T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİİ NÖROŞİRURJİ ANABİLİMDALI SIÇANLARDA SPİNAL KORD TRAVMASINI TAKİBEN İLKK DÖRT GÜNDE KANDA IL-1, IL-6, IL-8 VE TNF-ALFA DÜZEYLERİNİN SAPTANMASI VE SPİNAL KORDDA MEYDANA GELEN HİSTOPATOLOJİK DEĞİŞİKLİKLER Dr. Ahmet ÖZKAN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Alp İskender GÖÇER ADANA-2008
T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİİ NÖROŞİRURJİ ANABİLİMDALI SIÇANLARDA SPİNAL KORD TRAVMASINI TAKİBEN İLKK DÖRT GÜNDE KANDA IL-1, IL-6, IL-8 VE TNF-ALFA DÜZEYLERİNİN SAPTANMASI VE SPİNAL KORDDA MEYDANA GELEN HİSTOPATOLOJİK DEĞİŞİKLİKLER Dr. Ahmet ÖZKAN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Alp İskender GÖÇER ADANA-2008
TEŞEKKÜR Asistanlığım süresince eğitimim ve öğrenimim için yaptıkları katkılardan dolayı bölümümüzün tüm değerli hocalarıma, tezimin hazırlanmasında bana yol gösteren ve katkıda bulunan başta tez danışmanım Prof. Dr. Alp İskender GÖÇER olmak üzere, gösterdikleri dostluk ve destek için tüm çalışma arkadaşlarıma, tezim konusunda katkılarından dolayı Prof. Dr. Suzan ZORLUDEMİR e, Prof. Dr. Akgün YAMAN a, Doç.Dr. Şeyda ERDOĞAN a, Dr. Yaşar SERTDEMİR e, Vet. Dr. Kenan DAĞLIOĞLU na, manevi destekleri ile her zaman yanımda olan aileme ve burada isimlerini sayamadığım tüm dostlarıma gönülden teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR...I İÇİNDEKİLER.II TABLO LİSTESİ..V ŞEKİL LİSTESİ..VI KISALTMA LİSTESİ VII ÖZET VE ANAHTARSÖZCÜKLER..VIII ABSTRACT-KEYWORDS IX 1. GİRİŞ.1 2. GENEL BİLGİLER...3 2.1. Omurilik Yaralanmasının Tarihçesi...3 2.2. Omurilik Yaralanmasının Fizyopatolojisi..3 2.2.1. Deneysel Omurilik Yaralanma Modelleri 3 2.2.1.1. Travmatik Yaralanma.3 2.2.1.2. Non Travmatik Yaralanma...4 2.2.1.3. Deneysel Omurilik Yaralanmasında Takip Parametreleri..4 2.2.1.3.1. Klinik Muayene 4 2.2.1.3.2. Histopatolojik Muayene...4 2.2.2. Spinal Kord Yaralanmalarında Primer Mekanizmalar.5 2.2.3. Spinal Kord Yaralanmalarında Sekonder Mekanizmalar.6 2.2.3.1. Sekonder Hasar Mekanizmasının Patofizyolojisi...6 2.2.3.1.1. Sistemik Etkiler 8 2.2.3.1.2. Lokal Mikrovasküler Yaralanma. 8 2.2.3.1.3. Elektrolik Bozuklukları 9
2.2.3.1.4. Biyokimyasal Değişiklikler 10 2.2.3.1.4.1. Eksitotoksisite...11 2.2.3.1.4.2. Araşidonik Asit Salınımı ve Araşidonik Asit Metaboliklerinin Oluşumu..12 2.2.3.1.4.3. Serbest Oksijen Radikallerinin Oluşumu.12 2.2.3.1.4.4. Lipid Peroksidasyonu...14 2.2.3.1.4.5. Lipid Karboksilasyonu.17 2.2.3.1.4.6. Protein Oksidasyonu 18 2.2.3.1.4.7. Spinal Kord Hasarı Sonrası Gen Ekspresyonundaki Değişiklikler 18 2.2.3.1.4.8. Nötrofil Kaynaklı Hücre Hasarı...20 2.2.3.1.4.9. Sitokinler..21 2.2.3.1.5. İnflamasyon 25 2.2.3.1.6. İmmonolojik Sekonder Hasar.26 2.2.3.1.7. Apopitoz.27 2.3. Omurilik Yaralanmasının Patoloj.29 2.4. Omurilik Yaralanmalarında Farmakolojik Tedavi...31 2.4.1. Spinal Kord Yaralanmasında Deneysel Tedaviler..31 2.4.1.1. Kalsiyum Kanal Brokörleri..31 2.4.1.2. Antiokdisanlar ve Serbest Radikal Tutucular...32 2.4.1.3. Opioid Reseptör Antagonistleri 32 2.4.1.4. İnflamatuar/İmmün Cevapların Baskılanması..32 2.4.1.5. Tirotropin Salıcı Hormon ve TRH Analogları.33 2.4.1.6. GM-1 Gangliozid.33 2.4.1.7. Monoamin Modülatörleri.33 2.4.1.8. Büyüme Faktörleri 33 2.4.1.9. Eksitatör Aminoasit Reseptör Antagonistleri...34 2.4.2. Metilprednizolon 34 2.4.3. Aminofostin...37 2.5. Omurilik Yaralanmalarında Cerrahi Tedavi...41
3. GEREÇ ve YÖNTEMLER.43 3.1. Histopatolojik İnceleme İçin Örneklerin Hazırlanması 44 3.2. Biyokimyasal Parametreler İçin Örneklerin Hazırlanması...44 4. BULGULAR...45 4.1. Histopatolojik Bulgular...45 4.2. Biyokimyasal Bulgular.47 4.3. İstatistiksel Analiz Sonuçları 49 5. TARTIŞMA 53 6. SONUÇ ve ÖNERİLER..57 KAYNAKLAR...59 ÖZGEÇMİ..65
TABLO LİSTESİ Tablo No Sayfa No Tablo 1: IL-1α, IL-6, IL-8 ve TNFα kan sonuçları...48 Tablo 2: Sadece laminektomi yapılan sıçan grubu analiz sonuçları.... 49 Tablo 3: Laminektomi ile 5 dakika omuriliğe klip konan sıçan grubu analiz sonuçları...49 Tablo 4: Laminektomi ile 30 dakikaomuriliğe klip konan sıçan grubu analiz sonuçları.. 50
ŞEKİL LİSTESİ Şekil No Sayfa No Şekil 1: Omuriliğin zedelenmesinde ikincil mekanizmada lökositlerin rolü... 6 Şekil 2: Omurilik zedelenmesinde muhtemel mekanizmalar... 7 Şekil 3: Endotel lökosit adezyon molekülleri yoluyla endotel hücreleri ile nötrofillerin birbirini etkilemesi... 21 Şekil 4: Normal omurilik kesiti... 45 Şekil 5: Deney grubundan omurilik kesiti( 24 saat sonra)... 46 Şekil 6: Deney grubundan omurilik kesiti(72 saat sonra)... 46 Şekil 7: Deney grubundan omurilik kesiti(96 saat sonra)... 47 Şekil 8: TNF-Alfa nın zamana bağlı kan seviyesindeki değişiklik... 50 Şekil 9: IL-1Alfa nın zamana bağlı kan seviyesindeki değişiklik... 51 Şekil 10: IL-6 nın zamana bağlı kan seviyesindeki değişiklik... 51 Şekil 11: IL-8 in zamana bağlı kan seviyesindeki değişiklik... 52 KISALTMA LİSTESİ
IL-1α : İnterlökin -1 alfa TNF-α : Tümör nekroz faktör alfa IL-8 : İnterlökin-8 BOS : Beyin omurilik sıvısı EAA : Eksitator aminoasitler SOR : Serbest oksijen radikalleri ROT : Reaktif oksijen türevleri SOD : Süperoksit dizmutaz SCI : Spinal kord injurisi PMNL : Polimorf nüvelü lökosit MPSS : Metilprednisolon sodyum suksinat LTB4 : Lökotrien B4 IFN : İnterferon NO : Nitrik oksid NMDA : N-metil-d-aspartat AMPA : Amino 3-hidroksi 5-metil 4-izoksazola-propionik asit IL-6 : İnterlökin-6
ÖZET Sıçanlarda Spinal Kord Travmasını Takiben İlk Dört Günde Kanda Il-1, Il-6, Il-8 ve TNF-Alfa Düzeylerinin Saptanması ve Spinal Kordda Meydana Gelen Histopatolojik Değişiklikler Amaç: Medulla spinalis yaralanması, günlük aktivitenin kısıtlanmasına neden olan ve yaşam kalitesini etkileyen temel bir sağlık sorunudur. Ani gelişen omuriliğin başlangıçtaki mekanik hasarı birincil hasar denir. İkincil hasarda ise, kalsiyum artışı, eksitatör amino asid ve serbest oksijen radikallerinin salınması gibi birçok biyokimyasal ve hücresel değişikliklerin meydana gelir. Bu süreçte hasar görmüş dokuda TNF-α, IL 1, IL 6 ve IL 8 gibi birtakım kimyasal maddeler açığa çıkmakta ve bunlar hasar görmüş doku, beyin omurilik sıvısı (BOS) ve kan gibi vücut sıvılarında bulunmaktadır. Omurilik yaralanmasının akut döneminde yapılan farmakolojik tedavi, ikincil hasarı önlemeyi amaçlamaktadır. Bu nedenle omurilik hasarının erken tedavisi ve tedavi sürecini takip etmemizde yararlı olacak TNF-α, IL-1α, IL-6 ve IL-8 gibi parametrelerin kan düzeyini araştırdık. Gereç ve Yöntem: Çalışmamız, Haziran 