SIÇANLARDA DENEYSEL SİYATİK SİNİR ANASTOMOZU ÜZERİNE PİNEALEKTOMİ VE MELATONİN ETKİSİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ PROJE NO: SBAG-2323 (100S075)

1 SIÇANLARDA DENEYSEL SİYATİK SİNİR ANASTOMOZU ÜZERİNE PİNEALEKTOMİ VE MELATONİN ETKİSİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ PROJE NO: SBAG-2323 (100S075) Yrd. Doç. Dr. MEHMET TURGUT Doç. Dr. AYŞEGÜL UYSAL Yrd. Doç. Dr. MURAT PEHLİVAN Uzm. Dr. GÜLPERİ ÖKTEM Prof. Dr. MİNE YURTSEVEN EYLÜL 2002 İZMİR

2 ÖNSÖZ Bu araştırma projesi, sıçanlarda deneysel siyatik sinir anastomozu üzerine cerrahi pinealektomi işlemi ve eksojen melatonin etkisinin elektrofizyolojik ve morfolojik olarak değerlendirildiği deneysel bir çalışmadır. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Cerrahi ve Araştırma Laboratuvarı, Biyofizik Anabilim Dalı Laboratuvarı ile Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Elektron Mikroskobi ve İmmünohistokimya Laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Bu araştırma projesi, Türkiye Bilimsel ve Teknik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) tarafından desteklenmiştir [SBAG-2323 (100S075)].

3 İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ...2 İÇİNDEKİLER...3 TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ...5 TABLOLAR...5 ŞEKİLLER...5 ÖZ (ABSTRACT)...8 ÖZ...8 ABSTRACT...10 GİRİŞ...12 GENEL BİLGİLER... 14 PERİFERİK SİNİR MORFOLOJİSİ...14 AKSON DEJENERASYONU...17 AKSON REJENERASYONU...20 UÇ-UCA SİNİR ANASTOMOZU...21 NÖRAL FİBROZİS...22 NÖROMA OLUŞUMU...23 PERİFERİK SİNİRDE İLETİ...24 KOLLAJEN...25 BÜYÜME FAKTÖRLERİ...26 MELATONİN...31 GEREÇ VE YÖNTEM...33

4 DENEY GRUPLARI...33 CERRAHİ İŞLEMLER...34 İLAÇ UYGULAMASI...35 ELEKTROFİZYOLOJİK İNCELEME...36 MORFOLOJİK İNCELEME...40 İmmünohistokimyasal İnceleme...41 Elektron Mikroskobik İnceleme...43 İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME...45 BULGULAR...46 ELEKTROFİZYOLOJİK BULGULAR...46 MORFOLOJİK BULGULAR...49 Makroskobik Bulgular...49 İmmünohistokimyasal Bulgular....51 Elektron Mikroskobik Bulgular...62 TARTIŞMA...70 SONUÇ...77 KAYNAKLAR...79 EKLER...90 PROJE ÖZET BİLGİ FORMU

5 ŞEKİL VE TABLO LİSTESİ TABLOLAR Tablo 1. Sinir liflerinin iletim hızı ve kalınlıklarına göre sınıflandırılması. Tablo 2. Minimal yanıt ve maksimal yanıt için gerekli olan uyaran şiddetinin gruplara göre dağılımı. Tablo 3. Endoneurium, perineurium, epineurium ve damar çevresinde tip I kollajen immünoreaktivite dereceleri. Tablo 4. Endoneurium, perineurium, epineurium ve damar çevresinde tip III kollajen immünoreaktivite dereceleri. Tablo 5. Endoneurium, perineurium, epineurium ve damar çevresinde TGF-β1 immünoreaktivite dereceleri. Tablo 6. Endoneurium, perineurium, epineurium ve damar çevresinde bfgf immünoreaktivite dereceleri. Tablo 7. Tip I ve tip III kollajen ile TGF-β1 ve bfgf immünohistokimyasal analiz sonuçları. Tablo 8. Elektron mikroskobik kesitler üzerinde kollajen akümülasyonundaki değişikliklerin değerlendirildiği morfometrik analiz sonuçları. ŞEKİLLER Şekil 1. Miyelinli ve miyelinsiz bir periferik sinir yapısı görülmektedir: 1, epineurium; 2, perineurium; 3, endoneurium; 4, Schwann hücresi; 5, Ranvier düğümü; 6, miyelin kılıfı; 7, miyelinli akson; 8, miyelinsiz akson; 9, Schwann hücresi sitoplazması (Snell RS [85] dan alınmıştır). Şekil 2. Bir periferik sinirin yapısı: 1, akson; 2, perineurium; 3, arter; 4, epineurium; 5, endoneurium ve akson; 6, fasikül; 7, periferik sinir (Stevens & Lowe [90] dan alınmıştır). Şekil 3. Tek bir Schwann hücresinin sitoplazmik katlantıları içinde yer alan ve birbirleriyle direkt ilişkisi olmayan miyelinsiz sinir lifleri: 1, miyelinsiz akson; 2, nukleus; 3, Schwann hücresi (Stevens & Lowe [90] dan alınmıştır). Şekil 4. Periferik sinir seksiyonu sonrası gelişen dejenerasyon olayı şematize edilmiştir: 1, akson; 2, Schwann hücresi; 3, miyelin; 4, endoneurium; 5, parçalanmış akson; 6, miyelin damlacıkları; 7, lezyon bölgesi; 8, makrofaj (Snell RS [85] dan değiştirilerek alınmıştır). Şekil 5. Aksonal uzantısı kesintiye uğrayan bir sinir hücresi cisminde oluşan değişiklikler (Snell RS [85] dan değiştirilerek alınmıştır). Şekil 6. Periferik sinir seksiyonu (nörotomi) sonrası rejenerasyon gelişmesi şematize edilmiştir: 1, çok sayıda aksonal filament; 2, bant lifleri; 3, tek bir aksonal filament; 4, Schwann hücresi; 5, yeni miyelin kılıfı (Snell RS [85] dan değiştirilerek alınmıştır). Şekil 7. Normal koşullarda çok sayıda akson tek bir Schwann hücresi sitoplazması içinde birbirlerinden ayrılmış durumda iken, nöromada aksonlar birbirlerinden izole edilmemiş bir durumdadır: 1, Schwann hücresi; 2, Schwann hücresi sitoplazması; 3, akson; 4, nukleus (Sunderland S [93] dan alınmıştır).

