarıda hazırlanan 100 ppm lik Na ara standardından C1V1 = C2V2 formülünden uygun oranlarda seyreltilerek 10, 20, 30, 40 ve 50 ppm lik 10 ar ml çalışma standartları hazırlanır. Sayfa 72 / 94

73 Standart ekleme yönteminde; 1 den 6 ya kadar numaralandırılmış cam tüplere 5 er ml numune konur. 1. tüp hariç diğer 5 tüpe 100 ppm lik ara standarttan sırasıyla 1, 2, 3, 4 ve 5 ml ilave edilir ve bütün tüplerin son hacimleri saf su 10 ml ye tamamlanır. İç standardı yönteminde numuneye, analitle benzer kimyasal özelliklere sahip fakat numunede hiç bulunmayan başka bir metal iyonu ilave edilir. Alkali iyonların tayininde genellikle Li ilave edilir. Li doğal sularda pek bulunmaz. İç standardı yönteminde; 6 tane tüp alınır ve hepsine 100 ppm lik Li çözeltisinden 5 er ml konur. Daha sonra ilk 5 tüpe 100 ppm lik Na ara çözeltisinden sırasıyla 1, 2, 3, 4 ve 5 ml ilave edilir. 6. tüpe ise numune çözeltisinden 5 ml ilave edilir ve bütün tüpler 10 ml ye saf su ile tamamlanır Numune Hazırlanması Numunedeki aleve girişim yapan partiküller, orta gözenekli filtre kâğıdından süzülerek uzaklaştırılır İşlem 1) Standart çözeltiler ve 50 ml veya 50 ml ye seyreltilmiş numune alınır. 2) Sıfırlama çözeltisi gönderilerek alet sıfıra ve en derişik standart çözeltisi gönderilerek de emisyon şiddeti 100 e ayarlanır. Bundan sonra en derişik standart çözeltisi 50 ppm den başlayarak 10 ppm e kadar bütün standart çözeltilerinin ve hemen arkasından numunenin emisyon şiddeti ölçülür. Her standart çözeltisinin emisyon şiddetinin ölçülmesinden sonra alet sıfırlama çözeltisiyle sıfıra ayarlanmalıdır. Ölçmeler tamamlandıktan sonra, kalibrasyon çözeltilerinden 1 veya 2 tanesinin emisyon şiddeti tekrar ölçülmeli ve ilk ölçme ile farklılık varsa işlem tekrarlanmalıdır. İç standardı yönteminde, tüplere ayrıca Li çözeltisi ilave edildiğinden tüpler ayrıca Li içerikleri için de cihazda ölçülür. 3) Standart kalibrasyon grafiği yönteminde her bir kalibrasyon çözeltisinin emisyon şiddeti dikey eksene ve bu değeri karşılayan sodyum konsantrasyonu mg/l olarak yatay eksene işaretlenerek bir kalibrasyon eğrisi çizilir. Standart eklemede, yatay eksene eklenen standartların son konsantrasyonları, dikey eksene de okunan emisyon şiddeti değerleri yazılır. İç standardı yönteminde ise, yatay eksene Na standartlarının konsantrasyonları, dikey eksene de standart Na emisyon şiddetlerinin Li emisyon şiddetlerine oranları yazılır Hesaplama Standart kalibrasyon grafiği yönteminde, numunenin bir litresindeki sodyum miktarı mg olarak kalibrasyon eğrisinden doğrudan tayin edilir. Orijinal numune seyreltilmiş ise, sonuç seyreltme faktörüyle çarpılarak verilmelidir. Sayfa 73 / 94

74 Standart ekleme yöntemi için Şekil 5.4 deki gibi bir grafik çizilir. Burada yatay eksendeki eklenen standartların son konsantrasyonları, C1V1 = C2V2 formülüyle hesaplanarak işaretlenir. Örneğin birinci tüpe herhangi bir standarttan ilave edilmediği için x in 0 (sıfır) olduğu nokta işaretlenir. Ancak bu 1. tüpte numune olduğundan y eksenine bu sıfır noktası için bir emisyon şiddeti değeri işaretlenir. 2. tüpe 100 ppm lik ara standarttan 1 ml ilave edilip hacmi 10 ml ye tamamlanmıştı. Buna göre eklenen standardın son konsantrasyonu, ml = C2.10 ml formülünden C2 = 10 ppm olarak hesaplanır. Bu şekilde diğerlerini de hesap edersek x ekseninde 10, 20, 30, 40 ve 50 ppm olarak eklenen standartların son konsantrasyon değerleri hesaplanmış olur. Grafikte x i negatif bölgede kesen değer 2 kat seyrelmiş numunenin konsantrasyonudur. Bulunan değer seyreltme katsayısıyla çarpılarak sonuç hesaplanır. Ya da grafiğin denklemi bulunur. Numune konsantrasyonu y nin sıfır olduğu nokta olduğundan, bu denklemde y değerine sıfır verilir ve x bulunur (Şekil 5.4). Numune çözeltisi 2 kat seyreltildiği için sonuç 2 ile çarpılır. Şekil 5.4. Standart ekleme grafiği İç standardı yönteminde de Şekil 5 deki gibi bir grafik çizilir. Yatay eksene standart konsantrasyonları, dikey eksene de analit absorbansının iç standardı absorbansına oranları yazılır. Sayfa 74 / 94