2007-Ekim 2007 tarihleri arasında, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Beyin Cerrahisinde 280-310 gram 70 adet dişi Wistar sıçanlar dört gruba ayrılarak ve torokal 2-7 segmentleri arasına laminektomi yaptıktan sonra Yaşargil klipi ile deneysel omurilik travması oluşturularak ilk dört gün boyunca kandaki TNF-α, IL-1α, IL-6 ve IL-8 düzeylerindeki geğişiklikler ile zedelenen omurilik dokusundaki histopatolojik değişiklikler incelenmiştir. Veriler SPSS 15 programında analiz edilmiştir. Her grup kendi içinde zamana bağlı değişim gösterip göstermediği one-way-anova ile değerlendirilmiştir. Bulgular: Tüm sıçan gruplarında serumda sadece laminektomi yapılan ve laminektomi ile omurilik zedelenmesi oluşturulan gruplarda TNF-α,IL-1α, IL-6 ve IL-8 düzeylerinde artış olmuştur. Bununla birlikte serum seviyelerinde artış miktarı zamana ve zedelenmenin şiddetine bağlı olarak değişiklik gösterdiği gözlenmiştir. Sonuç: Travmatik omurilik zedelenmesinde TNF-α, IL-1α, IL-6 ve IL-8 serum seviyelerinde kontrol değerlerine göre zamana ve travmanın şiddetine bağlı olarak anlamlı bir artış olsa da, pratikte sadece IL-8 ile birazda TNF-α nın bize yol gösterici olabileceğini düşünmekteyiz. Anahtar Sözcükler: İnterlökin 1 alfa, Interlökin 6, Interlökin 8, Omurilik yaralanması, Tümör nekroz faktör alfa..
ABSTRACT Determining The IL-1a, IL-6, IL-8 and TNF-a Levels The in Blood of Rats 4 days After a Spinal Cord Trauma, and The Differences on The Spinal Cord Background: Spinal cord injury is a primer medical problem which limits daily activities and effects life quality spinal cord injury the metabolic and biochemical processes like Ca increase, eksitator amino acid and free oxygen radical relasing lead to secondary injury. In these processes chemical ajents like TNF-α, IL-1α, IL-6 and IL-8 laid off and exist in traumatic tissue, BOS and blood. The purpose of farmakolojik treatment of acute cord injury is to prevent secondery injury. Because of the reasen we investigated TNF-α, IL-1α, IL- 6 and IL-8 blood levels which can help to follow treatment process. Method and materials: The exsperimental spinal cord injury model was applied on 70 female 280-310 gr. Weighted rats in Çukurova Üniversity Medicine faculty between the dutes june 2007 and october 2007. The rats diveded in four groups and underwent torocal 2-7 segments laminektomy. Exposed by Yaşargil anevrisym clips and TNF-α, IL-1α, IL-6 and IL-8 levels changings and cord histopatologic changings were investigated. The datas were analysis in SPSS 15 program. All groups were evaluated according to time by one-way-anova. Results: In laminectomy and experimental spinal cord injury models TNF-α, IL-1α, IL-6 and IL-8 levels in serumwere increased,the rise in serum levels were different assosiated to injury time and severity. Conclusion: In traumatic cord injury TNF-α levels were significantly high assosiated to injury time and severity according to control levels.however we display only IL-8 and mildly TNF-α can lead in practice. Keywords: Interleukin-1a, Interleukin-6, Interleukin-8, Spinal cord injury, Tumor necrosis factor-a.
GİRİŞ Omurilik yaralanmaları günümüzde oldukça yaygın görülen, önemli sosyal ve ekonomik problemlere yol açan sağlık sorunlarından biridir. Teknolojinin ilerlemesi ve motorlu taşıtların çoğalmasıyla gittikçe artan sıklıkta karşımıza çıkmaktadır. Omurilik yaralanmaları çeşitli ülkelerde %2 4 sıklıkla görülmektedir 1,2. Amerika Birleşik Devletleri nde her yıl yaklaşık 10.000 dolayında yeni omurilik yaralanması olmaktadır. Travmatik spinal kord yaralanma insidansı daha güvenli otomobiller geliştirerek, meslekle ilgili güvenlik standartlarının yükseltilmesiyle spor ile ilgili düzenlemelerle, acil medikal sistemler ve akut travma ile ilgili düzenlemeler sonucu azalmıştır. Ortalama görülme yaşı 19 ve olguların 3 te 2 si erkektir. Bu genç yetişkinlerin, yalnızca %20 si tamamen rehabilite olup topluma geri kazandırılmaktadır. Omurilik yaralanması olan olguların rehabilitasyondaki yeni düzenlemeler ile hastanede yatış süreleri 2000 yılı öncesine göre günümüzde yaklaşık olarak %50 azalmıştır. Bununla birlikte yaşa ve yaralanmanın şiddetine bağlı olarak çeşitli masraflar ve sağlık hizmetleri için ortalama bir kişinin rehabilitasyon sonu tıbbi tedavi gideri 100.000 ile 300.000 dolar arasındadır. Basınç yaraları, mesane enfeksiyonu ve kemik kırıkları gibi ikincil tıbbi problemleri ve diğer birtakım giderler için bir kişiye hayatı boyunca ilave olarak ortalama 1,2 milyon dolar harcanmaktadır. Bu miktar hastanın genç olması ve kuadriplejik olması ile artış gösterirken yaşlı ve parezik hastalarda azalmaktadır 1. Travmatik omurilik yaralanmasında birincil zedelenme travma anında olan zedelenmedir. Bugün için birincil omurilik yaralanmasını önleyecek özel farmakolojik bir tedavi söz konusu değildir. Yaralanmaların meydana gelmesini engellemek ve yaralanma sırasında aktif ve pasif güvenlik önlemleriyle vücudun stabilizasyonunu sağlamak ortaya çıkacak hasarı azaltabilir. İkincil omurilik zedelenmesi ise oluşan birincil zedelenmenin başlattığı saatler içerisinde metabolik ve biokimyasal nedenlerle oluşan hasarlardır. Bu progresif süreçte yer alan lezyonlar henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Travmatik omurilik yaralanmasında medikal tedavide amaç bu mekanizmaların önlenmesidir 2,3,4,5. Bu çalışmada deneysel omurilik yaralanmasının fizyopatolojisi gözden geçirilmiş, travma sonrası kanda IL 1α, 6, 8 ve TNF-α değerlerinin belli aralıklarla 1
ölçülmesi ile omurilik hasarın olup olmadığının ve şiddetinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 2