6 Şekil 8. Elektrofizyolojik sinir aksiyon potansiyeli kayıt düzeneğinin blok diyagramı. Şekil 9. Ortamın fizyolojik serum ile ıslatılmasına bağlı olarak direncin değişmesinin etkileri. Aynı ölçüm sırasında aynı sinirden iki farklı trase elde edilmiş olduğuna dikkat ediniz. Şekil 10. Yüz mikrosaniye genişlikteki stimülasyon voltajına siyatik sinirden yanıt olarak alınan alınan aksiyon potansiyeli örneği. Şekil 11. Px cerrahi işlemi uygulanmış olan Grup IIb de yer alan bir sıçan siyatik sinirinden elde edilen kayıt örneği. Şekil 12. Sham-kontrol grubunda (Grup IIa) yer alan bir sıçan siyatik sinirinden elde edilen kayıt örneği. Şekil 13. Px + MLT grubuna (Grup IIe) ait bir sıçandan alınmış bir kayıt örneği. Şekil 14. Px grubunda (Grup IIc) yer alan bir sıçana ait kayıtta farklı stimülatör kademelerinde birbirinden ayrılarak gruplaşmış yanıtlar. Şekil 15. Kontrol grubunda (Grup Ia) yer alan bir denekte sinir anastomoz işleminden iki ay sonra sütür hattının normal görünümde olduğuna dikkat ediniz. Şekil 16. Anastomoz işleminden iki ay sonraki reeksplorasyonda Px grubundaki (Grup IIb) bir sıçanda sütür hattı bölgesinde bulböz bir genişleme ile karekterize nöroma örneği. Şekil 17. Normal kontrol grubuna ait (Grup Ia) siyatik sinir immünohistokimyasal boyamada tip I kollajen lokalizasyon alanlarının görünümü (ok), X 63. Şekil 18. MLT verilen Grup Ic ye ait siyatik sinir immünohistokimyasal boyamada endoneurium ve damar çevresinde tip I kollajen lokalizasyon alanları (ok), X 126. Şekil 19. Px işleminin uygulandığı Grup IIb ye ait siyatik sinir sütür anastomoz bölgesinde epineurium immünohistokimyasal boyamada tip I kollajen lokalizasyon alanları (ok), X 63. Şekil 20. Px+MLT uygulanan grupta (Grup IIe) siyatik sinir epineurium immünohistokimyasal boyamada tip I kollajen lokalizasyon alanları (ok), X 126. Şekil 21. Sham-kontrol grubunda (Grup IIa) siyatik sinir enine kesitinde epinöral alanlarda tip III kollajen immünohistokimya boyaması (ok), X 252. Şekil 22. Px işleminin uygulandığı Grup IIb ye ait siyatik sinir sütür anastomoz bölgesinde perinöral alanlarda tip III kollajen bağ dokusu içinde immünohistokimyasal boyaması (ok), X 126. Şekil 23. Normal kontrol grubunda (Grup Ia) siyatik sinir enine kesitinde epineuriumda kuvvetli reaksiyon veren TGF-β1 immünohistokimya boyaması (ok), X 252. Şekil 24. Px işlemi uygulanan Grup IIc ye ait siyatik sinir sütür anastomoz bölgesinde epineurium TGFβ1 immünohistokimyasal lokalizasyon alanları görülmekte (ok), X 63. Şekil 25. MLT verilen Grup Ic ye ait siyatik sinir immünohistokimyasal boyama sonucu epineurium, perineurium ve endoneuriumda TGF-β1 immunolokalizasyon alanları (ok), X 63. Şekil 26. Px işlemi sonrası MLT verilen grupta (Grup IIe) siyatik sinirde immünohistokimyasal boyama sonucu epineurium ve perineurium TGF-β1 lokalizasyon alanları (ok), X 63.

7 Şekil 27. Normal kontrol grubunda (Grup Ia) siyatik sinir enine kesitinde epinöral alanlarda bfgf immünohistokimya boyaması (ok), X 252. Şekil 28. Px işleminin uygulandığı Grup IIb ye ait siyatik sinir sütür anastomoz bölgesinde epineurium ve damar çevresi bfgf immünohistokimyasal lokalizasyon alanlarının görünümü (ok), X 126. Şekil 29. Px+MLT grubunda (Grup IIe) epinöral bfgf immunohistokimyasal boyaması (ok), X 126. Şekil 30. Kontrol grubu (Grup Ia) na ait sıçan siyatik sinirinin enine kesitinin elektron mikroskobik görünümü, X 1750. Schwann hücresi (S) ve miyelinsiz lifler (m), lameller bütünlüğü korunmuş değişik çapta miyelinli lifler (M), damar yapısı (d) ve endonöral kollajen (c). Şekil 31. MLT verilen Grup Ic ye ait siyatik sinir enine kesitinin elektron mikroskobik görünümü, X 1750. Değişik çapta miyelinli aksonlar (M), Schwann hücresi (S), miyelinsiz aksonlar (m) ve kollajen yapıları (c). Şekil 32. MLT verilen Grup Ic ye ait siyatik sinir enine kesitinin elektron mikroskobik görünümü, X 7200. Küçük çaplı miyelinli lifler (M) ve miyelinsiz lifler (m) ve endonöral kollajen (c). Şekil 33. Px işleminin uygulanmış olduğu Grup IIc ye ait bir siyatik sinir enine kesitinin elektron mikroskobik görünümü, X 1750. Büyük ve orta çaplı miyelinli aksonların miyelin lamellerinde ayrışma (Mx), lizis (*), aksoplazmaya doğru yer yer protrüzyon (p), aksoplazmada nörotübül ve nörofilament yapılarında artış (a), endonöral alanlarda kollajen akümülasyonu (c) ve ödem alanları (ö) mevcudiyetine dikkat ediniz. Şekil 34. Px işleminin uygulanmış olduğu Grup IIb ye ait siyatik sinir anastomoz bölgesinin enine kesitinde değişik çaplı miyelinli lifler (M), miyelin lamellerinde ayrışma ve lizis (*) ve ödem alanları (ö) görülmekte, X 1750. Şekil 35. Siyatik sinir anastomozu öncesi Px işleminin uygulanmış olduğu Grup IIb ye ait siyatik sinir sütür alanında miyelin lamellerinde ayrışma ve lizis (*), protrüzyon (p), endonöral kollajen (c) ve ödem alanları (ö) görülmekte, X 1750. Şekil 36. Siyatik sinir anastomozu öncesi Px uygulanmış olan Grup IIb ye ait siyatik sinir sütür alanında miyelin lamellerinde ayrışma ve lizis (x), endonöral kollajen lifleri (c) ve ödem (*) görülmekte, X 7200. Şekil 37. Px işlemi sonrası MLT tedavisi verilen Grup IIe ye ait siyatik sinir sütür alanından alınmış kesitte Schmidth-Lanterman aralığı (L), ödem alanları (ö) ve miyelin lamellerinde yer yer düzensizlik mevcudiyeti (Mx) görünümü, X 1750.