75 Şekil 5.5. İç standardı grafiği 5.4. Alev Fotometresiyle Potasyum Analizi Metodun Özeti Uygulanabilirliği ve Tayin Sınırı Alev emisyon analizi, elementlerin belli sıcaklıklarda uyarılması prensibine dayanır. Bu metotta numune gaz alevine gönderilir ve potasyum atomları tekrarlanabilir şartlar altında uyarılır. Uyarılan potasyum atomlarının temel hale dönerlerken yaydıkları ışın, fitreler veya prizmalar gibi istenilen dalga boyundaki ışını ayırıcı düzeneklerle diğer atomların yaydıkları ışınlardan ayrılır. Işık şiddeti fototüp potansiyometresi veya diğer uygun devrelerde ölçülür. Emisyon şiddeti, potasyum konsantrasyonuyla doğru orantılıdır. Numune ve standart çözeltilerinin emisyon şiddetleri ölçülerek kalibrasyon eğrisi çizilir. Bu eğriden numunenin potasyum konsantrasyonu tayin edilir. Bu metodla yaklaşık 100 μg/l veya daha düşük miktardaki potasyum AAS de alev emisyon modunda 766,5 nm dalga boyunda tayin edilebilir Numunelerin Korunması Kontaminasyonu önlemek amacı ile numuneler polietilen şişelerde korunabilir. Numune alındıktan 72 saat içinde analizine başlanmayacak ise (1+1) lik HNO3 çözeltisi ile ph değeri 2 3 e ayarlanarak daha uzun süre korunabilir Girişimler ve Giderilmeleri Numunede bulunan alevde girişim yapan partikül halindeki materyal 0,45 μm lik membran filtre kağıdından süzülerek giderilmelidir. Bütün cam malzemeler (1+15) lik HNO3 ile çalkalanıp saf su ile yıkanmalıdır. Sayfa 75 / 94

76 Na/K > 5/1, Ca/K > 10/1, Mg/K > 100 ise sodyum, kalsiyum ve magnezyum dahili standart metodunda girişim yapar. Bunun için önce kalsiyum ve sodyum iyonlarının miktarı tayin edilmeli ve gerekirse girişim yapan iyonların yaklaşık konsantrasyonları potasyum standartlarına ilave edilmelidir Standartların Hazırlanması Stok Potasyum Çözeltisi: 110 o C de kurutulmuş 1,907 g KCl bir miktar saf suda çözülür ve 1000 ml ye saf su ile tamamlanır. 1 ml = 1,0 mg K (1000 ppm) Ara Standard Potasyum Çözeltisi: 10 ml stok potasyum çözeltisi saf suyla 100 ml ye seyreltilir. 1.0 ml = 0,1 mg K (100 ppm) Standard Potasyum Çözeltisi: 100 ppm lik çözeltiden 5 ml alınıp, 50 ml ye saf su ile tamamlanır. Bu çözelti 10 ppm dir. 10 ppm.lik standart potasyum çözeltisinden aşağıdaki hacimlerde çekilerek 100 ml lik balonlarda 2, 4, 6, 8, 10 ppm lik çalışma standartları hazırlanır Numune Hazırlanması Numunede bulunan alevi etkileyen askıdaki materyaller, orta gözenekli filtre kâğıdından süzülerek uzaklaştırılır Hesaplama Standart çözeltilerinden hazırlanan kalibrasyon eğrisinden hesaplanır. Orijinal numune seyreltilmiş ise sonuç seyreltme faktörü ile çarpılarak verilmelidir. 6. KROMATOGRAFİK YÖNTEMLER Kromatografi ilk defa 1906 yılında bir Rus botanikçisi olan Tswett tarafından bitkilerin renk verici maddelerin ayrılmasında kullanıldı. Tswett renkli maddelerin ayrı bantlarını elde ettiği için metodunu «kromatografi» olarak isimlendirdi. Metotlar renksiz maddelere tatbik edildiği zaman bu yanlış bir isim oldu, fakat o kadar kat'i bir şekilde yerleşmişti ki, yerini başka bir isme bırakamadı yılında Kuhn ve Lederer, Tswett'in tekniğini karotenlerin ve ksantofillerin preparatif ölçüde ayrılması için başarı ile kullandı. Gaz-likid partisyon kromatografisi ilk defa olarak James ve Martin tarafından 1952 yılında uçucu yağ asitleri karışımlarının analizlerinde ve ayrılmasında kullanıldı. Kromatografi, bir karışımı bileşenlerine ayırma yöntemidir. Bu yöntemle bir karışımdaki eser miktardaki bileşenler bile ayrılabilir. Kromatografi farklı türde moleküllerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir fazda değişik hızlarla hareket etmeleri temeline dayanır. İki veya daha fazla bileşenden meydana gelen bir karışım, içi gözenekli bir katı ile doldurulmuş bir kolona boşaltılır ve bir sıvı ile kolon sürekli Sayfa 76 / 94

77 yıkanırsa, karışımdaki bileşenlerin farklı hızlarla aşağıya doğru indiği görülür. Bu tür ayırma işlemine kromatografik ayırma, bu yönteme de kromatografi denir. Bütün kromatografik yöntemlerde durgun ve hareketli olmak üzere iki faz bulunur. Hareketli faz genellikle bileşeni ortamdan ayıran itici güçtür. Durgun faz ise bileşenler kendi hızları ile hareket ederken yavaşlatıcı güç olarak etki eder. Kromatografi kolonuna konan örnek, önce bir süre durgun fazda kalır. Daha sonra hareketli faza geçer ve kolondan aşağıya doğru ilerlemeye başlar. Eğer farklı türde iki molekül, örneğin; parafin ve aromatik bileşik, böyle bir kolona konursa hareketli fazda geçirdikleri sürelerin farklı olduğu görülür. Bir başka deyişle durgun faz ve hareketli fazda geçirdikleri sürelerin oranları her iki molekül için farklıdır. Hareketli fazda daha az süre kalan bileşen diğerlerinden daha yavaş hareket eder. Böylece bileşenler birbirinden ayrılır. Kromatografik ayırmalarda hareketli faz, sıvı veya gaz; durgun faz ise katı veya sıvı olabilir. Buna göre itici güç sıvı veya gazın akma hızı, yavaşlatıcı güç ise katı yüzeyinde tutunma veya iki akışkanın birbirine dağılmasıdır. Kromatografik yöntemler birçok şekillerde gruplandırılabilir. 6.1 Kromatografi nin Sınıflandırılması Ayrılma Mekanizmalarına Göre Uygulama Biçimine Göre Faz Tiplerine Göre Ayrılma Mekanizmalarına Göre Adsorpsiyon kromatografisi Partisyon kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi İyon çifti kromatografisi Afinite kromatografisi Uygulama Biçimine Göre Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) Faz Tiplerine Göre Sayfa 77 / 94

