BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ DONDURMALARDA Listeria spp. VARLIĞININ KLASİK VE MOLEKÜLER YÖNTEMLE SAPTANMASI BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DONDURMALARDA Listeria spp. VARLIĞININ KLASİK VE MOLEKÜLER YÖNTEMLE SAPTANMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez 16/12/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir Yrd Doç. Dr. Işıl VAR Prof. Dr. Mehmet ÖZASLAN Prof.Dr. Mehmet GÜVEN DANIŞMAN DANIŞMAN ÜYE Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ KORKMAZ ÜYE.. Doç. Dr Mutlu Buket Akın ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2009YL17 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ DONDURMALARDA Listeria spp. VARLIĞININ KLASİK VE MOLEKÜLER YÖNTEMLE SAPTANMASI ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR 2. Danışman: Prof. Dr. Mehmet ÖZASLAN Yıl: 2010, Sayfa: 49 Jüri : Yrd.Doç.Dr. Işıl VAR Prof. Dr. Mehmet ÖZASLAN Doç. Dr.Mutlu Buket Akın Prof.Dr. Mehmet GÜVEN Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Listeria türleri çevreye geniş ölçüde yayılabilen, buzdolabı sıcaklığında gelişebilen, soğutma, dondurma, ısıtma ve kurutma işlemleri gibi olumsuz koşullar altında bile canlılığını koruyabilen, dondurmada bulunma riski diğer patojenlere göre daha yüksek olan halk sağlığı açısından önemli bir patojendir. Bu çalışmada, Çukurova bölgesinde faaliyet gösteren 4 farklı pastaneden 16 örnek, 10 küçük ölçekli imalathaneden 40 örnek ve 1 firmaya ait 4 paketli hazır dondurma olmak üzere toplam 30 adet sade ve 30 adet çeşnili dondurma kullanılmıştır. Bu örnekler, Listeria spp. varlığı açısından incelenmiştir. Klasik kültürel yöntem ile bu araştırmada incelenen 60 adet dondurma örneğinin 8 inden (oransal olarak % 13) Listeria spp. şüpheli koloniler izole edilmiştir. Listeria spp. şüpheli kolonilerin microbact test kiti kullanılarak biyokimyasal tanımlamaları ve PCR ile moleküler tanımlamaları yapılmıştır ve sonuç olarak örneklerde Listeria türlerine rastlanmamıştır. Moleküler yöntem ile Listeria izolasyon sonucu da negatif bulunmuştur. Listeria spp. türlerinin izolasyonu ve tanımlanmasında klasik yöntem ile moleküler yöntemin birlikte çalışılmasının bulunan sonuçların değerlendirilmesi açısından etkisi başarılı bulunmuştur Anahtar Kelimeler: Dondurma, Listeria spp., İzolasyon, PCR I

4 ABSTRACT MSc. THESIS DETECTION OF LISTERIA SPP. FROM ICE-CREAM BY CLASSICAL CULTUREL METHODS AND MOLECULAR METHODS ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY Supervisor : Asst.Prof. Işıl VAR Second Supervisor: Prof. Dr. Mehmet ÖZASLAN Year: 2010, Pages: 49 Jury : Asst.Prof. Işıl VAR Prof. Dr. Mehmet ÖZASLAN Assoc. Prof. Dr.Mutlu Buket Akın Prof.Dr. Mehmet GÜVEN Assoc. Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Listeria spp. are widespread pathogens important for human health. They grow easily at refrigerator temperature, resistant to chilling, heating and drying process and they can exist in ice-creams more than the other pathogens. In this study a total of 60 ice-cream samples (30 plain and 30 flovoured) belong to different 4 pastry-shop (16 samples), 10 small plants (40 samples), and 1 brand (4 samples) in Çukurova region. These samples were examined for Listeria spp. Listeria suspicious colonies were isolated from 8 samples of 60 by classical culturel mthod. The Listeria suspicious colonies were determined by microbact kit for biochemical properties and PCR for molecular identification. As a result, it was observed that there were no Listeria spp in ice-cream samples. It was found that Listeria isolaton was negative by molecular method, too. Moreover, it was found that to study both classical culturel and molecular methods together for isolation and identification of Listeria spp. was more successful,for evaluation the results. KeyWords: Ice cream, Listeria spp., Isolation, PCR II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim süresince imkansızları imkanlı hale getiren, zamanını bana ayırmaktan hiç çekinmeyen, sadece akademik hayatımı değil aynı zamanda sosyal hayatıma da şekil veren, olgunlaşmamı sağlayan, birlikte geçirdiğimiz her anı hayata dair bir derse çeviren, yol göstericiliğiyle örnek aldığım ve alacağım sevgili büyüğüm ve değerli danışmanım Yrd. Doç.Dr. Işıl VAR a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Lisans ve yüksek lisans eğitimim süresince her türlü ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, bilği ve birikimleriyle ışık tutan, üniversite hayatını bana sevdiren, hep bir idol olarak gördüğüm değerli büyüğüm ve danışmanım Prof.Dr. Mehmet ÖZASLAN a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Lisans ve yüksek lisans eğitimim süresince, bana bir aile sıcaklığını hissettiren, tecrübeleri ve emeği ile bana büyük destek olan değerli hocalarım Yrd.Doç.Dr. İbrahim Halil KILIÇ ve Uzm. Moleküler biyolog Işık Didem AFACAN a teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans eğitimim süresince her konuda desteklerini gördüğüm sevgili arkadaşlarım Biyolog Nur Fidan KOÇ a, Gıda Müh. Ali TEKİN e, Gıda Müh. Sevgi ERGELDİ ye ve doktora öğrencisi Gıda Müh. Sinan UZUNLU ya teşekkürlerimi sunarım. Beni iyi yetiştirebilmek için çabalayan, yaşamım süresince her zaman yanımda olan, tecrübeleriyle büyüdüğüm ve güçlü kişilikleriyle örnek aldığım, maddi manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen sevgili annem Hatice DEĞİRMENCİ ye ve sevgili babam Bayram Metin DEĞİRMENCİ ye sonsuz teşekkürlerimi borç bilirim. Hayatım boyunca her konuda desteklerini gördüğüm kardeşlerime sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR III İÇİNDEKİLER...IV ÇİZELGELERİN DİZİNİ... VII RESİMLERİN DİZİNİ...IX SİMGELER ve KISALTMALAR...XI 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dondurmalarda Listeria spp. sorunu Süt ve Süt Ürünlerinde Listeria spp. Sorunu Listeria spp. İzolasyon ve İdentifikasyonunda Yöntem Çalışmaları MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Dondurma Listeria spp.suşları Besiyeri ve kimyasallar Yöntem Örneklerin Analize Hazırlanması Listeria Türlerinin Klasik Yöntemle İzolasyonu Seçici Ön Zenginleştirme Seçici Zenginleştirme Bakteri Koloni Morfolojisinin İncelenmesi Saflaştırma Klasik Kültürel Yöntemle İzole Edilen Şüpheli Kolonilerin Morfolojik ve Biyokimyasal Olarak Tanımlanması Morfolojik Tanımlama (1) Bakteri Hücre Morfolojisinin İncelenmesi IV

7 Biyokimyasal Tanımlama (1) Oksidaz Testi (2) Katalaz Testi (3)Microbact Listeria İdentifikasyon Sistemi ile Tanımlama Klasik Kültürel Yöntem İle İzole Edilen Şüpheli Listeria spp. Koloni Örneklerinden DNA Ekstraksiyonu Dondurma örneklerinden Direkt Moleküler Yöntemle Listeria spp. İzolasyonu ve tanımlanması Ön zenginleştirme AbsoGene DNA Ekstraksiyon Kiti ile Dondurma Örneklerinden Direkt Listeria spp. DNA İzolasyonu DNA İzolatlarının amplifikasyonu (PCR) (1) PCR mix hazırlanışı (2) 1xPCR Buffer (3) 1xTE Buffer PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi (Eletroforez) Agaroz Jel Elektroforezi Uygulaması ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Klasik Kültürel Yöntemle Listeria Türlerinin İzolasyonu ve Tanımlanması Klasik Kültürel Yöntemle İzole Edilen Şüpheli Listeria Türlerinin Moleküler Yöntemle Tanımlaması Listeria Türlerinin Moleküler Yöntemle İzolasyonu ve Tanımlaması Listeria spp. Suşları ile Moleküler Yöntemin Doğrulanması SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1.TGK dondurma ve sütlü buz ürünlerinde mikrobiyolojik kriterler tebliği...5 Çizelge 2.1. Dondurma örneklerinin alındığı firmalar, örnek sayıları ve çeşitleri.. 13 Çizelge.3.1.Dondurma örneklerinden izole edilen şüpheli kolonilerin biyokimyasal özelliklerinin Listeria spp. ile karşılaştırılması 34 VII