8 ÖZ (ABSTRACT) ÖZ Günümüzde, klinik pratikte nöroşirürjiyenler için önemli bir sorun olmaya devam eden periferik sinir kesisi sonrası gelişen nöroma oluşumunun engellenmesine yönelik yoğun bir çaba hala devam etmektedir. Diğer yandan, son yıllarda gerçekleştirilen bazı deneysel çalışmalarda cerrahi pinealektomi (Px) işleminin yara granülasyon dokusundaki kollajen içeriğinde artışa neden olduğu ve Px sonrası melatonin (MLT) verilmesinin ise pineal bezin çıkarılmasının neden olduğu aşırı kollajen yapımını inhibe ettiği ileri sürülmüştür. Bu deneysel çalışmada, periferik sinir cerrahisi sonrası nöroma oluşumu ve anastomoz bölgesindeki kollajen yapımı üzerine MLT hormonunun olası rolünün değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmamızda, toplam 80 adet erkek sıçan kullanılmış olup kontrol grupları (normal kontrol grubu, serum fizyolojik grubu, sham kontrol grubu ve sham kontrol+serum fizyolojik grubu), MLT grubu, Px grupları (Px grubu ve Px+serum fizyolojik grubu) ve Px sonrası MLT tedavisi uygulanan grup (Px+MLT grubu) lardan ibarettir. Tüm sıçanlarda cerrahi olarak bilateral siyatik sinir seksiyonu ve primer sütür anastomozu işlemi uygulanmıştır. Bu işlemden 2 ay sonra ise sinir aksiyon potansiyeli kayıtlaması yapılmış ve hayvanlar sakrifiye edilmiştir. Daha sonra, siyatik sinir spesmenleri çıkarılıp elektron mikroskobik incelemeye alınmış, karşı taraf siyatik sinir segmentlerinden elde olunan kesitler ise tip I ve tip III kollajen ile TGF-β1 ve bfgf immünoreaktivitesi açısından incelemeye alınmıştır. Elektrofizyolojik veriler, cerrahi Px işleminin uygulandığı gruplarda aksiyon potansiyeli yanıtı için gerekli uyaran eşiğinin yüksek olduğunu, Px sonrası MLT verilen

9 grupta ise düşük bir uyaran eşiğinin mevcudiyetini ortaya koymuştur. Morfometrik ve immünohistokimyasal analiz sonuçları, cerrahi Px prosedürünün siyatik sinir anastomoz alanı kollajen içeriğinde ve makroskobik nöroma oluşumunda bir artışa neden olduğunu ve daha önce Px uygulanmış sıçanlarda ise MLT tedavisinin aynı bölge kollajen içeriğinde istatiksel olarak anlamlı bir düşmeye yol açtığını göstermiştir. Özetle, bu deneysel çalışmadan elde edilen bulgular; elektrofizyolojik ve morfolojik inceleme sonuçları arasında pozitif bir korelasyonun mevcut olduğunu, MLT in kollajen yapımı ve nöroma oluşumunu inhibe etmek suretiyle sinir rejenerasyonu üzerine olumlu bir etki gösterdiğini ortaya koymaktadır. Ancak, bu sonucun gelecekte bu alanda gerçekleştirilecek yeni deneysel ve klinik çalışmalarla doğrulanmasına ihtiyaç bulunmaktadır. Anahtar Sözcükler: Pinealektomi, melatonin, kollajen, transforme edici büyüme faktörü beta 1, bazik fibroblast büyüme faktörü, periferik sinir rejenerasyonu.

10 ABSTRACT Today an extensive effort for inhibition of neuroma formation, an important problem in clinical practice for neurosurgeons, in peripheral nerve surgery is still developing. On the other hand, it has been recently suggested by some experimental studies that surgical pinealectomy (Px) procedure induced elevation of the collagen content in the granulation tissue of a wound, but melatonin (MLT) application after Px procedure suppressed elevation of collagen accumulation in the tissue caused by pineal gland removal. In this experimental study, it was therefore aimed to investigate the possible effect of MLT on changes in the collagen production and the neuroma formation in peripheral nerve surgery. In this study, a total of 80 male rats was used for control groups (intact control group, vehicle group, sham operation group and sham operation+vehicle group), MLT group, surgical Px groups (Px group and Px+vehicle group) and group of MLT treatment following Px procedure (Px+MLT group). All animals underwent a surgical intervention consisting of bilateral sciatic nerve section and primary suture anastomosis. At two months after anastomosis, the animals were killed following completion of recording of nerve action potentials (NAPs). Then, sciatic nerve specimens were removed and processed for electron microscopy observation, and sections taken from the segments of contralateral sciatic nerve were also examined for immunoreactivity of collagen types I and III, TGF-β1 and bfgf. Electrophysiological findings demonstrated that the stimulus intensities required to excit a NAP response was increased in surgical Px group, but the presence of reduced threshold response in group of MLT treatment following Px procedure. Morphometric and immunohistochemical analyses revealed that Px

11 procedure caused an elevation of collagen content of the sciatic nerve and macroscopic neuroma formation, and that there was a statistically significant reduction in collagen content of the same region in pinealectomized animals treated with MLT. In conclusion, the results achieved in this experimental study showed that there was a positive correlation between the data of electrophysiological and morphological investigations, and that MLT enhanced nerve regeneration due to its inhibitory effect on neuroma formation. However, further experimental and clinical studies are warranted to confirm this result in future. Keywords: Pinealectomy, melatonin, collagen, transforming growth factorβ1, basic fibroblast growth factor, peripheral nerve regeneration.

