DENEYSEL POL K ST K OVER SIÇAN MODEL NDE DOKU DE KL KLER N N ENDOKR N VE METABOL K AÇIDAN DE ERLEND R LMES

T.C. EGE ÜN VERS TES TIP FAKÜLTES KADIN HASTALIKLARI VE DO UM ANAB L M DALI Prof. Dr. Onur B LG N DENEYSEL POL K ST K OVER SIÇAN MODEL NDE DOKU DE KL KLER N N ENDOKR N VE METABOL K AÇIDAN DE ERLEND R LMES UZMANLIK TEZ Dr. Ay e Gül D KMEN BESLER TEZ DANI MANI Prof. Dr. Hüseyin YILMAZ ZM R - 2009

ÖNSÖZ Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Do um Anabilim Dalı ba kanı Prof. Dr. Onur B LG N ba ta olmak üzere, de erli ö retim üyelerine ve sevgili ara tırma görevlisi arkada larıma, uzmanlık e itimim boyunca yardımlarından dolayı te ekkür ederim. Tez çalı malarım sırasında, tez danı mamım sayın Prof. Dr. Hüseyin YILMAZ a, Ege Üniversitesi Biyokimya Anabilim Dalı ö retim üyesi Prof. Dr. Güllinaz ALPER ERCAN ve ara tırma görevlisi Dr. Soycan MIZRAK a, yine Ege Üniversitesi Histoloji ve Embiryoloji Anabilim Dalından Uzm. Dr. Özlem YILMAZ D LS Z e yardımlarından dolayı te ekkürlerimi sunarım. Bugünlere gelmem de sonsuz emekleri olan sevgili anneme, babama ve de erli e ime desteklerinden, bana yaptıkları katkılardan dolayı çok te ekkür ederim. ii

Ç NDEK LER Sayfa No: KISALTMALAR... iv 1. G R...1 2. GENEL B LG LER...2 2.1. Polikistik Over Sendromu...2 2.2. Antioksidan-Oksidan Sistemi...29 2.3. Di i Sıçan Genital Sistemi Özellikleri...33 3. GEREÇ ve YÖNTEM...38 3.1. Çalı ma Grupları...38 3.2.I ık ve Elektron Mikroskobik Doku Fiksasyonu çin Hazırlanan Solüsyonlar...40 3.3. Katalaz Ölçümü...45 3.4. MDA Ölçümü...46 3.5. statistiksel De erlendirme...46 4. BULGULAR...47 4.1. Biyokimyasal Bulgular...47 4.2. Histolojik Bulgular...48 5. TARTI MA...52 6. SONUÇLAR...58 7. ÖZET...60 8. SUMMARY...61 9. KAYNAKLAR...62 iii

KISALTMALAR PKOS : Polikistik over sendromu PKO : Polikistik over LH : Luteinize hormon FSH : Folikül stimüle edici hormon USG : Ultrasonografi NIH : National Institutes of Health GnRH : Gonodotropin salgılatıcı hormon E2 : Östradiol DHEA : Dihidroepiandrostenedion E3 : Östron SHBG : Seks hormon ba layıcı globulin IGF-1 : nsülin benzeri büyüme faktörü IGFBP-1 : nsülin benzeri büyüme faktörü ba layıcı protein-1 PAI-1 : Plazminojen aktivatör inhibitörü-1 DM : Diabetes mellitus DHT : Dihidrotestosteron DHEAS : Dihidroepiandrostenedion sülfat BM : Vücud kitle indeksi LDL : Dü ük dansiteli lipoprotein HDL : Yüksek dansiteli lipoprotein HT : Hipertansiyon HAIR-AN : Hiperandrojenizm - insülin rezistans - akantozis nigrikans ACTH : Adrenokortikotropik hormon CRH : Kortikotropin salgılatıcı hormon KAH : Konjenital adrenal hiperplazi TSH : Tiroid uyarıcı hormon FDA : Food&drug administration IVF : nvitro fertilizasyon OH : Hidroksil H 2 O 2 : Hidrojen peroksit MDA : Malondialdehid TBA : Tiyobarbiturik asit CO 2 : Karbondioksit SOD : Süperoksit dismutaz TBARS : Tiyobarbitürik asit reaktif maddeler ROS : Reactive oxygen species= Reaktif oksijen türevleri - O 2 : Süperoksit LPO : Lipid peroksidasyonu NO : Nitrik oksit iv

1. G R Polikistik Over Sendromu, Stein ve Leventhal tarafından 1935 yılında tanımlanmı tır. De i ik derecelerde adet düzensizli i, hirsutismus, akne ve obezite ile seyreden bir sendromdur. Reprodüktif dönem kadınlarında en sık görülen endokrinopatidir. Prevalansı %6-8 civarındadır. Santral sinir sistemi, hipofiz, overler, adrenal glandlar ve ekstraglandüler dokular arasındaki etkile imlerin bozulmasına ba lı olarak en sık 15-30 ya larda ortaya çıkabilen, kronik seyreden ve yıllar içerisinde ya am kalitesini olumsuz etkileyen kompleks bir hastalıktır. Hiperandrojenizm, hiperinsülinemi ve glikoz intoleransı ile seyreden, uzun dönemde ise; infertilite, rekürren spontan abortus, hiperlipidemi, Tip2 DM, HT ve koroner ateroskleroz, endometriyum hiperplazisi ve endometriyum kanseri gibi durumlara neden olabilir. Gerek tıbbi gerek ise cerrahi olarak tedavi seçenekleri kullanılmaktadır. Polikistik over sendromu metabolik ve endokrin bir hastalıktır. Bu çalı mada deneysel sıçan modelinde polikistik over olu turularak, metabolik açıdan oksidanantioksidan sistemlere olan etkileri ara tırılmı tır. 1

2. GENEL B LG LER 2.1. POL K ST K OVER SENDROMU 2.1.1. Tanım ve Prevelans: PKOS, de i ik derecelerde adet düzensizli i (oligomenore, amenore), hirsutizm, akne ve obezite ile seyreden, ilk belirtileri erken ergenlik ça ında ortaya çıkan bir sendromdur(1,2,3). PKOS; reprodüktif dönem kadınlarında en sık görülen endokrinopatidir. Prevalansı farklı tanı kriterlerine göre de i mekle birlikte, genel olarak %6-8 civarındadır(4). 2.1.2. Tarihçe 1844 yılında Chereau 5, ilk olarak yumurtalıklarda sklerokistik de i imler tanımlamı tır. Stein ve Leventhal 6 1935 yılında kadınlarda menstruel düzensizlik bulgusu amenore, infertilite öyküsü, kıllanma ve obezite içeren klinik bulgularla bilateral PKO leri tanımlamı lardır. Overlerin normalden büyük, tunika tabakasının kalın oldu u bu tablo Stein-Leventhal sendromu olarak tanımlanmı tır(6). 1958 yılında McArthur, Ingersoll ve Worchester 5 PKO li kadınlarda yüksek LH düzeyleri gözlemi lerdir. 1976 yılında Kahn ve arkada ları 5 ve 1980 yılında Burghen ve arkada ları 5, insülin direnci ve PKOS arasında ili ki kurarak kilometre ta ı olu turmu lardır. Yen 7 ; 1980 de PKO olan hastalarda gonadotropin ve androjen sekresyonlarında tipik anormallikler oldu unu tespit etmi tir. Serum LH/FSH oranının, LH lehine bozulması 1980 li yıllarda tanıda yer almı tır. Saurberi ve Cooperberg 7 tarafından 1981 de, ilk kez USG de PKO görünümü tariflenmi tir. 1985 yılında ise Adams ve arkada ları 5, PKO lerin ultrasonografik varlı ının tanı kriteri olabilece ini açıklamı lardır. 2

2.1.3. Tanı Kriterleri Tanı kriterleri konusunda günümüzde tam bir fikir birli i sa lanamamı tır. 1990 yılında NIH konferansında, PKOS u açıklanamayan kronik hiperandrojenik anovulasyon olarak tanımlanmı tır. Bir ba ka ifade ile di er tanıların ekarte edilmesi yoluyla tanı konmaktadır. 2003 ESHRE/ASRM Rotterdam PKOS konsensus toplantısında, tanı kriterleri tekrar gözden geçirilmi ve de i tirilmi tir. Yeni tanımlamaya göre belirtilen 3 kriterden 2 sinin varlı ı tanı için yeterli olmu tur(8,9,10). 1) Hiperandrojenizmin klinik ve /veya biyokimyasal bulguları 2) Oligo-anovulasyon 3) lgili olabilecek di er patolojilerin (androjen salgılayan tümörler, geç ba layan tip KAH, Cushing sendromu, hiperprolaktinemi, tiroid bozuklukları) ekarte edilmesidir(10). Tablo 1. Polikistik over sendromu tanı kriterleri 1990 NIH tanı kriterleri 1. Kronik anovülasyon 2. Klinik ve/veya biyokimyasal hiperandrojenizm bulguları ve di er etyolojik nedenlerin ekarte edilmesi 2003 Rotterdam yeniden gözden geçirilmi tanı kriterleri* 1. Oligo-anovülasyon 2. Klinik ve/veya biyokimyasal hiperandrojenizm bulguları 3. Polikistik overler ve di er etyolojik nedenlerin ekarte edilmesi * Tanı için üç kriterden ikisinin bulunması gerekmektedir. Polikistik over sendromu ve polikistik over farklı kavramlardır. PKO; morfolojik bir tanımdır ve iki parametreyi kapsar. Bunlar USG ile over korteksinde inci kolyesi gibi dizili, 2-3mm çaplı 10-15 adet üzerinde follikül varlı ı ve artmı stroma görünümüdür(11). USG'de yalnızca PKO görünümünün olması, klinik bulguların ve serum androjen seviyesinin normal oldu u durumlarda te his için yeterli de ildir. Çünkü 3

USG'de PKO görünümü androjen üreten adrenal tümörler, geç ba layan tip KAH, Cushing sendromu, hiperprolaktinemi, tiroid bozuklukları gibi nedenlerle de olu maktadır. Bu önerilere göre; hiperandrojenizm klinik veya laboratuvar olarak bulunmalıdır. Ancak hangi androjenin yüksekli inin tanısal anlamı oldu u belirlenememi tir. Üstelik hirsutizm etnik nedenlere ba lı olarak da görülebilir(7,11,12). Anovulatuar kadınlarda PKO görülme sıklı ı %75 tir(13,14). Normal kadınların da %8-25 inde PKO görüntüsüne rastlanabilmektedir(15,16). Bu yüzden tanısal olarak PKO görüntüsünün kullanılmasından iddetle kaçınılması önerilmi tir(17). 2.1.4. Polikistik Over Sendromunun Patofizyolojisi 2.1.4.1. Normal menstrual siklusta Gonadotropin sekresyonu Düzenli ovulatuar siklus; merkezi sinir sistemi, hipotalamus, pituiter ve over arasındaki kompleks etkile meye ba lıdır. FSH nın ba langıçtaki monotropik predominansı folliküler geli im için esastır. FSH folliküler geli imi stimule etmekte, granuloza hücrelerinde LH resöpterlerini ve aromataz enzim sistemlerini indüklemektedir. Takiben plazma LH sekresyonu, orta ve geç folliküler faz boyunca, GnRH ın 90-100 dakikada bir olan salınımı 60 dk. da bire çıkarak artmaktadır. Ovulatuar LH piki, GnRH sıklı ı ve amplitüdündeki artı ve artan serum E2 kombinasyonuna ba lı olarak, olu an pozitif feedback cevabı ile olmaktadır. Plazma FSH seviyeleri, artan plazma E2 ve inhibin B nin inhibitör etkisine ba lı olarak, geç folliküler fazda dü mektedir. Ovulasyonu takiben plazma progesteron seviyeleri artmaktadır(18). Corpus luteumun yok olması ile plazma progesteron, E2 ve inhibin A seviyeleri azalmakta ve azalan progesteron GnRH sekresyon frekansında artmaya neden olmaktadır(19). 4

