INNO-LiPA HLA-DRB Dekoder Amplifikasyon.

ANAHTAR-KODU: FRI24098 80341 INNO-LiPA HLA-DRB dekoder Amplifikasyon 28820 v2 2015-09-16 p 1/7 INNO-LiPA HLA-DRB Dekoder Amplifikasyon. Türkçe Tarafından üretildi: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark 6 9052 Gent Belgium Tel. +32 9 329 13 29 BTW BE 0427.550.660 RPR Gent Tarafından dağıtılan: Fujirebio Europe N.V. Tel. +32 9 329 13 29 Fax +32 9 329 19 11 customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel. +49 511 857 3931 Fax +49 511 857 3921 germany@fujirebio-europe.com 0459 Fujirebio Italia S.r.l. Tel. +39 06 965 28 700 Fax +39 06 965 28 765 italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel. +34 93 270 53 00 Fax +34 93 270 53 17 spain@fujirebio-europe.com "Vurgulanan Not değişiklikleri" Fujirebio France SARL Tel. +33 1 69 07 48 34 Fax +33 1 69 07 45 00 france@fujirebio-europe.com Diğer Dillere bakınız / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: www.e-labeling.eu/fri24098 EUROPE +800 135 79 135 GR 00 800 161 220 577 99 IS 800 8996 LT 880 030 728 RO 0800 895 084 SK 0800 606 287 TR 0800 142 064 866 LI +31 20 796 5692 MT +31 20 796 5693 EE 0800 0100567 non-europe +31 20 794 7071 US +1 855 236 0910 CA +1 855 805 8539 AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU +800 135 79 135 8:00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

80341 INNO-LiPA HLA-DRB dekoder Amplifikasyon / 28820 v2 / ANAHTAR KODU:FRI24098 p 2/7 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı... 2 Test prensibi... 3 Reaktifler... 3 Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları... 3 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 4 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 4 Örnek toplama,hazırlama ve saklama... 4 DNA ekstraksiyon... 4 PCR karışım hazırlanması... 4 PCR döngüsü... 4 Uyarılar ve önlemler... 5 Test prosedürü... 5 Sonuçlar... 6 Görüntüleme... 6 Doğrulama... 6 Prosedür sınırlamaları... 7 Test performans... 7 Ticari markalar... 7 Kullanılan semboller Kullanım amacı Üretici In Vitro Diagnostik Medikal Cihaz Parti kodu Katalog numarası Tarafından Kullanılan Kullanım Talimatlarına başvurun Sıcaklık sınırlaması Amplifikasyon kiti Amplifikasyon Tampon LiPA Taq 86G Birincil Çözeltisi 86V Birincil Çözeltisi DRB1 Birincil Çözeltisi DRB 1+3+4+5 Birincil Çözeltisi INNO-LiPA HLA-DRB dekoder amplifikasyon kiti, in vitro kullanım için, insan lökosit antijeni (HLA) DRB1, DRB3, DRB4 ve DRB5 lokuslarının 2. ekzonunun nükleik asit amplifikasyonuna yöneliktir. Söz konusu reaksiyon, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vasıtasıyla gerçekleştirilir.