12 GİRİŞ Periferik sinir cerrahisinde proksimal ve distal kesi uçları arasındaki anatomik onarımın sağlanması amacıyla değişik fiziksel ve kimyasal modalitelerin kullanıldığı çok sayıda yöntem üzerinde çalışılmıştır. Yapılan deneysel ve klinik çalışmalarda, kesi yerinde oluşan ve sinir rejenerasyonu üzerine olumsuz bir etkiye sahip olan konnektif doku birikimi ile karekterize nöroma oluşumunun azaltılması amacıyla değişik sütür yöntemlerinin yanısıra, çeşitli doku yapıştırıcılarının kullanıldığı sütürsüz yöntemler de uygulanmıştır [3, 5, 7, 32, 51, 92]. Lazerin 1970 li yılların sonlarında kullanım alanına girmesinden itibaren, nöroşirürjide hem deneysel hem de klinik çalışmalarda lazer kullanımı hızla artış göstermiştir [2, 22, 34, 51]. Lazer enerjisinin kesi uçları arasında birleşmeyi sağladığı, nöroma oluşumunu azalttığı ve sinir rejenerasyonunu üzerine olumlu bir etki gösterdiği iddia edilmiştir [22, 51]. Ancak, bu konuda istenen düzeyde bir başarının elde edildiği ideal bir prosedür henüz mevcut değildir. Periferik sinir rejenerasyonu sürecinde, transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bfgf) gibi sitokinlerin fibroblastlar tarafından kollajen yapımı ve Schwann hücre aktivitesi üzerinde önemli bir role sahip oldukları saptanmıştır [8, 20, 40, 56, 68-72, 75, 81, 87, 88, 106]. Öte yandan, gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda melatonin (MLT) in yara granülasyon dokusundaki kollajen içeriğini azalttığı, pinealektomi (Px) sonrası kollajen içeriğinin artış gösterdiği ve Px sonrası MLT verilmesinin ise bu etkiyi inhibe ettiği ileri sürülmüştür [14, 16-18]. Bu gözlemlere dayanarak, TGF-β ve bfgf gibi sitokinlerin skar oluşumundan sorumlu olduğu ve MLT in ise skar dokusu oluşumuna engel olacağı hipotezinin test edilmesi düşünülmüştür. Bu amaçla, deneysel sıçan siyatik sinir kesisi (nörotomi) modeli kullanılarak MLT hormonunun periferik sinir cerrahisi

13 sonrası sinir rejenerasyonu ve nöroma oluşumu üzerine olan etkisinin değerlendirilmesi planlanmıştır. Bu deneysel çalışmada, sütür onarımı sonrası anastomoz bölgesinin kollajen içeriği ve nöroma oluşumu üzerine MLT in etkisi elektrofizyolojik ve morfolojik olarak incelenmiştir. Siyatik sinir rejenerasyonunun değerlendirilmesi amacıyla aksiyon potansiyeli kayıtlaması yapılmıştır. Daha sonra da elektron mikroskop kullanılarak anastomoz bölgesi için ultrastrüktürel bir inceleme gerçekleştirilmiştir. Nöroma dokusundaki tip I ve tip III kollajen ile TGF-β1 ve bfgf içeriğinde ortaya çıkan değişikliklerin ayrıntılı bir şekilde ortaya konulması amacıyla da immünohistokimyasal bir analiz uygulanmıştır.

14 GENEL BİLGİLER PERİFERİK SİNİR MORFOLOJİSİ Periferik sinir sisteminde sinir lifleri, afferent veya efferent aksonlar içeren miyelinli ya da miyelinsiz sinir lifi demetlerinden oluşan ve çevresi bağ dokusu kılıflarla sarılı oluşumlardır (Şekil 1) [5, 8, 10-13, 15, 19, 22-24, 32, 34, 43, 48, 51, 57, 76, 85, 87, 93, 101]. Şekil 1. Miyelinli ve miyelinsiz bir periferik sinir yapısı görülmektedir: 1, epineurium; 2, perineurium; 3, endoneurium; 4, Schwann hücresi; 5, Ranvier düğümü; 6, miyelin kılıfı; 7, miyelinli akson; 8, miyelinsiz akson; 9, Schwann hücresi sitoplazması (Snell RS [85] dan alınmıştır). Sinir lifleri, epineurium adı verilen fibröz bağ dokusundan ibaret bir kılıf ile kuşatılmış olup fasikül adı verilen sinir lifi demetleri için destekleyici ve koruyucu bir role sahiptir (Şekil 2) [12, 22, 34, 43, 51, 63, 76, 85, 86, 90, 92, 93, 101]. Epineurium; kalın kollajen ve elastik liflerden oluşmuştur [93, 95]. Bunlar arasında, kollajen lifleri çoğunlukta olup epineurium un kalınlığının yarısından çoğunu oluşturan komponent kollajen lifleridir [19, 23, 43, 49, 50, 57, 93]. Kollajen liflerinin çoğu

