KLİNİK BİYOKİMYADA ÖNEM KAZANAN ANTİOKSİDAN ve PROOKSİDAN TESTLERİ ve CUPRAC YÖNTEMİ

Transkript

1 KLİNİK BİYOKİMYADA ÖNEM KAZANAN ANTİOKSİDAN ve PROOKSİDAN TESTLERİ ve CUPRAC YÖNTEMİ Reşat APAK* ve Sema D. ÇEKİÇ İstanbul Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Bölümü Analitik Kimya Anabilim Dalı, Avcılar İstanbul * İstanbul Üniversitesi ve Türkiye Bilimler Akademisi (TÜBA) XXVII. ULUSAL BİYOKİMYA KONGRESİ 3-6 Kasım 2015 Antalya

2 Prof. Dr. Aziz Sancar (Kimya 2015 Nobel Ödülü) Tıp Nobel i mi, Kimya Nobel i mi? Hücresel DNA nın onarım mekanizmaları Kanser tedavisinde ritmik saat Yale Üniv de bakteriyel DNA ya UV hasarını belirleyen ve hatalı jenetik kodu kesen fotolaz ve benzeri enzimlerin keşfi; Chapel Hill deki North Carolina Univ de insanda gerçekleşen eşdeğer onarım mekanizmalarının keşfi.

3 Şekil 1. Reaktif türlerin ve antioksidanların canlı vücudundaki dengesi İç ve dış antioksidanların birlikte katkıda bulunduğu vücuttaki antioksidan savunma ağının görevi reaktif türleri tümüyle yok etmek değil oksidatif hasarı en aza indirirken bu türlerin bilinen yararlı fonksiyonlarını sürdürmelerine izin vermektir.

4 Serumda AOA ölçümünün önemini vurgulayan hastalık örnekleri: 120 sağlıklı, 80 hasta (40 akut miyokard enfarktüsü (AMI) hastası ve 40 kronik lenfotik lösemi (CLL) hastası) birey için antioksidan aktivite (AOA) ölçülmüştür. Aşağıdaki 120 sağlıklı bireye kıyasla (ortalama AOA 2.04 mmol/litre; standart sapma değeri 0,2) hem AMI hem CLL hastalarının AOA değerlerinin önemli ölçüde düşük olduğu saptanmıştır (t > 8.3; p < ). Şekil 2. Sağlıklı ve hasta bireylere ait serum örneklerinde ölçülen AOA değerleri Kaynak: D. Koracevic, G. Koracevic, V. Djordjevic, S. Andrejevic, V. Cosic, J Clin Pathol, 54 (2001)

5 İnsanlarda yaşlanma sürecinde Eritrosit sialik asit düzeyleri: Oksidatif stres belirteçleri ile ilişkisi Sialik asidler esas olarak glikoprotein ve gangliosidlerde bulunan bir monosakarid olan neuraminic asidin N- or O-sübstitue türevleridir. Yaşlanmanın bir fonksiyonu olarak kırmızı kan hücresi membranlarında sialik asit miktarının dikkate değer ölçüde azaldığı (r=-0.901) gösterilmiştir. Hidroperoksit formunda ölçülen lipid peroksidasyonu plazmada ve kırmızı kan hücresi membranlarında yaşlanmaya bağlı olarak artarken toplam antioksidan kapasitenin (TEAC) önemli ölçüde azaldığı görülmüştür. Sonuçta yaşlanma ile artan oksidatif stresin membran bileşimini değiştirerek sialik asidin bozunmasına yol açabileceği öne sürülmüştür. Yaşlılık süreci ve ölümü izlenen 2932 denekli (popülasyon medyan yaşı=70), sonuçları yeni açıklanan bir araştırmaya göre reaktif oksijen metabolitleri (d-rom) ve redox kontrol vasıtası olarak toplam tiyol düzeyleri (TTL) izlenen popülasyonda her iki parametrenin de yaşlılıkta ölüm ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Bu bulgular, yaşlanmanın oksidatif stres/serbest radikaller ile ilişkisini gösteren hipoteze destek vermektedir. (B. Schöttker et al., J. Gerontology: MEDICAL SCIENCES, 2014)