9 VIII

10 RESİMLER DİZİNİ SAYFA Resim 3.1. Listeria spp. lerin genel görüntüsü Resim 3.2.Microbact Listeria İdentifikasyon Sistemi görüntüsü Resim 3.3 DNA Ekstraksiyonunda Kullanılan Toplama Tüpü İçerisine Yerleştirilmiş Spin Kolonu Görüntüsü Resim 3.4. Saf kültür Listeria innocua 'nın farklı konsantrasyonları ve dondurma örneklerinden izole edilen şüpheli Listeria kolonilerinin elektrforezdeki DNA bant görüntüleri IX

11 X

12 SİMGELER VE KISALTMALAR FDA IDF EPS LEB BLEB ISO PCR PFGE TSA-YE USDA : Food and Drug Administration (Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi) : International Dairy Federation (Uluslararası Sütçülük Federasyonu) : Extracelluler polymeric substances (Hücre Dışı Polimerik Madde) : Listeria Enrichment Broth : Buffered Listeria Enrichment Broth : International Organization for Standardization (Uluslararası Standartlar Organizasyonu) : Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) : Pulsed-field Gel Elektroforez (Vurgulu Jel Elektroforez Alanı) : Triptik Soy Agar-Yeast Ektraktı : United States Department of Agriculture ( Amerikan Tarım Birimi) X

13 XI

14 1.GİRİŞ 1. GİRİŞ İnsan ve hayvan türleri için patojen mikroorganizmalar arasında son dönemlerde üzerinde en çok araştırma yapılanlardan bir tanesi Listeria spp. dir. Listeria türleri doğada oldukça geniş bir alana sahiptir. Bitkiler, hayvan yemleri, içme ve kullanma suları, çiğ veya dondurulmuş besinler, kırmızı et, balık, pişmiş sucuk ve sosis, sebze ve meyveler, peynir, çiğ ve pastörize edilmiş süt ve dondurma Listeria türleri için potansiyel kaynaklardır (Berktaş ve Bozkurt, 2006; Gönülalan, 2010). Dünyanın birçok gelişmiş ülkesinde gıda kaynaklı Listeriozis salgınları ve bu salgınların çocuk, yaşlı, gebe, immunsupresif bireyler gibi risk gruplarında bulunan kişilerde ölümlere yol açması bu konulara dikkatleri çekmiş ve konu üzerinde çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Listeria spp. enfeksiyonları dünyanın birçok ülkesinde sporadik ve endemik olarak görülebilmektedir (Gönülalan, 2010). Listeria türleri çevreye geniş ölçüde yayılabilen buzdolabı sıcaklığında gelişebilen, soğutma, dondurma, ısıtma ve kurutma işlemleri gibi olumsuz koşullar altında bile canlılığını koruyabilen halk sağlığı açısından önemli bir patojendir (Anonymous, 2009a). Bu bakteriler gıdalara doğrudan kontamine olabildiği gibi, enfekte materyal veya kişiler tarafından gıdaların işlenmesi, muhafazası, paketlenmesi, satışı ve tüketimine kadar geçen süre içerisinde sekonder olarak da kontamine olabilmektedir (Ekici ve ark.2004). Listeria; gram pozitif, fakültatif anaerob, çubuk ve kokobasil şekilli, hareketli, spor oluşturmayan, psikrotrof bakterilerdir. Listeria türlerinin gelişmesi için optimum sıcaklık dereceleri C olmakla birlikte, 1-45 C arasında da gelişebilme yeteneğine sahiptirler. Boyutlarının, μm x μm arasında değişebildiği, kültürlerde tek tek, çift, V,Y şeklinde ya da kısa zincirler halinde göründükleri bildirilmektedir. Bu mikroorganizmalar genç kültürlerde kokoid formunda görünürlerken, eski kültürlerde ise zaman zaman çok uzun flament şekillerinde görülebilmektedirler (Ekici ve ark, 2004; Hasöksüz ve Ilgaz, 1996). 1

15 1.GİRİŞ Listeria türlerinin dahil edildiği familyalar yıllar ilerledikçe değişiklik göstermiştir yılında Erysipelotrix cinsi ile birlikte Corynebacteriaceae familyasında kabul edilen Listeria'nın, korinebakterlerden daha çok Lactobacillus, Streptococcus ve Bacillus cinslerine özellikle de Brochotrix cinsine yakın olduğu belirlenmiştir. 1974' de yayınlanan Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology' de "yakınlık ilişkileri kesin olmayan bakteri cinsleri" başlığı altında yer alan Listeria birçok biyokimyasal test yanında peptidoglukan yapılarının ve G+C oranlarının belirlenmesinden sonra, yukarıda belirtilen aynı kitabın 1986 yılındaki baskısında, kendisine yakın cinsler olan Gram pozitif özellikteki Brochotrix, Erysipelotrix ve Kurthia cinsleriyle kıyaslanmıştır (Anonymous, 2010a; Doğan, 2000). Listeria spp. G+C oranına göre; % 55' in altındaki G+C oranıyla Clostridium, Lactobacillus ve Bacillus cinslerine yakın bulunurken, 16 S rrna analizlerine göre Brochotrix cinsine yakın bulunmuştur. Bu cinsin taksonomideki kesin yeri hala tartışılmaktadır (Anonymous, 2010a). Bununla birlikte, Listeria cinsi içinde bulunan türler bugün artık kesinlik kazanmıştır. Bu türler; L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes, L. seeligeri ve L. welshimeri ' dir. İnsanlar için dominant patojen tür, L. monocytogenes' in hemolisin üreten suşlarıdır ve insanlarda görülen listeriosis olarak adlandırılan enfeksiyöz hastalığın etmenidir. Ayrıca hayvan listeriosislerine de neden olduğu bildirilmektedir. İnsanlar için patojen olan tür L. monocytogenes olmakla birlikte, Listeria' ların neden oldukları hastalıklarda seyrek de olsa L. ivanovii, L. seeligeri ve L. welshimeri'nin varlığı da gösterilmiştir. Bununla birlikte dominant patojen suşun L. monocytogenes olduğu kabul edilmektedir. Listeria türleri içerisinde yalnızca L. monocytogenes ve L. seeligeri ve L. ivanovii kırmızı kan hücrelerini (eritrositleri) parçalayan bir hemolizin üretirler. ß-hemolitik olan bu türlerin CAMP testinde verdikleri pozitif ve negatif sonuç ile tanımlanmaları mümkündür. Aslında L. monocytogenes' in bütün suşları patojen değildir. Ancak patojen olanlar hemolisin üretirler. L. ivanovii' ninde hayvan listeriozlarının etmeni olduğu yüzyılın başlarından beri bilinmektedir (Anonymous, 2010a;Doğan, 2000). Listeria monocytogenes ilk olarak 1926 yılında Bacterium monocytogenes olarak tanımlanmış, 1940 yılında da günümüzdeki adını almıştır (Johansson 1999). 2

