Sentezi ve Bunların Sıcanlarda Serum Total Kolesterol ve Trigliserit Seviyelerine Etkileri

Summary : In this study, four new ethyl 2- (benzimidazolyl) phenoxyalkanoates ha ve been synthetized by reaction of 2- ( hydroxyphenyl) benzimidazoles with ethyl 2-bromoalkanoates in aceton with potassium carbonate. The structures of these compounds have been elucidated with their UV, IR, NMR spectra and elementary analysis. The effects of the compounds on serum total cholesteroı and trigliceride levels have been investigated in male albino rats. It has been found that decreases on serum total cholesterol and trigliceride levels which were caused by compound IV is statistically significant. (*) H.ü. Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Kimya Anabilim Dalı, Hacettepe - Ankara. I 9 FABAD Farın. Bil. Der. FABAD J. Pharm. Sel. 8, 9-29, 983 8, 9 29, 983 Bazı Benzimidazol Türevlerinin Sentezi ve Bunların Sıcanlarda Serum Total Kolesterol ve Trigliserit Seviyelerine Etkileri Cihat ŞAFAK(*) M. Fethi ŞAHİN (*I özet : Bu çalışmada, '2- (hidroksifenil)benzimidazoller ile etil 2- bromoalkanoatıarın aseton içinde potasyum karbonatlı ortamda reaksiyonuyla etil (2 - benzimidazolil)fenoksialkanoat yapısında dört bileşi~in semczi ~ apıimıştır. Y "pıları UV, IR, NMR ve elementer analizleriyle k:mıtlannıışlır. Bu Oikşiklerin beyaz erkek sıçanlarda serum total kolesterol ve trigliserit seviyelerine etkileri incelenmiştir. IV nolu bileşiğin serum total kolesterol ve trigliserit seviyelerinde neden olduğu azalmalar istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. SYNTHESIS OF SOME BENZIMIDAZOL DERIV ATIVES, AND THEIB EFFECTS ON SERUM TOTAL CHOLESTEROL AND TRWLICERIDE LEVELS in RATS

GİR İŞ Maddelerin hazırlanması için sentezi yapılan 2- sübstitüefenilbenzimidazol türevi bileşikler etil 2-bromoalkanoatıarla aseton içe- Owp4)R + Br- ~ -COOC,H5 CH, o:?of 0-~-COOG2 R Hı - HCI CHJ fenil halkasında 4-pirazolil (5l, 3-oksadiazolil (6), 2-benzofuril ve 2-benzotiyofenil (7), 2-benzotiyazolil ve 2-benzoksazolil (8), sübstitüentıeri taşıyan fenoksialkanoat yapısındaki bileşiklerde de benzer etkiler gözlenmiştir. Bu bilgilerin ışığı altında klofibratın bazı yan etkilerini ortadan kaldırmak ve daha etkin ilaç sentez etmek amacıyla fenil halkasının 3 ve 4 nolu konumlarında 2- benzimidazolil sübstitüenti taşıyan fenoksi alkanoat yapısında dört bileşiğin sentezi yapılmıştır. O R?-cOO~Hs. CH3.HCI risinde potasyum karbonat karşısında reaksiyona sokulmuş ve elde edilen bileşiklerin hidroklorür tuzlarına geçilmiştir. Julia ve arkadaşları () tarafınd a n sentezi yapılan ve etkisi Thorp ve Waring (2) tarafından gösterilen etil 2 - (p - klorofenoksi) - isobütirat (KLOFİBRAT) gunumüzde ençok kullanılan antilipidemik ilaçların en önemlisidir. Kloribrat yapısında ester grubu, asidin alkil grubu ve fenil hallmsında yapıl an değişiklikler sonucu antilipidemik etki gösteren çok sayıda bileş iğ in hazırlandığı bildirilmektedir (3, 4). Bunun yanısıra