80341 INNO-LiPA HLA-DRB dekoder Amplifikasyon / 28820 v2 / ANAHTAR KODU:FRI24098 p 3/7 Test prensibi PCR ile amplifiye edilecek DNA örneği deoksinükleosid 5'-trifosfatları (dntps), biyotinli primerler ve thermostable DNA polinerazın fazlasını içeren bir reaktif karışımında dahil edilir. Primerler bütün veya spesifik DRB allellerinin 2. ekzonunu amplifiye edeceklerdir (aşağıya bakın). Hedef dizileri primerlere maruz bırakmak için ısıtılmak suretiyle DNA sarmalının iki ipi birbirinden ayrılır ( denatürasyon ). Bu primerler, hedef sekansı kuşatan bölgeleri tamamlar. Bu nedenle, özel bir sıcaklığa soğutma üzerine bu primerler hedef bölgelerine bağlanacaktır (bağlanma). Başka sıcaklıkta ve dntp ler kullanılmasıyla termostabil DNA polimeraz hedef şablon boyunca bağlanmış primerleri uzatacaktır (uzama). Bu şekilde, bir döngüden sonra hedef dizinin iki tam biyotinile kopyası üretilmiş olur. 35 döngüden sonra, hedef dizinin büyük miktarda biyotinile kopyası elde edilir. Reaktifler Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları - Reaktifler -15 ile -25 C arasında ve orjinal şişelerinde tutulduğu sürece, kitin son kullanma tarihlerine kadar kararlıdırlar. Ancak, ilk kullanımdan sonra reaktifler (LİPA - Taq hariç) porsiyonlanöalı ve -15 ile -25 C arasında saklanması tavsiye edilir. - Reaktifler, özellikle amplifiye edilmiş DNA ürünleri, herhangi kontamine DNA kaynağından izole edilmiş şekilde saklanmalıdır. - Kit reaktiflerin fiziksel görünümündeki değişiklikler istikrarsızlık veya bozulma belirtisine neden olabilir. Verilen Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Amplifikasyon Tampon 4x 0,3 ml 56722 Containing Tüm dntp ler ve koruyucu olarak 0.05% NaN 3 içerir. Kullanmadan önce tamamen çözülmesini sağlayın. DRB1+3+4+5 Birincil Solüsyonu 86G Birincil Çözeltisi 86V Birincil Çözeltisi DRB1 Birincil Çözeltisi 1x 0,3 ml 56989 DRB1+3+4+5 alleleri ekzon 2 sinin amplifikasyonu için biyotinyli primerler, MgCl 2, ve koruyucu olarak 0.05% NaN 3 içerir. Kullanımdan önce tamamen MgCl 2 çözülmesi için tam çözülmeye izin verin. 1x 0,3 ml 56988 Kodon 86 da G veya D dizisini gösteren DRB alleleri ekzon 2 sinin sequence-specific amplifikasyonu için biyotinli primerler MgCl 2, ve koruyucu olarak 0.05% NaN 3 içerir. Kullanımdan önce tamamen MgCl 2 çözülmesi için tam çözülmeye izin verin. 1x 0,3 ml 56987 Kodon 86 da V dizisini gösteren DRB alleleri ekzon 2 sinin sequence-specific amplifikasyonu için biyotinli primerler MgCl 2, ve koruyucu olarak 0.05% NaN 3 içerir. Kullanımdan önce tamamen MgCl 2 çözülmesi için tam çözülmeye izin verin. 1x 0,3 ml 56984 DRB1 alleleri ekzon 2 sinin amplifikasyonu için biyotinyli primerler, MgCl 2, ve koruyucu olarak 0.05% NaN 3 içerir. Kullanımdan önce tamamen MgCl 2 çözülmesi için tam çözülmeye izin verin.

80341 INNO-LiPA HLA-DRB dekoder Amplifikasyon / 28820 v2 / ANAHTAR KODU:FRI24098 p 4/7 Bileşen Miktar Ref. Açıklama LiPA Taq 2x 0,035 ml 60694 Taq DNA polimeraz (3 U/µL) ve koruyucu olarak 0.03% NaN 3 içerir. Kullanımdan hemen öncesine kadar -15/-25 C de tutun. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - DNA ekstraksiyonu için materyaller. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Steril mikrotüpler. - Mikrotüp rakları. - Microtüp santrifüjü. - DNA termal döngü ve ekipmanları. - Dağıtım için ayarlanabilir pipetler 1-20 µl, 20-200 µl ve 200-1000 µl. - Otoklavlanmış distile su. - Mineral yağ (gerekirse). Güvenlik ve Çevre Koşulları Lütfen Material Safety Data Sheet (SDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz. En son güncellenen SDS versiyonu www.fujirebio-europe.com yer almaktadır. - Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. - Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar işlenirken eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık bertaraf kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnek toplama,hazırlama ve saklama DNA ekstraksiyon Genel olarak kullanılan salting-out DNA ekstraksiyon yöntemi veya spin kolonları temelli yöntemler asit sitrat dekstroz (ACD) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile antikoagüle edilmiş tam kan örneğinden genomik DNA hazırlamak için kullanılabilir. DNA örneklerini -15/-25 C de saklayın. Ekstrakte edilmiş DNA nın konsantrasyonu 0.02 µg/µl olmalıdır. Saflığı (A260nm/A280nm) 1.5 olmalıdır. NOT: Sağlanmayan reaktifler. PCR karışım hazırlanması Her bir bileşen eklenmiş ve doğru miktarda sağlanmalıdır. Çok fazla veya çok az örnek veya reaktif kullanımı özgün olmayan amplifikasyona hatta hiç amplifikasyon olmamasına neden olabilir. PCR döngüsü INNO-LiPA HLA-DRB dekoder için doğru sıcaklık profili seçilmelidir.