6 Antioksidan kapasite nedir? Nasıl ölçülür? Toplam antioksidan kapasite (TAC), antioksidanlarla reaktif türler arasındaki reaksiyonun termodinamiğini (verimini); antioksidan aktivite (AOA) ise aynı reaksiyonun kinetiğini (hızını) ölçer. Antioksidan etkinlik (TAC/AOA) testleri genelde enzimatik olmayan antioksidanları hedef alır ve doğrudan veya dolaylı olarak yürütülür. Doğrudan testlerde biyolojik olarak önemli reaktif türler (ROS/RNS), prob ile reaksiyona girerek onu dönüştürür. Antioksidanlar reaktif türlerle yarışmalı bir reaksiyona girerek probun daha az dönüşmesini sağlarlar:

7 Doğrudan ve dolaylı AOA testleri Prob + (ROS/RNS) Dönüşmüş prob + inaktif O,N-türleri (1) AOX + (ROS/RNS) Yükseltgenmiş AOX + inaktif O,N-türleri (2) (1) ve (2) reaksiyonları birbiriyle yarışır ve AOX lar varlığında prob daha az dönüşüme uğrayacağından probun başlangıç ve son hallerine ait spektroskopik sinyaller farklılaşır. Fark, TAC/AOA ölçüsüdür. Dolaylı testlerde ise biyolojik antioksidan etkinliği laboratuvar ortamında simüle edilir (yarışmasız reaksiyon): Prob + AOX İndirgenmiş prob + Yükseltgenmiş AOX Yine aynı şekilde probun başlangıç ve son halleri spektroskopik olarak farklı olup fark, TAC/AOA ölçüsüdür.

8 OKSİDATİF STRES BİOMARKERLERİ: Antioxidant capacity: Which capacity and how to assess it? Etsuo Niki, Journal of Berry Research 1 (2011)

9 OKSİDATİF STRES BELİRTECİ OLARAK PROTEİN KARBONİL (C=O) GRUPLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ Protein CO gruplarının yüksek seviyeleriyle oksidatif stres ve hastalıklar arasındaki ilişki tam olarak açıklanamamış olmakla birlikte oksidatif stres belirteci olarak sıklıkla kullanılır. Yaygın karbonil tayin yönteminde CO, 2,4-dinitrofenil hidrazin (DNPH) ile türevlendirilerek hidrazon türevleri oluşturulur. Şekil 3. Aldehit ve ketonların DNPH ile reaksiyonları sonucu DNPH oluşumu Bu türler spektrofotometrik, enzim-bağlantılı iminosorbent tayini (ELISA), tek boyutlu veya çift boyutlu elektroforezin ardından Western blot yöntemleri kullanılarak belirlenebilir.

10 DNA OKSİDATİF HASARININ BELİRLENMESİ DNA ya serbest radikal, özellikle hidroksil radikali ( OH) saldırısı sonucu en kolay yükseltgenen DNA bazı olan guanin den oluşan çeşitli (birincil ve ikincil) ürünler, oksidatif DNA hasarının belirlenmesinde kullanılır. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan analitik teknikler GC/MS, LC/tandem MS dir. Şekil 4. OH radikali saldırısı sonucunda guaninin C8-pozisyonuna radikal katılmasıyla oluşan C8-OH katılma ürünleri

11 COMET ANALİZİ Tek hücre jel elektroforezi (SCGE) yöntemi DNA sarmal kırıklarının belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem Mikrojel Elektroforetik Yöntem yada Comet Assay olarak da adlandırılır. Uygun şekilde süspande edilen hücreler önce lizing işlemine ardından da elektroforeze tabi tutularak akridin oranj gibi DNA bağlayıcı floresan boyayla boyanırlar. Kırık içeren örneklerde bu hasarlı fragmanlar nedeniyle elektrik yükü kazanan DNA, çekirdekten anoda doğru göç ederken aldığı kuyruklu yıldız benzeri görünümünden ötürü hasarlı hücreler COMET olarak adlandırılır. Şekil 5. COMET testinin uygulanışı ( Kaynak: O. Ostling ve K.J. Johanson, Biochemical and Biophysical Research Communications, (1984), 123,