Tablo 2. Polikistik over sendromu patogenezinde öne sürülen teoriler(20). PKOS patogenezinde öne sürülen teoriler üç ana ba lık altında toplanabilir: 2.1.4.2. Santral (LH) hipotezi Primer defekt LH pulse amplitüdü ve frekansında artı, LH/FSH oranında yükselmedir. GnRH pulsatilitesinde primer anormallik, GnRH reseptörlerinin endojen opioidlere duyarlanması ve LH salınımında dopaminerjik inhibisyonun azalmasıdır. Bunun sonucunda, LH salınımında artı ve hiperandrojenizm olu maktadır(21,22,23). 5

PKOS da LH puls sıklı ının artması, GnRH salınım sıklı ının arttı ını desteklemektedir. Yani normal ovulatuar siklusta görülen GnRH nın puls sıklı ının folliküler fazda artması ve luteal fazda azalması, anovulatuar PKOS da olu mamaktadır. Bu da GnRH salınımının düzenlenmesinde bozukluk oldu unu desteklemektedir(24). Dopamin ve endorfinlerin GnRH salınımını inhibe etti i bilinmektedir. Çalı malar, azalmı dopaminerjik aktivitenin, serum LH seviyesinin artması ile sonuçlandı ını göstermi ve PKOS lu %10-15 hastada hiperprolaktinemi varlı ını ortaya koymu tur(24). 2.1.4.3. Periferal (overyan veya adrenal) hipotez ntrensek overyan veya adrenal defekt androjen üretiminde artı a yol açar ve anovulasyon olu ur. Overde teka hücre hipertrofisi, granüloza hücrelerinde steroidojenik veya mitojenik anormallikler bulunmaktadır. nhibin B, granüloza hücrelerinde üretilir ve lokal olarak folliküler geli imi güçlendirir. nhibin B eksikli i anovulasyonla sonuçlanabilir(26). Bir GnRH agonisti ile endojen gonadotropin stimülasyonu yapılırsa, artmı overyan 17-hidroksiprogesteron cevabı olu ur. Bu da PKOS lu olgularda artmı sitokrom p450c17 enzimatik aktivitesine i aret eder(25). Bu kompleksde, 17-hidroksilaz ve 17,20-liyaz enzimleri vardır. Bu enzimlerin aktivitesindeki artı ın overyan seks steroidi sentezindeki artı a neden oldu u dü ünülmektedir(26). PKO de bütün androjenik hormonlar ve bunların prekürsörleri yükselmi tir. Bunlar potent androjenik steroidleri, 17- -hidroksisteroidleri (dihidrotestosteron, testosteron, androstenedion) ve daha az androjenik ama önemli prekürsörler olan 17 ketosteroidleri, DHEA ve androstenedion içerir. Ayrıca 17- hidroksiprogesteron artmı tır. Androstenedionun E3 a dönü ümü ile obez hastaların östrojen seviyeleri yükselir. Artmı adrenal androjenler, periferde ekstraglandüler olarak östrojene dönü ür. GnRH a artmı LH cevabı, PKOS da olu an persistant 6

plazma E2 ve artmı E3 ile sonuçlanmaktadır. Artmı östrojen de hipofizin endojen GnRH a sensitivitesini arttırır. Böylece LH a ba ımlı androjen yapımı artar. Bu tablo ise olguların %50 sinde androjen yüksekli inin sabit kalması ile sonuçlanır(27). 2.1.4.4. nsülin/ IGF hipotezi nsülin direnci ve hiperinsülinemi insülin sinyalinde postreseptör bir defekte ba lanmaktadır. PKOS lu kadınların %50 kadarında, insülin ba lanmasını takiben, azalmı insülin reseptör tirozin otofosforilasyonu ve artmı serin fosforilasyonu gözlenmi tir. Serin fosforilasyonu sonucu postreseptör etki inhibe olur, glukoz transportu yapılamaz(28). Hiperinsülinemi SHBG salınımında azalmaya ve bundan dolayı da serbest testosteron oranında artı a yol açmaktadır(29). Hiperinsülinemi, kendi reseptörü veya IGF-1 reseptörü aracılı ıyla overyan androjen üretimini stimüle eder. n vivo; insülinin 17-hidroksilaz ve 17,20-dezmolaz enzim sisteminde(p450c17) stimülasyona yol açtı ı dü ünülmektedir(30). Teka hücrelerine LH ve insülinin birlikte sinerjistik uyarıları, hiperandrojenizm ve geni lemi kistik overlere neden olmaktadır(31,32). IGF-1 ve/veya IGF-2 artı ı, teka hücrelerinde LH nın uyarısına ba lı olarak, hem indirekt hem de direkt kendi etkileri ile androjen sentezini artırmakta ve karaci erde IGFBP-1 sentezini baskılamaktadır(33). Hiperinsülinizm ve hiperandrojenizm ili kisinde, hiperinsülineminin primer oldu u fikri desteklenmektedir(34). Hiperinsülinemi, direkt olarak da hipotalamus ve hipofize etkisi ile LH pulsatilitesini arttırmı olur. 7

ekil 1. PKO da insülin/igf1-2 etkisi. 2.1.4.5. Genetik Tek ba ına herhangi bir genetik defekt tanımlanamamı tır. Çevresel faktörlerle, beslenme alı kanlı ı, egzersiz sıklı ı ve ya am tarzı gibi beraber çe itli genetik defektlerin, a ırı androjen üretimi ve insülin ile ilgili bozukluklara neden 8

oldu u dü ünülmektedir. Cooper 35 1968, Ferriman 35 1979, Lunde 35 1989 ve Carey 36 1993 de yaptıkları aile çalı malarında otozomal dominant geçi tanımlamı lardır. Givens 36 1988 de X e ba lı geçi tanımlarken, Hague 36 1988 de basit dominant geçi tanımlamı tır. Yapılan çalı malar sonucunda kabul gören, CYP11A geninin; hiperandrojenizm, VNTR geninin ise, anovulatuar sikluslar ve hiperinsülinizm ile ili kili olu udur(37). PKO dokusunun morfolojik ve histolojik ara tırılması, normal kadınların overleri ile wedge(kama) rezeksiyon yapılan PKOS lu kadınların kar ıla tırılması ile yapılmı tır(38). Ara tırma, her iki grupta primordiyal follikül sayısının aynı oldu unu, ama PKO de primer, sekonder ve tersiyer folliküllerin sayısında artı oldu unu göstermi tir. PKO i olan kadınların, 1/3 ünden fazlasında primer ve sekonder, %80 inde ise erken tersiyer follikül sayısında artı olmu tur. Matür follikül sayısında azalma mevcuttur(38). PKO lerde, erken tersiyer follikül geli imi de dahil olmak üzere, erken follikülogeneziste, follikül kurtarılmasında artı veya do al atrezide azalma mevcuttur. Tersiyer folliküllerin atrezisinde, normal kadınlara göre hızlanma ve takip eden follikül maturasyonunda engellenme vardır. Sekonder ve tersiyer folliküllerin atrezisi, fonksiyonel aktif tekal intersitisyel hücrelerin korunması ile sonuçlanır. Bu hücreler hipertrofik, aktif steroidojenik kapasiteli ve LH stimülasyonuna cevap veren hücrelerdir. Bu hücreler, PKO stromasındaki artı a katkıda bulunmakta ve androjen salgılamaktadırlar. Bir morfolojik çalı mada, PKOS lu kadınların overlerinde hiler interstisyel hücre konsantrasyonunda sıklıkla artı oldu u gösterilmi tir(39). Hiler hücreler Leydig hücrelere benzer ve puberte zamanında LH a cevap olarak testosteron sekrete etmektedirler. Düzenli ovulatuvar siklus; santral sinir sistemi, hipotalamus, hipofiz ve over arasındaki kompleks etkile meye ba lıdır. Bu 9

komponentlerden herhangi biri uygun zamanda uygun sinyali vermezse siklik fonksiyon bozulacaktır(17). FSH, ba langıçta monotropik predominansı folliküler geli im için esastır(18). FSH, folliküler geli imi stimüle etmekte, granüloza hücrelerinde LH reseptörlerini ve aromataz enzim sistemlerini indüklemektedir. Ovulatuvar LH piki; GnRH sıklı ı ve amplitüdündeki artı ve artan serum E2 kombinasyonuna ba lı olarak olu an, pozitif feedback ve her bir GnRH salınımına, LH sekresyonunun artan cevabı ile olmaktadır. Yapılan ara tırmalarda, PKO lu kadınlarda plazma LH seviyesinin genellikle yükseldi i, FSH nın ise dü ük folliküler faz sınırında oldu u sonucuna varılmı tır(17). Çalı malar sonucunda, LH/FSH oranındaki artı, PKOS da bir marker olarak kullanılmı tır. PKO da artmı serum LH nın prevalansı %30-90 dır(21). Taylor ve arkada ları(40), klinik zeminde PKOS tanısı alan, anovulatuvar hastaların %75 inde LH seviyesinin arttı ını göstermi lerdir. GnRH a artmı LH cevabı PKOS nun tipik bulgusudur(41). GnRH a FSH cevabı ovulatuvar kontrol grubu ile aynıdır(21). PKOS da LH pulse sıklı ının artması GnRH salınım sıklı ının arttı ını desteklemektedir. Yani; normal ovulatuvar siklusta görülen, GnRH nın puls sıklı ının folliküler fazda artması ve luteal fazda azalması, anovulatuar PKOS da olu mamaktadır. Bu da, GnRH salınımının düzenlenmesinde bozukluk oldu unu desteklemektedir. PKOS u olan kadınların ço unda hikaye de, bozuklu un pubertenin hemen sonrasında belirginle ti i ve bunların bir ço unda da, düzenli ovulatuvar siklusun hiç olmadı ı görülür. Hafif androjen fazlalı ı olan adölesanlarda, perimenar iyal periyod boyunca pulsatil LH, GnRH salınımlarının anormal oldu u ortaya çıkmı tır(42). PKOS da gonadotropin salınımında de i iklikler mevcuttur. LH salınımındaki anormalliklerin ve plazma LH ve FSH daki siklik de i ikliklerin, yoklu unu açıklayan birçok mekanizma ortaya konmu tur. PKO da klinik ve biyokimyasal olarak heterojen bir durum söz konusudur. Sendromun klasik 10

tanımında, anovulasyon ile hiperandrojenizm birlikte i vurgulanmaktadır(43). Klasik sendromlu kadınlarda yüksek androjen konsantrasyonu mevcut iken, hiç semptomu bulunmayan veya hafif semptom gösteren PKO li kadınlarda, ortalama serum testosteron seviyesi, normal kadınlara göre anlamlı ekilde yüksek bulunmu tur(44). PKOS da, adrenal androjen sekresyonunun fazla olabilece i bildirilmi se de, çalı maların ço unda, hiperandrojeneminin ana kayna ı over olarak gösterilmi tir(44). Serum insülin seviyelerinin, PAI-1 ile orantılı oldu u bazı preliminer çalı malarda saptanmı tır(45). PAI-1, overde kollejenazın preovulatuar follikül duvarını yıkmasını engellemektedir. E er, bu insülin/pai-1 ili kisi overde aktif rol alıyorsa, artmı PAI-1 seviyeleri anovulasyon ile ili kili olabilir. 2.1.5. Klinik ve Klinik Önemi 2.1.5.1. Kronik anovulasyon Kronik anovulasyonun klinik görüntüsü, düzensiz menstrüel siklus, oligomenore ya da amenore eklindedir. PKOS da menstrual disfonksiyon genellikle menar ile ba lar(46). ki menstruel siklus arasında, 35 günden fazla aralık olması oligomenore, 6 aydan daha uzun sürede hiç menstrüel kanama olmaması amenore olarak tanımlanmaktadır. Amenorenin nedeni kronik anovulasyon halidir. Hastalara progesteron deste i verilirse menstürasyon sa lanabilir. Düzensiz uterin kanamanın nedeni, sürekli anovulasyona ba lı östrojen miktarının artması ve östrojenin progesteron ile kar ılanmamasıdır. Yüksek ve sabit östrojen düzeyleri, endometriyumda a ırı proliferasyon ve damarlanma artı ına neden olur, progesteron olmadı ı için de endometriyum stromal deste i sa lanamaz, kanamaya meyilli bir endometriyum tabakası meydana gelir. Endometriyum hiperplazisi ve ardından geli ebilecek neoplastik de i iklik riski mevcuttur. Bu nedenle, PKOS lu ve iddetli 11