80341 INNO-LiPA HLA-DRB dekoder Amplifikasyon / 28820 v2 / ANAHTAR KODU:FRI24098 p 5/7 Uyarılar ve önlemler - DNA kontaminasyonundan kaçınmak için, pre-ve post-amplifikasyon adımları arasında maksimum fiziksel ayrım önerilir: ayrı odalarda, ayrı pipetler ve diğer laboratuvar malzemeleri, ayrı laboratuvar önlük ve eldiveni (ve onların stoğu) iyi laboratuar uygulamaları için alınabilecek minimum önlemlerdir. Kit herhangi bir kontamine edici DNA kaynağından özellikle amplifiye DNA ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçınınız. - Amplifikasyon işlemleri için reaktifler amplifiye DNA 'sından arındırılmış bir odada ele alınmalıdır. Otoklavlanmış tüp ve pipet uçları (tercihen pamuk takılı) kullanılmalıdır. - Post-amplifikasyon odasından pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüşten kaçının. - Amplifikasyon işlemi için otoklavlanmış tüpler ve pipet uçları kullanılmalıdır. Pamuk tıpalı pipet uçları önerilir. Herbir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Çözülme sonrası, Amplifikasyon Tamponunu ve Primer Çözeltisini vorteksleyin ve bütün reaktifleri asağıya doğru döndürün, özellikle LİPA-Taq. Test prosedürü - DRB allelleri ekzon 2 sinin amplifikasyonu için bu protokol GeneAmp PCR tüpleri (0.5 ml) ve PE-480 termal döngüler, veya MicroAmp PCR tüpleri (0.2 ml) ve GeneAmp PCR System 9700 termal döngüleri ve LiPA-Taq kullanılarak en iyi amplifikasyon için tasarlanmıştır. Bu protokol çoğu ticari termal cyclerlar için kullanılabilir ama cyclerın üreticisi tarafından yapılacak bazı modifikasyonları gerektirebilir. - Kullanımdan önce, bu protokolün laboratuvarınızda kullanımda olan thermal cycler ile uyumlu olup olmadığını belirleyin. Termal döngünün kullanımdan önce kalibre edildiğinden emin olun. - Spesifik olmayan amplifikasyonlar sonuçları bozabilir, önlemek için gerekli önlemleri alın: Buz üzerinde ve gecikmeden pipetleme adımlarını uygulayın. Örnekleri yerleştirmeden önce termal döngü ısıtma bloğunu (95 C) önceden ısıtın, ve hemen ardından döngü işlemini başlatın. 1. Her genomik DNA yı 0.02 ve 0.04 µg/µl konsantrasyonları aralığında TE tampon ile seyreltin. 2. (N) olarak hazırlanacak şişelerin sayısını belirleyin: N = DNA örneği sayısı + 1 (Negatif kontrol; DNA sız) + 1. Pamuk-filtreli pipet uçları kullanarak otoklavlanmış1.5 ml lik tüplerde bir master mix hazırlayın: DRB1+3+4+5 ve 86V amplifikasyon için: (N x 24.5 µl) otoklavlanmış distile su + (N x 10 µl) Amplifikasyon Tamponu + (N x 10 µl) Birincil Solüsyonu (DRB1+3+4+5 veya 86V) + (N x 0.5 µl) LiPA-Taq (N x 1.5U) DRB1 ve 86G amplifikasyon: (N x 24 µl) otoklavlanmış distile su + (N x 10 µl) Amplifikasyon Tamponu + (N x 10 µl) Birincil Solüsyonu (DRB1veya 86G) + (N x 1µL) LiPA-Taq (N x 3U) Bu amplifikasyon karışımının toplam hacmi şimdi (N x 45 µl dir).