Hazırlanan bileşiklerin erime derecesi, çözünürlük, UV absorbsiyonlarına ait özellikleri saptanıp; IR, NMR spektrumları ve elementer analizleriyle yapıları kanıtlanmıştır. Çalışmanın ikinci aşamasında, bu bileşiklerin beyaz erkek sıçanlarda serum totaı kolesterol ve trigliserit düzeyleri üzerine etkiltrinin incelenmesi amaçlanmıştır. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışmada kullanılan o - fenilendiamin, 3-hidroksibenzaldehit, 4-hidroksibenzaldehit, etil 2-bromopropanoat, etil 2-metil- 2-bromopropanoat, kolesterol, triolein, sodyum metaperiyodat, asetilaseton ve diğer kimyasaı maddeler Merek firmasının, sodyum karboksimetilselüloz (CMC) Selkim firmasının ürünüdür. Hayvan deneylerinde 20-220 g ağırlığında erkek beyaz sıçanlar kullanılmıştır. Sıçan yemi (Yem Sanayii) ve çeşme suyu ile beslenmişlerdir. Analiz çalışmalarında santrifüj (Wirmvka typ WE - 2), spektrofotometre (Bausch and Lomb), kapiler mikropipet (Cole - Parmerl den yararlanılmıştır. Klofibrat (Doğu) standart madde olarak kullanılmış tır. Kimyasal Çalışma : 2-Fenilbenzimidazoller 3 veya 4-hidroksibenzaldehit ve sodyum bisülfit oda temper'.ltüründe alkol - su ( : ) karışım ında reaksiyona sokuldu. Reaksiyo~ı ortamında bulunan çözücüler kuruluğa kadar uçurularak aldehit bisüifit katım ürünü kazanı ldı. Bu katım bileşiği ekimolar oranda o-fenilendiaminle dimetilformamit içinde 2 saat ısıtıldı. Oluşa':l 2-fenilbenzimidazol türevi madde kristalizasyonla saflaştırıldı (Verim %89-92). Etil 2- [3 ve 4-(2- benzimidazolillfenoksilj alkanoat hidroklorür : Ekimolar oranda 2-(Sübstitüefenil}benzimidazol ve etil 2-bromoalkanoat aseton içerisinde potasyum karbonatla geri çeviren soğutucu altında ısıtıldı (etiı 2-bromop ropanoatıa 9 saat, etil 2-metil-2-bromopropanoatıa 48 saat). Reaksiyon sonunda aseton uçurularak artık suyla yıkandı. 50 ml %0'luk potasyum hidroksitle muamele edilen bu karışım, 2 kez 00 m ı eterle ekstre edildi. Eterli faz sodyum sülfatla kurutulduktan sonra 50 ml'ye kadar yoğunlaştırıldı. Bu karışımdan gaz hidroklorik asit geçirilerek madde hidroklorür tuzu halinde çöktürüldü. Maddelerin tümü alkol - su ( : 2l karışımın dan kristallendirildi. Kontroller : Erime dereceleri Thomas Hoover erime derecesi tayin cihazı ile saptandı. UV spektrumları, maddelerin metanoldeki yaklaşık 5 x ıo-5 M konsantrasyonundaki çözeltileri hazırlanarak PYE Unicam SP 800 spektrofotometresinde; IR spektrumları, potasyum bro- 2