oligomenoresi olan kadınlarda, düzenli bir çekilme kanaması sa lamak gerekir. PKOS da kronik anovulasyonda anormal follikulogenezis ortaya konur. Sonuç olarak bu hastalarda infertilite ikayeti vardır. Nadiren bu sendromda spontan gebelik ve ovulasyon meydana gelebilmektedir(5,39,47). Sürekli anovulasyonun klinik sonuçları; infertilite, amenoreden disfonksiyonel kanamaya kadar de i en menstrüel kanama problemleri, hirsutizm, akne, endometriyum hiperplazisi ve endometriyum kanseri, muhtemelen meme kanseri riskinde artı, kardiovasküler sistem hastalıklarında artı eklinde olabilmektedir. Ayrıca hiperinsülinemi mevcut olan kadınlarda DM riskinde artı mevcuttur. 2.1.5.2. Hiperandrojenizm ve hirsutizm Hiperandrojenemi hastaların yakla ık yarısında mevcuttur. LH; overin teka hücrelerinden androjen sentezini uyarır, SHBG nin azalması da serbest androjen formlarını arttırır. Dola ımdaki major androjen testosteron olmakla birlikte, DHT, kıl follikülleri ve derideki pilosebase birim gibi, birçok duyarlı dokuda major nükleer androjendir. Hirsutizmde, total ve serbest testosteron yüksekli i, overyan hiperandrojenemi bulgusudur. Androstenedion düzeyleri de genelde artar ve overyan orjinlidir. DHEA ve DHEAS adrenal kökenlidir, yükselebilir. Periferde testosteron ve DHT a dönü ür. Androjenler periferde östrojene dönü ür ki; bu E3 formudur. LH/FSH yüksekli i %75 saptanır. Kadınlarda hirsutizmin esas nedeni; anovulasyon ve overlerden a ırı androjen üretimidir(48). Hirsutizm; kadınlarda kıllanmanın normalde çok hafif oldu u veya hiç olmadı ı androjene duyarlı alanlarında, tipik koyu ve kalın telli kılların fazlalı ı olarak tanımlanır. Androjene duyarlı alanlar denilince: dudak üstü, çene, yanaklar, kulaklar, karnın alt kısmı, linea alba, sırt, meme ve areolası, ekstremitelerin proksimal kısımları, kalçanın alt kısımları, intergluteal bölge, uyluk iç kısmı ifade edilmektedir. 12

Hirsutizm, ya lı cilt ve akne, de i en iddette ve derecede bireysel farklılıklarla (etnik, hedef organdaki androjen reseptör düzey farklılı ı gibi) ortaya çıkmaktadır. Kadınların ortalama olarak %70 i hirsutizm sergilerken, daha azı ise aknelidir. Bu amaçla Ferriman-Gallwey yöntemi kullanılabilir(49). Bu yöntemde kıl büyümesindeki artı ın derecesi vücudun 9 farklı bölgesinde objektif olarak de erlendirilir. Bu bölgeler androjene duyarlı olan bölgelerdir. Her bölge için 1 ile 4 arasında puan verilir. Toplam 8 in üzerindeki de erler hirsutizm olarak de erlendirilir. Hirsutizm hafif, orta, iddetli olarak grublandırılabilir. PKOS, androjen fazlalı ının ve hirsutizmin en sık rastlanan nedenidir. Bu hastalar tüm hirsutizmli kadınların %65-85 gibi bir ço unlu unu olu tururlar(48,49,50). 2.1.5.3. Obezite Obezite; PKOS lu kadınlarda sık görülür ve genetik faktörler, fiziksel aktivite ve diyetle ba lantılı olabilir. Obezite, normal ovulasyonu bozan üç de i iklik yapmakta olup, zayıflama ile bu de i iklikler düzelebilmektedir. Bu de i klikler unlardır: periferde androjenlerin östrojenlere aromatizasyonu, serbest E2 ve testosteron düzeylerinin artmasına neden olan, SHBG düzeylerinde azalma ve overin stroma dokusunda androjen sentezini uyaran insülin düzeyinde artı. PKOS olan kadınlarda vücut kütle indeksi normal kabul edilen sınırın genelde üzerindedir. i manlık genelde santral obezite eklindedir(51). Santral obezitede bel/kalça oranı fazladır(>0.85). BM, obesitenin en yaygın kullanılan indeksidir. BM ; a ırlık (kg)/(boy 2 ) olarak hesaplanır:(kg/m2)(52). BM aralıkları genellikle u ekilde tanımlanmı tır; normal a ırlıkta (19.1-24.9 kg/m2), yüksek kilolu (25-29.9kg/m2) ve obez (>30kg/m2). Obeziteli, santral ya da ılımlı kadınlar daha yüksek LH, androstenedion, E3, insülin, trigliserid, LDL, apolipoprotein-b seviyelerine 13

sahiptir(51). HDL ise dü üktür. Yüksek bel/kalça oranının, daha fazla menstrüel anormallik ve daha yüksek infertilite prevalansıyla birlikte oldu u gösterilmi tir(53). Obezite ve PKOS u olan hastaların, sıkı kalori kısıtlaması sonucu %5 veya daha fazla kilo kaybı durumunda insülin, IGF-1, SHBG ve menstrüasyonda de i iklikler gözlemlenmi tir. Menstrüel düzen sa lanmı, hirsutizm düzelmi tir. Bazı spontan gebelikler de görülmü tür(54). PKOS u olan kadınların %15 inde ba langıç çalı masında glukoz toleransı normalken, 5-7 yıl sonra bozulmu glukoz toleransına veya a ikar diabete dönü görülmektedir(55). PKOS lu olguların ba langıçta normal glukoz toleransı gösterdikleri halde, aynı hastalarda yılda %3 lük bir artı la, bozulmu glukoz toleransı veya DM a dönü saptanmı tır. Bu de i imin, hemen hepsi artan obezite ile ba lantılı olabilece inden, kilo alımının önlenmesi anormal glukoz toleransının azaltılmasında yararlı olabilece ini dü ündürmektedir. PKOS lu kadınlar gebeyken gestasyonel diabet olmaya daha e ilimlidir ve gebelikte glukoz intoleransı olan pekçok kadın PKOS özelliklerine sahiptir. Ayrıca spontan abortus, fetal anomali, HT gibi gebelik komplikasyonları artmı tır(56). 2.1.5.4. Hiperinsülinemi ve insülin rezistansı 1980 yılında ilk kez Burghen ve ark. 7 PKOS ile hiperinsülinizm ili kisini rapor etmi lerdir. nsülin rezistansı; endojen ve eksojen insüline normal biyolojik cevabın verilememesi diye tanımlanır. PKOS lu vakaların %43-76 sında insülin rezistansı tespit edilmi tir. Bu kadınlarda Tip 2 DM sıklı ında artı ve %5-30 oranında glukoz intoleransı saptanmı tır(57). Patofizyoloji konusunda de inildi i gibi, nsülin reseptör sayısında veya afinitesinde azalma görülmektedir; insülin aktivitesinde bir postreseptör defekt 14

olabilece i de öne sürülmü tür. PKOS lu kadınların %50 kadarında; insülin ba lanmasını takiben, azalmı insülin reseptör tirozin otofosforilasyonu ve artmı serin fosforilasyonu gözlenmi tir. Serin fosforilasyonu sonucu, postreseptör etki inhibe olur, glukoz transportu yapılamaz(28). PKOS da, beta hücre disfonksiyonu da vardır. Postprandiyal insülin sekresyonunun pulsatilitesi normal, fakat amplitüdü azalmı tır. Bu durum Tip 2 DM da da mevcuttur. PKOS ndaki yüksek DM prevalansının, insülin sekresyonundaki defektten ileri geldi i dü ünülmü tür(7). Yani, mevcut insülin rezistansını kompanze edebilecek insülin sekresyonu, pankreatik beta hücre disfonksiyonu nedeniyle olamamaktadır. Hedef organlardaki rezistanslıktan dolayı da hiperinsülinemi görülmektedir. nsülin overden östrojen, androjen, progesteron sentezini artırır. Hiperinsülineminin hiperandrojenemiye yol açı ını açıklayan iki mekanizma vardır: Bunlar: -Hepatik SHBG sentezinin inhibisyonu -IGFBP-1 sentezinin inhibisyonudur(33). Androjenlere olan etkisini IGF-1(ve/veya IGF-2) üzerinden yaptı ı dü ünülmektedir. IGF-1, teka hücrelerinin LH ya cevabını artırır. nsülin, teka hücrelerinde IGF-1 reseptörüne ba lanır, IGF-1 reseptörlerinin aktive olması, androjen sentezini artırır. Yüksek insülin düzeylerinin, IGFBP-1 düzeyini azaltması da, serbest IGF-1 in artmasına neden olur. nsülin SHBG seviyesini azaltarak serbest testosteron miktarını artırır(29). Hiperinsülinemiye ba lı olarak, plazma ya asiti düzeylerinde de i iklikler meydana gelmektedir. Plazma serbest ya asitlerini baskılıyabilecek insülin seviyeleri sa lanamadı ı durumlarda, serbest ya asitleri düzeyindeki artı, karaci erde glukoz yapımını arttırmakta ve hiperglisemiyle sonuçlanmaktadır. Ayrıca; trigliserit, LDL 15

seviyesinde yükselme, HDL kolesterol seviyesinde dü me, ateroskleroza ba lı kalpdamar hastalıkları ve yüksek tansiyon ortaya çıkmaktadır(58). Bu kadınlarda cilt lezyonları akantozis nigrikans (hiperkeratoz, papillomatozis ve artmı pigmentasyon ile karekterize mukokutenöz bir erüpsiyondur.) görülebilmektedir. 1976 da HAIR-AN sendromu tanımlanmı tır(59). 2.1.5.5. nfertilite Klasik olarak PKOS da infertilitenin primer sebebi anovulasyondur. Anovulasyona neden olan LH hipersekresyonu ile infertilite arasındaki ili ki sanıldı ından daha kompleksdir. LH ayrıca, bilinmeyen bir mekanizma ile fertilizasyon ve erken gebelik kayıpları ile de ili kili olabilir(45,60,61). Ovulasyon indüksiyonu ve yardımcı üreme teknikleri PKOS lu infertil hastalarda tedavi amacıyla uygulanmaktadır. Kilo vermeye rezistans gösteren hastalarda, ovulasyon indüksiyonu esnasında hiperinsülinemiyi azaltıcı bir diyet kısıtlaması, tedavinin etkinli ini artıracaktır(62,63,64,65,66). 2.1.5.6. Hiperprolaktinemi Prolaktin gen ekspresyonu ön hipofiz laktotrop hücrelerinde, desidualize endometriyumda ve myometriyumda meydana gelir. nsanlarda ana fonksiyonu laktasyonu ba latmak ve devam ettirmektir. 1985 den bugüne, PKO li hastalarda hiperprolaktinemi sıklı ı %3,2 ile %12,5 arasında de i iklik göstermi tir. PKO olan ve olmayan kadınlarda, intravenöz dopamin uygulanması ile her iki grupta da serum LH ve prolaktin seviyelerinde dü me görülür, bu da gösteriyor ki; PKOS lu tüm olgularda anormal LH sekresyonu ile ili kili hipotalamik dopamin rahatsızlı ı varlı ında sonuç hiperprolaktinemidir. Gerçekte, PKOS lu tüm hastalarda LH puls sıklı ı ve amplitüdünde artı görülür, fakat sadece birkaç hastada prolaktin artı ı görülmektedir. 16