80341 INNO-LiPA HLA-DRB dekoder Amplifikasyon / 28820 v2 / ANAHTAR KODU:FRI24098 p 6/7 Hafifçe vorteksleyin ve 45 µl olmak üzere master karışımını (N-1) otoklavlanmış amplifikasyon tüplerine porsiyonlayın. 3. Gerekirse her tüpe 2 damla (~ 40 µll) mineral yağ ekleyin (ör. PE-480 kullanılırken). 5 µl (0.1-0.2 µg) genomik DNA hazırlığı pipetleyin (gerekliyse mineral yağın içinden). Negatif kontrol tüpüne 5 µl distile su ( DNA sız ) koyun. NOT: Vortekslemeyin veya karıştırmayın. Amplifikasyon karışımının tüpün tabanında olduğunu kontrol edin. 4. Örnekleri önceden ısıtılmış ve kalibrasyonu yapılmış termal bloklara yerleştirin ( termal döngü üreticisi tarafından sağlanan talimatları izleyin). DRB dekoder amplifikasyon için olan amplifikasyon programını başlatın. DRB dekoder amplifikasyon profili: Döngü tipi PE-480 PE-2400 PE-9600 Adım sıc ± 0.75 C zamanlama zamanlama 1. Denatüre 95 C 5 dk 5 dk 2. Denatüre 95 C 30 sn. 20 sn. 3. anneal 58 C 20 sn. 20 sn. primerleri 4. uzama 72 C 30 sn. 20 sn. primerleri 5. uzatma 72 C 10 dak. 10 dak. 2-4 basamakları 35 defa tekrarlayın NOT: Aynı amplifikasyon profili INNO-LiPA HLA-DPB Amplifikasyon hariç bütün INNO-LiPA HLA sınıf II ürünleri için kullanılabilir. 5. Amplifikasyon sürecinden sonra, örnekleri derhal INNO-LiPA HLA-DRB decoder test stripleriyle kullanın veya -15/-25 C de örnekleri saklayın. NOT: Amplifiye edilmiş DNA ları kullanılmamış amplifikasyon reaktifleri ile beraber saklamayın. Sonuçlar Görüntüleme - Amplifiye edilmiş ürün varlığı,% 2 lik agaroz jel içinde kontrol edilebilir. Oluk başına amplifiye edilen üründen 10 µl yükleyin. Oluk başına 10 ul amplifiye ürün yükleyin. Amplikon 280 bp uzunluğunda tek bir bant olarak gözlenmelidir. NOT: DRB1 Birincil Solüsyonu primer-dimerlerinin oluşumuna neden olabilen primer setidir. Bu durum sonuçları etkilemeyecektir. - In-house gözlemler göstermiştir ki; % 2'lik agaroz jel üzerinde 10 µl amplifiye edilmiş ürün denetlendikten sonra ~ 280 bp uzunluğunda bir bant görünüyorsa, LIPA testi ile yorumlanabilir bir sonuç verilmelidir. Doğrulama - Her amplifikasyon çalışmasına en azından bir pozitif ve bir negatif kontrol eklenmelidir. Herhangi bir yeni laboratuvar prosedüründe test prosedürünün doğru bir şekilde uygulanabileceğine dair yüksek derecede güven gelişene kadar pozitif ve

80341 INNO-LiPA HLA-DRB dekoder Amplifikasyon / 28820 v2 / ANAHTAR KODU:FRI24098 p 7/7 negatif kontrolün varlığı dikkate alınmalıdır. Ek bir pozitif kontrolün varlığına ihtiyaç duyuluyorsa, bilinen bir pozitif örnek kullanın. - Jelde negatif bir kontrol için pozitif bir bant elde edilirse çalışma dışlanmalı ve bütün test prosedürü tekrar edilmelidir. Prosedür sınırlamaları - Bu ürünün kullanımı amplifikasyon tekniklerinde iyi eğitimli personelle sınırlandırılmalıdır. - Polimeraz inhibisyonu (ör. heparin,hemoglobin) testin tamamen başarısız olması için sebep olabilir. - Tek kullanımlık eldivenden gelebilecek pudra veya sodyum hipokloritin amplifikasyon üzerinde inhibe edici etkisi vardır. - DRB1 primer pozisyonundaki DRB1*1130 allelinin anormal dizisi sebebiyle bu allel için DRB1 primer seti ile amplifikasyon beklenmez. - Primer bağlanma bölgesindeki dizilim bütün alleller için bilinmemektedir. Primer bölgesinde yanlış eşleşme riskinin, primer başarısızlığı hiç gözlenmemişken ve tüm grupları kapsayan 80 allelden daha fazlası test edilmişken çok düşük olduğu kabul edilir. Buna rağmen, homozigot sonuçlarda allelik dropout durumu göz önüne alınmalıdır. - İyi laboratuvar uygulamaları ve önceden belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik amplifikasyona olanak sağlar. Test performans INNO-LiPA HLA-DRB dekoder 3 Avrupa ve 2 Kuzey Amerika doku tipleme laboratuarında rutin tipleme örnekleri ile değerlendirilmiştir. Çalışma boyunca INNO-LiPA HLA-DRB dekoder ile toplam 136 örnek test edilmiştir. Çalışma boyunca INNO-LiPA HLA-DRB dekoder amplifikasyon hataları yoktur. Ticari markalar - INNO-LiPA, dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de. - LiPA Benelux da tescili ticari markadır ve dünyanın geri kalanında bir ticari markadır (ABD dahil). - GeneAmp ve MicroAmp Applied Biosystems, LLC tescili ticari markalarıdır.