GENEL BİLGİLER 2.1.Omurilik yaralanmasının tarihçesi Omurilik yaralanması ile ilgili ilk yazılara Mısırlı Cerrahlarca yazılan ve sinir sistemiyle ilgili ilk yazılı bilgileri içeren Edwin Smith in papirüsünde rastlanmaktadır (MÖ 1700 ) 6,7. Hipokrat ta MÖ 400 lü yıllarda paraplejiyi tarif etmiştir. Sonraki yıllarda Aulus Cornelius Celcius tarafından bir traksiyon cihazı geliştirilmiştir. Galen M.Ö. 150 yılında omurilikte longitudinal insizyonun fonksiyon kaybına, fakat transvers insizyonunun total kayba neden olduğunu söylemiştir 8. Paulus ilk kez 7.yüzyılda dekompresif laminektomi yapmıştır 6. Benedikt Stilling 1842 de omuriliğin seri kesitleri üzerinde ilk çalışmayı gerçekleştirmiş, Marshall Hail 1850 de spinal şok terimini kullanmıştır. Kolliker 1852 de omuriliğin ön boynuzundan motor sinirlerin nasıl çıktığını tarif etmiştir. Ernst von Bergmann 1870 de sinir sistemi cerrahisi üzerine ilk kitabı yazmıştır. Omurilik travması ile ilgili ilk fizyopatolojik çalışma ise Schamus tarafından 1890 da tavşan omuriliğinde travma sonucu gelişen patolojik değişiklikleri incelenerek yapılmıştır 9. Ailen 1911 de köpeklerin omuriliğine ağırlık düşürerek yapılan çalışmalarında, intakt görülmesine rağmen, omurilikte birkaç saat içerisinde gri cevherde başlayıp beyaz cevhere yayılan hemorojik nekrozu gözlemiş ve santral hemorajik nekroz olarak isimlendirmiştir 3. Deneysel çalışmalar 1970 li yıllarda tekrar başlamış ve travmada omurilik kan akımının azaldığı ve doku harabiyetini azaltan tedavilerin omurilikte kan akımını artırdığı saptanmıştır. 2.2. Omurilik yaralanmasının fizyopatolojisi 2.2.1. Deneysel omurilik yaralanma modelleri 2.2.1.1. Travmatik Yaralanma Akut kinetik kompresyon( Kaf, klip, balon kompresyon, vertebral dislokasyon, impaktör ), Akut statik kompresyon(ağırlık uygulama) Çarpma veya ağırlık düşürme, Akselerasyon-deselerasyon, Distraksiyon, Transseksiyon( Parsiyel veya komplet) 10. 3
2.2.1.2. Non travmatik yaralanma İskemi (Aort oklüzyunu, selektif arteriyel veya venöz oklüzyon),tümör kom presyonu (Ekstradural), Kimyasal veya fotokimyasal deneysel spinal kord yaralanması oluşturulan hayvanlarda, iyileşmenin takibi amacıyla birçok parametre geliştirilmiştir. Bu parametrelerden biri olan Tarlov sistemi, klinik nörolojik muayenenin derecelendirilmesi esasına dayanan, subjektif bir yöntemdir. 1977 yılında Rivlin ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve objektif bir test olan Inclined Plane(eğik düzlem) ise, hayvanın eğik bir düzlem üzerine yatay pozisyonda yerleştirilmesinden sonra, düzlemin zeminle olan açısı giderek arttırılır; hayvanın 5 saniye süresince devrilmeden durabildiği en yüksek açı, o hayvanın Inclined Plane derecesi olarak belirlenir. Travmanın şiddeti ve oluş şekline bağlı olarak ortaya çıkan spinal kord yaralanmasına primer yaralanma denir. Primer yaralanmadan sonraki saatler ve günler içerisinde gelişen bir dizi fizyopatolojik sürece bağlı olarak ortaya çıkan spinal kord yaralanmasına da sekonder yaralanma denir. Allen ile başlayan, sekonder mekanizma kavramı bugün de hala incelenmekte ve etkili medikal tedavi yöntemleri araştırılmaktadır 11. 2.2.1.3. Deneysel Omurilik yaralanmasında takip parametreleri 2.2.1.3.1. Klinik muayene Subjektif: Tarlov motor skalası gibi Objektif: Inclined Plane gibi 2.2.1.3.2. Histolojik muayene Subjektif Objektif: Akson sayımı gibi Görüntüleme: CT, MRI gibi. Anjiografik değerlendirme. Spinal kord kan akımı ölçümü. Aksonal tarayıcılar ile değerlendirme. 4
Biyokimyasal ölçümlerle değerlendirme. Nörofizyolojik değerlendirme: Uyarılmış potansiyeller gibi. Yüksekten Yüksekten düşmeler, trafik kazaları, iş kazaları, günlük yaşama ait kazalar, göçük altında kalmalar, spor yaralanmaları ve ateşli silah yaralanmaları omurilik yaralanmalarının başlıca sebepleridir. Ayrıca vertebrada primer bir patoloji (tümör, enfeksiyon, osteoporoz, metabolik ve kemik hastalıkları vb.) sonucunda basit travmalarla da patolojik kırıklar gelişebilir. Vertebra fraktürlerinin %50 den fazlası (L1>T12>L2>T11) torakolumbar bölgede görülür ve tüm omurilik yaralanmalarının % 40 ı T12-L1 bölgesindedir. Servikal vertebra yaralanmalarında nörolojik defisit % 40 oranlarına ulaşmaktadır. Erişkinlerde torakolumbar vertebra yaralanmalarında nörolojik defisit % 10-38 arasında değişen oranlarda görülmektedir. Travmalarda omurilik hasarı indirekt yolla fleksiyon, ektansiyon mekanizmaları ve bunlarla birlikte torsiyonel, kompresif translasyonal ya da distraktif kuvvetlerin birleşimi sonucu vertebral kolona etki eden ani akselerasyon ve deselarasyon güçleri sonucu oluşur. Spinal kord travmasında doku harabiyeti iki mekanizma ile oluşmaktadır 11. 2.2.2. Omurilik Yaralanmalarında Primer (mekanik) Mekanizmalar Travmatik akut omurilik yaralanmasında, yaralanma anında oluşan hasarlardır. Travma anında vertebra patlama fraktürü veya fraktür, dislokasyon sonucu omurilikte meydana gelen akut kompresyon, laserasyon, gerilme, yırtılma, kemik, disk veya yabancı cismin omuriliğe çarpması sonucu oluşan yaralanmalara birincil omurilik yaralanması denilir. Bugün için primer omurilik yaralanmasına özel farmakolojik tedavi söz konusu değildir. Yaralanmanın meydana gelmesini engellemek ve yaralanma sırasında aktif ve pasif güvenlik önlemleriyle vücudun stabilizasyonunu sağlamak ortaya çıkacak hasarı azaltabilir. Primer yaralanmanın derecesi, yaralanmaya neden olan gücün şiddetine, etki süresine ve omurilik tarafından absorbe edilen enerji miktarına göre değişir. Omuriliğin uzun süre bası altında kalması, nörolojik hasarın daha büyük ve prognozunun daha kötü olmasına yol açar. Omurilik yaralanmasını takiben spinal şok ortaya çıkabilir. Ortaya çıkan spinal şokun şiddeti yaralanmayı oluşturan kuvvetin şiddetine ve yaralanmanın olduğu seviyeye göre değişir 2,3,4,5,12. 5
Birincil Yaralanma İkincil Yaralanma Spinal kord Şekil 1. Lökositler spinal kordun otoregülasyonuna neden olarak ikincil yaralanma sürecinde çok önemli rol oynar 3. 2.2.3. Omurilik Yaralanmalarında Sekonder mekanizmalar 2.2.3.1. Sekonder Hasar Mekanizmasının Patofizyolojisi Allen 1911 de, kısa süreli spinal kord travmasına maruz kalan hayvanlarda ilerleyici klinikle birlikte ilerleyici doku hasarı olduğunu bildirmiştir 3. Bu durumun açıklanması için, çeşitli patofizyolojik mekanizmalar öne sürülerek ikincil hasar kavramı gelişmiştir. Spinal kord yaralanması sonrasında, spinal kordda hemoraji, ödem, demiyelinizasyon, aksonal ve nöronal nekroz ile kavite oluşumu ve infarkt ile sonlanan bir seri patolojik değişiklikler oluşur. Bu patolojik durum santral hemorajik nekroz olarak tanımlanır 3. 1978 de Nemecek, ışık mikroskobunda yaralanmış dokudaki intravasküler trombusları göstermiş ve bu ciddi nekrozu otodestruksiyon olarak tanımlamıştır 13. 6