2.1.6. Uzun Dönem Sa lık Riskleri PKOS lu kadınlarda, hiperandrojenizm ve obezite nedeni ile dislipidemi, disfibrinojenemi geli ebilir ve bundan dolayı koroner arter hastalı ı riski artar. nsülin rezistansı da dislipidemiye katkıda bulunur. HDL/LDL oranı azalır, trigliseritler artar(67,68). Çalı malarda, PKOS olan kadınların yakla ık % 70 inde lipid düzeylerinin sınırda yüksek oldu u bulunmu tur(44). PKOS da fibrinolitik aktivite bozulur, PAI-1 seviyesi artar. Bu artı insülin direncine ba lıdır. Kilo kaybı ve insülin duyarlılı ını artıran ajanlar PAI-1 seviyesini de azaltır(45). HT sıklı ı artmı tır. nsülin rezistansının HT a da neden oldu u dü ünülmektedir. Özellikle sistolik kan basıncı artar. PKOS olan kadınlarda glukoz intoleransının daha fazla oldu u bildirilmi tir(69). Reprodüktif dönemlerinde glukoz intoleransı sıklı ı; %30-35, Tip2 DM sıklı ı; %7-10 olarak bulunmu tur(70). Kronik anovulasyon ve kar ılanmamı östrojen etkisine ba lı olarak endometriyum hiperplazisi ve endometriyum kanseri geli ebilmektedir. Endometriyum kanseri geli iminde; obezite, uzun süreli kar ılanmamı östrojen etkisi, nulliparite, HT, Tip 2 DM ve infertilitenin rol oynadı ı bilinmektedir ki; bu durumlar aynı zamanda PKOS ile de ili kilidir(71). PKOS nun meme kanserinde bir risk faktörü oldu una dair kesin bulgu yoktur. Epidemiyolojik çalı malar; hiperandrojenik kadınlarda(plazma SHBG seviyesinde azalma, serbest testosteron ve serum östrojenlerde artmayla) meme kanseri riskinin aratabilece i yolundadır. Son zamanlarda, hiperinsülinemi ve insülin rezistansı, meme kanseri için olası ba ımsız bir risk faktörü olarak öne sürülmü tür(72). 17

PKOS ve over kanseri birbiri ile ili kili olabilir(73). 426 kanser vakası ve 4081 kontrol grubu üzerinde yapılan vaka kontrollü bir çalı mada, PKOS lu kadınlarda epitelyal over kanserinin 2.5 kat arttı ı saptanmı tır(73). PKOS lu kadınların daha yüksek östrojen seviyelerine sahip oldu u belirlenmi tir. Androjenlerin periferik aromatizasyonu ve SHBG azalması sonucunda artan serbest E2 nedeniyle, dola ımdaki östrojenler kemik mineral kitlesine koruyucu etki yaparlar. 2.1.7. Ayırıcı Tanı PKOS ayırıcı tanısı yapılırken; androjen yüksekli i ve anovulasyon ile birlikte olan klinik durumlar, androjen salgılayan tümörler, Cushing sendromu, KAH, hiperprolaktinemi göz önünde bulundurulmalıdır. Ayrıca ekzojen ilaç alınımı, tiroid patolojileri, hipertekozis de erlendirilmelidir. Serum DHEA-S tayini adrenal kaynaklı adrojen üretimini belirlemek için kullanılır. DHEA-S düzeyinin, 700ug/dl den (postmenozopal kadınlarda 400 ug/dl)fazla oldu u olguların ço unda tümör ara tırması yapmak gerekir. Yüksek serbest testosteron düzeyleri(80 ng/dl den fazla), anovulasyonlu ve hirsutizmli kadınlarda bulunur. Total testosteron düzeyinin, 200 ng/dl den fazla oldu u olgularda tümör ara tırması yapmak gerekir(74,75). Cushing sendromu, kortizol sekresyon fazlalı ıdır. Bu sendrom farklı ekillerde olu abilir: hipofizer ACTH fazlalı ı (Cushing hastalı ı), tümör kaynaklı ektopik ACTH fazlalı ı, otonom olarak kortizol salgılayan adrenal veya nadiren over tümörleri ve nadir görülen CRH sekresyonudur. Cushing sendromu tanısını koymak için bazal artlarda en faydalı ölçümler yirmidört saatlik idrarda kortizol miktarı (10-90 ug=28-50 nmol) ve gece plazma kortizol düzeyidir (< 15 ug/dl=420 nmol/l)(17) 18

KAH ayırıcı tanısında klinik tablo genelde PKOS na benzer. Ayırıcı tanı periferik kanda, 17-hidroksi progesteron düzeylerinin yüksekli inin gösterilmesi ile yapılabilir. KAH de en sık 21- hidroksilaz enzim eksikli i görülmektedir. PKOS lu vakaların, %10-%30 unda prolaktin yükselmi olabilir(30 ng/ml den fazla). E er hasta oligomenoreik ise LH, FSH, Prolaktin ve TSH ölçümü yararlı olur. A ırı yüksek prolaktin düzeylerinde, prolaktin sentezinin hipofizer pataloji kaynaklı oldu u dü ünülür; ayırıcı tanıda hipofiz görüntüleme yöntemleri yapılmalıdır. Tablo 3. Polikistik over sendromunda semptomların sıklı ı ve ayırıcı tanısı(7). Ayırıcı Tanı Semptomlar Sıklık -Androjen salgılayan tümörler -Ekzojen androjen alımı -Cushing Sendromu -Konjenital adrenal hiperplazi -Primer hipotalamik amenore -Primer overyan yetmezlik -Tiroid patolojileri -Hiperprolaktinemi durumları -Hipertekozis -Menstruel Bozukluk -Oligomenore -Amenore -Düzenli menstruel siklus -Anovulatuar infertilite -Hirsutismus -Obezite -Asemptomatik %66 %47 %19 %30 %73 %48 %38 %20 2.1.8. Tıbbi Tedavisi Amaçlar; Ya am tarzı modifikasyonu ve kilo kaybı Reprodüktif fonksiyonu düzeltmek Dola ımdaki androjenleri azaltmak Gebelik istemine yönelik tedavi Endometriyumun korunması nsülin rezistans sonuçlarının önlemesi Dislipidemi, HT, aterosklerotik kalp hastalı ı tedavisi yapılmasıdır. 19

2.1.8.1. Ya am tarzı de i iklikleri Vücut a ırlı ının %5 inden fazla kilo kaybı androjen seviyelerini dü ürebilir ve ovulasyonun spontan geri dönmesini sa layabilmektedir. Kilo kaybı ile SHBG seviyesi yükselir ve insülin rezistansı azalır. Düzenli egzersiz de insülin rezistansında azalmaya yardımcı olur(76,77). 2.1.8.2. Disfonksiyonel uterin kanama tedavisi Kar ılanmayan östrojen etkisi ile endometriyum hiperplazisi ve uzun dönemde endometriyum kanseri riski açısından, en az 3 ayda bir endometriyal dökülme sa lanması gerekmektedir. Bunun için progesteron ya da oral kontraseptifler kullanılabilir. Ancak, bu ajanların bir süre kullanımı sonrası tedavi kesildi inde siklusların düzelmesi beklenmemelidir(17). 2.1.8.3. nsülin duyarlılı ını arttırıcı ajanlar Bu ilaçlar periferik insülin duyarlılı ını arttırır, dola an insülin seviyesini azaltırlar. Bu gruptaki ajanlar; biguanidler ve thiazolidinedionlardır. Etkileri ki isel farklılıklar gösterir. nsülin sekresyonunu arttırmazlar ve nadiren hipoglisemiye yol açarlar. Troglitazon grubu ise, hepatotoksisitesi nedeniyle kullanımdan kaldırılmı tır. Bu ilaçların PKOS tedavisinde kullanılması için FDA onayı yoktur. Metformin 3-6 ay kullanıldı ında, hastaların yarısında ovulasyon sa lanmı tır. Uzun dönem tedavide androjen seviyeleri de azalabilmektedir. Hepatik glukoz üretimini inhibe etmekte ve periferal dokuların insüline duyarlılı ını arttırarak, insülin üretimini azaltmaktadır. Böbrek yetmezli i, konjestif kalp yetmezli i, karaci er fonksiyon bozukluklarında, metformin allerjisinde veya metabolik asidoz durumunda kullanımı kontrendikedir. En önemli yan etkisi laktik asidoza neden olabilmesidir. Bulantı, karında i kinlik, ishal ve i tahsızlık yapabilir. PKOS lu hastalarda, metformin 20

tedavisi, insülin duyarlılı ını artırır ve insülin seviyesini azaltır. Ba langıçta günlük 850mg dozunda kullanılır ve günde 2-3 tablete kadar çıkabilir. Gebelikte genellikle güvenli oldu u kabul edilir. Ayrıca klomifen sitrata dirençli PKOS olgularında; %37 oranında spontan ovulasyon sa ladı ını gösteren çalı malar mevcuttur. Ovulasyon e i ini dü ürdü ü dü ünülmektedir ve klomifene alternatif, hatta adjuvan ajan olarak kullanılabilece i belirtilmi tir(56,78,79,80). 2.1.8.4. Hirsutizm tedavisi Hirsutizm tedavisinde en popüler tedavi aracı oral kontraseptiflerdir. Oral kontraseptifler, dola ımdaki LH ve FSH düzeyini suprese ederek, overdeki androjen üretimini azaltırlar(81). Oral kontraseptiflerdeki progesteronlar, derideki 5alfaredüktaz aktivitesini de inhibe ederler. Progesteronların, SHBG düzeyini azaltıcı etkilerinden sakınmak için, etinodiol asetat ve noretindron asetat gibi androjenik etkinligi az olan progesteron kompenentine sahip preparatların seçilmesinde yarar vardır. Estrojen kompenenti ile SHBG düzeyinde artma sa lanarak, oral kontraseptiflerin hirsutizm tedavisindeki klinik etkinli i daha da artar. SHBG artı ı ile daha fazla androjen ba lanır ve serbest testosteron seviyesi azalır. Serbest testosteron düzeyindeki supresyon, daha yüksek dozlarla elde edilen sonuçlarla benzerdir(81). Spironolakton; aldosteron antagonistidir ve bir diüretiktir. Hirsutizmin tedavisinde spironolaktonun androjenlerin overyan ve adrenal biyosentezinin inhibisyonu, kıl follikülinde androjen resöptörü için yarı ma ve do rudan 5 alfa redüktaz aktivitesinin baskılanması gibi pek çok etkinli i vardır(82). Reseptörlerin bloke edilmesi en önemli mekanizmadır. Spironolakton, idiopatik hirsutizm tedavisinde son derece etkilidir(83). Spironolakton tedavisinde dozun mümkün oldu unca yüksek tutulması gerekir. Günde 200 mg ile iyi sonuçlar alınır. Yan etkileri 21

arasında diürezde artı, bitkinlik hissi, disfonksiyonel kanama, libido kaybı, hepatik disfonksiyon sayılabilir. Spironolakton ile oral kontraseptifleri birlikte kullanmak oldukça faydalıdır(84). Siproteron asetat; kuvvetli bir projestin ve androjen reseptör blokeridir(85). Reseptör düzeyinde testosteron ve DHEA-S için kompetatif inhibitör olarak etki gösterir. Hem, LH supresyonu sa layarak gonodotropin sekresyonunu inhibe eder, hem de, androjen reseptörlerine ba lanarak androjen etkisini bloke eder. En sık izlenen yan etkileri bitkinlik, ödem, libido kaybı, kilo alma, ba a rıları, depresyon ve mastaljidir. Gebelikte kullanımı kontredikedir. Hirsutizmin ters ardı ık tedavisinde siproteron asetat 5-14. günlerde 100 mg/gün olarak, etinil östradiol ise 5-25. günlerde 30-50 mcg olarak verilir. Simetidin; testosteron, DHT ve adrenal androjenlerin serum düzeylerini azaltmaz, fakat bunların androjen reseptörlerine ba lanmalarını engeller. Nispeten zayıf bir androjen reseptör antagonistidir. Flutamid prostat kanserinin tedavisinde kullanılır. Andrenal androjen sentezini zayıf bir ekilde bloke eder(86). Testosteronun reseptör düzeyinde ba lanmasını da bloke eder. Günlük 250-500mg lık dozlarda hirsutizm için etkili bir tedavi sa lar. Hepatotoksik yan etkileri olabilir. drarın ye ilimsi bir renk almasına, cildin ve saçların a ırı kurumasına, bitkinli e neden olabilir. Teratojenik potansiyeli oldu undan bir kontraseptif yöntem ile kombine edilmelidir. Finasterid; bening prostat hipertrofisinin tedavisinde etkinli i onaylanmı bir 5 alfa-redüktaz enzim inhibitörüdür(87). Günlük 5 mg dozunda hirsutizm tedavisi için yararlı olabilir. Gebelikte kullanımı güvenli de ildir. Böbrek fonksiyonları bozuk olan hastalarda dikkatli olunmalıdır. Rezidüel idrar hacmini artırabilir. 22