16 1.GİRİŞ Listeria monocytogenes in neden olduğu rahatsızlıklara genel olarak Listeriosis denilmekte hem hayvanlar, hem de insanlarda görülmektedir. Listeria monocytogenes ile bulaşmış gıdaların tüketimi sonucu görülen Listeriosis menenjit, hamilelerde düşük, öldürücü septisemi, endokarditis (kalbin endokard tabakasının iltihabı) ve ensefalitis (Beyin yangısı) gibi son yıllarda önemli sağlık sorunlarına neden olmaktadır. İnsanlarda görülen Listeriosis te hamileler, fetüsler, yeni doğan bebekler, yaşlılar ve bağışıklık sistemi zayıf düşen kişiler risk grubunu oluşturmaktadır (Ekici ve ark, 2004; Berrada ve ark, 2006; Vermeulen ve ark, 2007; Mattila ve ark, 2008). L. monocytogenes enfeksiyonları ile ABD de her yıl yaklaşık 2500 kişi hastalanmakta ve ortalama 500 kişinin ölümüne neden olmaktadır (Yavuz ve Korukluoğlu, 2010). Tarihte görülen önemli listeriozis salgınları; 1966 yılında Almanya da süt ürünlerinden kaynaklanan 279 vaka ile %39 ölüm; 1976 da ABD de çiğ salata kaynaklı 20 vaka ile % 25 ölüm; 1980 yılında Yeni Zelanda da midye ve çiğ balıktan kaynaklanan 22 vaka ile %32 ölüm; yıllarında Kanada da lahana salatasından kaynaklanan 41 vaka ile %34 ölüm; 1983 yılında Boston-ABD de pastörize sütten kaynaklanan 49 vaka ile %29 ölüm; 1985 de Kaliforniya-ABD de Meksika tipi peynir nedeniyle 142 vaka ile %21 ölüm; yıllarında İngiltere de ciğer ezmesinden kaynaklanan 355 vaka ile %26 ölüm; 1992 yılında Fransa da domuz etinden kaynaklanan 279 vaka ile %32 ölüm; yıllarında ABD de sosisli sandviç ve şarküteri etlerinden kaynaklanan 101 vaka ile % 21 ölüm; yine ABD de 2002 yılında tavuk ve hindi eti kaynaklı 53 vaka ile %21 ölüm görülmüştür (Yavuz ve Korukluoğlu, 2010; McLauchlin ve ark., 2004) yılında ABD de 46 eyalette toplam 696 listeriozis vakası bildirilmiştir. Kolombiya bölgesinde görülen vakaların %57 sini 60 yaş üstü insanların oluşturduğu belirtilmiştir yılında ABD de toplam 753 vaka bildirilirken bu rakam 2005 yılında 842 ye yükselmiştir (Anonymous, 2005a; Anonymous, 2006). Listeria monocytogenes kontamine gıdaların sadece halk sağlığı bakımından değil, gıda işletmeleri açısından da büyük sorun olduğu bilinmektedir. Bu alanda yapılan 3

17 1.GİRİŞ çalışmalarda, bulaşma için çapraz kontaminasyonun, personel hijyeninin ve çiftlik hijyeninin önemini ikinci plana iten, üretim alanında yüzeylere yapışan, Listeria monocytogenes in varlığı ortaya konulmuştur (Anonymous, 2010b). Yapılan çalışmalar Listeria monocytogenes infeksiyonlarında çoğunlukla süt ve süt ürünlerinden izole edilen L.monocytogenes in biyofilm oluşturma yeteneklerinin yüksek olduğunu ortaya koymuştur (Anonymous, 2010b; Petran ve Zottola,1988). Biyofilm; mikrobiyel olarak değişime uğramış, yüzeye ya da birbirine tutunarak, matriks ya da hücre dışı polimerik madde (Extracelluler polymeric substances-eps) içine gömülmüş olan planktonik hücrelerden çoğalma, genetik yapı ve protein sentezi açısından tamamen değişik yapıda olan biyolojik bir oluşumdur (Anonymous, 2010b; Rijnaarts ve ark, 1993; Hood ve Zottola, 1997; Watnick ve Kolter, 2000; Donlan, 2002). Pek çok mikroorganizma savunma, adezyon ve kolonizasyon oluşturma, yaşanabilir çevre geliştirme ve topluluk oluşturabilme amacıyla biyofilm yapmaktadır. Biyofilm yapan mikroorganizmaların büyük bir çoğunluğu insanda hastalık etkeni olan patojenlerden oluşmaktadır. Gıdanın yapısındaki su ve içeriğindeki besin maddeleri, optimum ph değeri ve ideal sıcaklık gibi faktörler mikroorganizmalar için en uygun ortamı sağladığından, özellikle gıdalar ve gıda işletmeleri, birçok mikroorganizma için potansiyel biyofilm geliştirme merkezleridir. Özellikle taze ve işlenmiş, bitkisel, et ürünleri, tavuk, balık, süt ve süt ürünleri gibi hayvansal orijinli gıdaları işleyen işletmelerde rastlanmaktadır (Ergeldi, 2010). Süt işletmelerinde rutubetin yüksekliği ve sıvı akışının olması nedeniyle L. monocytogenes e ait biyofilm en çok taşıma hattı ve gider kanallarında görülmektedir (Mattila, 1990). Daha çok süt ürünleri ile bulaşan L. monocytogenes in, soğuğa dirençli ve pastörizasyon sıcaklığına dayanıklı (farklı gıda örneklerinde ve L. monocytogenes in suşlar arasındaki farklılıklarına göre) bir mikroorganizma olduğu bildirilmiştir. Dondurma yapımında kontamine çiğ süt kullanımı, hatalı pastörizasyon ya da işlem sonrası kontaminasyonlar L. monocytogenes bulaşmasında etken parametrelerdir. Bu 4

18 1.GİRİŞ nedenle, dondurmada bulunma riski diğer patojenlere göre daha yüksek olmaktadır. (Ağaoğlu ve Alemdar, 2004; Sergelidis ve Abrahim, 2009). Türk Gıda Kodeksi (TGK) dondurma ve sütlü buz ürünlerinde mikrobiyolojik kriterler tebliğinde 25 g dondurma örneğinde Listeria monocytogenes bulunmaması gerektiğini bildirmiştir (Anonim, 2009a). Çizelge1.1 de dondurmada aranan mikroorganizmalar ve limitleri verilmiştir. Çizelge 1.1. TGK dondurma ve sütlü buz ürünlerinde mikrobiyolojik kriterler tebliği (Anonymous, 2009a). Gıda Mikroorganizmalar Numune alma planı Limitler ( 1 ) n c m M Dondurma ve sütlü buz E. coli ( 3 ) 5 0 <3 S. aureus ( 4 ) Salmonella spp /25 g-ml L. monocytogenes 5 0 0/25 g-ml 1986 yılında Amerika da bir dondurma firmasının ürettiği dondurmaları tüketen kişilerde grip benzeri semptomlar gösteren Listeria kontaminasyonu belirlenmiş ve bu olay 4 eyalette en az 40 kişinin hastalanması ve sonuç olarak da ürünün piyasadan toplatılması ile sonuçlanmıştır. Listeria kontaminasyonu Fransa daki dondurmalarda da görülmüş ve ürünün piyasadan toplatılmasına neden olmuştur (Rothwell,1990). Listeria üzerine yapılan çeşitli araştırmalarda, Listeria varlığının gösterilmesi ve sayımı için değişik standart yöntemler geliştirilmiştir. L. monocytogenes' in gıdada var/yok şeklinde aranmasında; ABD Gıda ve İlaç Kuruluşu (FDA), Uluslar arası Sütçülük Federasyonu (IDF), Uluslararası Standartlar Organizasyonu (ISO), Campden and Chorleywood Gıda Araştırma Birliği (CCFRA), ABD Tarım Bakanlığı (USDA), Almanya Sağlık Kuruluşu tarafından önerilen 35 LMBG standart yöntemi (35 LMBG Test Yöntemleri Koleksiyonu), Avustralya ve Yeni Zelanda standart test yöntemi bulunmaktadır. Bu standart 5