Birincil Yaralanma İkincil Yaralanma 1. Kord içinde kanama 2. Toksik eksitatör aminoasit salınımı 3. Endojen opiyantların akümülasyonu 4. Yağların hidrolizi 5. Serbest radikal boşalımı 6. İskemi ve reperfüzyon Şekil 2. Spinal kord yaralanmasında olası mekanizmalar 3. Spinal kord yaralanmalarında sekonder hasar mekanizmaları birbiriyle ilişkili ve birbirini tetikleyen dört ana teoride toplanmıştır: Serbest Oksijen Radikalleri Teorisi: İskemik dokuda fazla miktarda biriken radikaller ve onların ürünleri doku hasarının ilerlemesine neden olurlar. Kalsiyum Teorisi: Serbest kalsiyum iyonlarının nörotransmitter kanallardan fazla miktarda geçişi sonucu doku yıkım enzimleri olan fosfolipaz, proteaz ve fosfatazın aktive olmaları doku harabiyetine neden olur. Opiat Reseptör Teorisi: Naloxone gibi opiat reseptör blokörleri nörolojik iyileşmeyi hızlandırır. Enflamasyon Teorisi: Lipid enflamasyon mediatörleri ve diğer sitokinler lezyon sahasında birikirler ve takiben makrofaj ve polimorfonükleer lökosit infiltrasyonuna neden olurlar. Bu teoriler baz alınarak spinal kord yaralanmalarının medikal tedavisinde nöroprotektör etkisi olduğu düşünülen pek çok madde denenmiştir. Opiat reseptör antagonistleri, steroidler (Metilprednizolon), antioksidan maddeler ve serbest radikal tutucular, gangliozidler, tirotropin salıcı hormon ve analogları, araşidonik asit modülatörleri, glutamat reseptör blokerleri, monoamin modülatörleri, kalsiyum kanal antagonistleri, nonsteroidal antiinflamatuarlar, immün supresifler, büyüme faktörleri, serotonin reseptör blokerleri ve sodyum kanal blokerleri bu amaçla kullanılmışlardır. Bunlar arasından sadece metilprednizolon klinik uygulamada yaygın olarak kullanılmaktadır 14,15,16,17,18. 7
2.2.3.1.1. Sistemik Etkiler Spinal kord yaralanmasının şiddeti ve seviyesi, spinal kord kanlanmasını etkileyen lokal travmanın yanında, oluşan nörojenik şokun ağırlığıyla da yakın ilişkilidir. Nörojenik şok; sempatik tonus azalması, vagusun anormal kardiyak etkisi ve bradikardi gelişmesi sebebi ile ortaya çıkar. Servikal düzeydeki bir spinal kord yaralanması ciddi hipotansiyon ve bradikardi yapabilir. Periferik rezistans ve kardiak output azalırken tüm hemodinamik dengeler bozulur 19. 2.2.3.1.2. Lokal Mikrovasküler Yaralanma İnsan spinal kord yaralanmalarında ve deneysel modellerde, spinal kord hasarının en önemli sebeplerinden birisi posttravmatik iskemidir. Posttravmatik spinal kord iskemisi travma şiddeti ile lineer korelasyon göstermektedir. Oluşan patolojilerin hepsi, azalmış doku perfüzyonu ve enerji azalmasından kaynaklanmaktadır. Spinal kord yaralanmalarında en sık görülen bulgu özellikle gri cevher ve omuriliğin santralindeki hemorajidir 20,21. Mekanik darbenin ilk etkisi ile kapiller, venüller ve bazı arteriollerde yırtılmalar olur. Deneysel çalışmalarda anterior spinal arter ve anterior sulkal arterin akımının mekanik travma sonrasında da devam ettiği görülmüştür 22. Ancak omuriliğin santral kısmının kanlanmasının büyük kısmını sağlayan anterior sulkal arterlerde vazospazm oluştuğunu bildiren çalışmalar da mevcuttur 20,18. Yine angiografik çalışmalarda, büyük arteriol ve arterlerin de etkilenmediği gösterilmiştir Mikrosirkülasyon bozukluğu sadece yaralanma bölgesinde kalmamakta rostral ve kaudal olarak da ilerlemektedir. Mikrosirkülasyonun bozulmasına, direkt mekanik etkiye bağlı vazospazmın yanında, glutamat, prostaglandinler, katekolaminler gibi travmaya sekonder salgılanan biyokimyasal ajanlarla oluşan vazospazm da sebep olmaktadır 24. Yine kan ve kan ürünlerinin de direkt etki ile vazospazmı artırdığı bilinmektedir. Bu olay, kan yıkım ürünleri ile karşılaşan damar duvarındaki değişiklikler ile hemoglobinin yıkılarak methemoglobin oluşma sürecinde ortaya çıkan süperoksit radikallerine bağlanmıştır 25. İntravasküler tromboz ile vazospazm ve sonucunda oluşan iskemiden Tromboksan A 2 sorumlu bulunmuştur. Araştırmacılar, spinal kord yaralanması sonrası spinal kord kan akımı otoregülasyon mekanizmalarının 8 23,22.
bozulduğunu bildirmişlerdir. Normalde spinal kord kan akımı, sistemik kan basıncı değişikliklerinden etkilenmez. Otoregülasyonun bozulması spinal kord iskemisini artırır. Spinal kord yaralanması sonrası, otoregülasyon bozukluğu sebebi ile hiperemiler ve sekonder hemorajiler oluşabilir. Oluşan bu reperfüzyon, serbest radikal ve diğer toksik maddelerin oluşumunu artırarak, doku hasarını fazlalaştırabilmektedir 3. 2.2.3.1.3. Elektrolit Bozuklukları Spinal kord yaralanmasının ardından hücre içi ve dışı kompartmanlar arasında ciddi elektrolit değişiklikleri olmaktadır. Kalsiyumun hücre içi artışı özellikle iskemi ve travmada daha fazla olmak üzere, tüm nöral yaralanmalarda başrol oynamaktadır. Hücre içi kalsiyum girişi merkezi sinir sisteminde toksik hücre ölümünün son ortak yolu olarak isimlendirilmektedir 26. Kalsiyum iyon konsantrasyonu ekstrasellüler aralıkta hücre içine göre 1000 kat daha fazladır. Spinal kord yaralanmasında, bu büyük gradient farkı ile hücre içine Ca +2 iyon girişi olur. Kalsiyumun travma sonrası hücre içine girişi 3 yolla olmaktadır: 1. Hasar görmüş olan hücre membranından 2. Voltaja duyarlı kalsiyum kanallarından 3. Glutamat ile aktive olan kalsiyum kanallarından Kalsiyumun hücre içine girmesi nörotoksisiteyi tetikler. Ca +2 iyonları hücre içinde fosfolipazları, proteazları ve fosfatazları aktifleştirerek hücre hasarının ilerlemesine neden olur. Hücre içine giren kalsiyum, proteinkinaz C enzimini aktive ederek nöroflaman ve mikrotübül parçalanmasına yol açar. Fosfolipaz C enzimini aktive ederek hücre membranını oluşturan yağ asitlerini yıkar. Ayrıca yaralı mikrosirkülasyonda düz kas kasılmasına sebep olarak vazospazma ve dolayısıyla iskemiye neden olmaktadır 27. Benzer biçimde, araşidonik asit metabolizmasını başlatmakta ve siklooksijenaz yolunun diğer ürünleri olan serbest radikal üretimine de katkıda bulunmaktadır. Serbest radikallerin etkisiyle de araşidonik asit metabolizması, hücre yıkımını ve iskemiyi arttıran prostanoid üretiminin artışıyla sonuçlanmaktadır 28. Spinal kord yaralanmasından sonra meydana gelen miyelin hasarı ile miyelin kılıfı tarafından sarılmış olan hızlı K + kanallarının aktivitesi artar ve membran potansiyeli K + denge potansiyeline yaklaşır. Sonuçta aksonal ileti bloğu oluşur 29. Beyaz cevher 9