15 longitudinal ve geri kalan küçük bir bölümü ise oblik bir seyir göstermektedir [93]. Bağ dokusu elemanları, periferik sinirin kompresyon ve gerilme gibi çevresel etkenlere karşı direncinden sorumlu olan elastikiyet özelliği ve dalgalı bir görünüme sahip olmasından sorumlu yapılardır [23, 50, 93]. Periferik sinirin yapısında, besleyici damarlar (arteriae nervosum, venae nervosum), lenfatikler ve sinirler de mevcuttur [93]. Epinöral doku, bir sinir gövdesinin kesit yüzeyinin % 30-75 ini oluşturmaktadır [93]. Kural olarak, fasiküller küçük ve sayıca fazla ise epineurium miktarı da o oranda artış göstermektedir [90, 93]. Şekil 2. Bir periferik sinirin yapısı: 1, akson; 2, perineurium; 3, arter; 4, epineurium; 5, endoneurium ve akson; 6, fasikül; 7, periferik sinir (Stevens & Lowe [90] dan alınmıştır). Her bir sinir lifi arasında ise, endoneurium denilen ince bir gevşek bağ dokusu desteği yer almaktadır [5, 12, 19, 22, 32, 38, 43, 48, 51, 77, 85, 101]. Endoneurium da yer alan kollajen liflerinin yapımının (retiküler lifler) Schwann hücrelerinde gerçekleştirildiği düşünülmektedir [19, 37, 55, 57, 78, 83, 93]. Fasikül içinde yer alan sinir lifleri dalgalı bir seyir göstermekte olup, bu özelliğin sinir gövdesinin gerilme ve yüklenme gibi etkilere karşı koruyucu bir mekanizma olduğu ve endonöral kılıfa elastikiyet kazandırdığı düşünülmektedir [38, 93, 90].

16 Sinir Lifleri Bir sinir hücresine ait akson ve dendrit gibi hücre uzantılarına sinir lifi adı verilmekte olup, periferik sinirin yapısında yer alan sinir demetlerinin temel yapı taşıdır [5, 32, 85, 93]. Her bir sinir lifi ise akson, aksonun plazma zarı (aksolemma) ve bunu çevreleyen bir kılıfı bölümlerinden oluşmaktadır [85, 93]. Genel olarak, periferik sinir lifleri iletim hızlarına ve lif kalınlıklarına göre sınıflandırılmaktadır (Tablo 1) [85, 93]. Tablo 1. Sinir liflerinin iletim hızı ve kalınlıklarına göre sınıflandırılması* Lif tipi İletim hızı (m/sn) Sinir lifi çapı (μm) Miyelin A lifleri Alfa 70-120 12-20 Var Beta 30-70 5-12 Var Gamma 15-30 3-6 Var Delta 10-30 2-5 Var B lifleri 3-15 1.5-3.0 Var C lifleri 0.5-2.0 0.4-1.2 Yok *Tablodaki veriler Snell RS [85] ve Sunderland S [93] dan değiştirilerek alınmıştır. Sinir lifleri, en dışta yer alan bağ dokusu kılıf tabakasının mevcudiyetine göre ise; miyelinli ve miyelinsiz olarak iki tipe ayrılmaktadır [12, 43, 51, 85, 86, 93, 101]. Miyelinli sinir lifleri, Schwann hücresi olarak bilinen destek hücreleri tarafından oluşturulan bir miyelin kılıf ile kuşatılmış olan sinir lifleridir [85, 93]. Şekil 1 de görüldüğü gibi, miyelin kılıfı Ranvier düğümleri adı verilen aralıklar ile kesintiye uğratılan segmentler şeklinde olup her bir segmentte sadece bir Schwann hücresi yer almaktadır [85, 93]. Miyelin tabakasının mevcut olmadığı ve Schmidt-Lantermann aralıkları olarak da bilinen alanlarda akson ekstrasellüler iyonlarla temas halindedir [93]. Bir sinir lifinde, aksonun büyüklüğü arttıkça miyelin kılıfının kalınlığı da artış göstermektedir [92]. Miyelinli sinir liflerinin elektron mikroskobik görüntülerinde,

17 miyelin de kendi içinde ince tabakalara ayrılmış olarak görülmektedir [90, 92]. Miyelinsiz sinir lifleri, tek bir Schwann hücresini paylaşan ve bir oluk içinde yer alan çok sayıda aksondan oluşmakta olup Ranvier düğümleri mevcut değildir (Şekil 3) [90]. Şekil 3. Tek bir Schwann hücresinin sitoplazmik katlantıları içinde yer alan ve birbirleriyle direkt ilişkisi olmayan miyelinsiz sinir lifleri: 1, miyelinsiz akson; 2, nukleus; 3, Schwann hücresi (Stevens & Lowe [90] dan alınmıştır). AKSON DEJENERASYONU Bir sinir hücresine ait aksonunun kesilmesi durumunda; proksimal ve distal akson segmentleri ile hücre gövdesinde birtakım dejeneratif değişiklikler gelişmektedir [5, 12, 13, 22, 32, 34, 43, 48, 51, 63, 85, 86, 92]. Şekil 4 te cerrahi seksiyon (nörotomi) işlemi uygulanmış bir periferik sinirin proksimal ve distal bölümlerinde gelişen dejenerasyon olayı özetlenmiştir [85].

18 Şekil 4. Periferik sinir seksiyonu sonrası gelişen dejenerasyon olayı şematize edilmiştir: 1, akson; 2, Schwann hücresi; 3, miyelin; 4, endoneurium; 5, parçalanmış akson; 6, miyelin damlacıkları; 7, lezyon bölgesi; 8, makrofaj (Snell RS [85] dan değiştirilerek alınmıştır). Proksimal Akson Segmentindeki Değişiklikler Lezyon düzeyinden itibaren proksimal bölümdeki ilk Ranvier düğümüne kadar olan sinir segmentinde önce dejenerasyonla ilişkili bazı değişiklikler olmaktadır [12, 85]. Kısa bir süre sonra ise, proksimalden gelişen aksonal uzantılar endonöral tüpler içinde ilerleyerek lezyon alanına ulaşmaktadır. Eğer erken bir dönemde sinirin kesik uçları cerrahi olarak karşı karşıya getirilir ise, proksimaldeki aksonal uzantılar distalde yer alan sinir segmentine doğru büyümeye devam etmektedir. Aksi halde, aksonal uzantılar çevre doku içine doğru yanlış bir yönelim göstererk sonlanmaktadır. Distal Akson Segmentindeki Değişiklikler Lezyon alanının distalinde gelişen değişikliklere Wallerian dejenerasyon adı verilmektedir [5, 12, 13, 34, 43, 48, 85, 86, 92, 93]. Travma sonrası bir hafta içinde, tamamen parçalanan distal akson segmenti çevrede yer alan Schwann hücreleri ve makrofajlar tarafından sindirilmektedir [12, 85]. Aynı şekilde, miyelin kılıfı da parçalanmakta ve makrofajlarca fagosite edilmektedir [85]. Schwann hücreleri ise