78 Sıvı kromatografisi Sıvı-Katı kromatografisi Sıvı-Sıvı kromatografisi Gaz kromatografisi Gaz-Katı kromatografisi Gaz-Sıvı kromatografisi 6.2 Gaz Kromatografisi Kromatografik yöntemler içinde en önemlisi gaz kromatografisidir. Burada hareketli faz gaz; durgun faz ise sıvı veya katıdır. Gaz-katı kromatografileri tutunma olayına dayanır. Ayırma gücü iyi olmadığı için pek fazla kullanılmazlar. Gaz-sıvı kromatografileri nde ise yüzeyi geniş gözenekli katı maddeye özel bir sıvı emdirilir. Bu sıvı, katı maddenin gözenekleri dâhil bütün yüzeyine dağılır ve bir durgun faz gibi davranır. Hareketli olan gaz fazı bu fazın içinden kolaylıkla geçer. Bu kromatografide etkin olan olay dağılmadır. Analizi yapılacak örnek içindeki maddeler bu iki faz arasında dağılırlar. Gaz kromatografisi yönteminde kolonlar 2-10 mm iç çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat inert bir katı dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir sıvı kaplanması yerine, bu sıvı filminin doğrudan ince bir cam veya silika kapiler borunun iç yüzeyine tutundurulması ile mm iç çapında ve m gibi çok uzun kapiler kolonların kullanılması mümkün olabilir. Bu nedenle kapiler kolonların verimliliği ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla çok daha iyidir. Kullanılan cihazlarda, kolondan önce örnek maddesinin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme veya katı örneklerin gaz halindeki ürünlere dönüştürülmesi için bir piroliz bölmesi vardır. Kolon, sıcaklığı ayarlanabilen veya programlanabilen bir fırına yerleştirilir. Sıvı örnekler, bir enjektör yardımıyla cihazın giriş kısmına verilir. Kolon çıkışına yerleştirilen uygun bir dedektörle izlenen sinyal, gerektiğinde uygun bir dedektörle integre edilir. Yöntemde en yaygın olarak kullanılan dedektör türü, ısısal gaz iletkenliği ilkesinden yararlanılarak geliştirilen ısısal iletkenlik dedektörüdür. Seçici olmayan, yani her tür örneğe uygulanabilen bu dedektörler, özellikle kapiler kolonların kullanılmaya başlamasından sonra yerlerini daha duyarlı dedektörlere bırakmışlardır. Bu tür dedektörlerden birisi olan elektron yakalama dedektöründe kolondan çıkan gazlar beta ışımasına maruz bırakılır. Beta tanecikleri ile yani yüksek enerjili elektronlarla çarpışan moleküller iyonlaşırlar ve bir elektron akımı oluştururlar. Isısal iletkenlik dedektörüne oranla 100 kat daha duyarlı olan elektron yakalama dedektörleri, doymuş hidrokarbonlara karşı duyarlı değildirler. Alev iyonlaşma dedektörü adıyla bilinen bir başka tür dedektörde ise kolondan çıkan gazlar, hidrojen- oksijen gazları ile karıştırılır ve yakılır. Oluşan pozitif yüklü iyonlar daha negatif bir elektroda doğru çekilerek elektrik akımı Sayfa 78 / 94

79 oluştururlar. Alev iyonlaşma dedektörü de seçimli bir dedektör olup N2, O2, CO2 gibi alevde iyonlaşmayan moleküllere karşı duyarlı değildir. Bu dedektörle hemen hemen aynı ilkeye dayanarak çalışan ve özellikle kükürt ve fosfor atomları içeren moleküllere karşı duyarlı olan alev fotometresi dedektöründe, kükürtün 394 nm de, fosforun ise 526 nm de yaydığı ışıma ölçülür. Tetraalkilli kurşun ve kalay bileşikleri gibi çoğu organometalik bileşikler uçucudurlar ve GC de kolayca ayrılırlar. Diğer organometalik türler, örneğin di- ve trialkilkurşun, di- ve trialkilkalay gibi iyonik organometallerin GC kolonundan ayrılabilmesi için bunları türevlendirme yöntemi ile uçucu türlerine dönüştürmek gerekir. Şekil 6.1 Gaz Kromatografisi Genel şekli En çok kullanılan türevlendirme teknikleri, hidrür oluşturma ve alkilasyondur. Hidrür oluşturma tekniği, yalnızca As, Sb, Bi, Sn, Pb, Se, Te ve Ge gibi hidrür oluşturan elementlere uygulanır. Alkilleme genellikle, di ve trialkilkurşun, mono-, di- ve trialkilkalay gibi iyonik organometalik türlere uygulanır. Bütün bu türevlendime teknikleri, orjinal metal-karbon bağlarının bütünlüğünü değiştirmeksizin, yalnızca bileşiklerin uçuculuğunu değiştirir. Son zamanlarda GC için uçucu metalik hidrürlerin elde edilmesinde, yeni kolon üzeri türevlendirme tekniği rapor edilmiştir. Bu yöntem, NaBH4 değiştiren fraksiyon içeren GC dolgulu kolonlarında veya gaz kromatografının enjeksiyon bölmesinin içine yerleştirilmiş, NaBH4 içeren mini bir reaktör içinde, organik ve inorganik metallerin hidrür türevlerinin oluşumunu kapsar. Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert bir gaz kullanılır ve bu gaza taşıyıcı gaz adı verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika, alumina veya karbon gibi bir katı ise yöntem, gaz-katı kromatografisi adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr gibi inert katı bir dolgu maddesi üzerine tutturulmuş uçucu olmayan bir sıvı film ise yöntem gaz-sıvı kromatografisi adını alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar denilir. Gaz kromatografisi yönteminde Sayfa 79 / 94