rılmıştır. şekilde belirlendi. lik çözeltisiyle mililitrede 5 mg madde olacak şekilde çözülerek gastrik intübasyonla uygulandı. Kontrol grubuna ise sadece yukarıda sözü edilen CMC çözeltisi verildi. Son madde verilişinden 24 saat sonra ikinci kan numuneleri alındı (8. gün). O ve 8.gün alınan kan numunelerinde serum total kolesterol ve trigliserit seviyeleri spektrofotometrik olarak saptandı 22 4.20 g (0.02 mol) 2- (3-hidroksifenil) benzimidazol ve 3-62 g (O.02 mou etil 2-bromopropanoatın re Beyaz, kristalize bir maddedir. e. d.94-6 C. Alkol, aseton, dimetilsülfoksit, dimetilformamitte çözünür. Su, eter, kloroform, bem::m ve karbon tetraklorürde çözünmez. MeOH 244 (log E : 4.7) ve 300 nm (log E : 4.38). IR 3200 (N - H geriiim), 3000-2400 (N+-H gerilim), 730 (C = C ve C = N gerilim), 220, 00 ( C - O gerilim), 790,745 cm-ı (. 3 - disübstitüe benzen). NMR cr.23 (3H; triplet; - COOCH 2 ),.66 (3H; dublet; -0-CH), 4.40 (2H; kuartet; -COOCH 2 ), 5-52 (IH; kuartet; -0-CH-), 7,49-8.57 ppm de (loh; muıtiplet; benzen halka (9, 0). Her grupta elde edilen degerlerin ortalama ve standart hataları hesaplandı. O ve 8. günkü total kolesterol ve trigliserit değerleri arasındaki değişmeler eşler ara s ı farkın önem kontrolü testi () ile istatistiksel olarak incelendi. BULGULAR : Khnyasal Çalışma Etil 2-[3- (2-benzimidazolil) fenoksi]propanoat hidroklorür (I) aksiyonuyla elde edildi. Verim 4.00 g (%57.80). UV ).. maks 228 (log E 4.25), (C =O gerilim), 620, 600, 560 mürle hazırlanan disklerle Perkin Elmer Model 457 IR spektrofotometresinde : NMR spektrumları, DMSO - d 6 (Aldrich) içinde Perkin Elmer 90 MHz spektrometresinde alındı. Elementer analizler Schering (Almanya) firmasında yaptı Biyolojik Çalışma : Deneyde kullanılacak sıçanlar on günlük incelemeye alındı. Bu süre sonunda herbirinde 7 sıçan o lacak şekilde 6 gruba ayrıldı. Vücut ağırlıkları deney başlangıcı ve bitiminde saptandı. Beslenme rejiminde bir değişiklik yapılmadı. Gruplar kontrol, standart ve etkisi araştırılacak maddelere ait olacak Yukarıda sözünü ettiğimiz on günlük gözlem sonunda denekler e terle anestezi edilerek intrakardiyak enjeksiyonla ilk kan numuneleri alındı (O. gün). İ lk kan numunesinin alınışından 24 saat sonra Klofibrat ve etkisi araştırılacak maddeler günde 50 mg/kg oranında tek doz halinde 7 gün süreyle uygulandı. Maddeler CMC'nin su alkol ( : ) karışımındaki % 0.25'

lan ve NH hidrojenleril pikleti görülür. Analiz C 8 HrnCIN 2 0 3 için hesaplanan C, 62.34; H, 5.52; N, 8.08; bulunan C, 62.'22; H, 5.43; N, 8.05. Etil 2 - [4 - ('2 - benzimidazolil) fenoksij propanoat hidroklorür (IIJ 4.20 g (0.02 mol) 2- (4-hidroksifenil) benzimidazol ve 3.62 g (0.02 mol) etil 2- bromopropanoatın reaksiyonuyla elde edildi. Verim 4.6 g (%60.00). Beyaz, kristal iz~ bir maddedir. e.d. 32-3 C. Alkol, aseton, dimetilformaınit, dimetilsülfoksitde çözünür. Su, eter, kloroform, benzen ve karbon tetraklor ürde çözünmez. MeOH UV A maks 227 (log E : 4.03), 254 (log ı::: 4.4) ve 30 nm (log E: 4.49). IR 3300 CN - H gerilim), 3000-2400 (N+ - H gerilim), 720 (C=O gerilim), 600, 490 (C = C ve C = N gerilim) 240, 090 (C - H gerilim), 840 cm- (.4 - disübstitüe benzen). NMR cr.23 (3H; triplet; -COOCH 2 ),.66 (3H; dublet; -0-CH), 4.40 (2H; kuartet; -COOCH 2 ), 5.52 ClH; kuartet; -0-CH), 7.40-8.96 ppm de (loh; muıtiplet; benzen halka ları ve NH hidrojenleril pikleri görülür. Analiz CrnH 9 CIN 2 0J için hesaplanan C, 62.34; H, 5.52; N, 8.08; bulunan C, 62.6; H, 5.76; N. 8.20. Etil 2-metil-2- [3- (2- benzimidazolil) f enoksij propanoa t hidroklorür (III) 4.20 g (0.02 mol) 2-( 3- hidroksifenil) benzimidazo ve 3.86 g (0.02 mol) etil '2-metil- 2 - bromopropanoatın reaksiyonuyla elde edilmiştir. Verim '2.65 g (%37.00). Beyaz kristalize bir maddedir. e.d. 49-50 C. Alkol, aseton, dimetilformamit, dimetilsülfoksitde çözünür. Su, eter, kloroform, benzen ve karbon tetraklorürde çözünmez. MeOH UV A maks 227 (log E : 4.2), 245 (log ı:: : 4.00), 298 (log E : 4.22) ve 306 nm (log E : 4.2ll. IR 3330 (N - H gerilim), 300-2300 (N + - H gerilim), 730 CC =O gerilim), 620, 555, 495 CC=C ve C=N gerilim), 230, '50 (C - O gerilim), 800, 755 cm -ı (.3 - disübstitüe benzen), NMR cr.20 (3H; triplet; -COOCH 2 J,.66 (6H; singlet; -C-C )z, 4.38 (2H; kuartet; -COOCH 2 ), 7.26-8.46 ppm de (loh; multiplet; benzen halkaları ve NH hidrojenleril pikleri görülür. Analiz C 9 H 2 CIN 2 0 3 için hesaplanan C, 63.24; H, 5.87; N, 7.76; bulunan C, 6'2.90; H, 5.97; N, 7.35. Etil 2 - metil - 2 - [4 - (2 - benzimidazolil) fenoksij propanoat hidrok Iorür (IV) 4.20 g (0.02 mol) 2 - (4 - hidroksifcnil) benzimidazol ve 3.86 g (0.02 mol) etil 2- metil- 2- bromopropanoa tın reaksiyonuyla elde edilmiştir. Verim 2.80 g ( %39.00). Beyaz, kristalize bir maddedir. e.d. 94-5 C. Alkol, aseton, dimetilformamit, dimetilsülfoksitde çözünür. Su, eter, kloroform, benzen ve karbon tetraklorürde çözünmez. 23