yaralanması sonucu oluşan anoksi, ATP ve membran depolarizasyonunun kaybına sebep olarak Na + kanallarından hücre içine Na + akışını sağlar. İntrasellüler Na + konsantrasyonundaki bu artış, membran depolarizasyonu ile birlikte olunca, Na + - Ca +2 değiştiricinin ters çalışmasına sebep olur. Bu da hücre içine zararlı miktarda Ca +2 girişini sağlar 16. 2.2.3.1.4. Biyokimyasal Değişiklikler Omurilik yaralanmalarında birçok biyokimyasal mekanizmaların rol oynadığı bildirilmiştir. Bu olayların en önemlisi yaralanmadan sonra omurilikte norepinefrinin artmasıdır. Norepinefrin hasarlı omurilikteki lezyon düzeyinde kan akımının azalmasından doğrudan sorumlu tutulmuştur 30. Na +, K + ve Ca ++ gibi iyonların yer değiştirmesi, lizozomal ve fosfolipaz aktivasyonu, prostoglandin, tromboksan ve eksitatör aminoasit gibi nörotoksik maddeler, opiat reseptör aktivasyonu, lipid peroksidasyonu gibi birçok biyokimyasal olay bu nokta üzerine odaklanmıştır. Yaralanmadan sonraki ilk 30 dakika içinde birincil nöronal hasar başlar. Elektrolit konsantrasyonundaki değişiklikler lezyon düzeyinde iletimin durmasına yol açar. Hücre içinde Na +, hücre dışında ise K + konsantrasyonunun artmasının aksonal iletimi durdurduğu gösterilmiştir. Kalsiyum hem Na + hem de K + akımında önemli rol oynar. Normalde hücre dışı Ca ++ konsantrasyonunun hücre içinden 1000 kat daha fazla olduğu saptanmıştır. Yaralanmadan sonra ise Ca ++ pompasının bozulmasından veya hasarlı kalsiyum kanallarından sızma sonucu fazla miktarda Ca ++ hücre içine girerek fosfolipaz, proteaz ve fosfatazları aktive eder. Fosfolipazlar membranın yapısını bozarak yağ asitleri ve araşidonik asidi serbestleştirir. Siklooksijenaz ve lipooksijenazlar araşidonik asidi, prostoglandinlere ve lökotrienlere çevirir. Ca ++ ile aktive olan fosfatazlar, nitrik oksid sentaz gibi enzimleri aktive ederler. Sonuç olarak Ca ++ iyonları birçok enzimin salınmasına, metabolizma ve taşınmasına neden olarak hücre fonksiyonunu bozar. Hücreye giren Ca ++ mitokondrideki elektron transportunu da etkileyerek serbest radikalleri açığa çıkarır. Serbest radikaller ile diğer vazojenik ve inflamatuvar maddeler kan akımını azaltarak hasarın ilerlemesine neden olur. 10
2.2.3.1.4.1. Eksitotoksisite Spinal kord yaralanmasıyla oluşan iskemi, eksitator aminoasitlerden (EAA) olan glutamat ve aspartatın artarak eksitotoksisite mekanizmasının aktive olmasına neden olur. Her iki aminoasit de spinsl kord ve beyinde düzensiz dağılım gösterirler. Glutamat spinal kordda özellikle arka köklerde yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Glutamatın duyusal iletimin sağlanmasında, ayrıca motor aktivite ve spinal reflekslerin düzenlenmesinde rol aldığı düşünülmektedir. Aspartatın da spinal kordda eksitator ara nöronlarda iletici olması, motor ve spinal reflekslerin düzenlenmesinde rol alması olasıdır 31. İskemi, adenozin 5- fosfat azalmasına neden olarak, hücre homeostazını sağlayan Na-K pompası benzeri enerji bağımlı mekanizmaların çalışmalarını engeller. Ekstraselüler ve intraselüler alanlardaki iyonik kompozisyon değişiklikleri, membran polarizasyonunu değiştirerek, sinaptik keselerden EAA ların salınmasına neden olur. EAA salınımı, nöron ve glial hücrelerin enerji bağımlı olan geri alım mekanizmasının da çalışmaması nedeniyle dengelenemez 31. Yapılan çalışmalar EAA in neden olduğu geç doku hasarında glutamat reseptörlerinin önemini vurgulamışlardır 32. Son yıllarda glutamat reseptörleri iyonotropik ve metabotropik olarak iki ana grupta toplanmaktadır. İyonotropik reseptörler farmakolojik özelliklerine göre, N-metil-daspartat (NMDA), amino 3-hidroksi 5-metil 4-izoksazola-propionik asit (AMPA) ve kainat reseptörleri olarak gruplara ayrılırlar. Metabotropik reseptörler ise guanozin 5- trifosfat-bağlayıcı proteinlerini ya da siklik nukleotid benzeri intraselüler sekonder mesajcılar bağlantısıyla transmembran proteinlerini etkileyen reseptörler olarak ayrılmaktadırlar. Kafa travmasında en güçlü eksitotoksik etki NMDA reseptörleri vasıtasıyla olurken, travmatik spinal kord yaralanmasında AMPA ve non-nmda reseptörleri üzerinden olmaktadır 33. AMPA reseptörlerinin aktive olması ağırlıklı olarak sodyumun ve eşlik eden kalsiyumun hücre içine girişine neden olur. AMPA reseptörlerinin aktivasyonu elektrofizyolojik olarak, NMDA reseptörlerinin de aktivasyonunu sağlar. NMDA reseptörlerinin aktivasyonu hücre içi kalsiyum birikimi ile sonuçlanır. Glutamat eş zamanlı olarak metabotropik reseptörleri de etkileyerek, inozitol fosfolipidlerin metabolize olmasına sebep olur. Ayrıca hücre içi kalsiyum depolarının serbest kalmasına ve hücre duvarı, mitokondri ya da endoplazmik retikulum da bulunan kalsiyum pompalarının inaktivasyonuna da sebep olarak daha sonra 11
glutamat düzeyleri normale dönse bile, hücre içi kalsiyum miktarı irreversibl olarak yükselir. Böylece hücre içi kalsiyum artışı, kalsiyum bağımlı-proteaz ve lipazların aktive olması ve hücre iskeletinin yıkımına ve hücre membranının bozulmasına neden olur 34,32,28. 2.2.3.1.4.2. Araşidonik Asit ve Metabolizması Travmanın direkt etkisi ile ya da kalsiyumun anormal hareketi, membran fosfolipidlerinden, fosfolipaz aktivitesi ile araşidonik asit salınımını artırmakta, o da siklooksijenaz tarafından hızla metabolize edilerek, prostanoidler ve prostasiklin haline dönüştürülmektedir. Prostaglandin A 2 güçlü bir vazokonstriktör maddedir. Tromboksan benzeri prostanoidler, trombositlerin endotele yapışmasını arttırırken, intravasküler trombosit agregasyonuna, mikrovasküler tromboembolilere ve vazokonstriksiyona neden olur. Prostasiklin ise tam tersi etki göstermektedir. Ancak yapımı siklooksigenaz yolunun ürünlerinden olan serbest radikaller tarafından selektif olarak engellenmektedir. Bu yüzden ortamda vazospazm ve iskemi daha da ilerleyebilmektedir 35,36. 2.2.3.1.4.3. Serbest Oksijen Radikallerinin Oluşumu Serbest radikal, dış yörüngesinde tek sayıda, yani serbest elektron bulunan atom ya da molekül anlamına gelmektedir 35. Bu tek elektron, çiftlenme eğiliminde olduğu için ileri derecede reaktiftir ve canlı hücrede bulunan tüm moleküllerle reaksiyona girebilir. İnsan vücudunda pekçok serbest radikalin varlığı gösterilmekle birlikte, en yaygın olanı oksijen kaynaklı serbest radikallerdir. Günümüzde, serbest oksijen radikalleri (SOR) yerine daha kapsamlı olarak, reaktif oksijen türevleri (ROT) tanımı kullanılmaktadır. Serbest radikaller protein yapılarla, nükleik asitler ve DNA yla, hücrenin enerji kaynağı olan karbonhidratlarla reaksiyona girerek, orijinal yapıyı bozarlar. Poliansatüre membran lipidlerinin serbest radikallerle peroksidayonu iskemik nöronal hasarın gelişmesinde önemli bir mekanizmadır. Sonuç fonksiyonu kaybolmuş ve antijenitesi değişmiş hücre membranı ve hücre yapısındaki yıkımdır. İskeminin ve reperfüzyonun serbest radikal oluşumundaki rolleri tam olarak açığa kavuşturulmamakla birlikte, iskemi sırasında artan hücre içi Ca +2 un fosfolipaz- A 2 12