12 TBARS YÖNTEMİ Düşük maliyeti ile en yaygın dolaylı prooksidan tayin yöntemlerinden birisi de TBARS Yöntemi olarak adlandırılan Tiyobarbitürik aside reaktif maddeler yöntemidir. Ancak sonuçlar çok çeşitli enterferanslardan etkilenmekte olup verilerin yorumlanması sırasında çok dikkatli olunması gerektiği bilinmektedir. TBARS Parameter Kit for Measuring Oxidative Stress R&D SYSTEMS a Biotechne Brands Şekil 6. TBARS Yöntemi, tiyobarbitürik asit (TBA) ve deoksiribozdan gelen malondialdehit (MDA) arasındaki reaksiyon sonucu oluşan pembe kromojenin absorbansının 532 nm de (veya floresansının 553 nm de) okunmasına dayanır. Bu kromojen butan 1-ol e ekstrakte edilebilir.

13 TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ Literatürde toplam antioksidan kapasitenin (TAC) ölçülmesi amacıyla sıklıkla kullanılan yöntemler çok keskin sınırlarla ayrılmamakla beraber mekanizmalarına göre, elektron transferi (ET) veya hidrojen atomu transferi (HAT) esaslı tayinler olarak iki sınıfta toplanabilir. Çok yaygın olarak kullanılan ABTS/TEAC ve DPPH Yöntemleri ise ET/HAT karma mekanizmasıyla çalışır. Elektron Transferi (ET) esaslı spektrofotometrik yöntemler antioksidan kapasitesini indirgendiğinde renk değiştiren bir kromojenik bir yükseltgenin renk şiddetinin ölçülmesi esasına dayanır. Renk şiddetindeki değişim örnekteki antioksidanın miktarı ile doğru orantılıdır. Prob (n) + e (antioksidan kaynaklı: AH) Prob (n-1) + AH + (ET) esaslı yöntemlere örnek olarak, ferrisiyanür, FRAP, ve CUPRAC ve CERAC Yöntemleri verilebilir. Kaynak: R. Apak, K. Güçlü, B. Demirata, M. Özyürek, S. E. Çelik, B. Bektaşoğlu, K. I. Berker, D. Özyurt, Molecules, 12 (2007)

14 ABTS/TEAC YÖNTEMİ Şekil 7. ABTS Yöntemi. (Şekil Boligon et al., Med chem 2014, 4(7), den alınmıştır) ABTS/TEAC: ABTS + K 2 S 2 O 8 ABTS + (λmax=734 nm) ABTS + + ArOH ABTS + ArO + H + ABTS: 2,2 -azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonik asit) TEAC: Trolox ekivalent antioksidan kapasite Literatürde ABTS/TEAC Yönteminde kullanıldığı bildirilen diğer dalgaboyları 415 ve 645 nm olmasına rağmen en yaygın kullanım bulan bitki pigmentlerinden gelen enterferansın daha düşük olduğu λ= 734 nm dir. Kaynak : Re, R,; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M. Free Radical Biol Med. (1999) 26,

15 DPPH YÖNTEMİ Şekil 8. DPPH radikali ve antioksidan (AO-H) tarafından indirgenmesi (Şekil Boligon et al., Med chem 2014, 4(7), den alınmıştır) DPPH + ArOH DPPH + ArO + H + DPPH : Stabil [2,2-diphenyl-1-picryl-hidrazil] radikali λmax=515 nm. Kaynak : Bondet, V.; Brand-Williams, W.; Berset, C. Food Sci. Technol. 30 (1997)