MeOH (log E : 4.2) ve 3~ nm Oog E : Madde II 7 69.43+ 3.98 79.43 + 3.33... 5.9 Madde III 7 46.4+ 6.67 47.57 ± 7. + 0.98 Madde IV 7 63.86+ 3.56 70.43+ 4.92 + 4.0 24 l Anaİ i z C 9 H 2 CIN 2 0 3 için hesaplanan C, 63.24; H, 5.87; N, 7.76; bulunan C, 63.29; H, s.87; N, 7.86. Biyolojik Çalışma : Deney başlang ı cında (O. gün) ve bitiminde (8. gün) deneklerin vücut ağırlık ları saptanarak deney süresindeki ağırlık değişmesi Tablo ı 'de gösterilmiştir. O ve 8. gün alınan kan numunelerinin serum total kolesterol ve trigliserit seviyeleri; aralarındaki değişme yüzdesi ve değer ler in istatistiksel analiz sonuçları Tablo 2 ve 3 ile Şekil ve 2 de gösterilmiştir. Tablo. Madde Verilmeden Önce ve Sonra Sıçanların Ağulıklar ı (g) Madde Denek Sayısı o. Gün 8. Gün % Değişme Kontrol 7 82.29+ 3.85 87.4+ 3.05 + 2.66 Klofibrat 7 77.00+ 4.60 84.30+ 5.4 + 4.2 Madde 7 66.40 + 0.0 62.60+ 3.60-2.28 UV ). mak s 226 (log E 4.04), 254 4.50). IR 3330 (N - H gerilim), 300-2300 (N+ - H gerilim), 720 (C = O gerilim), 620, 600, 495 (C = C ve C = N gerilim), 255, 40 (C - O gerilim), 840 cm-ı (,4 - dlsübstiüe benzen). NMR cr.23 (3H; triplet; -COOCH 2 ),.72 (6H; singlet; -C( ) 2, 4.43 (2H; kuartet; -COOCH 2 ), 7.26-8.90 ppm de (loh; multiplet ; benzen halka ları ve NH hidrojenleri) pikleri görülür. ve Değişme Yüzdesi