80 ayrıca mm iç çapında, m boyunda kapiler kolonlar da kullanılabilir. Bu tür kolonlarda verimlilik, dolgulu kolonlara göre daha iyidir. Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı programlanabilen bir fırın içine yerleştirilmiş olan kolon gelmektedir. Sıvı örnekler bir şırıngayla bir septumdan giriş kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir dedektörden sinyal izlenir ve bir integratör ile kaydedilir. Gaz kromatografisi yönteminde incelenebilen maddeler için belli sıcaklıktaki alıkonma sürelerinin birbirinden farklı olmasından yararlanarak nitel analiz yapılabilir. Ancak, birçok bileşen için tek bir kolonla birbirine yakın alıkonulma süreleri elde edilebileceğinden, sonuçların güvenilir olması için birkaç değişik kolon kullanmakta yarar vardır. Bir maddenin alıkonulma süresi, belli bir kolon için, belli sıcaklıkta ve belli taşıyıcı gaz akış hızında sabit bir değerdir. Bu sebeple de, bir iç standart maddesinin analiz örneğine eklenmesi ve sonuçların bu maddeye bağıl olarak belirtilmesi daha çok tercih edilen bir yoldur. Gaz kromatografisi yönteminde nicel analiz ise kromatogramdaki piklerin altlarında kalan alanların hesaplanması ile veya pik yüksekliğinin ölçülmesi ile yapılır. Örneğin, enjekte ettiğimiz bir karışımda başlangıçta eşit miktarlarda A ve B bileşenlerinin olduğunu varsaydığımız bir durumda, kromatogramda bu bileşenlere ait piklerin altında kalan alanlar da birbirine eşit olacaktır. Bir bileşen kolondan ne kadar erken çıkarsa, o bileşene ait pik de o kadar keskin elde edilirken, kolondan geç çıkan bileşenlere ait pikler ise geniş ve yayvan olarak elde edilmektedir. Bu ise istenmeyen bir durumdur. Bu durumu önlemek için sıcaklık programlaması yöntemi uygulanır. Başlangıçta kolon sıcaklığı düşük tutulur ve zamanla doğrusal bir biçimde arttırılır Gaz kromatografisinin Kullanım Alanları Çevre, Kimya, Su-Gıda, Tekstil, Polimer Laboratuarları Aroma, Koku, Parfüm Sanayi Endüstriyel kimyasal-solvent Sanayi Adli Tıp, Polis Kriminal Laboratuarları İlaç Sanayi Petrol Sanayi Araştırma Laboratuarları Yağ Sanayi Ambalaj Sanayi Gaz kromatografisinin uygulamaları Su, Gıda,Toprak ve Havada; PAH,PCBs, Uçucu ve yarı uçucu, Fenol, Aldehit analizleri Sayfa 80 / 94

81 Su, Gıda,Toprakta Pestisit ve Herbisit analizleri, Hidrokarbon, Sülfür analizleri Sıvı ve Katı Yağlarda Yağ Asitleri Kompozisyonu Yağlarda Sterol ve Wax tayini Alkol ve Saflık analizleri Narkotik-Alkoloid madde analizleri (amfetamiler, anestezikler, antihistaminler, babitüratlar...) Alkollü içeceklerde Yüksek Alkoller Nikotin analizi Kanda organik asit analizleri Balda Naftalin analizi İçme sularında THM ve Koku analizi Biberon memelerinde Nitrosaminler Mısır şurubunda Asetaldehit analizi Rafineri gaz analizleri Gaz Kromatografisi Cihazının Ana Kısımları Gaz Kromatografi Cihazı Kromatografik sistem şematik olarak şekilde görülmektedir. Taşıyıcı gaz, basınç ve akışı ayarlayan kısım, Numune enjekte etme kısmı, (enjeksiyon bloğu) Fırın (Isıtma kısmı, kolon fırını) Detektör kısmı, Kaydetme kısmı.(integratör-kaydedici-bilgisayar) Taşıyıcı gaz, basınç ve akışı ayarlayan kısım, Gaz kromatografisinde kullanılan gazların saflığı % oranında olmalıdır. Kullanılan gazlar inert olmalı ve çalışma esnasında analizi yapılan maddelerle reaksiyon vermemelidir. Bunun için He ve N2 gazları taşıyıcı gaz olarak kullanılır. ECD (elektron yakalama dedektörü) gibi yüksek hassasiyete sahip olan dedektörlerde taşıyıcı gazın saf olması çok önemlidir. Aksi taktirde temel hatta (base-line) gürültü pikleri çıkar. Alev iyonlaşma dedektörü (FID) daha az hassastır. Fakat FID kullanılan H2, hava ve N2 nin gerektiği kadar saf olmaması durumunda temel hatta gürültü meydana gelir. Taşıyıcı gazın içindeki su miktarı da çok önemlidir. Gaz içinde bulunan su kolonun bozulmasına neden olur. Gaz içindeki suyun kolona ulaşmasını engellemek için gaz hatlarına filtreler takılır. Bu filtreler aynı zamanda tuzak olarak da adlandırılır. Sayfa 81 / 94