19 hızla prolifere olmakta ve fibroblastlardan gelişen fibröz doku ile birlikte lezyon alanını işgal etmektedir [5, 12, 13, 19, 22, 77, 85, 93, 105]. Sinir Hücresinin Gövdesindeki Değişiklikler Aksondaki bir hasar sonrası hücre gövdesinde gelişen değişikliklere retrograd dejenerasyon adı verilmektedir (Şekil 5) [12, 85, 93]. Travmatik hasar sonrası ilk 1-2 hafta içinde, kromatolizis olarak bilinen sinir hücre çekirdeğindeki Nissl cisimciklerinin eriyip kaybolması ile karekterize bir olay gelişmektedir [45, 85]. Hücre çekirdeği, hücre içindeki merkezi konumundan perifere doğru hareket etmekte ve hücre gövdesi şişme göstermektedir [85]. Kural olarak, aksondaki hasar hücre gövdesine ne kadar yakın ise, hücre gövdesinde o denli önemli değişikliklere yol açmaktadır [85]. Şekil 5. Aksonal uzantısı kesintiye uğrayan bir sinir hücresi cisminde oluşan değişiklikler (Snell RS [85] dan değiştirilerek alınmıştır). AKSON REJENERASYONU Periferik sinirlerde yer alan endonöral tüplerin yenilenen aksonlara yol göstermesi ve Schwann hücrelerinin de yardımı ile aksonal rejenerasyon gerçekleşmektedir [13, 15, 24, 32, 36, 46, 48, 63, 83, 85, 91-93, 96]. Schwann hücresi ile akson ve ekstrasellüler matriks arasındaki etkileşimler periferik sinir

20 rejenerasyonu için son derece önem taşımaktadır [19, 20, 46, 78, 91, 105]. Yapılan klinik ve deneysel çalışmalarda, aksonun büyüme hızının günde 2-4 mm olduğu saptanmıştır [85]. Rejenerasyon sonucu endonöral tüp içinde gelişen aksonal sürgün orijinal akson çapının ancak % 80 i kadar ulaşabilmekte ve iletim hızı da orijinal aksondaki kadar büyük olamamaktadır [85]. Bir sinirin proksimal ve distal uçları arasındaki mesafe birkaç milimetreden fazla ise ya da uçlar arasındaki aralık fibröz bir doku ile doldurulmuş ise iyileşme olasılığı oldukça zayıftır [32, 43, 85]. Proksimal uçtan gelişen aksonal sürgünlerin çevre bağ dokusu içine doğru kaçması sonucu nöroma adı verilen ve kördüğüm olmuş liflerin oluşturduğu bir kitle karşımıza çıkmaktadır [5, 13, 43, 48, 85, 86, 92]. Sinirin proksimal ve distal uçlarının uç-uca getirildiği sütür işlemi sonrası aksonal rejenerasyon olayı gelişmektedir. Önce, endoneurium daki Schwann hücreleri mitotik bölünmeye uğramakta ve kesinin proksimal ve distal segmentlerindeki endonöral tüplerin içindeki boşluğu doldurmaktadır (Şekil 6) [24, 78, 85, 91]. Proksimalde yer alan kesik akson ucundan sürgün şeklinde çok sayıda aksonal uzantı çıkmakta ve Schwann hücreleri arasındaki yarıklar boyunca endonöral tüp içinde ilerleyerek proksimal ve distal sinir uçları arasındaki mesafeyi geçmektedir [15, 20, 24, 85, 92]. Daha sonra, komşu Schwann hücreleri lezyon düzeyinden başlayarak distale doğru her bir aksonun çevresinde miyelin bir kılıf oluşturmaya başlamaktadır [85]. Rejenerasyon esnasında, çok sayıda ve farklı aksonlara ait olan aksonal uzantılar çoğu kez tek bir endonöral tüp içine girebilmekte ise de, sonuçta sadece biri devamlılığını koruyabilmekte ve diğerleri ise dejenere olmaktadır [85]. Böylece, çok sayıda aksonal uzantı hasar bölgesini geçmek suretiyle distal uçta bulunan bir

21 endonöral tüp içine girmeyi başaramamakta, sinir uçları arasında ve çevrede yer alan bağ dokusu içine doğru ilerlemektedir. Şekil 6. Periferik sinir seksiyonu (nörotomi) sonrası rejenerasyon gelişmesi şematize edilmiştir: 1, çok sayıda aksonal filament; 2, bant lifleri; 3, tek bir aksonal filament; 4, Schwann hücresi; 5, yeni miyelin kılıfı (Snell RS [85] dan değiştirilerek alınmıştır). UÇ-UCA SİNİR ANASTOMOZU Sinir uçlarının lup ya da cerrahi mikroskop kullanılarak bir araya getirilerek sütüre edilmesinden ibaret olan anastomoz işlemi iyi bilinen bir nöroşirürjikal prosedür olup epinöral ya da interfasiküler onarım şeklinde uygulanabilmektedir. Sütür hattı bölgesinde gelişen fibrozis ve skar oluşumunun olabildiğince azaltılması fonksiyonel bir iyileşmenin elde edilebilmesi bakımından anastomoz için kullanılan sütür materyali ve uygulanan cerrahi teknik son derece önem taşımaktadır. Sütür işlemi için kullanılacak iğne olabildiğince ince ve atravmatik olmalı, sütüre edilecek sinirin kalınlığına göre 8/0 ya da 10/0 sütür materyalleri kullanılmalı, sütür sayısı çok fazla olmamalı ve epinöral onarımda sütürler epineurium a sınırlı kalmalıdır [32, 93]. Sinir uçlarının çok gevşek ya da çok sıkı bir şekilde birbirine yaklaştırılması sinir