19 1.GİRİŞ yöntemlerden yalnızca ISO, 35 LMBG, Avustralya ve Yeni Zelanda standart yöntemlerinde, L. monocytogenes' in kantitatif olarak belirlenmesi de yer almaktadır yılından bu yana multilokus enzim elektroforezi, ribotiplenidrme, DNA mikrorestriksiyon ve makrorestriksiyon profil analizi, polimormik DNA nın rastgele amplifikasyonu (Random Amplified Polimorphic DNA; RAPD) gibi moleküler tiplendirme yöntemleri kullanılarak L. monocytogenes tiplendirilmesi yapılmaktadır. Çeşitli enzim immuno analiz kitleri ile DNA-RNA hibridizasyon teknikleri de L. monocytogenes belirlenmesinde yüksek duyarlılıkta kullanılmaktadır (Anonymous, 2010a). Bu çalışmada, Listeria türlerinin gıda güvenliği ve hijyeni açısından Adana ilimizde üretilen dondurmalarda görülme sıklığının araştırılması amaçlanmıştır. Aynı zamanda araştırmada, IDF nin önerdiği klasik kültürel yöntem ve moleküler yöntem ile izolasyon ve tanımlama birlikte çalışılmıştır. 6

20 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1.Dondurmalarda Listeria spp. Sorunu Farber ve ark yılında Kanada da yaptıkları çalışmada 394 adet dondurma örneğinin % 0.3' ünde, Little ve de Louvois 1999 da İngiltere de yaptıkları çalışmada 100g 1214 yumuşak dondurma örneğinin %0.8' inde L. monocytogenes varlığı tespit etmişlerdir. Kozak ve ark ve 1987 yıllarında ABD de yaptıkları çalışmalarda, 1986 yılında 232 adet dondurma örneğinin % 2.6 sı 1987 yılında ise 427 adet dondurma örneğinin % 4.4' ünde L. monocytogenes varlığını tespit etmişlerdir (Lake ve ark, 2003). Çifçioğlu ve ark. (1992) İstanbul da satışa sunulan dondurmalarda Listeria cinsi bakterilerin varlığını belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada, inceledikleri 50 dondurma örneğinde L. monocytogenes oranını %10 olarak saptamışlardır (Ağaoğlu ve Alemdar, 2004). Cotton ve White (1992) Amerikanın Mississippi eyaletinde yapmış oldukları çalışmada, çevre şehirlerden 353 dondurma örneğini analize almışlar ve örneklerin %6.5 inde L. monocytogenes izole etmişlerdir (Var ve ark., 2007). Nichols ve De Louvois (1995), İngiltere ve Galler de 1000 örnek yumuşak tip dondurma ve 964 örnek sert tip dondurmada L. monocytogenes in varlığını araştırmışlar, her iki tipteki dondurmaların %2 sinde L. monocytogenes i tespit etmişlerdir (Lake ve ark, 2003). Nawal. Gh. ve ark.(1997) Amerika da dondurma, çiğ süt ve peynir örneklerinde Listeria türlerinin tespiti için toplam 180 örnekten sütte %6.25, peynirde %6 ve dondurmada %8 oranında Listeria türlerinin varlığını göstermişlerdir. Dığrak ve ark. (2000) Kahramanmaraş ta tüketime sunulan 86 dondurma örneğini Salmonella spp., Klebsiella pneumoniae, E.coli, Listeria spp. varlığı yönünden FDA'nın (Food and Drug Administiration) önerdiği metodu kullanarak araştırmışlardır. Çalışmada kullanılan 86 örnekten 42 sinde (%48,8) araştırılan mikroorganizmalar bulunmuştur. Örneklerin 4 ünde Listeria monocytogenes bulan 7

21 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR araştırmacılar dondurmaların Listeria yönünden potansiyel risk oluşturacağı sonucuna varmışlardır. Cordano ve Rocourt (2001) Şili de 68 ambalajsız ve 535 ambalajlı dondurma numunesi üzerinde yaptıkları çalışmada, ambalajsız dondurmaların %7,4 ünde, ambalajlı dondurmaların %3,5 ünde L.monocytogenes tespit etmişlerdir. Dhanashree ve Otta (2003) Hindistan da 320 gıda (peynir, dondurma, çiğ ve pastörize süt, tavuk, balık, koyun eti, lahana) örneğini Listeria spp. varlığı yönünden incelemişlerdir. Örneklerin %17.5 inde Listeria spp. tespit etmişlerdir. Tespit edilen örneklerden deniz ürünlerinde 48 örnekte Listeria innocua, 2 örnekte L. monocytogenes, diğer gıda ürünlerden 6 örnekte Listeria innocua belirlenirken dondurma örneklerinin hiç birinde Listeria spp. tespit edilememiştir. Uysal ve Anğ (2003), İstanbul da 511 süt ve süt ürünü örneğinde Listeria türlerinin varlığını araştırmışlardır. Örneklerin 13 ünde L. monocytogenes, 1 inde de L.grayi tanımlamışlardır. Ağaoglu ve Alemdar (2004) Van da tüketime sunulan dondurmalarda halk sağlığı yönünden önem taşıyan patojen bakterilerin varlığını belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada. 75 adet dondurma örneğinin % 8 inde Listeria monocytogenes, %25.3 ünde K. pneumoniae, %17.3 ünde Salmonella spp., %13.3 ünde E.coli ve %13.3 ünde koagülaz (+) S. aureus tespit etmişlerdir. Sonuç olarak, incelenen dondurma örneklerinin %65.3 ü için (49 örnek) mikrobiyolojik yönden Türk Standartlarında bildirilen kriterlere uygun bulunmadığı bildirilmiştir. Akman ve ark. (2004) Listeria spp. izolasyonu için IDF (The International Dairy Federation) metodunu kullanarak yapmış oldukları bir çalışmada Adana ve Kahramanmaraş ta satılan dondurmalarda Listeria spp. varlığını araştırmışlardır. Adana da 30 ve Kahramanmaraş ta 28 dondurma örneğinde çalışmışlardır. Analizler sonucunda Adana daki örneklerin 10' unda (%17.2), Kahramanmaraş taki örneklerin 14 (%24.1) ünde Listeria spp. izole etmişlerdir. L. monocytogenes örneklerde bulunamamıştır. Bu çalışmada dondurmaların Listeria enfeksiyonları yönünden potansiyel risk olmadığını fakat bu ürünlerin tüketiminde dikkatli olunması gerektiğini belirtmişlerdir. 8

22 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Molla ve ark. (2004) süt ürünlerinde L. monocytogenes ve Listeria türlerinin varlığını belirlemek için 46 dondurma örneğini incelemişler ve örneklerin 20 si Listeria pozitif olarak bulmuşlardır. Listeria spp. in izolasyon ve identifikasyonunda ISO , 1996' da önerilen izolasyon prosedüründe belirtilmiş olan yöntemi kullanmışlardır. Örneklerin 9 unda Listeria monocytogenes, kalan 11 örnekte ise diğer Listeria türleri tespit edilmiştir. Sonuçta L. monocytogenes ve diğer Listeria türlerinin süt ürünlerinde yaygın olarak bulunduğunu bildirmişlerdir. El-Sharef ve ark. (2006) Libya nın Tripoli şehrinde satışa sunulan dondurmaların mikrobiyolojik kalitesini belirlemek için 160 dondurma örneğini incelemişler ve örneklerin 7' sinde L. monocytogenes e rastlamışlardır. Abrahao ve ark. (2008) yaptıkları çalışmada 90 yumuşak tip peynir ve 60 dondurma örneğini Listeria spp. yönünden incelemişlerdir. Peynir örneklerinin %12.2 sinde Listeria spp. pozitif bulunurken (% 6.7 L. monocytogenes, %5.5 i Listeria innocua ) dondurma örneklerinden Listeria spp. izole edilememiştir. Jaleli ve Abedi (2008) yaptıkları çalışmada et ve et ürünleri, süt ürünleri, sebzeler ve tüketime hazır gıdalardan oluşan 617 örneği Listeria spp. yönünden incelemişlerdir. Örneklerin %4.6 sında Listeria spp. ve %1.2 sinde L. monocytogenes tespit etmişlerdir. Listeria spp. et ve et ürünlerinde %6.7, süt ve süt ürünlerinde %1.3, sebzelerde %1.2 ve tüketime hazır gıdalarda %12 oranında bulunmuştur. Çalışılan 39 dondurma örneğinin birinde Listeria spp. bulunmuş olup L. monocytogenes e rastlanılmamıştır. Çalışma sonucunda çiğ, pişirilmemiş ve tüketime hazır gıdaların risk oluşturduğu sonucuna varmışlardır. Gönülalan (2010) yaptıkları çalışmada Kayseri de satışa sunulan dondurmalardaki Listeria spp. varlığının belirlenmesi amacıyla sade ve meyveli toplam 50 örnekten 25 sade dondurma örneğinden 6'sının (%24), 25 adet meyveli dondurma örneğinden 3'nün (%12) Listeria türleri ile kontamine olduğunu belirtmişlerdir. Dondurma örneklerinde L. monocytogenes varlığının belirlenmesinde, ISO /A da önerilen izolasyon prosedüründe belirtilmiş olan yöntem kullanılmıştır. 9