82 Şekil 6.1 Çeşitli Gaz Kromatografisi Gaz Filtreleri Gaz filtreleri oksijen, karbon, su filtreleri şeklinde sisteme takılır. Bazen sisteme dördüncü filtre şeklinde oksijen göstergesi filtreside takılabilir. Bu filtrelerin çeşitli tipleri vardır Numune enjekte etme kısmı, (enjeksiyon bloğu) Numunelerin buhar fazında kolona aktarabilmek için örnek odasına aktarılmasında çeşitli yöntemler vardır. Şırınga Enjeksiyonu (Sıvı örneklerin direk analizi) Manual injeksiyon Autosampler injeksiyon Valve Enjeksiyonu (Gaz Örneklerin direk analizi) Gas Örnekleme valfi Harici Örnekleme Sistemleri Purge and Trap (Sıvı ve katı örneklerde uçucuların analizi) Headspace (Sıvı ve katı örneklerde uçucuların analizi) Thermal Desorption (Gaz örneklerden uçucuların analizi ) Örneğin gaz haline dönüştürülmesi için enjeksiyon bloğunun örnekteki bileşenlerin kaynama noktalarının en yüksek olandan 50 0 C kadar yüksek olması gerekir Çeşitli Enjeksiyon Bloğu Tipleri Purge packed ( Dolgulu kolonlar için ) Split / Splitless ( Kapiler Kolonlar için ) Cool on-column ( Kapiler Kolonlar için ) PTV ( Programable Temparature Vaporization-Kapiler Kolonlar için ) VI ( Volatile Interface-Kapiler Kolonlar için ) CIS ( Cooled Injection System-Kapiler Kolonlar için ) Sayfa 82 / 94

83 Şekil 6.2 Siplit/Siplitless enjeksiyon bloğu şekli Enjeksiyon manuel olarak 10 µl lik enjektörle birlikte cihaza yapılabilir. Enjeksiyon bloğu üzerinde bulunan silikon kauçuktan yapılmış septum adı verilen parçadan enjeksiyon yapılır. Septum numunenin verilmesi esnasında enjektör tarafından delindiğinden bir süre sonra gaz kaçırmaya başlar. Bu nedenle belli sayıda enjeksiyondan sonra değişmesi gerekir Split/Splitless (Kapiler Kolonlar için) inlet: enjeksiyon bloklarında cihaz programından ayarlanmak suretiyle örnek enjeksiyon sisteminde iki eşit olmayan hacme ayrılır. Çok az kısmı kolana giderken büyük kısmı dışarı atılır. Bölünme oranı, kolondan geçen ve dışarı atılan taşıyıcı gaz ölçülerek ayırıcı valf yardımıyla yapılır. Genelde bu oran 1/10 1/100 oranında değişir. Bu şekilde enjeksiyon işlemi siplit olarak tanımlanır. Siplitless enjeksiyon işleminde ise örnek bölünmeden direkt olarak kolana verilir Cool on-column (Kapiler Kolonlar için )İnlet : Bu sistemde örnek direkt olarak kolana verilir. Sayfa 83 / 94

84 Şekil 6.3 Cool on-column ( Kapiler Kolonlar için ) Bu esnada hem kolon hemde fırın soğuk olmalıdır yada sıcaklıkları solventin kaynama noktasının altında olmalıdır. Çünki örnek hemen buharlaşmadığından örnek ayrımı ve değişimi problemleri minimize edilmiş olur. Eğer doğru yapılırsa ön soğuk kolon enjeksiyonu güzel sonuçlar verir Purge packed (Dolgulu kolonlar için) İnlet: Bu tip inletlerde yüksek seviyede ayrım gerektirmediği zamanlarda paket kolonlarda kullanılır. Geniş borsilikat kolanlar kullanılır. Bu kolonlarda akış 10 ml/dk kadar çıkarılabilir. Sayfa 84 / 94

85 Şekil 6.3 Purge packed (Dolgulu kolonlar için) inlet PTV (Programable Temparature Vaporization-(Kapiler Kolonlar için) İnlet: Sıcaklık programlanabilir buharlaşma inletlerde farklı modları vardır. Siplit modu siplitless modu gibi. Hem manuel hemde otomatik olarak kullanılabilir. Bu inletin özelliği sıcaklık programı oluşturulabilmesidir. Bu şekilde çözücü kaynama noktasına yakın veya daha düşük sıcaklıkta tutulan Kapiler kolona seyreltik örneklerin verilmesini mümkün kılar. Şekil 6.4 PTV (Programable Temparature Vaporization-Kapiler Kolonlar İçin İnlet CIS ( Cooled Injection System-Kapiler Kolonlar için )İnlet: Split/splitless enjeksiyon bloklarına benzer. Ancak programlanabilir sıcaklık kontrollü bir inlettir. Hem ısıtabilir hemde soğutma özelliği vardır. Sıvı azot, karbondioksit ve peltier element soğutma gibi soğutucular kullanılır. Sayfa 85 / 94