Ketokanozol antifungal bir ilaçtır. Steroid sentezindeki çe itli basamakları inhibe ederek hem adrenal, hem de over kaynaklı hiperandrojenizm de etkili olur(88). 2.1.8.5. nfertilite tedavisi Gebelik istemi olan olgulara ovulasyon indüksiyonu yapılır ve indüksiyonda seçilecek ilk ajan klomifen sitrattır. Selektif östrojen modülatörleri içerisinde trifeniletilen grubunda yer alan bir ajandır. Farklı dokularda farklı etkiler (östrojenik veya antiöstrojenik) gösterebilir. Hipotalamus seviyesinde, östrojen reseptörlerine ba lanması sonucunda hipoöstrojenemi uyarısı ile GnRH salınımını, buna ba lı olarak da gonadotropin salınımını arttırmaktadır. Klomifen sitrat hipofizin GnRH ya duyarlılı ını arttırmaktadır. Önerilen doz eması menstruasyonun 5. ve 10. günleri arası, 5 gün süre ile 50-150 mg/gün dozunda kullanılır. Olguların %80 inde ovulasyon, %40 olguda ise gebelik elde edilebilir. Antiöstrojen tedavilerinde, ovulasyon indüksiyonunda tekrarlayan ba arısızlık durumunda, klomifen sitrat rezistans kadınlarda (200 mg/gün denendi i halde cevap alınamıyorsa) gonadotropin tedavisi kullanılabilir. Çe itli protokoller mevcuttur. Bu tedavi ile de %90 ovulasyon, %15-20 gebelik elde edilir. Cerrahi olarak geçmi te, overin wedge rezeksiyonu çok kullanılmı tır. Wedge rezeksiyon laparoskopik veya laparotomik yapılabilen, overin yakla ık 1/3 ünün çıkarılması i lemidir(5). Overyan wedge rezeksiyon önemli doku kaybının oldu u bir i lemdir. 108 hastanın katıldı ı çalı mada yapılan bilateral overyan wedge rezeksiyon, hastaların %95 inde düzenli menstrüel siklus ve %85 inde de gebelik sa lamı tır(89). Yıllar içinde, bu i lemle ili kili yapılan çalı malarda ba arı hızları ve faydaları do rulanmı tır. Bununla birlikte, wedge rezeksiyonun en büyük dezavantajı, laparoskopik olarak uygulananlar da dahil olmak üzere sıklıkla periadneksiyal, 23

overyal adezyonlar ve laparatominin yan etkileridir(90,91). Ayrıca prematür overyan yetmezli e yol açabilen bir i lem oldu u için, günümüzde popülaritesini yitirmi tir. Overyan drilling, laparoskopik olarak her iki over kapsülünde 2-4mm derinli inde 8-15 delik olu turularak uygulanır. lemde unipolar elektrot kullanılır. Tahribat sonrasında, overyan androjen üretiminin azalması, periferde aromatizasyonla östrojene dönü ecek androjen miktarını da azaltmaktadır. Bu da, feedback mekanizması ile hipotalamus-hipofiz-over aksını etkileyerek folliküler olgunla ma ve ovulasyonun olu masını sa lamaktadır. Overde androjenlerin azalması, folliküler olgunla ma ve ovulasyonun olu masına izin vermektedir. Genelde laparoskopik overyan drilling yöntemi ile menstrüel siklus ve ovulasyon %80 oranında düzelmektedir(92,93,94). Bu olguların IVF sonuçları da iyidir(95). Tedaviye ba ladıktan üç-altı ay sonra hastalarda tedavi etkinli ini de erlendirmek amacıyla, fiziksel muayeneler ve laboratuvar çalı maları yapılmalıdır. Tedaviye bir iki yıl devam edildikten sonra ilaçlar kesilerek hastanın izlenmesi denenebilir. Anovulatuvar durumunu koruyan hastalarda bile tedavi kesildikten sonra testosteron supresyonu 6 ay ile 2 yıl kadar sürer. ekil 2. Polikistik over sendromu olan kadınlarda tedavi algoritması(96). PKOS KRON K ANOVULASYON Düzensiz kanama Hirsutizm nfertilite Genel sa lık. riskleri Kilo fazlalı ı varsa, konservatif yakla ımlarla kilo kaybı sa lanmalıdır. Oral Kontraseptif Oral kontraseptif Medikal Metformin ve Spironolakton Ovulasyon Diyet ve ndüksiyonu egzersiz 24

ekil 3. PKOS olan kadınlarda ovulasyon indüksiyonuna yakla ım(96). Diyet ve egzersiz Ovulasyon var Ovulasyon yok Klomifen Sitrat (50mg-150 mg) Ovulasyon var Ovulasyon yok Klomifen sitrat ve metformin Ovulasyon var Ovulasyon yok Overyan drilling veya gonadotropinler veya invitro fertilizasyon 2.1.9. Polikistik Over Sendromunun Histolojik Görünümleri Over yüzey epiteli germinal epiteldir. Bu, visseral peritonun de i ikli e u ramı mezoteliyumudur. Önce küboidal epitel, ilerleyen ya larda yassı epitel olarak devam eder. Epitelin altında kollojen ba dokusundan yapılı ince bir bölge olan tunica albigunea vardır. Tunica tabakasının altında overin büyük bölümünü kaplayan kortex yer alır. Korteksin stroması primitif tip bir ba dokusudur, içinde büyük mekik biçiminde fibroblastlar mevcuttur. Bu fibroblastların arasında, her yöne giden sıkı ık dizilmi kollojen ve retiküler lifler görülür. De i ik geli im evrelerinde çok sayıda folikül korteks stromasına gömülüdür. En iç tabaka ise medulla tabakasıdır. Medullanın stroması mesoovarium ile devam eden, yo un düzensiz ba dokusudur; içinde çok sayıda kan damarı, lenfatik ve sinir yapılarını barındırır(97). 25

ekil 4. Normal over histolojisi(97). Resim 1. Normal over histolojisi(97). 26

Polikistik overde ise: - Tüm overin hipertrofisi - Kalınla mı kapsül - Artmı sayıda subkapsüler follikül kistleri - Nadir sayıda korpus luteum veya albikans - Over stromasının hiperplazisi ve fibrozisi - Granüloza tabakasının kalınlı ında azalma - Granüloza tabakasının atrezik yapısı - Teka internanın artmı kalınlı ı - Teka hücrelerinin prematür luteinizasyonu görülür. Multikistik overler ile PKO ler bazen birbirleriyle karı tırılmaktadır. Teorik olarak PKO, normal ve multifolliküler overlerden daha büyük olması, daha fazla follikül içermesi ve hipertrofik stroması ile ayrılmaktadır. Histolojik olarak Gougeon sınıflandırması yapılmaktadır. Buna göre: Stage A: Foliküller en az 5 tane düzgün ekilli, da ınık piknotik nükleuslu granüloza hücresi içerir. Stage B: Tekal yapının korundu u, belirgin piknosizi olan daha az granüloza hücresi mevcuttur. Hiperplazi ve luteinizasyon bazen görülebilir. Stage C: Foliküllerde az sayıda granüloza hücresi olup, hiyalinizasyon ve fibrosiz mevcuttur. Teka hücrelerinde hipertrofi, luteinizasyon ve dejenerasyon görülür. PKOS nun tanısında kullanılan USG kriterleri : A- Eksternal Morfolojik Bulgular -Artmı overyan alan veya volüm - Artmı yuvarlak index (overyan geni lik/overyan uzunluk) -Azalmı uterin geni lik/overyan uzunluk oranı 27

B- nternal Morfolojik Bulgular -Çok sayıda mikrokist(2-8 mm) -Mikrokistlerin periferal da ılımı -Overyan stromanın artmı ekojenitesi -Kesit kesiminde, overyan stromanın artmı yüzeyi(komputerize ölçüm) artmı overyan boyut ve normal uterin geni likten dolayı, PKOS da uterin geni lik/overyan uzunluk oranı azalmı tır(<1). Gerek normal gerek multifoliküler overde, her iki overin alan toplamı <11cm2 olarak gösterilmi tir(98,99). Stromal hipertrofi ve hiperekojenite, PKO ve multifoliküler over ayırmada en güvenilir ultrasonografik belirti olarak kabul edilmektedir(100). Resim 2.3.4. PKO görüntüsü(7). 28

2.2. ANT OKS DAN-OKS DAN S STEM Biyolojik yapılar, özellikle membranlar, yüksek oranda doymamı ya asidi içermektedir. Doymamı ya asitleri, bir radikal ba latıcının ya da serbest oksijenin varlı ında oksidasyona u ramaktadır. LPO, serbest radikaller tarafından ba latılan ve zar yapısındaki çok doymamı ya asitlerinin oksidasyonunu içeren kimyasal bir olay olarak tanımlanmaktadır. LPO ndaki asıl etkili radikalin OH radikali oldu u kabul edilmektedir. Bu radikal O - 2 radikalinden veya H 2 O 2 ten demirin katalitik etkisi altında olu maktadır. Serbest radikal etkisi ile ya asidi zincirinden hidrojen atomunun uzakla ması, bu ya asit zincirinin radikal niteli i kazanmasına neden olmaktadır. Daha sonra lipid radikalinin moleküler oksijen ile tepkimeye girmesi ile lipid peroksit radikali meydana gelmektedir. Bu lipid peroksit radikali de, zar yapısındaki çok doymamı ya asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin olı umunu sa lamakta, kendileri de açı a çıkan hidrojen atomlarını alarak lipid hiperoksitlerine dönü mektedir. LPO lipid hidriperositlerinin aldehid ve di er karbonil bile kelere dönü mesi ile sona ermektedir. LPO nun son a amasında olu an bile kelerden biri MDA dir. MDA, peroksidasyona u ramı olan poliansature ya asitlerinden olu an 3 karbonlu bir bile iktir. MDA miktarı, TBA testi ile ölçülmekte ve bu yöntem lipid peroksid düzeylerinin saptanmasında kullanılmaktadır. 2.2.1. MDA ve Konjuge Dienler Peroksidasyona u ramı olan poliansatüre ya asidlerinden olu an reaktif bile iklerden biri olan üç karbonlu MDA bir ketoaldehiddir. Ara idonik asidden, birçok lipoksidden, hidroperoksidlerden, endoperoksidlerden, prostaglandinlerden ve tromboksanlardan olu abilen MDA nın ana kayna ı, doymamı ya asidlerinin peroksidasyonudur(101). 29