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.2.Süt ve Süt Ürünlerinde Listeria spp. Sorunu Kviatek ve ark. (1992), Polonya da yaptıkları bir çalışmada süt toplama tanklarından alınan 16, süt ineklerinin her birinden ayrı ayrı alınan 81 çiğ süt örneği IDF (İnternational Dairy Federation ) in önerdiği izolasyon metoduna göre analize alınmışlardır. İncelenen tank sütlerinden 9 (%56.2) unda L. monocytogenes, 2 sinde (%12.5) Listeria spp., bireysel süt örneklerinden 6 sında (% 7.4) L. monocytogenes ve 1'inde (%1.2) Listeria spp. izole edilmiştir (Ertaş 1997). Gaya ve ark (1996) Listeria spp. in izolasyon ve identifikasyonunda DNA hibridizasyon yöntemini (Gene-Trak Listeria Assay) kullanarak yaptıkları bir çalışmada, İspanya'da ova ve dağ çiftliklerindeki 1445 çiğ süt örneğinde Listeria spp. varlığını mevsimsel olarak incelemişler ve örneklerden % 2.56 sında Listeria monocytogenes, % 1.73 ünde Listeria innocua, % 0.21 inde Listeria ivanovii, % 0.07 sinde Listeria seeligeri tespit etmişlerdir. Mevsimsel olarak ilkbahardaki sütlerde % 9.33, kışın elde edilen sütlerde % 5.14, sonbahar ve kışın bakılan sütlerde % 0.85 oranında Listeria varlığı tespit edilmiştir. Elde edilen örneklerin ova çiftliklerinde % 7.03 dağ çiftliklerinden sağlanan sütlerde % 1.25 oranında Listeria türleri tespit edilmiştir. Ova çiftliklerinden sağlanan sütlerde dağ çiftliklerinden çalışılan sütlere oranla daha fazla Listeria türleri olduğu tespit edilmiştir. Ertaş ve ark (1997), Elazığ da koyun ve keçi sütlerinden, Listeria türlerinin varlığını araştırdıkları çalışmada IDF (İnternational Dairy Federation )' in önerdiği izolasyon metodu kullanmışlardır. Araştırmacılar toplam 300 süt örneğinden 5 (%1.66) inde Listeria spp. izole etmişlerdir. Çalışmada hiçbir süt örneğinde L. monocytogenes bulunamamış bulunan izolatların diğer Listeria türleri olduğu tespit edilmiştir. Ünlü ve ark (1997), Sivas taki çiğ sütlerdeki Listeria spp varlığını araştırmışlardır. Araştırmada (Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi nin (Food and Drug Administiration) FDA'nın önerdiği metodu kullanmışlardır. Araştırmacılar 100 süt örneğinden 6'sında Listeria spp. tespit etmişlerdir ve 6 örneğin 4 adedinin L. monocytogenes 2 adedinin diğer Listeria spp. türleri olduğunu bildirmişlerdir. 10

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sağun ve ark (2001), Van şehir merkezi ve merkeze bağlı çevre köylerden alınan 250 adet çiğ süt örneğinde ve 254 adet otlu peynirde Listeria türlerinin varlığını ve yaygınlığını araştırmışlardır. Çiğ süt örneklerinden 6'sında ve otlu peynir örneklerinin 13'ünden Listeria spp. tespit etmişlerdir. Aygun ve Pehlivanlar (2006), FDA metodunu kullanarak yaptıkları bir çalışmada 157 süt ve süt ürününü (beyaz peynir, çiğ süt, tereyağı, yoğurt) Listeria spp. yönünden araştırmışlardır. Örneklerden 47 çiğ süt örneğinin % 2.12 sinde, 85 beyaz peynir örneğinin % 8.23 ünde Listeria spp. tespit etmişlerdir. 10 adet Tereyağı ve 15 adet yoğurt örneğinde ise Listeria spp.'ye rastlanılmamıştır. Hamdi ve ark (2007), Multıplex PCR metodunu kullanarak Listeria monocytogenes varlığını inceledikleri çalışmada,. 153 çiğ süt örneğinden 4 ünde (%2.61) ve 80 süt tankı örneğinin 6 sında (%7.5) L. monocytogenes varlığını göstermişlerdir. Yolanda ve ark. (2008) yaptıkları bir çalışmada PCR metodu ile 90 çiğ süt örneğinde Listeria spp. varlığını incelemişlerdir ve örneklerin %3 nde L. monocytogenes ve % 15 in de diğer Listeria türlerine rastlamışlardır Listeria spp. İzolasyon ve İdentifikasyonunda Yöntem Çalışmaları Uysal ve Anğ (2003) yaptıkları çalışmada süt ve sılaj ürünlerinde Listeria türlerinin varlığını FDA yöntemini modifiye ederek çalışmışlardır. İki farklı seçici zenginleştirme yöntemi kullandıkları çalışmada LPM ve Oxford agar besiyerini kullanmışlar ve besiyerleri arasında izolasyonda eşit sayıda koloni izole edildiğini ve besiyerleri arasında farklılık görülmediğini belirtmişlerdir. Dhanashree ve Otta (2003) yaptıkları bir çalışmada çiğ balıklarda Listeria spp izolasyonu ve identifikasyonunu United States Department of Agriculture (USDA) ve Netherlands Government Food Inspection Service (NGFIS) metodunu göre yapmışlardır izolasyon sonucuna göre metotlar arasında farklılık bulunmadığı bildirmişlerdir. Abrahao ve ark. (2008) yaptıkları çalışmada dondurma ve yumuşak peynirde Listeria spp. varlığını araştırmışlar ve Rapid visual immunoprecipitation assay (VIP) 11

25 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR /AOAC metodu ile FDA metodunu birlikte çalışmışlardır. Yöntemler arasında izolasyonda fark olmadığını ancak klasik kültürel yöntem olan FDA yı izolasyon sonuçlarının doğrulanması amaçlı kullandıklarını bildirmişlerdir. Jalali ve Abedi (2008), dondurulmuş ürünler, salata, yoğurt, et ürünlerinde yaptıkları çalışmada Listeria türleriniin izolasyonunda United States Department of Agriculture (USDA) metodunu kullanmışlar, identifikasyonunda ise biyokimyasal metod ile PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) metodunu kullanmışlardır. İdentifikasyon sonucu iki yöntem arasında fark olmadığını bildirmişlerdir. 12