86 Şekil 6.5 CIS ( Cooled Injection System-Kapiler Kolonlar için ) VI ( Volatile Interface-Kapiler Kolonlar için )İnlet: Uçucu gaz örneklerinin analiz edilmesinde kullanılan enjeksiyon bloğudur. Head space, purge ve trap ve bazı hava toksik maddelerlerin analiz edildiği cihaza bağlanabilir. Siplit, splitless ve direkt modla çalışabilir. Şekil 6.6 VI ( Volatile Interface-Kapiler Kolonlar için ) Gaz Kromatografisi (GC) kolonları Modern GC metodunda çok ince bir tüp gibi kolonlar kullanılır ve bunlar açık tüpsü kolonlar diye adlandırılır. Bu tip kolonlar çok dar çaplı ( µm) camdan, erimiş silika, tesirsiz metal (örnek; nikel) yada Silicasteel den yapılır. Bu tüpler çeşitli boylarda olabilir (2 60 m yada daha fazla). Kolonların etrafı kaynama noktası yüksek bir sıvıyla kaplanır. Bu da sabit faza yardımcı olur. Unutulmaması gereken çok önemli bir hususta kolon sıcaklığındaki değişimin hiçbir zaman sabit fazdaki sıvının katıya dönüşmesine izin verecek kadar düşmemesi gerektiğidir. Sabit faz genellikle bir organosiloksan polimeridir. Dolayısıyla birçok metil grubu fonksiyonel gruplara karışır ve sabit faza çeşitli tipteki bileşikleri ayırma özelliği sağlar. İç çapları 320 µm yada daha az olan kolonlar da en uygun akış oranı dakikada 2 ml yada daha azdır. Bu kolonlar direkt olarak kütle spektroskopisinin içine sokulur. Geniş çaplı kolonlar (530 µm ve 750 µm) 2 ml/dk dan daha yüksek akış oranına sahiptir ve iki cisim arasındaki ortak yüzey aracı bulundurmalılar. Gözenekli tabakalı açık tüplü (PLOT) kolonların polimerik materyalli fiberleri vardır. Al2O3 yada duvarlarında moleküler elek bağları vardır. Bunlar özel Sayfa 86 / 94

87 karışımları ayırmak için kullanılır. Örneğin; moleküler elekli PLOT kolonların kullanımı sürekli aynı kolon gazların (O2, N2, CO, H2O gibi) ayrıştırılmasında kullanılır. Sarmalanmış kolonlar 3 mm ve 6 mm lik iç çapa sahiptirler. Bazen 12 mm kadar geniş olabilirler. Uzunluğu 1 m ile 3 m arasında değişir. Bazen 15 m ye kadar çıkabilir. Katı bir desteğin üzerine tüplüklü kolonların dış yapısında kullanılan sabit faz kaynama noktası yüksek sıvılarla katı destek (örnek; diatomaceos earth) kaplanır. Toplam ağırlığın % 1 10 u genellikle likit kısımdan oluşur. Daha sonra bu katı madde kolonun içine paketlenir ve kolonun sabit fazı başlar. Açık tüplü kolonlar ve destek kaplı açık tüplü (SCOT) kolonlar birbirine benzer. SCOT kolonlar sabit fazın whiskers halindeyken destek geçici olarak kolonların dış yüzeyinden çekilir. Kolonun ortası açılır. Uygun kolon performansı, taşıyıcı gazın akış oranına, kolonun çapına ve sabit fazın tabakasının kalınlığına bağlıdır. Kromatografik kolonun randımanı yüksek ekivalent teorik tabakası (HETP) terimleriyle adlandırılır. Bu da kolon uzunluğunca sabit fazla hareketli faz arasında analitlerin parçalanması, ayrılmasındaki eşitliğin başarılması demektir. Şekil 6.7 Gaz Kromatografi Kolonları Gaz Kromatografisi (GC) Kolon Fırını Sayfa 87 / 94

88 Gaz kromatografisinde kolonlar fırın içinde bulunurlar ve bu fırınlar çok hassas şekilde sıcaklık ayarlamaları programlanabilir ve kontrol edilebilir. Örneğin kolon içinden geçmesi tamamen sıcaklıkla alakalıdır. Yüksek sıcaklıkta analitler çok daha hızlı hareket ederler. Analitlerin kolon içinde hızlı hareket etmesinde ayrım iyi olmaz. Genelde kolon sıcaklığı analiz uzunluğu ve analitlerin ayrılma durumuna göre seçilir. Bütün analiz boyunca Sıçaklığın sabit tutulası izotermal olarak adlandırılır. Analiz esnasında sıcaklık zamana bağlı olarak artırılır. Bu rampa olarak da tanımlanır. Son sıcaklığa kadar olan kısım sıcaklık programı olarak adlandırılır. Şekil 6.8 Kolon fırını Sayfa 88 / 94