16 FRAP YÖNTEMİ FRAP (Demir(III) İndirgeme Antioksidan Gücü) tayini, elektron transfer reaksiyonlarının avantajlarına sahip, göreli basit ve ucuz bir yöntemdir. Burada yükseltgen, bir demir(iii) kompleks tuzu olan Fe(III)(TPTZ) 2 Cl 3 (TPTZ : 2,4,6-tripiridil-s-triazin) dir. Şekil 9. FRAP Yöntemi ve kromoforu [Fe(II)(TPTZ) 2 ] Kaynak: F.F., Benzie, J.J., Strain, Anal. Biochem., 239 (1996)

17 FERRİSİYANÜR (HEKZASİYANOFERRAT(III)-PRUSYA MAVİSİ) YÖNTEMİ 1986 dan beri bilinen ferrisiyanür yöntem, başlangıçta (Fe(III)+SDS) eklenmesiyle ve ph=1.6 olacak şekilde modifiye edilmiştir. Prusya mavisi Fe[Fe(CN) 6 ] - oluşumuyla λ max =750 nm ye çıkartılmıştır: ferrik-ferrisiyanür yöntemi Böylece potansiyel 0.36 V un üzerine çıkarılır. Fe 3+ + ArOH Fe 2+ + ArO + H + Fe 2+ + Fe(CN) K + KFe[Fe(CN) 6 ] λ max =750 nm. Kaynak: K. I. Berker, K. Güçlü,. I. Tor, B. Demirata Öztürk, R. Apak, Food Anal. Methods, 3 (2010) ve K. I. Berker, B. Demirata, R. Apak,, Food Anal. Methods,5 (2012)

18 CUPRAC YÖNTEMİ Açık mavi CUPRAC reaktifi Sarı renkli ürün Şekil 10. CUPRAC reaksiyonu ve kromoforu: Bis(neokuproin) bakır(i) kelat katyonu (Reaksiyon sırasında açığa çıkan protonlar NH 4 Ac tamponu tarafından nötralleştirilir). Elektronik konfigürasyonu d 10 yapısında olan Cu(I) ile Nc arasında oluşan kompleks, Cu(II)-d 9 konfigürasyonuna nazaran daha tetraedral bir yapı kazanarak moleküler gerginliği azaltır ve Cu(I) i stabilize eder (ML 2 için Logβ 2 kümülatif oluşum sabitleri Cu(I) ve Cu(II) için 19 ve 12). Şekil 11. Farklı konsantrasyonlardaki kuersetinin CUPRAC reaksiyonu sonucunda oluşan Cu(I)-Nc spektrumu Kaynak: R. Apak, K. Güçlü, M. Özyürek, S. E. Karademir, J. Agric. Food Chem., 52 (2004)

19 CUPRAC Yöntemi metil-β-siklodekstrin (Me-β-CD) içeren çözeltilerde lipofilik ve hidrofilik antioksidanların bir arada tayinine olanak sağlamaktadır. Şekil 12. Antioksidan bileşikler ile Metil-β-CD arasındaki Konak-konuk (Host guest) etkileşimini takiben inklüzyon kompleksinin TAC içeriği CUPRAC Yöntemi ile tayin edilir. CUPRAC Yöntemi uygun şekilde modifiye edilerek H 2 O 2, süperoksit ve hidroksil radikallerinin dolaylı olarak ölçülmesinde kullanılabilir.

20 POLİFENOLİK BİLEŞİKLERİN HİDROKSİL RADİKALİ SÜPÜRME ANTİOKSİDAN AKTİVİTESİ Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH. + OH - (t=10 dakika) + katalaz H 2 O 2 H 2 O + O 2 (Fenton reaksiyonunun durdurulması) Kaynak: M. Özyürek, B. Bektaşoğlu, K. Güçlü, R. Apak, Anal. Chim. Acta, 616 (2008)