Birçok makromolekül ile hızlı bir ekilde tepkimeye giren ve çok reaktif bir bile ik olan MDA, serbest olarak ya da farklı doku bile enleri ile kompleks olu turmaktadır. Doku lipid peroksidasyonu sonucu olu an MDA hücresel düzeyde metabolize edilir. Karaci er aldehid dehidrogenazı tarafından enzimatik yıkılıma u rayan MDA, CO 2 e metabolize olmakta ya da mitokondriyal yolda yıkılabilmektedir. drarda asid ile hidrolize edilebilen formda küçük miktarlarda ekskrete edilir. Eritrosit membranının aminofosfolipid organizasyonunu bozan MDA, hücre hasarında ve ya lanma pigmenti olan lipofusinlerin olu umunda etkili oldu u gösterilmi tir. MDA nın, mutajenik oldu u ve kimyasal karsinojen gibi davrandı ı da bilinmektedir(101,102). O O ekil 5. MDA kimyasal görünüm Biyolojik örneklerde, LPO nun ve serbest radikal aktivitesinin belirlenmesinde kullanılan en kolay ve yaygın yöntem, MDA nın TBA ile tepkimesidir(103). LPO nun belirlenmesi için kullanılan ve spesifik olmayan bir yöntem olmasına ra men TBA tepkimesi, MDA üretiminin iyi bir göstergedir. Bu tepkime MDA ile TBA arasındaki etkile ime dayanır. Asidik ko ullarda TBA ile birlikte ısıtılan örnek, sonuçta 532 nm dalga boyunda absorbans veren pembe bir ürün olu turur. TBA tepkimesinin spesifitesi yöntemin hassasiyeti kadar yüksek de ildir. Bunun nedeni, TBA nın MDA dı ında albumin, periodat ile okside olan glikoproteinler, pirimidinler gibi bazı bile iklerle de renkli ürünler olu turabilmesidir. Ayrıca, TBA testinin kaynatma a amasında daha önce olu mu olan lipid hidroperoksidlerinin yıkılımı sonucunda 30

artefakt bir MDA üretimi olmaktadır. Okside lipidlerde bulunan 2,4-alkadienler ve 2- alkenaller de TBA ile pozitif sonuç vermektedir. HPLC, serbest MDA ölçümünde en güvenilir yöntemdir. Karbon merkezli lipid radikaller, kendilerini stabilize eden bir düzenlemeye u radıktan sonra, konjuge dien olarak adlandırılırlar ve bu ürünler 234 nm dalga boyunda karakteristik bir absorbsiyon bandı olu tururlar. Deney hayvanlarından elde edilen dokularda ve safla tırılmı lipid sistemlerde bu absorbansın tayini önemli bir indeks olarak kullanılmaktadır. ekil 6. Konjuge dien yapısı. A. Poliansatüre ya asidi B. Ya asidi hidroperoksidi ve konjuge dien 2.2.2. Antioksidan Sistemler Hücrelerde oksidatif hasarı önleyen, ortadan kaldıran veya kısmen azaltan bazı mekanizmalar bulunmaktadır. Do rudan etki ile oksidanları inaktif hale getiren ve bu etkilerinde dört farklı mekanizma kullanan maddelere antioksidanlar adı verilmektedir. Bu mekanizmalar; 1. Çöpçü etkisi: Oksidanları tutma ve zayıf bir moleküle dönü türme eklinde bir etki olup enzimler bu mekanizma ile hareket etmektedirler. 2. Bastırıcı etkisi: Bir hidrojen aktararak oksidanları etkisiz hale getirme etkisidir. Vitaminler ve flavanoidler bu ekilde etki eder. 3. Onarma etkisi 31

4. Zincir koparma etkisi: Oksidanları ba layarak i levlerinin önlenmesidir. A ır mineraller hemoglobin, seruloplazmin ile do rudan oksidanları ba layarak, etkisiz hale getirme etkisidir. Okside edilebilen substrata göre, daha dü ük düzeylerde bulunan ve substratın oksidasyonunu geciktiren veya inhibe eden maddelerdir(104,105). Do al antioksidanlar ve antioksidan özelli e sahip ilaçlara ek olarak, günümüzde lipid dü ürücü ilaçlar arasında olan probukol ve statinler ile kalsiyum antogonistleri, antioksidan etki açısından yo un olarak ara tırılmaktadır(104,106). Tablo 4 de do al antioksidan moleküller gösterilmi tir. Tablo 4. Do al antioksidan moleküller Enzim SOD: O - 2 nin H 2 O 2 ye dismutasyonunu katalizler Katalaz: H 2 O 2 nin dismutasyonunu katalizler. Glutatyon peroksidaz: H 2 O 2 nin ve lipid peroksitlerinin indirgenmesini katalizlemektedir. Glutatyon redüktaz: Okside glutatyonu redükte glutatyona dönü türerek dolaylı antioksidan etki gösterir a) Hidroperoksidaz b) Sitokrom C oksidaz Enzim dı ı Seruloplazmin: Demiri yükseltger. Transferrin: Demiri ba lamaktadır. Hemoglobin: Oksidanları ba lar. E vitamini ve analogları: Lipid peroksidasyon tepkimelerini engeller. - C vitamini: Do rudan O 2 ve OH tutar, E vitaminini rejenere eder. A vitamini: Direkt olarak peroksillere etki eder. Ürik asit: Süperoksit, hidroksil ve peroksil tutucusudur. 2.2.3. Katalaz Sı ır karaci erinde yapılan çalı malar sonucunda, katalazın yapısal olarak 248 kda molekül kütlesinde oldu u ve kovalent olmayan ba la ba lı protoporfirin IX Fe(hem) grubu içeren bir hemoprotein oldu u gösterilmi tir. Mükoz, kemik ili i, enzim, membran, böbrek, kan, karaci erde ve eritrosit dı ında özellikle 32

peroksizomlarda yüksek miktarda bulunur. Katalaz; hidrojen peroksidi, yüksek hızlı tepkimelerde katalitik tepkime ile, dü ük hızlı veya yüksek elektron alıcısı konsantrasyonlarının bulundu u ortamlarda ise peroksidatif tepkime ile suya çevirerek ortamdan uzakla tırmaktadır(107,108). Katalaz (peroksidatif ) ROOH + AH 2 H 2 O + ROH + A H 2 O 2 + H 2 O 2 Katalaz (katalitik) 2 H 2 O + O 2 Katalazın aktif kısmı olan Fe +3 -protoporfirinin iki fonksiyonal döngüsü bulunur. Katalaz-Fe +3 + H 2 O 2 Katalaz-Fe +3 -HOOH (inaktif) Katalaz-Fe +3 -HOOH + H 2 O 2 Katalaz-Fe +3 + 2H 2 O + O 2 Ortamdaki çok az H 2 O 2 konsantrasyonunda aktif olmayan enzim, elektron alıcısı ile tepkimeye girmektedir: Katalaz -Fe +3 -HOOH + AH 2 Katalaz-Fe +3 + 2 H 2 O Oksidanların glutatyon peroksidaz aktivitesini bastıracak düzeye ula tı ında mitokondrial katalaz, membran hasarına neden olan hidrojen peroksidin etkisini önler. Son çalı malarda sıçan kalp mitokondrisinde LPO na kar ı katalazın koruyucu rol oynadı ı saptanmı tır(109). 2.3. D SIÇAN GEN TAL S STEM ÖZELL KLER Sıçan di i genital sistemi, yumurtanın tutuldu u ve embriyoların geli ti i bölgeler gibi genel özellikleri bakımından insandakine benzemekle birlikte farklı oldu u bazı noktalar vardır. 33

Sıçanların(özellikle rattus norvegicus) e le mesi gerçekle mi se vaginal tıkaç olu umu gerçekle ir. Tıkaç 16-24 saat kalır; ancak 48 saate kadar da varlı ı sürebilir. Sıçanların gebeli i 21-23 gün sürer. Do um genellikle geceleri gerçekle ir ve ortalama 10 yavru vardır. Gerilme ve arka bacaklardaki ekstansiyon genellikle yakla an do umun belirteçleridir. Yavrular do du unda di iler genellikle plasentalarını yerler, eylem 1-4 saat sürer ve do umdan sonra fertil postpartum östrus bir siklus ile yeniden 4,5-5 günde bir tamamlanan düzenli menstruel döngüye geçi gösterirler. Yavruların do um a ırlı ı 4,5-6,0 gr dır. Laktasyon 21 gün sürmektedir. Yeni do mu yavrularda testisler karın bo lu undadır. 4-6 haftalıkken skrotuma iner. Yavruların ergenli e geçi i için 2 ayda cinsel olgunluktan bahsedilirse de, ço u soyda genellikle 100 günden sonra olmak üzere 3-4 ayda olgunla ma gerçekle ir. Sıçan ömrü ise ortalama 24, maksimum 36 aydır. Optimal verimlilik süresi ise 9-10 aydır(110). Sıçanların uteruslarının sa ve sol kornusu oldu u için bicornuate(bifid) uterus olarak adlandırılmaktadır. Her iki kornu uteri de kan damarları bakımından çok zengindir. Bu anlamda mevcut yapı sıçanların bir batında çok sayıda yavru do urabilmesine olanak sa lamaktadır. Uterus endometriyumunu dö eyen epitelyum kemirgen türlerinde yalancı çok katlı prizmatik epitelyum özellli inde olup lamina propriada gev ek ba dokusu içinde artmı nötrofil ve lenfosit yo unlu u belirgindir. Lamina muscularis mucozası olmadı ı için alttaki lamina submukoza ile devam eder. Endometriyum bezlerini tunika submukoza içindeki lamina propriasına yerle mi basit ya da dallı tübüler bezlerdir. Kemirgenlerdeki endometriyumda bezler yer almaz ve son derece vaskülerdir. Bu bölgelerde karünküller adı verilen uterus ile ekstraembriyonik membranları ba layan yapılar ortaya çıkmaktadır(110). 34

Miyometriyum uterusun tunika muskularisini olu turmaktadır. Kalın iç sirküler tabaka ile dı longitudinal düz kas katmanından meydana gelmi tir. ç ve dı kas katmanları arasında ise büyük kan damarları yer almaktadır. Perimetrium uterusun tunika serozasına verilen addır. Tipik olarak gev ek düzensiz ba dokusu özelli i göstermekle beraber çok sayıda lenfatik damar içeri i de belirgindir. Memeli türlerinde stratum vaskulare farklı özellikler gösterebilmektedir. Örne in di i domuzlar için bu bölge belirsiz olabilirken, ineklerde sirküler düz kas tabakasının dı ına yerle mi olabilir..sıçan türleri için ise stratum vaskulare büyük kan damarlarını içeren iç ve dı düz kas katmanları arasındaki miyometriyum tabakasıdır Uterusun her iki cornusu yan yana gelerek vaginayı olu turmak üzere birle irler. Ancak her bir cornunun kendi serviks yapısını olu turdu u bilinmektedir. Her bir serviksin duvarları kalın ve güçlü muskuler yapılar eklindedir. Serviksin açıklı ı oldukça küçük olmakla beraber do uma izin verecek ekilde geni leyebilme özelli i gösterir. Sıçanda ovaryumlar böbreklerin arka yüzünde bir dizi folikül kitlesi eklinde izlenmektedir. Ço unlukla ya kitlesi içine gömülü olduklarından dikkatlice diseke edilmesi gerekir. Ergin gebe olmayan sıçanda genellikle ovaryumlar olgu ya da iyi geli mi ekildedir. Ovidukt(fallop tüpleri) ise küçük oldukça sıkı kıvrılmı tübüler yapılar olup ovaryumlardan uterusa do ru bilateral olarak uzanan yapılardır(110). Ovaryumun en dı yüzeyini tek katlı izoprizmatik epitelden olu an germinatif epitelyum örter. Bunun hemen altında Tunika albuginea adı verilen ince fibröz ba dokusu çeperden olu an bir kapsül ovaryumları çevrelemektedir. Buradan parankim içine do ru uzanan, ince ba dokusu bantların ovaryum dokusunu ünitelere ayırdı ı 35

izlenmektedir. Ovaryum dokusu içinde, çe itli çaplarda primer, sekonder ve tersiyer folliküllerle, çok sayıda korpus luteumun yer almaktadır. Granüloza hücreleri, poligonal, eozinofılik stoplazmalı olup, çekirdekleri kromatinden orta derecede zengin ve yuvarlak biçimdedir. Bunlar orta sıklıkta mitoz göstermektedir. Stroma içinde folliküller arasında geni, kaba granüllü sitoplazma ve küçük, gev ek kromatin da ılımı gösteren yuvarlak çekirdekli interstisyel hücreler yeralmaktadır. nterstisyel hücreler arasında, belirgin endokrin vasküler bir stroma yer almakta olup, gümü boyama ile bunların tek tek retikülün a ı ile sarıldı ı görülmü tür. Ovaryum stroması içinde, nadir olarak da mastositler bulunabilir. Vasküler yapılar konjesyon dı ında özellik göstermemektedir(97,110). Resim 5. Di i sıçanın ürogenital sistem anatomisi 36