89 Şekil 6.9 Kolon Fırını Programı Gaz Kromatografisi (GC) Dedektörleri Bir gaz kromatografisi dedektörü kromatografik işlem uygulanan bir karışımdaki bileşenleri süratle ve hassasiyetle algılayabilen bir aygıttır; sisteme uzamsal ve zamansal boyutlarda yerleştirilebilir. Herhangi bir anda, taşıyıcı gazdaki madde konsantrasyonu sadece binde birkaç seviyesindedir ve dedektör bunun çok altındaki değerleri algılayabilecek kapasitede olmalıdır. Ayrıca bir pikin dedektörü geçtiği süre 1 sn veya daha kısa bir zaman aralığı olduğundan, dedektör kısa bir periyot içinde tüm algılama gücünü gösterebilmelidir. Dedektörün doğrusal ve muntazam algılamalar yapabilmesi ve uzun süre kararlılığını koruyabilmesi istenir. İlk kullanılan dedektörler arasında gaz yoğunluğu terazisi, katarometre, alev temokupl dedektörü, x-ışını dedektörü ve emissivite dedektörü sayılabilir. Gaz kromatografisi tekniklerindeki gelişmeler son on yılda artık kararlı hale gelmiş gibidir; bu durum GC dedektörleri için de söz konusudur. Son yıllarda çok az sayıda yeni ticari gaz dedektörü üretilmiştir. Yirmi yıl öncesinde olduğu gibi hala çok popüler olan ve tüm gaz kromatografik çalışmaların, yaklaşık %95 inde kullanılabilen dört dedektör tipi vardır; termal iletkenlik (TCD), alev iyonizasyon (FID), nitrojen fosfor (NPD), ve elektron yakalama (ECD) Algılanması istenen komponentlere bağlı olarak geliştirilmiş çok çeşitli gaz kromatografisi dedektörü vardır. Kullanım alanı yaygın olan bazı dedektörler, uygulama alanları ve hassasiyetleri aşağıdaki tabloda verilmiştir. Tablo 6.1 Tipik bazı Gaz Kromatografi Dedektörleri ve Algılama Limitleri Gaz kromatografisi dedektörerin çoğu, GC kolonundan gelen akımdaki bileşenle-rin iyonlaştırılmasında farklı iyonizasyon metotlarının kullanıldığı iyon dedektörleridir; bir kapasitör Sayfa 89 / 94

90 veya vakum tüpüne benzerler. Bir iyonizasyon dedektörü, içinde, önemli derecede iyonizasyon potansiyeli ürete-bilen bir gaz bulunan sızdırmaz bir iyon odacığı dır. Bu amaçla argon, kripton, neon, ksenon, helyum gibi gazlar kullanılabilir. Tipik olarak odacık metalden yapı-lır; negatif potansiyel taşır (katot) ve topraklanmıştır. Anot gergin bir tel, bir çubuk veya bir disk olabilir. Odacığın bir tarafında veya son kısmında bir pencere vardır; pencere ışını (alfa, beta, gama ve X- ışınları) ölçebilecek derecede şeffaf olmalı ve ışının odacığın iç tarafına nüfuz etmesine olanak vermelidir. Elektrotlar bir güç kaynağına bağlandığında ve odacığa ışın verildiğinde, iyonizasyonla oluşan orta-lama akım veya puls sayısı ve/veya bunların genliği, ışının miktarını gösterir. İlk üretilen GC iyonizasyon dedektörlerinin (1950 yılları) hassasiyetleri, katharometre veya alev termokupl dedektörler seviyesindeydi (~10-6 g/ml) Termal İletkenlik Dedektörü, TCD Kullanım alanı geniş olan bu yöntemde, gaz akımındaki ısısal iletkenliğin değiş-mesi algılanır; bu amaçla kullanılan cihaza bazan "katharometre" denir. Cihazın hassas elementi elektrikle ısıtılan bir kaynaktır; kaynağın sıcaklığı, sabit elektrik gücünde, etrafındaki gazın ısıl iletkenliği ile değişir. Element ince bir Pt tungsten tel veya yarı iletken bir termistördür. Tel veya termistörün direnci gazın ısıl iletken-liğinin bir ölçüsüdür; telin sıcaklık katsayısı pozitif, termistörünki negatiftir. TCD lerde genellikle çift dedektör kullanılır; biri taşıyıcı gazı (referans), diğeri taşı-yıcı gaz ve örnek karışımının ısıl iletkenliğini izler. Bunlar örnek injeksiyon odacığının önündeki gaz akımı içine ve kolon çıkışına konarak taşıyıcı gazın ısıl iletkenliği yok edilir; akış hızı, basınç ve elektrik gücündeki değişiklerin etkisi de en aza indirilir. Dedektörlerin dirençleri, bir Wheatstone köprüsünün iki kolu üzerinde birleştirilerek kıyaslanır. Hidrojen ve helyumun ısıl iletkenlikleri, pek çok organik maddeye göre 6-10 kat daha fazladır. Bu nedenle çok az miktarlardaki organik maddeler bile kolon akışındaki ısıl iletkenliği önemli derecede düşürür. Azot ve karbon dioksitin iletkenlikleri organik maddelerinkine yakındır; bu nedenle taşıyıcı gaz azot veya karbon dioksit ise ısıl iletkenlik yöntemi hassasiyetini kaybeder. Isıl iletkenlik dedektörleri basit, kaba ve ucuzdur. Bunlar diğer bazı dedektörler kadar hassas değildir. Sayfa 90 / 94

91 Şekil 6.10 Termal İletkenlik Dedektörü Şematik Görünümü Alev İyonizasyon Dedektörü (FID) Pek çok organik bileşik bir hidrojen/hava alevinde piroliz edildiğinde, bazı ara ürünler verirler; bu reaksiyonlar alevden elektrik taşınmasına yol açarlar. Şekilde görülen bir sistemle iyonlar toplanarak oluşturuldukları iyon akımı ölçülebilir. Bir alevin elektrik direnci çok yüksektir (1012 ohm gibi) ve meydana gelen akım da önemsizdir; bu akım ancak bir elektrometre ile ölçülebilir. Karbon bileşiklerinin alevdeki iyon sayısı (kabaca) alevde indirgenen karbon a tomlarının sayısı ile orantılıdır; Karbonil, alkol, ve amin gibi fonksiyonel gruplar çok az iyonlaşırlar veya hiç iyon vermezler. Hidrojen alev dedektörleri çok kullanılan, çok hassas dedektörlerdir. Isıl iletkenlik dedektörlerine kıyasla daha karmaşık ve daha pahalıdır. Bunların doğrusal algı-lama aralığı daha geniştir. Şekil 6.11 Alev iyonizasyon Dedektörü Şematik Görünümü Sayfa 91 / 94