enzimini aktive ettiği ve karboksigenaz ve lipogenazların etkisiyle prostaglandinler ve lökotrienler oluşurken ortaya çıkan SOR nin oluşumunda major rol oynadıkları düşünülmektedir. İskeminin neden olduğu hasarın önemli bir kısmının reperfüzyon sırasında, post-iskemik dönemde olduğu düşünülmektedir. Esas hasarın, hipoksi döneminde değil dokunun tekrar moleküler oksijenle karşılaştığı dönemde olduğu kabul edilmektedir 36,28. Reperfüzyona, doku ph sının azalmasına neden olan laktat benzeri asit metabolitlerin neden olduğu öne sürülmüştür 36. Reperfüzyonda yüksek miktarda ROT üretilir. Düşük oksijen basıncında meydana gelen ROT lara bağlı reaksiyonlar, hipokside daha da tehlikeli olur. İskemik dokunun reperfüzyonu sırasında gerçekleşen reoksijenasyon bir yandan nöronal canlılığın devamını sağlarken diğer yandan da reaktif oksidanların oluşumuna yol açan sayısız enzimatik oksidasyon reaksiyonu için substrat olarak gerekli olan oksijeni ortama getirmektedir. Oksijenin indirgenmesini izleyen dönemde süperoksid (O - 2 ), hidroperoksil (HO - 2 ), hidrojen peroksid (H 2 O 2 ) ve hidroksil radikali (. OH) nin dahil olduğu birçok reaktif oksijen türü oluşmaya başlar [Reaksiyon 1,2,3,4,5]. O 2 + e - O - 2 [Reaksiyon 1] O - 2 + H + HO - 2 [Reaksiyon 2] O - 2 + O - 2 +2H H 2 O 2 [Reaksiyon 3] 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 [Reaksiyon 4] O - 2 + H 2 O. 2 OH+OH - + O 2 [Reaksiyon 5] Üç numaralı reaksiyon superoksid dismutaz (SOD) enzimi tarafından fizyolojik ph da 2X10 9 L mol -1 hız sabitesi ile katalizlenir. Reaksiyon sonunda oluşan H 2 O 2, memeli hücrelerinde katalaz ve glutatyon peroksidaz (GSHPx) tarafından glutatyon redüksiyonu ile su ve moleküler oksijene detoksifiye edilir [Reaksiyon 4]. Okside glutatyon da nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) varlığında glutatyon redüktaz (GR) ile redükte glutatyona dönüştürülür. Hidroksil radikalleri son derece aktif oksidanlardır. Bu radikaller hücrede lipid peroksidasyonu, protein oksidasyonu ve DNA hasarını başlatırlar. Superoksid radikalleri daha az reaktif olmakla birlikte yarı ömürleri daha uzundur ve Haber-Weiss reaksiyonu aracılığı ile hidroksil radikallerini oluştururlar [Reaksiyon 5]. Bu reaksiyon Fe 2+, Cu 2+ gibi iz metal iyonları varlığında daha hızlı - ilerlemektedir (Fenton reaksiyonu).hidroksil radikali oluşumu için bir diğer yol ise O 2 in beyindeki nöronal endotelial ve glial nitrik oksid sentaz (NOS) aracılığı ile sürekli 13
oluşan ve bir gaz radikal olan nitrik oksid (NO. ) ile girdiği reaksiyondur. Bu reaksiyon ürünü peroksinitrittir (ONOO - ) [Reaksiyon 6] O - 2 + NO. ONOO - [Reaksiyon 6] ONOO - +H + ONOOH [Reaksiyon 7] ONOOH. OH +NO 2 [Reaksiyon 8] Son derece hızlı gerçekleşen bu reaksiyonda ONOO - oluşum hızı 6.7X10 9 L. mol 1. s -1 olup diffuzyon sınırlıdır 37. Fizyolojik ph da ONOO - derhal. OH ve nitrojen diokside (NO 2.) parçalanır [Reaksiyon 7,8]. Çok güçlü bir prooksidan olan ONOO -, SOD ile reaksiyona girerek güçlü bir nitratlayıcı ajan oluşturur. Sonuçta hücresel proteinlerin tirozin kalıntılarının nitratlanması hücresel disfonksiyon ve ölüme yol açabilir. ONOO - in iskemik beyin hasarındaki rolü son beş yıl içinde araştırılmaya başlanmıştır. Diğer yandan NO. in hem serebral kan akımını artırıcı vazodilatatör rolü, hem de nöronal hasar yapıcı serbest radikal özelliği nedeniyle, iskemik nöron hasarındaki yeri konusunda çelişkili görüşler bulunmaktadır 38. NO in nöronal koruyucu şeklinde mi yoksa N-metil-D-aspartat reseptör aktivasyonu ardından hasar verici mediatör olarak mı rol oynayacağının radikalin redoks durumu tarafından belirleneceği öne sürülmektedir. Ayrıca PC 12 hücre dizeleri ile yapılan çalışmalarda Cu Zn-SOD aktivitelerindeki azalmanın NO. -ONOO - yolu aracılığı ile apopitotik hücre ölümüne neden olduğu ortaya konmuştur 39. Morfolojik çalışmalar korteksin 3. ve 5. tabakalarında bulunan piramidal nöronların ve hipokampusta Ammon boynuzunun CA1 bölgesinde bulunan nöronların iskemi- reperfüzyon hasarından en fazla etkilenen bölgeler olduğunu ortaya koymaktadır. Reperfüzyonun ilk 15 dakikasında nöronlarda morfolojik olarak gözlenen hasar mikrovakuolizasyondur. Sonraki altı saat içinde hasar ilerler ve 48 72 saat sonra nöron parçalanması görülür. 2.2.3.1.4.4. Lipid Peroksidasyonu Plazma membranındaki doymamış yağ asitleri, fosfolipidler, glikolipidler, gliserid ve steroller, okside olabilen aminoasit içeren transmembran proteinleri, glukoz, mannitol ve deoksi-şekerler serbest radikal hasarına çok duyarlıdır. Reaksiyonlar içinde en önemlisi hidroksil radikalinin ( OH) membran lipidleriyle reaksiyona girerek lipid peroksidasyonunu başlatmasıdır. Lipid peroksidasyon, poliansatüre lipidlerin oksidatif 14
yıkımıdır 40. Bu yıkım, genişleyen bir zincir reaksiyonu şeklinde ilerler. Plazma membranı ve hücre içi organellerde lipid peroksidasyon hemen tüm serbest radikal kaynakları tarafından stimüle edilebilir ve ortamdaki Fe ve Cu gibi transizyonel metallerin varlığında potansiyalize edilebilir. Bu reaksiyon tüm yeni oluşmuş kimyasal serbest radikaller tükeninceye kadar devam eder. Hücre membranındaki doymamış yağ asitlerinin kaybı, lipid peroksit oluşumu, lipid preparasyonlar tarafından oksijen tüketimi peroksidasyonu gösterir. Membran yağ asitlerinin peroksidasyonundan sonra oluşan kısa zincirli yağ asitleri, membran permeabilitesini ve viskozitesini önemli ölçüde etkiler 40. Reperfüzyon hasarının en önemli nedeni, artan serbest radikallerin nörönal hücre, plazma ve organel membranları, vasküler endotel hücre membranı ve myelinde başlattıkları lipid peroksidasyonudur. Radikal aracılı bir zincir reaksiyon mekanizması şeklinde gelişen lipid peroksidasyonu sırasında, doymamış yağ asidlerinin yan zincirlerinde yeniden düzenlenme söz konusudur 41. Lipid peroksidasyonu üç aşamada gerçekleşmektedir. Başlangıç basamağı (initiation) İlerleme basamağı (propagation) Sonlanma basamağı (termination) Başlangıç basamağı: Hız kısıtlayıcı olup yeterli reaktivitedeki oksijen kaynaklı bir radikalin bir metilen (-CH 2 -) grubundaki divinil (allilik) hidrojen atomunu koparması ile gerçekleşmektedir. Yağ asidinde çift bağ varlığı C-H bağını zayıflatarak H + atomunun kopartılmasını kolaylaştırmaktadır. Bu nedenle membran lipidlerinin doymamış yağ asidleri yan zincirleri, peroksidasyona özellikle duyarlıdırlar. İlk hidrojen atomunu kopartacak reaktivitedeki radikaller, hidroksil (. OH), alkoksil (RO. ), peroksil (ROO. ) ve hidroperoksil (HO. 2) radikalleri olup, süperoksid anyonu ve hidrojen peroksid bu reaksiyonu başlatamamaktadır 42. Hidrojen atomu tek bir elektron içerdiği için, başlangıç reaksiyonu sonunda geride karbon üzerinde eşlenmemiş bir elektron kalmaktadır (-. CH-). Daha önce başlangıç reaksiyonu kavramı daha ileri basamakları kapsamaktaysa da, son görüşler bu aşamanın sadece hidrojen atomunun koparılması reaksiyonu olduğunu kabul etmektedir 43. 15