Resim 6. Di i sıçanın ürogenital sistem anatomisi. A:Sol ovaryum (ya dokusuna gömülmü halde yerle imi izleniyor) B:Üst oviduct(döllenmenin oldu u bölge) C:Uterus(ve onu besleyen zengin damar a ı) D:Vagina E:Ya dokusu(iç organların etrafına birikmi ) F:Karaci er(koyu kırmızı; birkaç lobu) G:Caecum(kalın barsa ın ilk parçası ) H:Kalın barsak. 37

3. GEREÇ ve YÖNTEM Bu çalı ma, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Etik Kurulu'nun 07.11.2008 tarih 2008-77 sayılı onayıyla ve Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı ve Genel Cerrahi Anabilim Dalı Deneysel Cerrahi Bilim Dalı nın katkıları ile gerçekle tirilmi tir. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Yeti tirme Merkezi'nden temin edilen, seksüel olgunlu a eri mi a ırlıkları 190-230gr arasında de i en Wistar albino di i ıçanlar, 25 ±2 C oda ısısında ve ardı ık aydınlık ve karanlık dönemlerle, serbest su ve gıda sa lanarak çalı maya alındılar. Yem ve su günlük olarak de i tirildi. Çalı ma süresince hayvanlar Genel Cerrahi Anabilim Dalı Deneysel Cerrahi Bilim Dalı tarafından temin edilen, kenarları sert plastik ve üstünde çelik ızgara bulunan deney grubuna göre i aretlenmi kafeslerde(20x10x10 cm) tutuldu. Tüm sıçanlar deneysel cerrahi laboratuvarlarına getirildikten sonra iki hafta ortama alı abilmeleri için uygun ko ullarda bakılmı tır. Ardı ık en az 2 siklus boyunca 4 günlük normal estrus siklusu gösteren denekler bu çalı madaki çalı ma gruplarını olu turmaktadır. 3.1. ÇALI MA GRUPLARI Deneysel PKOS modeli indüklenen sıçanlar (n=10): Estradiol valerat tek doz intramuskuler biceps femoris kası içerisine 4mg estradiol(sigma ß Estradiol 17-valerate; CAS 979-32-8) 0.2ml susam ya ı(sigma sesame oil; CAS: 8008-74-0) ile birlikte uygulandı. Uygulamadan 30-33 gün sonra sıçanlar anestezi altında kesilerek incelendi; kan örnekleri ve over dokuları alındı. Sham indüksiyon yapılan sıçanlar (n=10): Tek doz intramuskuler biceps femoris kası içerisine 0.2ml susam ya ı(sigma sesame oil; CAS: 8008-74- 0) uygulandı. Kontrol grubu sıçanlar (n=10): Bu gruba hiç bir i lem yapılmadı. 38

Ara tırmamızda bir adet kontrol, bir adet de sham gurubundan olmak üzere, 2 hayvanın 33 günlük bekleme süresi içinde ölmesi üzerine, çalı mada sa kalan 28 hayvan kullanıldı. 3.1.1. Deneysel Sıçan PKO Modelinde Uygulanmak üzere seçilme kriterleri Di er hayvan türleri modellerine göre kolay uygulanabilirli i Gerek indüksiyon gerekse dokudaki çe itli analizler için gerek duyulan kimyasal miktarının daha az olması, çalı ma maliyetinin daha az olması Hastalı ın karakterizasyonu açısından güvenilir olarak tanımlanması. Ayrıca sıçanın memeli bir hayvan olması, elde edilen sonuçlarının insanlara da uygulanabilme oranının yüksek olu u. Beklenen PKO lehinde de i ikli in gerçekle ti inin ön çalı mada histopatolojik olarak gösterilmi olması gibi nedenler ile deneyde sıçan PKO modeli kurgulanmı tır. 3.1.2. Deneysel Sıçan PKO Modelinin Uygulanması Bu çalı mada daha önce ba arıyla uygulanmı olan deneysel PKO modellerinden faydalanılmı tır ve yaptı ımız ara tırmalara göre bu model üniversitemizde de ilk kez uygulanmı tır. Bütün çalı ma gruplarında deneysel PKO, estradiol valerat enjeksiyonları sonrasında olu turulmu tur. 33 gün sonra intraperitoneal xylazine(6mg/kg) ve ketamin(30mg/kg) ile anestezi yapılmı tır. Anestezi altında intra kardiak 5cc kan alınıp, Glukoz Roche Diagnostic glukometre stripleri kullanılarak glukometri cihazı ile kan ekerleri ölçülmü tür. Biyokimyasal analiz için MDA ve katalaz enzim ölçümü yapılmı tır. Biyokimyasal örneklerin alınmasının tamamlanmasını takiben hala anestezi altındayken orta alt hattan abdominal median kesi ile batına girilmi tir. Bikornus olan 39

uterus çekumun kaudalinde izlendi. Uterusun sa kornu uterotubal bölgenin hemen üzerinden klemplenerek over dokuları çıkarıldı. Sıçanların çıkarılan dokuları uygun konsantrasyonlardaki so uk fiksatifler içine konularak Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı nda rutin ı ık mikroskobik takip i lemlerinden geçirilip bloklanmak üzere yollandı. Daha sonra hala sıçanlar anestezi altındayken dekapitasyon ile sakrifiye edilmi lerdir. 3.1.3. Çalı ma Dı ı Bırakılma Kriterleri Ara tırma süresince adeziv skar dokusu geli tirme yatkınlı ı yüksek olmamakla beraber enjeksiyonlar sonrasında izlemde batında ülserasyon, ya da yara olu umu ve iyile mesinde gecikme, yara yerinde enfeksiyon veya abse biçimli yara komplikasyonları geli tiren hayvanlar çalı maya dahil edilmemi tir. Ara tırmanın son a amasında doku alınması amacıyla açılan batında abdominal abse bulgusu gösteren, ya da a ırı büyük, kistik overlerin yanı sıra makroskobik olarak dilate ve ödemli pembe-kırmızı renkli fallop tüpleri ile belirlenen, hidrosalpenjit bulgusu gösteren denekler çalı ma dı ı tutulmu tur. zlem sırasında ölen hayvanlar için olası infeksiyon ve benzeri sorunların önlenmesi amacıyla koruyucu kırmızı paketler içinde di er tıbbi atık materyaller ile birlikte uzakla tırılarak yok etme yöntemi uygulanmı tır. 3.2. I IK VE ELEKTRON M KROSKOB K DOKU F KSASYONU Ç N HAZIRLANAN SOLÜSYONLAR 3.2.1. Tampon ve Fiksatifler 0.2 M Nötral Tuzlu Fosfat Tamponu ph =7.2 NaH2PO4.2H2O (Merck): 0.813 gr Na2HPO4.7H2O(Merck): 4.040 gr NaCl (Merck): 8.780 gr 40

Distile Su: 1000 cc 0.1 M Nötral Fosfat Tamponlu %2 lik Formalin Solüsyonu ph =7.2 0.2 M Nötral Tuzlu Fosfat Tamponu: 45.95 cc Formaldehyde (Merck s %37 lik Stoktan): 54.05 cc Doku diseksiyonu sonrasında ı ık mikroskobik inceleme için ayrılan over dokusu örnekleri 48 saat süreyle belirlenmi formülasyonlara göre 1 gün önceden hazırlanmı so uk fiksatifler içinde +4 C de bekletildikten sonra doku takibine alındı. 3.2.2. I ık Mikroskobik Doku Takip Yöntemi I ık mikroskobik gereç: %70 etanol %80 etanol %95 etanol %95 etanol %100 etanol (Merck) Xylol (Merck) Parafin (Surgipath; beyaz ve mavi boncuk) Gömme: 1. Parçalar 48 saat fiksatiflerde +4 C de bekletiidi 2. 24 saat tamponda +4 C de yıkandı 3. Oda ısısına alınan parçalar 2 saat akarsuda yıkandı 4. 2 saat % 80 etanolden 5. 4 saat %95 etanol l den 6. Bir gece (~15 saat ) %95 etanol II' den 7. 2 saat %100 etanol I' den 8. 2 saat % 100 etanol II' den 9. 2 saat %100 etanol III' den geçirildi. 10. Alkolden çıkarılan parçalar oda ısısında açık havada iyice kurutuldu 41

11. Parça boyutları küçük oldu u için 1-3 dakika Xylol I'de 12. 3 dakika Xylol II' de 13. 3 dakika Xylol lll de bekletilerek parçalar effafla tırıldı. 14. 37 C lik etüvde erimi beyaz boncuk parafin içerisine alınan parçalar 1 gece bekletiidi. Etüvden çıkarılan parçalar, özel bloklama kalıplarının içinde erimi mavi boncuk parafine gömülerek oda ısısında bloklandı. Kalıplar içinden bloklar buzdolabında bekletilerek çıkarıldı. Kesit Alma: Leica RM 2145 model mikrotomda 3 mikronluk kesitler(feather microtome blade R35 ile) önceden temizlenmi kullanıma hazır rodajlı(objektträger;76x26mm) ve poli-l-lizin kaplı(menzel-glaser;25x75mm) lamlara alındı. Kesitler 37 C ye ısıtılmı etüvde (Heraeus) 10 gün kalacak ekilde kurutulmu tur. Deparafinizasyon tekni i: Oda ısısındaki Xylolde preparatlar Xylol I, II, III evrelerini 1 gece Xylol dolu alede bekletme eklinde bu teknik uygulanmı tır. 3.2.3. Rutin I ık Mikroskobik Histokimyasal Olarak Yapılan Boyalar ve Hazırlanı ı HematoksiIen ve Eosin: Genel morfoloji ile dokunun genel görünümü ve oryantasyonunun de erlendirilmesi açısından standart olarak ı ık mikroskobu incelemelerinde en sık kullanılan boyama yöntemidir. Yapıyı olu turan doku tiplerinin tanımlanmasını hücrelerin nükleer pozisyonunu ve nükleus sayılarını, dejenerasyon ve rejenerasyon bulgularını, hiyalin depolanmaları veya fibrozis varlı ının de erlendirilmesine olanak sa lar. 42