Kontrol 27.30+ 7.87 86.00+ 23.55 P< 0.05 (önemli) + 46. Klofibrat 87.70±6.80 45.70±5.34 P< 0.05 (önemli) - 22.38 Madde I 96. 70+.83 85.60± 7.8 P> 0.05 (önemsiz) -.48 Madde II 9.29±3-54 90.5+3-98 P>0.05 (önemsiz) - 24.43 Madde III 64.00+32.53 43.7 ±29.93 P>0.05 (önemsiz) - 2.80 Madde IV 50.57±0.62 82.00+3.70 P< 0-05 (önemli) - 43.5 25 Tablo 2. O. ve 8- Gün Alman Serum Numunelerinde mg/00 mi Ola rak Total Kolesterol Seviyeleri ve Değişme Yüzdesi Madde O. Gün 8. Gün Eşıer Arası Farkın %Değişme önem Kontrolü Kontrol 86.57 + ll.62.00+ 6.46 P<0-05 (önemli) + 28.2 Klofibrat 85.43±0.00 58.86±.9 P<0.05 (önemli) - 3.0 Madde I 0.30+ 2.30 80.70+ 3.0 P>0.05 (önemsiz) - 20.34 Madde II 7il.29± 9-46 64-57± 3.77 P>0-05 (önemsiz) - 7.52 Madde III 69.7+ 6.67 74.29+ 7.0 P>0.05 (önemsiz) + 6-57 Madde IV 9.4±0-23 59.7±3-74 P<0.05 (füıemlii - 26.4 Tablo 3. o. ve 8. Gün Alınan Serum Numunelerinde mg/00 mı Olarak Trigliserit Seviyeleri ve Değişme Yüzdesi Madde O. Gün 8- Gün Eşler Arası Farkın % Değişme önem Kontrolü

/ il //// I e l ~ 8 ' r 26 Şekil : o. ve s. Gün Alınan Serum Numunelerinde Total Kolesterol Seviyeleri. (Dikey çubuklar ortalama değerlerin standart hatasını, taranmış histogramlar madde verildikten sonraki değerleri göstermektedir) g il il /. / / /...... ID.o ;:: o i2

l B r / / // / /! ~--_:_..:...:.--=,.---=--=--~--!...!...~-=-:...!.-L-J.~i - ------~~----------------~ ~_..,"":t-..,_--------------~~... ---------------' Şekil 2 : o. ve 8. Gün Alınan Serum Numunelerinde Trigliserit Seviyeleri. (Dikey çubuklar ortalama değerlerin standart hatasını, taranm ı ş histogramlar madde verildikten sonraki değerleri göstermektedir) - - / /

maktadır. mıştır. TARTIŞMA VE SONUÇ jeksiyon yolu, yeterli miktar kan alınmasın a olanak vermesi bakı mından tercih edilmiştir (4). Maddelerin verilişinde CMC'nin alkol su karışımındaki çözeltisi kullanıl mış, bunun sonucu maddenin ko 28 6). ğinde : lıdır (p < 0.05). Bu sonuç alkol un antilipidemlk etkiye sahip olduk ları görülmektedir. Madde IV'ün her iki seviyede neden olduğu azalma istatistiksel olarak önemli olup özellikle trigliserit seviyesinde neden olduğu azalmanın, uygulanan dozda klofibratdan fazla oluşu dik kat çekicidir. (Geliş Tarihi : 24.8.982) lay süspande olması sağlanmıştır CMC çözeltisinin hazırlanmasında alkol kullanılmasınd a güdülen a maç, deney süresince deneğe alkol vererek literatürde de önerildi ği gibi, alkolün kan lipit düzeyini artırmasından yararlanmaktır (5, Spektrofotometrik ölçümler sonucu elde edilen tota kolesterol ve trigliserit değerleri incelendi Kontrol grubundaki total ko!sterol ve trigliserit seviyelerinde görülen sırasıyla %28.2 ve %46. lik artış istatistikseı olarak anlam lipit seviyesinde artışa neden olan bir etmen olduğunu göstermekte dir. Klofibrat verilen grupta mad denin her iki seviyedede neden ol du ğu azalmalar önemli bulunmu ş tur ( p < 0.05). Madde I, II, ve III verilen grupların tümünde, madde lerin kolesterol ve trlgliserit seviyelerinde neden olduğu azalmalar istatistiksel olarak önemsizdir. Bu sonuçlar kontrol grubuyla kıyas landığında maddelerin klofibrat kadar olmamakla birlikte belli bir Sentezi yapılan bileşiklerin IR, NMR spelürumları ve elementer analiz sonuçları yapılarını kanıtla Maddelerimizin IR spektrumla rında karakteristik N+ - H, C=O, aromatik halkaya ait C = C gerilim, C - O gerilim ve benzen halkasmdaki sübstitüentlerin birbirlerin.'.! göre konumlarını belirleyen pikler görülmektedir. NMR spektrumların da alkil ve fenil halkası hidrojenlerine ait pikler uygun kimyasal kayma ve integral değer l erin e sahiptir. Maddelerimizde bulunan imidazol halkasının. azotu üzerin deki hidrojene ait pik aromatik sahada bulunmaktadır. Gerçekten de spektrumları aldığ ım ız çözeltiye dötöryum oksit konulup alınan spektrumlarda aromatik sahada bir hidrojene karşı gelen integral değer i aza lması göz l enmiştir. Buna dayanarak adı geçen hidrojenlerin aromatik sahada olduğu saptan Antilipidemik aktivite deği ş ik türde deney hayvanları ile yapıla bilmektedir (2, 3). Bu çalışmada temini ve bakım kolaylığı nedeniy le s ıçan tercih ed ilmiştir. Kan numunelerinin alınmasında literatür de de önerilen intrakardiyak en.