İlerleme basamağı: Karbon merkezli radikal, moleküler bir düzenleme ile izole çift bağ formundan, konjuge dien formuna geçer. Oluşan lipid alkil radikali oksijen ile reaksiyona girerek lipid peroksil radikalini oluşturur. Lipid peroksil radikali ise, bir başka yağ asidinden hidrojen atomunu kopararak lipid hidroperoksidi ve yeni bir lipid alkil radikalini oluşturarak yeni bir zincir reaksiyonu başlatabilmektedir. Lipid hidroperoksidleri, fizyolojik koşullarda nispeten kararlı moleküller olmakla birlikte, geçiş metalleri veya metal komplekslerinin katalizörlüğünde parçalanabilmektedirler. Beyin, ferrik demir (Fe 3+ ) açısından zengin bir organdır. Bu demirin büyük bir kısmı hemoglobin, myoglobin, aktif bölgesinde demir içeren enzimlerde veya ferritin gibi depo proteinleri ile transferrin gibi transport proteinlerine bağlı olarak bulunmaktadır. Bu şekli ile demir katalizör görevini yapamaz. Serbest demirin en önemli kaynağı ferritindir. NADH ve O - 2, ferritindeki ferrik demirin indirgenmesini ve ferröz demir (Fe 2+ ) olarak salınmasını kolaylaştırmaktadır [Reaksiyon 9]. NADH + Fe 3+ + Ferritin NAD + + Fe 2+ + Ferritin [Reaksiyon 9] İndirgenmiş metal iyonları (Fe 2+ ve Cu + ) lipid hidroperoksidi ile reaksiyona girerek alkoksil radikalini (LO. ), okside metal iyonları ise (Fe 3+ ve Cu 2+ ) daha yavaş bir reaksiyonla alkoksil ve peroksil (LOO. ) radikallerini oluşturmaktadır [Reaksiyon 10]. LOOH + M n+ LO. + M (n+1)+ + OH [Reaksiyon 10] Her iki radikal de başka yağ asidlerinden hidrojen atomu kopartarak lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonunu sürdürürler 42. Sonlanma basamağı: Lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonları, iki lipid peroksid radikali etkileşinceye (annihilasyon) kadar sürmekte ve siklik peroksid (LOOL) oluşumu ile sonlanmaktadır [Reaksiyon 11] LO. 2 + LO. 2 LOOL + O 2 [Reaksiyon 11] Lipid peroksidasyonu sırasında, karbon bağlarının kopması ile aldehid yapısında yıkılım ürünleri ortaya çıkmaktadır. Bu sitotoksik metabolitler, malondialdehid (MDA) gibi alkaneller, 4 hidroksinonenal gibi hidroksialkenallerdir. Malondialdehid sınıfından olan tiyobarbitürik asid ile reaksiyon veren maddeler (TBARS), iskemi reperfüzyon olayında lipid peroksiasyonunun en duyarlı göstergelerindendir 42. İskemide başlayan lipolizin, reperfüzyon süresince de devam ettiğine dair kanıtlar bulunmaktadır. Bu nedenle reperfüzyonda, enzimatik lipoliz ve lipid peroksidasyonu, membran hasarında 16
sinerjizm içinde sürmektedir. Perokside olmuş yağ asidleri, lipolizi gerçekleştiren fosfolipazlar için doğal yağ asidlerine oranla daha iyi substratlardır. Ayrıca lipid peroksidasyon ürünleri de fosfolipaz aktivitesini stimüle etmektedirler 41. Lipid peroksidasyonu, ortamda doymamış yağ asidleri, oksijen ve metal katalizörler (Fe 2+, Cu + ) bulunduğu sürece logaritmik olarak artarken yeni serbest radikallerin oluşumuna neden olmaktadır. Bu nedenle reperfüzyon dönemi, lipid peroksidasyonu için gerekli koşulları sağlaması bakımından çok uygundur. Lipid radikalleri veya MDA gibi peroksidasyon ürünleri aracılığı ile lipid peroksidasyonu, biyolojik membranlarda yaygın hale geldiği zaman hücresel yapı ve fonksiyon hasarları ortaya çıkmaktadır. Lipid peroksidasyonu sonucu ortaya çıkan ve fonksiyonel hasara neden olan temel yapısal değişiklik; membran yağ asidlerinin interior alkil zincirlerine hidrofilik bir grubun girmesi ve yağ asidlerinin aköz faza doğru dönmeleridir. Bunun sonucunda oluşan fonksiyonel hasarlar şunlardır: Yapısal hasarın derecesine göre, plazma membranında akışkanlığın azalması, membran geçirgenliğinin değişmesi, membran potansiyeli azalması, membrana bağlı enzimlerde (Örn: Na + -K + ATPaz) aktivite azalması. Lizozomal ve mitokondrial membranları ilgilendiren ileri derecede lipid peroksidasyonu ile organel içeriğinin (mitokondrial matriks enzimleri, lizozomal enzimler gibi) hücre içine salınması. Normal koşullarda lizozomlar içinde güvenli bir şekilde tutulan lizozomal proteolitik enzimlerin sitoplâzmaya salınmaları ile hücre içi proteolizin hızlanması ve doku hasarının şiddetlenmesi 37. Membran geçirgenliğinin bozulması ile protein sentezi için çok önemli olan K + ve Mg 2+ konsantrasyonlarının değişmesi ve buna bağlı olarak protein sentezinin inhibisyonu. Lipid peroksidasyonunun yıkılım ürünü olan malondialdehidin, proteinlerin amino grupları ile şift bazı oluşturması ve tiyol grupları ile etkileşim. Bu şekilde oluşturduğu protein fragmantasyonu ve polimerizasyonunun yanısıra MDA nın mutajenik etkisi de gösterilmiştir 43. 2.2.3.1.4.5. Lipid Karboksilasyonu Reperfüzyonda ortaya çıkan serbest radikallerin etkisi ile oluşan lipid radikali, dokuda artmış bulunan karbondioksid ile reaksiyona girerek lipid karboksil radikalini 17
oluşturmaktadır. Karboksil radikali, lipid peroksidasyonu kadar yaygın olmasa da membran hasarına katkıda bulunmaktadır [Reaksiyon 12, 13, 14] 42. L. + CO 2 LCOO. [Reaksiyon 13] HO. + LH HOH + L. [Reaksiyon 12] LCOO. + HOH LCOOH + HO. [Reaksiyon 14] 2.2.3.1.4.6. Protein Oksidasyonu Hücrenin protein yapıları, serbest radikallerin, özellikle duyarlı amino asidler ile direkt etkileşimi sonucunda hasara uğramaktadır. Protein fonksiyonu için kritik pozisyonda olan amino asidler (Örn: enzimin aktif bölgesindeki amino asidler), özellikle radikal hasarına duyarlıdırlar. Metionin, sistein gibi terminal sülfidril (-SH) grubu bulunduran amino asidler ile triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin gibi aromatik amino asidler, oksidasyona en fazla maruz kalmaktadırlar. Oksidasyon sonucu proteinlerin sekonder ve tersiyer yapılarında oluşan değişiklikler fonksiyonlarını etkilemektedir 43. Enzim veya reseptör fonksiyonuna sahip membran proteinleri, özellikle serbest radikallerin modifikasyonlarına duyarlı oldukları için protein oksidasyonu ile önemli hücresel ve membran fonksiyonları bozulmaktadır. Protein yapılarındaki hasarın gösterilmesi için, protein karbonillerinin belirlenmesi yaygın olarak kullanılan bir göstergedir. Son yıllarda protein bağlı okside amino asitlerin; özelikle aromatik ve sülfidril içeren kalıntıların analizi yapılmaktadır 44. Bunun yanısıra iskemi-reperfüzyon sürecinde hücre içi enzimlerden olan antioksidan enzimlerin oksidasyonları da bu enzimlerin aktivitelerindeki azalmanın nedenlerinden birini oluşturabilmektedir 45,46,47. 2.2.3.1.4.7. Spinal Kord Hasarı Sonrası Gen Ekspresyonundaki Değişiklikler Son yıllarda yapılan çalışmalarda spinal kord hasarı sonrası meydana gelen gen ekspresyonundaki değişiklikliler ve bunların etkileri üzerinde ayrıntılı olarak durulmaktadır 48. Toshibana ve ark. spinal kord hasarını takiben meydana gelen gen ekspresyonunu deneysel tamamlayıcı modellerde DNA mikroarray tekniği ile çalışmışlar ve 3 genin arttığını (heat shock,27kda protein, metalloproteinaz 1 doku 18