Resim 7. Hazırlanan Hematoksilen ve Eosin boya seti. HematoksiIen ve Eosin Boyanma tekni i: 1. Xylol içinde belirtilen úekilde deparafinizasyon sonrası kesitler iyice dıúarıda kuruduktan sonra alkolden geçirilir. 2. %100 Alkol 2dk. 3. %100 Alkol 2dk. 4. %95 Alkol 2dk. 5. %80 Alkol 2dk.(veya daha uzun süre) bekleterek rehidratasyon sa lanır 6. Distile su 5dk. (preparatlar iyice süzülecek) 7. Hematoksilen(Merck) 2,5dk. (Hemotoksilen her kullanılıúta süzülecek) 8. Akar suda 5dk. 9. Acid Alkole pembe renk oluúana kadar batırılıp çıkarılma úeklinde 10. Akar suda daldır çıkar 11. Amonyaklı su mor renk olana kadar batırılıp çıkarılma úeklinde 12. Akar suda daldır çıkar 13. Distile su 5dk(preparatları kurula) 14. Eozin Y(Merck), %3 sudaki solüsyonu 2.5dk.(boyanın tazeli ine göre süre de iúir) 15. %95 Alkol 2,5dk. daldır çıkar 16. %100 l Alkol 2,5dk 17. %100 II Alkol 2dk 43

18. Dı arıda iyice kurut 19. Xylol I 10dk 20. Xylol II 10dk 21. Xylol III 10dk veya bir gece bekletildi. 22. Sonunda preparatların üzerine bir damla entellan damlatılarak lameller(isotherm Cover glass, 24x50 mm, 0.13-0.17mm kalınlı ında) ile doku arasında hava kabarcı ı kalmayacak ekilde kapatıldı ve 60 C deki etüvde yarım saat kuruması için bekletildi. Sonuç olarak bazik olan sitoplazma eozinik(asidik-pembe), asidik olan nüklous hematoksilen ile bazik-mor olarak boyanır(111). 3.2.4. Mikroskobik De erlendirme Yöntemi Histopatolojik incelemede bütün gruplar için ı ık mikroskobunda yukarıda belirtilen histokimyasal teknikler ile parafine gömülmü kesitlerden(3µm, her 10. kesit lama alınmı tır) her grupta sistematik rastgele örnekleme ile seçilen hayvanlardan elde edilen rastgele 5 kesitte çe itli büyütmelerde(4x, 10x, 20x, 40x, 100x) toplam 5-8 alanda rastgele elde edilen görüntüler ı ık mikroskobuna(olympus BX-51) entegre renkli dijital kamera(olympus C-5050) bulunan bilgisayara(win XP) kaydedildi ve morfolojik de i iklikler açısından de erlendirildi. Çalı ma sırasında corpus luteum ya da büyüyen çe itli evrelerdeki folliküllerin kantifikasyonundan çok korpus luteum olu umu ile birlikte ovulasyon olup olmadı ının; yani sa lıklı folliküler geli imin gerçekle ip gerçekle medi inin belirlenmesi amaçlanmaktadır. Morfometrik (stereolojik) ve istatistiksel prensiplere göre herhangi bir istatisitiksel analizin yapılmasına gerek yoktur. Eritrosit lizat örneklerinde katalaz ve MDA ölçülmü tür. Katalaz aktivitesi peroksit degradasyonunun 240 nm de spektrofotometrik olarak kaydedildi i Aebi ve Beers in yöntemine göre ölçülüp hesaplanmı tır(108). Dakikada 1 mol H 2 O 2 i parçalayan enzim miktarı 1 U katalaz olarak ifade edilmi tir. Hemoglobin de erleri 44

Drabkin in metodu ile Schimatzu UV 1208 model spektrofotometrede ölçülmü tür(112). MDA, modifiye Yagi metodu ile ölçülecektir(113). Bu yöntemde Shimadzu UV- 1208 spektrofotometrede TBARS düzeyleri ölçülecektir. 3.3. KATALAZ ÖLÇÜMÜ 3.3.1. Deneyde Kullanılan Reaktifler A) Fosfat Tamponu (50 mm, ph=7): I) Na 2 HPO 4.2H 2 O dan 8.85 g/l II) KH 2 PO 4 ten 6.81 g/l (Tüm reaktifler bidistile deiyonize su ile hazırlanmı tır.) Bu iki çözelti ayrı kaplarda hazırlandı ve daha sonra I. kaptan 600 ml ve II. kaptan 400 ml alınarak temiz bir kaba kondu. ph 7 ye ayarlandı. B) %30 luk H 2 O 2 : 200 ml fosfat tamponuna, optik dansitesi 240 nm dalga boyunda quartz küvette 0.5 olana kadar 5 er µl %30 H 2 O 2 ilave edilerek hazırlandı. 3.3.2. Analiz Prosedürü Heparinize veya sitratlı kan, santrifüj edildi. Plazması uzakla tırıldı. Eritrosit sedimenti 3 kez izotonikle yıkandı. 5 g/ 100 ml hemoglobin olacak ekilde 4 kat distile su ile hemolizat hazırlandı. Sonra bu hemolizat 1/500 oranında fosfat tamponu ile dilüe edildi(ölçümden hemen önce). Hemoglobin veya protein bakıldı(107,108). Kör Numune Fosfat Tamponu 3 ml 2,99 ml + %30 luk H 2 O 2 Numune - 0.01 ml 240 nm de quartz küvette 30 saniye boyunca oda sıcaklı ında absorbans azalı ı izlendi. 45

3.3.3. Hesaplama k = 0.153 x log(a 1 /A 2 ) x (DF/C) A 1 : 15. saniyedeki absorbans A 2 : 30. saniyedeki absorbans DF : 300 C : Litredeki g hemoglobin veya g protein. 3.4. MDA ÖLÇÜMÜ 1. TBA reaktifi hazırlanması 1,875 gr TBA, 12,5 ml HCL (%37), 75 ml TCA (%100) 250 ml ye distile su ile tamamlandı. 2. Stok stdv hazırlanması 220 mg tetraetoksipropan ve 7 ml HCL % 0,9NaCL ile ile 100 cc ye tamamlandı. Ancak 100 µmol/l den çalı ıldı. 3. Eritrosit MDA çalı ması 50µL hemolizat + 450µL distile su +1 ml TBA...100 C de 20 dakika kaynatıldı. 2000 rpm de 10 dk santrifüj edilerek supernatant 532 nm de köre kar ı okutuldu. 3.5. STAT ST KSEL DE ERLEND RME Verilerin analizi SPSS paket programı kullanılarak yapılmı tır. Veriler, grup içinde tek yönlü varyant analizi ile de erlendirilmi tir. Gruplar arası de erlendirmede, anlamlı farklılık oldu u için Post Hoc Bonferroni yöntemi ile kar ıla tırma yapılmı tır. 46

4. BULGULAR 4.1. B YOK MYASAL BULGULAR MDA: Tek yönlü analiz ile deney grubunda MDA de erleri 0.34±0.29 mmol/ml iken, sham grubunda 0.83±0.44 mmol/ml ve kontrol grubunda 1.2±0.53 mmol/ml olarak bulunmu tur. Bonferroni yöntemiyle gruplar arası de erlendirme yapıldı ında; deney grubu ile kontrol grubu arasında p<0.001 oldu u için fark anlamlıdır. Deneyle sham grubunda p=0.64 oldu undan anlamlı de ildir. Sham ile kontrol grubunda da p=0.239 oldu undan anlamlı bulunmamı tır. Katalaz: Deney grubunda 7.24±3.90 mmol/ml, sham grubunda 7.13±2.18 mmol/ml ve kontrol grubunda 6.44±3.19 mmol/ml olarak ölçülmü tür. Gruplar arası de erlendirmede p de erlerinin hepsi p>1 oldu u için anlamlı de ildir. Glukoz: Deney grubunda 127.7±19.4 mgr/dl, sham grubunda 145.8±21.5 mgr/dl, ve kontrol grubunda 137.4±18.9 mgr/dl bulundu. Bonferroni ile ikili de erlendirmede, deneyle sham arasında p=0.11 ve deneyle kontrol arasında p=0.74 oldu undan anlamlı de ildi. Sham ile kontrol grubu kar ıla tırıldı ında p=0.98 ile yine anlamlı bulunmadı. Tablo 5. Gruplar içi tek yönlü varyant analiz yöntemiyle MDA-Katalaz-Glukoz de erlendirmesi. MDA(mmol/mL) Katalaz(mmol/mL) Glukoz(mgr/dl) Deney (N:10) 0.34±0.29 7.24±3.90 127.7±19.4 Sham (N:9) 0.83±0.44 7.13±2.18 145.8±21.5 Kontrol (N:9) 1.2±0.53 6.44±3.19 137.4±18.9 Total 0.77± 0.54 6.90±3.10 136.6±18.9 47

Tablo 6.7.8. Gruplar arası Post hoc Bonforreni analiz yöntemiyle MDA-Katalaz- Glukoz de erlendirmesi. Tüm gruplarda sadece MDA analizinde deney ile kontrol grubunun p<0.001 olarak bulunmu tur. MDA Mean difference Std.error p Deney - Sham -0.48 0.19 0.64 Deney-kontrol -0.85 0.19 0.001 Sham -kontrol -0.36 0.20 0.23 Tablo 7. Katalaz Mean difference Std.error p Deney - Sham 0.10 1.47 1 Deney-kontrol 0.79 1.47 1 Sham -kontrol 0.69 1.5 1 Tablo 8. Glukoz Mean difference Std.error p Deney - Sham -18.18 8.26 0.11 Deney-kontrol -9.74 8.26 0.74 Sham -kontrol 8.44 8.47 0.98 4.2. H STOLOJ K BULGULAR Histolojik olarak polikistik overin özelliklerine baktı ımızda; bütünüyle ovariyan hipertrofi dü ündürecek ekilde tunika albuginea da kalınla ma, subkapsüler kistik foliküler yapılar ve bunlara kar ılık azalmı matür folikül yapıları izlenmektedir. Bu grupta izlenen folliküllerin morfolojisi normal sıçan ovaryumunda izlenen de i ik geli im a amalarındaki follüküllerden farklı özellikler göstermektedir. Ovarian stromal elementlerdeki hiperplazi ve intersisyel hücrelerdeki artı belirgin olup, folliküler atrofiye e lik etmektedir. Nadir izlenen geç primer ve sekonder follikül yapılarında dikkati çeken özellik granüloza tabakasında incelme ve atrofik patern, dejeneratif çe itli folliküllere ait görünümler ve bunlarda teka interna tabakası hücrelerinde sayıca artı ve teka hücrelerinde artmı lipid vakuollerine ait imajlardır. Atretik bir dizi geç primer ve erken sekonder follikül yapısı izlenmesine kar ılık bu grupta hiç graaf 48

follikül ve/veya kistik folikül görülmemi olması önemlidir. Bu bulgular ovarian stromal hipertrofi ve folliküler geli imde arresti dü ündürmektedir. Resim 8. Deneysel PKO grubu over dokusunun 4x(a), 10x(b), 20x(c), 40x(d) büyütmelerdeki görünümü. Kontrol ve sham grubu over dokusu özellikleri genellikle birbirlerine benzer özelliklerde olup siklus arresti yönünde belirteçler içermemektedir. Yapıda en belirgin olarak dikkati çeken polikistik over grubu over dokusu parankimasından farklı olarak çe itli çaplarda primer, sekonder ve tersiyer folliküller ile, çok sayıda korpus luteumun yer almakta olmasıdır. Poligonal eozinofilik boyanan granüloza ve teka hücreleri folikül çevrelerinde oldukça belirgin biçimde izlenmektedir. Stromal elemanların da ılımı vasküler yapılarda konjesyon dı ında özellik göstermemektedir. 49

Resim 9. Sham grubu over dokusunun 4x(a), 10x (b), 20x(c), 40x(d) büyütmelerdeki görünümü. Resim 10. Kontrol grubu over dokusunun 4x(a), 10x (b), 20x(c), 40x(d) büyütmelerdeki görünümü. 50

Over histolojisinden elde edilen bulgular deneysel PKO grubundaki sıçanlarda PKO geli ti ini göstermektedir ve deneysel modelin validasyonunu teyit eder özelliktedir. Resim 11. PCOS grubu sıçanlarda polikistik olarak büyümü overlerin batın açıldı ındaki makroskopik bulgusu görülmektedir. 51