21 Şekil 13. Salisilik asit probuna hidroksil radikali saldırısının ardından oluşan temel hidroksilasyon ürünleri Kaynak: B. Bektaşoğlu, M. Özyürek, K. Güçlü, R. Apak, Talanta, 77 (2008)

22 POLİFENOLİK BİLEŞİKLERİN KSANTİN/KSANTİN OKSİDAZ INHİBİSYON AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜLMESİ Ürik asidin CUPRAC absorbansı vardır (TEAC katsayısı = 1) İnkübasyon çözeltisinin Cu(II)- neokuproinin ksantin ksantinoksidaz sistemininden oluşan ürünler ile indirgenmesi sonucu oluşan CUPRAC absorbansının polifenolikler varlığındaki azalır, absorbans farkı test edilen bileşiklerin ksantinoksidaz inhibisyon aktivitesi ile orantılıdır. % İnhibisyon = 100 [(Ao-A)/Ao] A ve A 0 sırasıyla inhibitör varlığındsa ve yokluğundaki CUPRAC absorbanslarıdır. Kaynak: M. Özyürek, B. Bektaşoğlu, K. Güçlü, R. Apak, Anal. Chim. Acta, 636 (2009)

23 POLİFENOLİK BİLEŞİKLERİN (Cu(II)-katalizörlüğünde) HİDROJEN PEROKSİT SÜPÜRME AKTİVİTESİNİN BELİRLENMESİ Ar(OH) n + H 2 O 2 + CuCl 2 CUPRAC yöntemi uygulanır (37 o C de inkübasyon t = 30 dak.) % H 2 O 2 süpürülmesi = 100 [A o -(A 1 -A 2 )/A o ] A 0 = H 2 O 2 çözeltisinin CUPRAC Absorbansı A 1 = (H 2 O 2 + süpürücü) karışım çözeltisinin katalaz yokluğundaki CUPRAC Absorbansı A 2 = (H 2 O 2 + süpürücü) karışım çözeltisinin katalaz varlığındaki CUPRAC Absorbansı Kaynak: M. Özyürek, B. Bektaşoğlu, K. Güçlü, N. Güngör, R. Apak, J. Food Comp. Anal., 23 (2010)

24 HİDROJEN PEROKSİT TAYİNİ YOLUYLA KATALAZ AKTİVİTESİNİN DOLAYLI OLARAK TAYİNİ

25 CUPRAC antioksidan sensörü CUPRAC Kolorimetrik sensörü Cu(II)-Nc Nafyon membran Nafyon-Cu(II)-Nc Nafyon-Cu(I)-Nc Rotatörde 30 dak. karıştırılır Antioksidan örneği Ölçülen absorbans (450 nm) Referans: M. Bener, M. Özyürek, K. Güçlü, R. Apak, Development of a Low-Cost Optical Sensor for CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity) Measurement of Food Extracts, Anal. Chem., 82 (2010)

26 BİYOLOJİK ÖRNEKLERİN SÜPEROKSİT RADİKAL SÜPÜRME AKTİVİTELERİNİN BELİRLENMESİ Şekil 14. PMS-NADH sisteminde üretilen O 2 - TBHQ nin TBBQ ye yükseltgenmesi İnhibisyon (%) = 100 [(Ao-A)/Ao] İnkübasyon karışım çözeltisinin süpürücü varlığında ve yokluğundaki absorbansları sırasıyla Ao ve A olarak ifade edilmiştir. Kaynak: B. Bekdeşer, M. Özyürek, K. Güçlü, R. Apak, Anal. Chem., 83 (2011)