22 rejenerasyonunu olumsuz yönde etkileyecektir [22, 32, 34, 43, 51, 93]. Yine, sütüre edilecek sinirin proksimal ve distal ucundaki fasiküler yapı dikkatle incelenmeli ve karşılıklı olarak doğru bir şekilde sütüre edilmelidir. Standart epinöral anastomoz tekniği, interfasiküler onarım tekniğine kıyasla daha kolay ve kısa süreli bir işlemdir. NÖRAL FİBROZİS Travmatik periferik sinir lezyonu gibi sinir gövdesi ve çevre doku hasarının sözkonusu olduğu değişik patolojilerde, sütür hattı boyunca reaktif bir skar dokusu gelişmektedir [5, 22, 32, 43, 48, 51, 76, 93]. Böyle bir olayda, önce hasara uğrayan dokulardaki fibroblastların sayıları artmakta ve daha sonra kollajen lifleri salgılanmaktadır [93]. Epineurium daki kollajen liflerinin, endoneurium da yer alan liflere kıyasla daha kalın ve miktar olarak da daha fazla olduğu saptanmıştır [93]. Kural olarak, travmanın şiddeti ne kadar fazla ise, hasar bölgesinde oluşan skar dokusu da o denli fazla olmaktadır [43, 92, 93]. Yine, vasküler doku hasarı, hematom, enfeksiyon ve iskemi gibi patolojik durumların mevcut olduğu hallerde de nöral fibrozis miktarı artış göstermektedir. Hatta, epinöral sütür amacıyla kullanılan materyalinin kendisinin de skar oluşumunu stimüle ettiği bile iddia edilmektedir [93]. NÖROMA OLUŞUMU Nöroma oluşumu periferik sinir cerrahisinde karşılaşılan ve bugün bile hala çözüme kavuşturulamamış bir cerrahi sorundur. Bu lezyon yukarıda da belirtildiği şekilde, çoğu kez seksiyon şeklindeki bir travmatik hasar sonrası sinirin soğansı bir genişleme göstermesiyle karekterize non-neoplastik bir antitedir [5, 13, 43, 48, 86, 93]. Sözü edilen oluşum sinirin proksimal ve distalde yer alan kesik uçlarının herbirinde ya da anastomoz bölgesi içinde gelişebilmektedir [5, 43, 48, 93]. Nöroma

23 dokusu histolojik olarak şu öğelerden oluşmaktadır: aksonlar, Schwann hücreleri, fibroblastlar ve kollajen lifleri [48, 93]. Sinirin proksimal ucunda gelişen nöroma distalde yer alan nöromadan farklı olarak rejenerasyon gösteren sinir lifleri de içermektedir [93]. Nöroma oluşumunun büyüklüğü, çevre komşu doku içine uzanım gösteren sürgün şeklindeki aksonal dallanmaların sayısı ile Schwann hücresi ve fibroblast proliferasyonu ile pozitif korelasyon göstermektedir [93]. Kural olarak, travmatik lezyon sinir hücresine ne kadar yakın ve daha proksimalde lokalize ise, hasar bölgesinde oluşacak nöroma da o denli büyük olmaktadır [93]. Aksonların etrafını çevreleyen endoneurium un oluşturduğu endonöral tüpler rejenerasyon gösteren aksonların doğru hedef organlara ulaşmasını sağlayan önemli bir anatomik yapıdır [48, 93]. Öte yandan, skar dokusu rejenerasyon gösteren aksonların distale doğru ilerlemesini zorlaştıran ve rejenerason için engel teşkil eden önemli bir bariyerdir [22, 32, 34, 43, 48, 51, 93]. Nitekim, sinir uçlarının uygun bir şekilde sütüre edilmediği olgularda rejenerasyon gösteren aksonların önemli bir bölümü interfasiküler epinöral doku içine doğru rastgele uzanım gösteren dallanmalar sözkonusudur [93]. Şekil 7 de görüldüğü şekilde, nöromaların çoğu içinde yer alan ve yeterli bir izolasyona sahip olmayan ince lifler içermeleri nedeniyle oldukça hassas ve ağrılı bir özelik göstermektedir [13, 48, 93]. Şekil 7. Normal koşullarda çok sayıda akson tek bir Schwann hücresi sitoplazması içinde birbirlerinden ayrılmış durumda iken, nöromada aksonlar

24 birbirlerinden izole edilmemiş bir durumdadır: 1, Schwann hücresi; 2, Schwann hücresi sitoplazması; 3, akson; 4, nukleus (Sunderland S [93] dan alınmıştır). PERİFERİK SİNİRDE İLETİ İstirahat döneminde, sinir lifi polarize durumda ve içi dışına göre negatif olup potansiyel farkı 80 milivolt düzeyindedir [85]. Sodyum (Na+) ve potasyum (K+) iyonlarının plazma zarından diffüzyonu ile oluşan ve ATP enerjisi kullanan sodyumpotasyum pompası aracılığı ile sürdürülen bu duruma istirahat membran potansiyeli adı verilmektedir [85]. Bir uyarı uygulanması sonrası, Na+ iyonları akson içine geçmekte ve aksolemma dışındaki pozitif iyonlar nötralize olmaktadır. Bu durumda membranın dış kısmı içe göre negatif olup potansiyel farkı +40 milivolt tur [85]. Yeterli şiddetteki bir uyarı ile aksonun ilk segmentinden başlayan ve aksolemma boyunca ilerleyen negatif elektrik dalgasına aksiyon potansiyeli adı verilmekte olup, sinir impulsları sinir lifi boyunca aksiyon potansiyelinin hareketi sonucu ilerlemektedir [85]. Bir sinir lifinin ileti hızı, aksonun çapı ile ilişkilidir ve kalın lifler küçük çaplı olanlara kıyasla daha hızlı bir ileti sağlamaktadır [85]. Yine, miyelin kılıfının kalınlığı da ileti hızı üzerine etkili olan diğer bir faktör olup, bir sinir lifindeki ileti hızı; en kalın liflere ait 120 m/sn ile en ince liflerdeki 2 m/sn nin altındaki değerler arasında değişmektedir [85, 93]. Klinik pratikte, sinir lifinin çapının ve miyelin kılıfı kalınlığının değiştiği travmatik sinir lezyonları gibi değişik patolojilerde de sinir ileti hızında bozukluk ortaya çıkması kaçınılmaz bir sonuçtur. Sinir rejenerasyonunun değerlendirilmesinde, nöroma oluşumunun histolojik özellikleri yanında sinir aksiyon potansiyeli kayıtlaması ve sinir ileti hızı ölçümleri de değerlidir [29]. Miyelinli sinir liflerinde, miyelin kılıfı bir yalıtkan işlevi görmekte olup lif çapı ile ileti hızı arasında doğrusal bir ilişki mevcuttur [85, 93].