inhibitörü, yağ asit-binding protein) ve 7 genin %50 den fazla azaldığını (lesitin kolesterol açil transferaz,dipeptilaminopeptidaz ile ilgili protein, fosfolipaz C delta4, plazma membran Ca+2-ATP az isoform 2, G-protein G(0)alfa subunit,gabatransporter- 3 ve nöroendokrin protein7b2) göstermişlerdir. Gen ekspresyonundaki tüm bu değişiklikler revers transkripsiyon polimeraz chain reaksiyon (rpcr) ile doğrulanmıştır. Bu gen ekspresyonundaki değişikliklerin akut spinal kord hasarında görülen yıkım ve tamir sürecinde kritik rol oynadıkları düşünülmüştür. Bu çalışma akut SCI yi takiben meydana gelen gen ekspresyonunu açıklamada çok önemli bir basamak olmuştur 48. Nesic ve ark. spinal kord hasarını takiben meydana gelen gen ekspresyonundaki değişiklikleri kontüzyonel hasar modeli kullanarak çalışmışlardır. Akut spinal kord hasarının patofizyolojisindeki en erken ve önemli olay olan ekstrasellüler Ca+2 konsantrasyonu ile ilişkili olarak NMDA reseptör inhibisyonunun gen ekspresyonundaki etkileri araştırılmış ve NMDA reseptör antagonisti MK801 in ekspresyonda kontrol grubu ile kıyaslandığında %50 ye varan azalma olduğunu tespit etmişlerdir 48. Fehling ve ark. Kv 1,4 protein gen ekspresyonundaki artışın hasarı takiben altı hafta sonra anlamlı düzeye ulaşmasının oligodendrosit proliferasyonu için iyi bir işaret olduğunu saptamışlardır. Ayrıca Fehling ve Nashmi spinal kord hasarı sonrası voltaj kapılı potasyum kanallarının aksonal disfonksiyondaki önemini göstermişler ve tedavide hedef rolü üzerinde durmuşlardır 48. De Winter ve ark. SCI hasarının nöral skardaki fibroblastlarda Class 3semoforin ekspresyonunu tetiklediğini gösterdiler 48. Klimaschwski ve ark. SCI yi takiben clusterin regulasyonu ve lokalizasyonu üzerinde yaptıkları çalışmada; clusterin ekspresyonunun travmayı takiben 2 gün sonra lezyone segmentin içinde glial fibriler asidik protein (GFAP) pozitif astrositlerde arttığını ve bunu takiben komşu nöronlarda skar dokusundaki glial elemanlarda yükseldiğini gösterdiler. Bununla bağlantılı olarak bu bulguların, clusterin ekspresyonunun SCI sonrası subakut ve geç fazda olduğunu ortaya koydu. Trenz ve ark.id genlerinin spinal kord hasarı sonrası astrositler,oligodendrositler ve nöral progenitor subpopülasyonunda zamana bağımlı artışının hücresel cevaptaki önemli rolü üzerinde durdular. Ayrıca İkeda ve Ark. deneysel spinal kord hasarı sonrası brainderiveted neuorotropik factor ekspresyonu saptadılar ve bunun SCI sonrası erken cevapta nöroprotektif faktör olarak nöron ve astrositlerde sentezlendiğini, geç fazda ise makrofaj-mikrogliada eksprese edilerek nörorestorasyonda rol aldığını tespit 19
ettiler. Gen ekspresyonu hakkında artan modern bilgiler, spinal kord hasarı tedavisinde gen tabanlı hedeflerin teröpotik kullanımı konusunda önemini sürdürmektedir 48. 2.2.3.1.4.8. Nötrofil Kaynaklı Hücre Hasarı İskemik dokuda, serbest radikaller de dahil olmak üzere diğer bazı kemoatraktanların etkisi ile göç eden nötrofiller, aşağıdaki mekanizmalar ile reperfüzyonda doku hasarının ilerlemesine yol açmaktadırlar. Salgıladıkları proteazlar (elastaz, jeletinaz vb.) ile endotel hücre parçalanmasına neden olurlar. Reperfüzyon döneminin en önemli mikrovasküler patolojisi olan kan akışının geri dönmemesi fenomenine (no reflow phenomen), aktive olmuş nötrofillerin yol açtığı ve nötrofillerin kapillerlerdeki agregasyonları ile kan akımının geri dönmesine engel olan kapiller tıkaçları oluşturduğu bildirilmiştir 33. Salgıladıkları vazokonstrüktör ajanlar ve trombosit aktive edici faktör (PAF) ile daha büyük damarlarda da (arteriyol, prekapiller damarlar) daralmaya neden olmaktadırlar. Bir araşidonik asid metaboliti olan LTB4 salgılayarak, süperoksid anyon radikali üretimine ve nötrofillerin kemotaksisine neden olmaktadırlar. Böylece bir geri beslenme mekanizması ile toplanmış olan nötrofillerden salgılanan kemotaktik faktörler yeniden serbest radikal üretimine ve nötrofil infiltrasyonuna neden olmaktadır 9. Hartmann ve arkadaşları nötrofillerce üretilen süperoksid anyon radikalininin, eritrositlerin agregasyonunu da hızlandırdığını ve bu etkinin nötrofil agregasyonu ile birlikte kapiller tıkanmayı daha arttırıcı olabileceğini savunmuşlardır 49. 20
Sıçanlarda Spinal Kord Yaralanması Şekil 3. Endotel lökosit adezyon molekülleri yoluyla endotel hücreleri ile nötrofillerin etkileşimi 3. 2.2.3.1.4.9. Sitokinler Sitokinlerin hücreler arasında sinyal ileten, peptid veya glikoprotein yapısında, molekül ağırlıkları 20-30 kda arasında değişen, çözünebilir biyolojik mediyatörlerdir. Makrofajlar, monositler, lenfositler, fibroblastlar, endotelyal hücreler, tümöral hücre klonları gibi çok çeşitli hücre grupları tarafından sentezlenerek, immun ve inflamatuar olaylara katılan hücrelerin etkinliklerini arttırırlar. Lenfositler tarafından sentezlenen sitokinlere lenfokinler, monosit ve makrofajlardan sentezlenenlere ise monokinler denilmektedir. Keşfedilen ilk sitokin interferondur(ifn).daha sonra Oppenheim ın çalışmaları ile 1975 ten itibaren sitokinler ile ilgili bilgiler hızla artmıştır. Ancak terminoloji halen biraz karışık ve tartışmalıdır 50. Örneğin, interlökin terimi immun hücreler tarafından oluşturulan ve lökositler arası iletişimi sağlayan maddeler için kullanılmakla birlikte, çok sayıda interlökin nonhemapoetik hücreler tarafından salgılanmakta ve somatik hücrelerin aktivitesini düzenlemektedir. TNF alfa ve TNF beta gibi bazı sitotoksik proteinlerle de ortak özellik göstermektedirler. Çok önemli bir grup mediatörü temsil eden ve başlıca lökositler arasında etkileşim yapan interlökinler, TNF-α ve hematopoetik büyüme faktörleri topluca sitokin adı altında toplanmışlardır. Sitokinlerin çoğu multifonksiyoneldir. Bir kısmı birbiri ile benzer aktivite gösterir(tnf- 21