26 3.MATERYAL ve YÖNTEM 3.MATERYAL VE YÖNTEM 3.1.Materyal Dondurma Bu çalışmada, Adana ilinde bölgesinde faaliyet gösteren 4 farklı pastaneden 16 örnek, 10 küçük ölçekli imalathaneden 40 örnek ve 1 firmaya ait 4 paketli hazır dondurma örneği olmak üzere toplam 30 adet sade ve 30 adet çeşnili dondurma kullanılmıştır. Çalışma iki tekrarlı olup toplam 60 örnek çalışılmıştır, Dondurma örneklerinin alındığı firmalar, örnek sayıları ve tekrarları Çizelge 3.1 de gösterilmiştir. Örnekler (4 paketli örnekler hariç) steril cam kavanozlara aseptik koşullarda alınarak soğuk zincir altında laboratuara getirilip derin dondurucuda (- 18 C ) depolanmıştır. Çizelge 2.1. Dondurma örneklerinin alındığı firmalar, örnek sayıları ve çeşitleri Firma sayısı ALIM YERİ ÖRNEK SAYISI ÇEŞİT A ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET FISTIKLI B ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAKAOLU C ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET KARAMELLİ D ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET ÇİLEKLİ E ADANA MERKEZ 4 2 ADET SADE, 2 ADET LİMONLU F CEYHAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAKAOLU G CEYHAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET FISTIKLI H CEYHAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET ÇİLEKLİ I KOZAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAKAOLU J KOZAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET KARAMELLİ K KOZAN 4 2 ADET SADE, 2 ADET ÇİLEKLİ L KADİRLİ 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAKAOLU M KADİRLİ 4 2 ADET SADE, 2 ADET KAVUNLU N İMAMOĞLU 4 2 ADET SADE, 2 ADET ÇİLEKLİ O PAKETLİ HAZIR ÖRNEK 4 2 ADET SADE, 1 ADET KAKAOLU,1 ADET ÇİLEKLİ 13

27 3.MATERYAL ve YÖNTEM Listeria spp. Suşları Bu çalışmada dondurmalardan izole edilmesi amaçlanan Listeria türlerinin pozitif kontrolü olarak kullanılacak olan suş Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Mikrobiyoloji laboratuarlarının saf kültür stoklarından temin edilmiştir Besiyeri ve Kimyasallar Klasik kültürel ve moleküler yönteme göre ön zenginleştirme, seçici zenginleştirme ve saflaştırma, tanımlama için kullanılan besiyeri ve kimyasallar özel firmalardan temin edilmiştir Yöntem Örneklerin Analize Hazırlanması Örnekler (4 paketli örnekler hariç) steril cam kavanozlara aseptik koşullarda alınarak soğuk zincir altında laboratuara getirilip derin dondurucuda (-18 C ) depolanmıştır Listeria türlerinin Klasik Kültürel Yöntemle İzolasyonu Listeria türlerinin dondurmadan izolasyonunda önce IDF (International Dairy Federation) yöntemi kullanılmıştır. IDF ın önerileri modifiye edilerek örneklerden Listeria türlerinin izolasyonu çalışması yapılmıştır. Ön denemelerde IDF ile yapılan çalışmalarda Listeria izolasyonu gerçekleşmeyince izolasyon şansını arttırmak için bir başka alternatif yöntem olan FDA nın önerdiği yöntem de çalışmaya alınmıştır. Her iki yöntemde de (IDF ve FDA ) izolasyon 3 adımda gerçekleştirilmiştir. İlk adımda seçici ön zenginleştirme işlemi uygulanmıştır. Seçici ön 14

28 3.MATERYAL ve YÖNTEM zenginleştirmede amaç proses süresince ya da çevresel faktörlerden zarar görmüş hücrelerin onarılmasını ve tekrar canlandırılmasını sağlamaktır (Anonim 2005a; Doğan 2000). İkinci adımda, seçici zenginleştirme işlemi uygulanmıştır. Dondurmada Listeria türlerinin bulunma düzeyi ortamda var olan bakterilere göre çok düşük seviyede olduğu için, Listeria spp. dışındaki mikroorganizmaların üremelerini yavaşlatmak ya da engellemek için seçici zenginleştirme uygulanmış ve ortamda bulunan rekabetçi bakteri türlerinin çoğalması sınırlandırılmış ve Listeria hücrelerinin artışına olanak sağlanmıştır (Anonim, 2005a; Dogan, 2000). Üçüncü adımda ise Listeria türlerinin saf olarak izole edilebilmesi için seçici katı besiyerlerine sürme işlemi uygulanmıştır Seçici Ön Zenginleştirme IDF yöntemine göre aseptik koşullar altında laboratuvara getirilen dondurma örneklerinden toplam 25 gram içinde 225 ml lik steril Listeria Enrichment Broth (LEB) (Merck ) bulunan 500 ml hacimli erlenmayere koyulmuştur. Bu besiyerinin seçici antimikrobiyal katkı maddeleri besiyerinin içeriğinde bulunduğundan sonradan ilave edilmemiştir. Ardından 30 o C deki etüvde 24 (1 gün) ve 48 (2 gün) saat süre ile ön zenginleştirmeye bırakılmıştır. Belirlenen bu 2 ayrı süre bitiminde tek kullanımlık steril plastik öze ile seçici katı besiyerlerine paralelli olacak şekilde ekim yapılmıştır. FDA yöntemine göre izolasyonda ise analizi yapılacak her bir örnek, 25 er gram tartılarak 225 ml Buffered Listeria Enrichment Broth (BLEB) (Merck ) besiyerinde homojenize edilmiştir. Besiyeri önce 30 C de 4 saat inkübe edilmiş, sonra selektif katkı (Listeria Selective Enrichment Supplement) ilave edilip inkübasyon 48 saate tamamlanmıştır. 15

29 3.MATERYAL ve YÖNTEM Seçici Zenginleştirme Listeria türlerinin izolasyon şansını arttırmak amacıyla bu çalışmada iki farklı seçici katı besiyeri kullanılmıştır. IDF ve FDA yönteminde seçici zenginleştirme aşamaları aynı olduğundan iki yöntemin seçici zenginleştirmesi aşağıdaki gibi yapılmıştır. Ön zenginleştirme sonrasında seçici zenginleştirme amacıyla kulanılacak olan 1. Katı Besiyeri Palcam (Listeria Selective Agar) (Merck ) olup antibiyotik katkıları (Selective Supplement) ilave edilerek kullanılmıştır. Palcam Selective Supplement hazırlanışı: Seçici katkı 1 vial Steril distile su 1 ml Kullanılan diğer seçici zenginleştirme besiyeri ise Oxford Listeria Selective Agar (Merck ) olup bu besiyeri de seçici antibiyotik katkıları ilave edilerek (Listeria Selective Supplement) (Merck) hazırlanmıştır. Listeria Selective Supplement hazırlanışı: Seçici katkı 1 vial Steril distile su 2.5 ml Saf alkol 2.5 ml Seçici ön zenginleştirme sıvı besiyerinde 30 o C de 1 günlük inkübasyonu süresi bitiminde seçici besiyerlerine (Oxford ve Palcam) paralelli olacak biçimde ekim yapılmıştır. Ekim yapıldıktan sonra besiyerleri 2 gün süre ile 37 o C lik etüvde seçici zenginleştirmeye bırakılmıştır. 16

30 3.MATERYAL ve YÖNTEM Bakteri Koloni Morfolojisinin İncelenmesi Ekim yapılmış plaklardaki şüpheli Listeria spp. lerin seçiçi katı besiyerindeki koloni görünümleri incelenmiştir. Koloni görüntüsü Oxford besiyerinde 2-3 mm çapında siyahımsı yeşil kahverengi siyah zonlu çökük merkezli koloniler, Palcam besiyerinde ise mm çapında zeytin yeşili-gri renkli, bazen siyah merkezli ancak her zaman siyah zonlu koloniler Listeria türleri olarak şüphelenilmiştir Saflaştırma Seçici zenginleştirme işlemi bitiminde Oxford ve Palcam besiyerinde üreyen farklı kolonilerden Listeria türlerine ait olduğu düşünülen şüpheli kolonileri ayırmak ve saf kolonileri elde edebilmek için TSA-YE besiyerlerine yeniden ekimleri yapılmıştır. Seçici zenginleştirme işleminde olduğu gibi hazırlanıp 37 o C deki etüvde 2 gün süre ile inkübasyona bırakılmıştır. Her iki yöntemin de saflaştırma aşamaları aynı şekilde yapılmıştır. Resim 3,1 Listeria Türlerinin genel görüntüsü 17