27 İSKEMİ-REPERFÜZYON UYGULAMASINDA CUPRAC IN BAŞARISI: Teorik olarak, oksidan saldırısı arttıkça antioksidan stokunun azalması beklenir. Çeşitli araştırmacılar prooksidanlar ile toplam antioksidan kapasite arasındaki bu ters orantıyı göstermiştir. Örneğin, Bean ve ekibi kısmen tıkanmış olan tavşan mesanesinde iskemi-reperfüzyon sonucunda reaktif oksijen (ve/veya azot) türleri oluşturmuşlardır. Bu şartlarda serbest radikallerdeki artış sonucu koruyucu antioksidanların miktarında azalma olması beklenir. Bu çalışmada elektron transferine dayanan iki farklı antioksidan kapasite tayin yöntemi, CUPRAC ve FRAP kullanılarak tıkanmış ve normal (kontrol) mesane dokularının antioksidan aktivitesi incelenmiştir. FRAP ın aksine CUPRAC ile tıkanmış mesane dokusunun AOA sinin kontrol amaçlı kullanılan mesanenin kas ve mukozasına kıyasla daha düşük olduğu belirlenmiştir.

28 Şekil 15. Mesanedeki tıkanmanın kas ve mukozadaki toplam antioksidan kapasite üzerine etkisinin CUPRAC Yöntemi ile incelenmesi. Şekil 16. Mesanedeki tıkanmanın kas ve mukozadaki toplam antioksidan kapasite üzerine etkisinin FRAP Yöntemi ile incelenmesi. Grafikteki her bir bar dört farklı örneğe ait değerlerin ortalaması ve ortalamanın ± standart hatasını temsil etmektedir. Kaynak: H. Bean, F. Radu, E. De, C. Schuler, R.E. Leggett, R.M. LevinMol Cell Biochem 323 (2009)

29 Soy metal nano-partiküllerin (NP) Yüzey Plasmon Rezonans Absorpsiyonu Sıfıra yakın dielektrik sabitli NP lerin SPR absorpsiyonu, yerleşik yüzey plazmon (LSPR) bandına yol açar. Au/Ag-NP leri yüksek molar abs. katsayılarından ötürü optik dedeksiyonda bilinen reaktiflerden daha yüksek duyarlılığa olanak verirler. Yüzey plazmonların özellikleri ortamın kimyasal yapısına ve çözücüye, özellikle de NP-kabuk kalınlığına bağlı olduğundan, Ag(I) iyonlarından sitrat ile elde edilen Ag- NP tohumlarının antioksidan katılmasıyla büyümesine dayalı bir AOX kapasite yöntemi geliştirilmiştir. LSPR-bandı, soy metalin küresel nanopartiküllerinin iletkenlik bandı elektronlarının, gelen ışığın elektrik alanıyla koherent titreşimi sonucu ortaya çıkar. Şekil 17: Küresel Au-kolloidler için serbest elektronların kollektif titreşimi (şematik) Referans: Xia, Y., Halas, N. J., 2005, Shape-controlled synthesis and surface plasmonic properties of metallic nanostructures, MRS Bulletin, 30,

30 Gümüş nano-parçaçık esaslı antioksidan kapasite (SNPAC) tayin yöntemi 2Ag + + (CH COONa) -C(OH)(COONa) (CH COONa) 2Ag 0 + (CH COONa) CO (CH COONa) + Na + + H + + CO 2 nag + + Ar(OH) n nag 0 + Ar(=O) n + nh + Şekil 18. Gallik asit varlığında gümüş nanoparçacıkların UV-vis spektrumu Şekil 19. Gümüş nanoparçacıkların SEM görüntüsü (a) trisodyum sitrat varlığında (b) Gallik asit + trisodyum sitrat varlığında Referans: M. Özyürek, N. Güngör, S. Baki, K. Güçlü, R. Apak, Development of a Silver Nanoparticle-Based Method for the Antioxidant Capacity Measurement of Polyphenols, Anal. Chem., 84 (2010)

31 Ellman reaktifi (RSSR ) ile türevlendirilmiş Au-NP ler yardımıyla biyo-tiyollerin (R-SH) kolorimetrik tayini Trisodium citrate + DTNB Heating and Reflux (5 min) Au-NP (Au 0 ) SEM image of Au-NPs synthesized with trisodium citrate. Equilibrated (for 24 h) DTNB-Au-NP Au-NP + DTNB mixture Centrifuged and supernatant was removed Freeze-dried and resuspended Reference: Güçlü, K., Özyürek, M., Güngör, N., Baki, S., Apak, R., 2013, Selective optical sensing of biothiols with Ellman s reagent: 5,5 -Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)-modified gold nanoparticles, Analytica Chimica Acta, 794,