850y (977). 7. Bernasconi, R., Ferrin.i, P.G., «Heterocyclic Substituted Alkanecarboxylic Acid Compounds», Ger. Pat 2.724, 043 (977); ref. C.A. 88, 0520j (978). 8. Nakamura, Y., Wagatsuma, K., Tanaka, K., Aono, s., «Substituted Phenoxyacid Derivatives», Japan Pat 7. 4.54_0 (970) ; ref. C.A. 76, 4696r (972).. 5. Kudzına, D.J., Schonfeld, G., «Alcoholic Hyperlipidemia Induction by Alcohol but not by Carbohydrate», J. Lab. Clin. Med., 77, 384 395, 97. 6. Ginsberg, H., Olefsky, J., Farquhar, J.W., Reaven, G.M, «Moderate Ethanol Ingestion_ and Plasma Triglyceride Lcvels», Ann. Int. Med._, 80, 43-49, 974, 9. Meites, s., Faulkner, W.R.,. Ma,.. nual of Practicaı Micro ~iul J General Procedures in Clinical Chemistry, Illinois, Charles and Thomas Publisher, s. 67, 962. 0. Sigma Technical Bulletin No. 405, The 'Quantitative Colorimetric Determination of Triglycerides in Serum or Plasma», Saint Louis, Sigma Chemical Company, 978.. S ümbülo ğlu, K., Sağlık Bilim!erinde Araştırma Teknikleri ve istatistik, Ankara, Çağ Mat- ; baası, s. 24, 978. 2. Kritchevsky, D., «Experimental : Atherosclerosis», Paoletti, R.,. (ed), Lipid Pharmacology, New ; York, vol. II, 964. 3. İdem, «Anlına! Modeis for At herosclerosis Research», Kritc- : hevsky, D., (ed), Hypolipidemic Agents, Heidelberg, Springer - ' Verlag, vol. XLI, 975. 4. Moreland, F.A., «Collection and Withdrawaı of Body Fluids and Infusion Techniques», Willlam, I.G., (ed), Methods of Animal Experimantation, New York, Academic Press, voı. I, 965. KAYNAKLAR. Julia, M., Ballarge, M., Tchernoff, G., «Sur Quelques Nouve aux Derives Aryloxyisobuty.:rJ ques et Apparentes» Bull. Soc. Chim. Fr., 7?6 - ~8, 956., 2. Thorp, J.M., Wariiıg, W.S., «Mo dification of Metabolism and Distribution of Lipids by Ethyl Chlorophenoxyisobutyrate» Nature, 94, 948-949, 962. R., «Hypolipidaemic Agents», Harper, N.J., Sim monds, A.B., (ed), Advances in 3. Howe, Research, London, Academk Press Inc., vol. 9, s. 7, 974. 4. Witte, E.c., «Antihyperlipida emic Agents», Ellis, G.P., West, G.B., (ed), Progress in Medici Amsterdam, nal Chemistry. North - Holland Publishing Company, voı. II, s. 9, 975. 5. Nakanishi, M., Kobayashi, R., Nako, Y., «Pyrazolilphenoxyacetic Acid Esters and Amidesı> Japan Pat 74 20, 70 (974) : ref. C.A. 8, 05497t (974). 6. Yurugi, S., Miyake, A., «, 2. 4-0xadiazoles» Japan Pat 77 00, 272 (977); ref. C.A. 87,