31 3.MATERYAL ve YÖNTEM Klasik Kültürel Yöntemle İzole Edilen Şüpheli Kolonilerin Morfolojik ve Biyokimyasal Olarak Tanımlanması Morfolojik Tanımlama (1) Bakteri Hücre Morfolojisinin İncelenmesi Koloni görüntüleri incelenen ve TSA-YE de saflaştırılan kolonilere gram boyama işlemi uygulanmış ve hücre morfolojileri ışık mikroskobunda incelenmiştir. Bakteri hücrelerinin hücre zarlarını aşırı zorlayacak osmatik basınç farklılığını engellemek ve dolayısıyla hücre morfolojisini korumak amacıyla preparat hazırlamada su yerine serum fizyolojik (% 85 NaCl çözeltisi) kullanılmıştır (Temiz, 2000). Gram boyamada kullanılan kimyasallar aşağıda listelenmiştir: Kristal Violet Lugol Çözeltisi %96 lık Etil Alkol Sulu Fuksin Çözeltisi Kristal Violet: Gram boyamada kullanılan ilk boya olan kristal violet için; 0.5g boya tartılarak 100 ml damıtık su içinde çözündürüp kullanılmıştır (Temiz, 2000). Lugol Çözeltisi: Gram boyamada preparatlar kristal violet ile muamele edildikten sonra lugol çözeltisi kullanılmıştır. Lugol çözeltisi hazırlamak için 2g potasyum iyodür (KI) kullanılmış ve 300 ml damıtık suda çözündürülmüştür. Bu çözeltiye daha sonra 1g iyice ezilmiş iyot kristali eklenmiş ve oda sıcaklığında tam çözünme sağlanıncaya kadar karıştırılmıştır (Temiz, 2000). %96 lık Etil Alkol: Gram boyamada kullanılan etil alkol (Teknik) piyasada ticari olarak satılan % 96 lık saflıkta temin edilmiştir. 18

32 3.MATERYAL ve YÖNTEM Sulu Fuksin Çözeltisi: Preparatlar etil alkol ile muamele edildikten sonra karşıt boya olarak sulu fuksin çözeltisi ile işleme tabi tutulmuştur. Sulu fuksin çözeltisinden önce bazik fuksin çözeltisi hazırlanmıştır. Bazik fuksin, 1g fuksin (%90 boya içerikli) tartılarak 1000ml distile suda çözündürülmesiyle elde edilmiştir. Ardından bu boya çözeltisinden 10 ml alınıp 100 ml damıtık suya karıştırılmasıyla sulu fuksin çözeltisi hazırlanmıştır (Temiz, 2000) Biyokimyasal Tanımlama Morfolojik olarak şüpheli bulunan koloni örneklerine biyokimyasal testler uygulanmıştır (Temiz, 2000) (1) Oksidaz Testi Bu test hem oksidaz kiti (Bactident Oxidase, Merck) hem de oksidaz ayracı birlikte kullanılarak uygulanmıştır. Oksidaz ayracı aşağıda verilmiş olan miktarlarda tetrametil-1,4-fenilendiamin (Merck) ve distile suyun karıştırılılmasıyla hazırlanmıştır. Manual olarak hazırlanmış oksidaz ayracı ışıktan korunacak biçimde +4 o C de buzdolabında saklanmıştır. Oksidaz ayracının hazırlanışı: Distile su 10 ml Tetrametil-1,4-fenilendiamin 0.1 g Dondurmadan izole edilen kolonilerin oksidaz reaksiyonlarını test edebilmek için filtre kağıtları dikdörtgen şeritler halinde kesilip bir petri kutusu içerisinde sterilize edilmiştir. Her oksidaz testi için steril yeni bir şerit kullanılmıştır. Önceden bantlar halinde kesilip, sterilize edilmiş filtre kağıtları temiz lamın üzerine konulmuştur. Filtre kâğıdının üzerine 2-3 damla oksidaz ayıracı damlatılmış ve besiyerinden plastik öze yardımı ile alınan şüpheli koloni, filtre 19

33 3.MATERYAL ve YÖNTEM kağıdı üzerindeki ayıracın damlatıldığı bölgeye sürülmüştür. Filtre kâğıdındaki sürüntü bölgesinde 5-15 saniye içinde mor renk oluşumunun gözlenmesi halinde oksidaz testi pozitif olarak kabul edilmiştir. Oksidaz testi negatif veren koloniler, renk değişimi gözlenmeyen koloniler Listeria spp. olarak şüphelenilmiştir (Anonim, 2005b) (2) Katalaz Testi Başka bir biyokimyasal tanımlama testi olan katalaz testi saf H 2 O 2 (Teknik) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Saf haldeki hidrojen peroksitin analizde kullanılmak üzere % 3 lük çözeltisi hazırlanmıştır (Anonim, 2005b). Kullanımdan önce taze olarak hazırlanan % 3 lük hidrojen peroksitten bir lam üzerine 1-2 damla konulmuş ve şüpheli koloni öze yardımı ile alınarak hidrojen peroksite karıştırılmıştır. Gaz kabarcıklarının oluşumunun gözlenmesi halinde test sonucu pozitif kabul edilmiştir (Anonim, 2005b) (3) Microbact Listeria İdentifikasyon Sistemi ile Tanımlama Biyokimyasal tanımlama sonrası oksidaz negatif ve katalaz pozitif ve gram pozitif basil ve kokobasil olan koloniler microbact test kiti ile Listeria spp. olup olmadıkları test edilmiştir. Ticari olarak satılan microbact test kiti protokollerine uygun olarak kullanılmıştır. Bu hazır kit içerisinde bulunan kimyasallar aşağıda listelenmiştir: Tepsi Herbiri 1 strip içeren 20 poşet 20 tüp (5 ml nutrient broth içeren tüp) 1 hemoliz test reaktifi (haemolysin reagent) Microbact test kiti aşağıdaki işlem sırasına göre uygulanmıştır. 20

34 3.MATERYAL ve YÖNTEM 1) Alüminyum poşetinden bir test stripi çıkarılmış ve tepsinin içerisine yerleştirilmiştir. 2) Hemolizin reaktifi oda sıcaklığına getirilmiştir. 3) 5 ml nutrient broth içeren tüplere şüpheli koloni aşılanmış ve 37 C ± 1 C de saat inkübe edilmiş ve şüpheli koloniler aktif hale getirilmiştir. 4) Test stribinin üzerindeki kapak açılıp, steril bir pipet yardımıyla her bir kuyucuğa süspansiyondan (nutrient broth da aktif hale getirilmiş şüpheli koloni) 4 er damla (yaklaşık100 µl) konulmuştur. 5) Stripler inkübatörden çıkarılmış, kapağı kaldırılmış, tüm test sonuçları kayıt formuna not edilmiştir. Sonuçların yorumlanmasında reaksiyon tablosundan yararlanılmıştır. 6) Elde edilen reaksiyon sonuçları kitin içerisinde bulunan veri tablosu ile karşılaştırılmıştır. 7)Microbact 12L nin bilgisayar destekli identifikasyon programı ile sonuçlar değerlendirilmiştir (Anonim,2010c). Resim 3.2. Microbact Listeria İdentifikasyon Sistemi görüntüsü 21