32 p-aminotiyofenol ile türevlendirilmiş Au-NP ler ile kolorimetrik NİTRİT tayini Şekil 20: 4-Aminotiyofenol ile modifiye edilmiş Au- NP yüzeyinde nitrit sensörü (nitrit, nitropatlayıcıların hidrolizinden gelir) Şekil 21: Türevlenmemiş AuNP (a), 4-aminotiyofenol ile modifiye edilmiş AuNP (b) ve RDX hidrolizini takiben oluşan ürünlerle renklenmiş AuNP spektrumları; RDX derişimi: 20 (c) ve 50 (d) mg L

33 Kombine oksidan-antioksidan kolorimetrik sensörü (DMPD yöntemi): Anabilim Dalımızda yapılan bir çalışmada daha önce Bener ve çalışma grubunun CUPRAC Sensörü geliştirmekte kullandıkları O (CF 2 ) 2 SO 3 - esaslı Nafyon membran üzerinde hem prooksidan hem antioksidan tayin edebilen bir sensör geliştirilmiştir. Bu amaçla N,N-dimetil-p-fenilen-diamin (DMPD) ile hidroksil ( OH) ve süperoksit (O 2 - ) radikalleri arasındaki reaksiyon sonucunda oluşan katyonik yarı-kinon radikalleri (DMPDQ) Nafyon membran üzerine tutturulmuştur. Membran üzerinde oluşan pembe renk reaktif oksijen türlerinin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Nafyon üzerinde tutulan katyonik radikallerin oluşturduğu pembe renk antioksidanlar varlığında azalır. Sensör üzerinde ölçülen absorbanstaki azalma (ΔA) antioksidan konsantrasyonu ile orantılıdır. Şekil 22. DMPD den oluşturulan katyonik DMPDQ yarıkinon türevleri Kaynak: S. D. Çekiç, A. N. Avan, S. Uzunboy, R. Apak; Analytica Chimica Acta 865 (2015) 60 70

34 Çalışmada hidroksil ( OH) ve süperoksit (O 2 - ) değişik kaynaklar kullanılarak üretilmiştir; OH hem Fenton sistemi ile hem de (UV+H 2 O 2 ) kullanılarak elde edilirken O 2 -, ksantin/ksantin oksidaz reaksiyonuyla oluşturulmuştur. Şekil 23. (a) Nafion membrane kesiti, (b) DMPDQ radikallerini sorplamış olan Nafyon membran (Antioksidansız çözeltide Fenton sisteminden eldilen hidroksil radikalleri varlığında), (c) 0.05 µmol kuersetin varlığında ve (d) 0.10 µmol kuersetin varlığında çözeltide azalan hidroksil radikalleri nafyon membran üzerinde oluşan renk şiddetinde azalmaya neden olur. Örnek antioksidan olarak seçilen Epigallokateşin gallatın değişen miktarları ile antioksidan varlığında ve yokluğunda nafyon membran üzerinde ölçülen absorbans farkları arasındaki ilişki aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Şekil 24. (a) Fenton yöntemiyle üretilen OH, (b) Ksantin/ksantin oksidazdan elde edilen O 2 - (c) UV/H 2 O 2 sisteminden üretilen OH den kaynaklanan ve nafyon üzerinde ölçülen absorbansın antioksidan yokluğunda ve varlığındaki absorbans farkları ile EGCG konsantrasyonu rasındaki ilişki

35 Teşekkür: 114Z089 no lu proje ile verdikleri katkıdan ötürü TÜBİTAK ve İstanbul Üniversitesi Gıda Antioksidanlari Ölçümü Uygulama ve Araştırma Merkezi (GAAM) Birimine teşekkür ederiz. Teşekkürler 35