92 Nitrojen-Fosfor Dedektörü (NPD) Nitrojen-fosfor dedektörü (bazen termiyonik dedektör de denir), alev iyonizasyon dedektörüne benzeyen, fakat tamamen farklı prensiplere göre çalışan çok hassas özel seçici bir dedektördür; g/ml fosfor ve g/ml nitrojeni ölçebilir. Bir fosfor atomuna karşı, bir azot atomundan 10 kat, bir karbon atomundan da kat daha fazla respons verir. Bu özellikler NPD yi özellikle fosforlu pestisidlerin tanımlanması ve tayin edilmesinde çok önemli kılar. Bir NPD yapı olarak alev iyonizasyon dedektörüne benzer; farklılık, hidrojen jetine yakın bir mesafede yerleştirilmiş, içinde ısıtıcı bir sarım olan bir ribüdyum veya sezyum klorür taneciktir; taneciğin bulunduğu yerde, H2 ve taşıyıcı gaz N2 karışır. Dedektör hem nitrojen ve hem de fosforun algılanması için kullanıldığında hidrojen akımı en düşük düzeyde tutulmalıdır; bu durumda jette gaz yanmaz. Dedektörün sadece fosforu algılanması istendiğinde daha fala hidrojen verilir ve karışım jette yanar. Isıtılan alkali tanecik, termiyonik emisyonla elektronlar emitler (yayar), bunlar anotta toplanır ve elektrot sisteminde arka plan akımını yaratırlar. Nitrojen veya fosfor içeren bir örnekle çalışıldığında kısmen yanmış nitrojen ve fosforlu maddeler taneciğin yüzeyinde adsorblanır. Adsorblanmış madde yüzeyin iş-fonksiyonu düşürür, bunun sonucu olarak elektron emisyonu artar ve anotta toplanan akım yükselir. Şekil 6.12 Azot Fosfor Dedektörü Şematik Görünümü Elektron-Yakalama İyonizasyon Dedektörü (ECD) Elektron-yakalama dedektörleri, X-ışınları ölçümüne benzer şekilde çalışırlar. Dedektörde düşük enerjili β ışını ile elektronlar ve iyonlar üretilir. İlk kullanılan kaynak bir gümüş sarım Sayfa 92 / 94

93 içinde absorblatılmış trityumdu; ancak bu maddenin yük-sek sıcaklıklarda kararsız olması nedeniyle çok daha kararlı olan 63Ni kaynak kullanılmaya başlanmıştır. Kolondan çıkan akım, bir beta-vericiden geçirilir. Vericiden gelen bir elektron, taşıyıcı gazı (çoğunlukla azot) iyonlaştırır ve bir elektron çıkarır. Ortamda organik madde yoksa bu iyonizasyon sonunda sabit bir akım görülür. Organik madde bulunması durumunda ise elektronlar madde tarafından yakalanacağından akım düşer; Akım kaybı ölçülür ve sinyal meydana gelir. Elektron-yakalama dedektörü, FID kadar hassas bir dedektördür; fakat dinamik aralığı sınırlıdır. Daha çok halojenli bileşiklerin analizlerinde kullanılır. Peroksidler, kinonlar, ve nitro grupları gibi elektronegatif fonksiyonel gruplara karşı çok hassastır. Aminler, alkoller, ve hidrokarbonlara karşı hassasiyetleri düşüktür. Bu dedektörler en çok klorlu tarım ilaçlarının analizlerinde kullanılır. Resim 6.13 Elektron-Yakalama Dedektörü Şematik Görünümü Kütle Spektrometre (MS) Dedektörler Sayfa 93 / 94

94 Kütle spektrometre dedektörler, tüm gaz kromatografisi dedektörleri arasında en güçlü olanlarıdır. Bir GC/MS sisteminde ayırma boyunca, kütle spektrometresi sürekli olarak kütleleri tarar. Örnek kromatografi kolonundan çıktığında bir transfer hattından geçerek kütle spektrometrenin girişine gelir; burada bir elektron-darbe (impact) iyon kaynağı tarafından iyonlaştırılır ve fragmanlara ayrılır. Bu işlem sırasında örnek enerjili elektronlarla bombardıman edilir ve elektrostatik kuvvetler molekülün elektron kaybederek iyonlaşmasını sağlar. Bombardımanın ilerletilmesi iyonların fragmanlara dönüşmesine neden olur. Kütle analizörüne giren iyonlar burada m/z (kütle-yük oranı) değerlerine göre sıralanırlar. İyonların çoğu tek değerlidir. istemde, kromatogram alıkonma zamanlarını belirler, kütle analizörü de pikler-den, karışımda ne tür moleküllerin bulunduğunu saptar. Kullanımı en yaygın olan kütle analizörü, gaz anyon ve katyonların elektrik ve magnetik alan vasıtasıyla uzun süre tutulmasını sağlayan kuadrupol iyon-kapanı analizördür. İyon kapanı analizöründe üç elektrot bulunur. Merkez elektrot halka; üst ve taban elektrotlar yarım küre şeklindedir. İyonizasyon ve kütle analizi aynı yerde gerçekleşir. Ayrılan iyonlar bir iyon dedektörüyle ölçülür; kullanımı en yaygın olan dedektör, sürekli dinod tip bir iyon dedektörü olan elektron multiplierlerdir. Şekil 6.15 GC-MS Dedektörü Şematik Görünümü Sayfa 94 / 94