35 3.MATERYAL ve YÖNTEM Klasik Kültürel Yöntem İle İzole Edilen Koloni Örneklerinden DNA Ekstraksiyonu Klasik kültürel yöntemle TSA-YE besiyerinde elde edilen saf Listeria spp. şüpheli koloniler, hızlı biçimde içerisinde 500 µl 1xPCR buffer bulunan eppendorflara alınmıştır. Moleküler inceleme gerçekleşene kadar -20 o C de saklanmıştır. İzolasyonda klasik kültürel yöntem sonucu elde edilen kolonilerin doğrulanması amacıyla de anlatıldığı gibi moleküler tanımlama yapılmıştır Dondurma Örneklerinden Direkt Moleküler Yöntemle Listeria spp. İzolasyonu ve Tanımlanması Dondurma örneklerinden moleküler izolasyon ve tanımlama; Ön zenginleştirme, DNA ekstraksiyonu, PCR ve görüntüleme (elektoforez) olmak üzere 4 aşamalı olarak gerçekleştirilmiştir Ön zenginleştirme Dondurmadan Listeria türlerinin izolasyonu için ilk önce dondurma örnekleri klasik izolasyonda olduğu gibi ön zenginleştirme işlemi uygulanmış 225 ml Listeria enrichment broth (Merck) besiyerine 25 gram gıda örneği tartılmış 30 o C de 24 saat inkube edilmiştir AbsoGene DNA Ekstraksiyon Kiti ile Dondurma Örneklerinden Direkt Listeria spp. DNA İzolasyonu Dondurma örneklerinden direkt izolasyon için ticari olarak satılan AbsoGene Ekstraksiyon Kiti protokollerine uygun olarak kullanılmıştır Bu hazır kit içerisinde bulunan kimyasallar aşağıda listelenmiştir: 22

36 3.MATERYAL ve YÖNTEM Proteinase K Solutıon B BL Buffer (Parçalama Çözeltisi)(Lysis Buffer) Solution W1 Wash Buffer (Wash 1 Buffer=Yıkama Çözeltisi 1) Solution W2 Wash Buffer (Wash 2 Buffer=Yıkama Çözeltisi 2) Solution E Elution Buffer (Ayırma Çözeltisi) Kit içerisinde bulunmayan ektraksiyon için gerekli kimyasallar: Lizozim % ethanol TE Buffer ( Tris-HCI, EDTA) Bakteri DNA ekstraksiyonu aşağıdaki işlem sırasına göre uygulanmıştır: 1) Ön zenginleştirme işlemi uygulananan dondurma örnekleri, içi boş steril eppendorflara (1.5ml hacimli) alınmıştır. Daha sonra 5000 devir/dk da 5 dakika santrifujlenmiş ve süpernatant kısmı atılmşıtır. 2) Karışımın üzerine 200 µl Lizozim eklenmiş ve vortekslenmiştir. Lizizi etkili biçimde tamamlamak için 37 o C de 30 dakika inkubasyona bırakılmış inkubasyon süresi boyunca karışımın daha iyi çözülmesi için her 3 dakika bir vorteksleme işlemi uygulanmıştır. Daha sonra 5000 devir/dk da 2 dakika santrifuj edilmiştir. 3) Santrifuj işlemi sonrası ependorf tüplerine 200 µl BL (Buffer Liziz Çözeltisi) ve 20 µl proteinaz K eklenmiş, vorteksleme işlemi yapılmıştır. Ardından 56 o C de 1 saat inkübasyona bırakılmıştır. inkubasyon süresi boyunca karışımın daha iyi çözülmesi için her 10 dakika bir vorteksleme işlemi uygulanmıştır. 4) Etüvde 56 o C de inkübasyondan sonra 250 µl solusyon B eklenmiş ve 20 kez tekrarlı bir şekilde, vurgulu vorteks uygulanmıştır. Karışım devir/dk da 2dk santrifüjlenmiş ve 65 o C de 15 dakika her 3 dakikada bir vorteksleme işlemi uygulanacak sekilde inkubasyona bırakılmıştır. 23

37 3.MATERYAL ve YÖNTEM 5) İnkubasyon sonrası karışımın üzerine 200 µl (% ) etanol eklenmiştir; 5 sn aralıklarla 20 kez vurgulu vorteks uygulanmıştır. Karışım devir/dk da 2 dakika santrifüj edilmiştir. 6) Kit içerisinde mevcut olan spin kolonlardan her bir örnek için bir adet alınıp 2mL hacimli toplama tüplerine yerleştirilmiştir devir/dk 1dk santrifüj işlemi uygulanmıştır. Spin kolonu yeni bir toplama tüpüne (1,5 ml hacimli ependorf tüpü) alınmış ve sıvı kısmı uzaklaştırılmıştır. 7) Filtrenin (spin kolon filtresi) kenarlarını ıslatmadan üzerine 700 µl AW1 Buffer (Yıkama Çözeltisi 1) eklenmiştir. Wash Buffer çözeltileri kullanılmadan önce uygulama protokolüne göre etanol ile seyreltilmiştir. Ardından devir/dk 1dk süre ile santrifüj edilmiştir. Spin kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarılıp sıvı kısmı uzaklaştırılmıştır. 8) Yeniden (spin kolon filtresi) filitrenin kenarlarını ıslatmadan 700 µl AW2 Buffer (Yıkama Çözeltisi 2) eklenmiş ve devir/dk 1dk süre ile santrifüj edilmiştir. 9) Spin kolonu yeni bir toplama tüpüne (1.5 ml hacimli) yerleştirilmiş 70 o C de önceden hazırlanmış olan 200 µl Solution E ile otomatik pipet yardımıyla çalkalama yapılarak yıkanmıştır. Oda sıcaklığında 3 dakika bekletilmiş ardından devir/dk 1dk santrifüj edilmiştir. Spin kolonu atılmış toplama tüpünde elde edilen supernatant, moleküler tanımlamada kullanılmak üzere -20 o C de saklanmıştır. 24

38 3.MATERYAL ve YÖNTEM Resim 3.3. DNA Ekstraksiyonunda Kullanılan Toplama Tüpü İçerisine Yerleştirilmiş Spin Kolonu Görüntüsü DNA İzolatlarının amplifikasyonu (PCR) Moleküler tanımlamada kullanılmak üzere saklanan DNA izolatlarına Listeria türlerine ait olan iap geni (işgal ile ilişkili gen bölgesi yani ektraselüler bir protein olan p60 kodlayan bölgenin tanımlanması amacıyla Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction=PCR) işlemi uygulanmıştır. PCR da kullanılan malzemeler aşağıda listelenmiştir: dntp Mix (datp-dctp-dttp-dgtp) Primerler (List-unıt 1, List-unıt 2) TaqPolimeraz 5xFlexi Buffer 3.5 mm MgCl 2 25

39 3.MATERYAL ve YÖNTEM İçerisinde datp, dctp, dgtp ve dttp nukleotidleri ayrı ayrı sulu çözeltiler halinde bulunan dntp Mix kiti ticari olarak temin edilmiştir ve her bir nukleotidden 0.2 µl alınarak steril 1.5 ml lik eppendorf tüpü içinde dntp Mix hazırlanmıştır. DNA izolatlarının moleküler olarak tanımlanmasında PCR işlemi uygulanmıştır. DNA izolatları kalıp DNA olarak kullanılmış ve PCR işlemi ile amplifikasyonları gerçekleştirilmiştir. Listeria spp. olduğu doğrulanmış amplikonlar DNA bantlarının görüntülenmesi ve tür bazında ayrımın yapılabilmesi için agaroz jel elektroforezine tabi tutulmuştur (Cocolin, 2002) (1) PCR mix hazırlanışı bekletilmiştir. DNA izolatları -20 o C den çıkarılıp oda sıcaklığında çözününceye kadar Listeria türlerine özgü primerler kullanılmıştır. Listeria türleri 1. L. ivanovii Forward 5 -ATGTCATGGAATAA- 3 ( ) Rewerse 5 -AAAAACATCTTGGAAAAGC- 3 ( ) Listeria türleri 2. L. seeligeri Forward 5 - ATGTCATGGAATAA- 3 ( ) Rewerse 5 -AAAAACACCTTGGTAAAGC- 3 ( ) 3. L. welshimeri Forward 5 - ATGTCATGGAATAA- 3 ( ) Rewerse 5 -AAAAACATCTTGGAAAAGC- 3 ( ) 4. L. innocua Forward 5 - ATGTCATGGAATAA- 3 ( ) Rewerse 5 -AAAAACATCTTGGAAAAGC- 3 ( ) 5. L. monocytogenes Forward 5 - ATGTCATGGAATAA- 3 ( ) Rewerse 5 -AAAAACACCTTGGAAAAGC- 3 ( ) bp bp 26