25 Sunderland a göre [93], miyelinli sinir liflerinde ileti hızı; yaklaşık olarak, sinir lifinin dış çapı (μm) x 6 ya eşittir. Miyelinsiz sinir liflerinde ise; ileti hızı lif çapının kare kökü ile orantılı olup, basit bir ifade ile sinir lifinin çapı (μm) x 2 dir [93]. KOLLAJEN İnsan vücudundaki proteinlerin 1/3 ünü oluşturan kollajen bağ dokusunun temel öğesidir [26]. Periferik sinirin normal yapısında yer alan ekstrasellüler matriks komponentleri (kollajen, fibronektin ve laminin) arasında kollajenin özel bir yeri vardır. Kollajen lifleri fibroblastlar tarafından oluşturulan oldukça büyük moleküller olup özellikle travmatik sinir lezyonları sonrası gelişen skar dokusu içeriğinin önemli bir bölümünü oluşturmaktadır. Sekiz basamaktan oluşan bir sentez proçesi sonucu protokollajen molekülleri hidrojen bağları ile birbirleriyle bağlanarak kollajen mikrofibrillerini oluşturmaktadır [26]. Kollajen moleküllerini oluşturan aminoasitlerin 1 3 ünü glisin, 1 5 ini prolin ve hidroksiprolin meydana getirmektedir [26]. Kollajen molekülünün bir alt grubu da tropokollajen adıyla anılmakta olup fibroblastlar tarafından salgılanan üç farklı polipeptid zincirinden oluşmaktadır. Tropokollajen, kollajen mikrofibrillerinin esas yapı maddesi olup heliks şeklinde bir yapıya sahiptir. Her biri farklı bir birleşim ve özelliğe sahip en az 14 çeşit kollajen molekülünün mevcut olduğu bilinmektedir [70]. Embriyonik dönemde periferik sinirlerin yapısında esas olarak tip 1 ve tip 3 kollajenler mevcut olup erişkin hayatta tip III kollajen içeriğinde bir miktar azalma olmaktadır [23]. Yine, periferik sinir içinde tip IV kollajenin varlığından da söz edilmektedir [47, 49]. Sinir fasiküllerinde, perineurium un çapı arttıkça birim alana düşen kollajen miktarında da doğru orantılı bir artışın sözkonusu olduğu saptanmıştır

26 [49]. İmmünohistokimyasal çalışmalar, rejenerasyon gösteren periferik sinirin fibrotik bağ doku kılıflarının (epineurium, perineurium ve endoneurium) yapısının tip I ve tip III kollajen den oluştuğunu ortaya koymuştur [19, 49, 50, 57, 63, 72, 82, 83]. Tip I kollajen esas olarak epineurium da lokalize olup endoneurium ve perineurium daki retiküler lifler tip III kollajen yapısındadır [50, 57, 82, 83]. Periferik sinir rejenerasyonunda endoneurium da tip I kollajen ve fibronektin yapımından sorumlu olan hücre tipinin endonöral fibroblastlar olduğu anlaşılmıştır [82, 83]. Yapılan deneysel çalışmalarda, epinöral fibroblastların kollajen yapımından sorumlu hücreler olduğu ve travmatik sinir lezyonlarında büyüme faktörleri için nötralizan antikorların uygulanması durumunda aksonal rejenerason için bir engel teşkil eden aşırı kollajen oluşumunun önlendiği bildirilmiştir [56]. BÜYÜME FAKTÖRLERİ Sitokinler olarak da bilinen bu biyolojik ajanların fibroblastlar tarafından kollajen sentez ve depolanması üzerine olan etkileri nedeniyle yara iyileşmesi ve skar oluşumunda düzenleyici bir role sahip oldukları kabul edilmektedir [15, 20, 25, 27, 31, 36, 39-41, 56, 58, 59, 61, 68, 73, 75, 78-81, 89, 91, 94, 97, 104, 106, 108]. Tranforme Edici Büyüme Faktörü-beta (TGF-β) Son yıllarda, çeşitli hücre tipleri üzerine olan geniş spektrumlu bir biyolojik aktiviteye sahip olmaları nedeniyle özellikle TGF-β türü sitokinler bir hayli önem kazanmıştır. Yapısal olarak birbirine benzer olan bu ajanlar hücre proliferasyonu ve farklılaşması, matriks oluşumu ve immünoreaktivite üzerine önemli etkileri olan çok fonksiyonlu düzenleyici proteinlerdir [15, 20, 25, 47, 56, 59, 61, 68, 73, 75, 78-80, 89, 91, 97, 104, 106]. Yine, protein yapısındaki bu ajanların kemik ve kartilaj

27 oluşumu, proteoglikan metabolizması ve fibrozis oluşumunda da rol oynadıkları bildirilmiştir [52, 54]. Önce, biyolojik olarak inaktif olan öncül bir tip şeklinde salgılanan bu sitokinler daha sonra aktif hale dönüşmekte ve spesifik hücre reseptörlerine bağlanmak suretiyle ilgili hücrelerde biyolojik bir yanıt oluşmasına yol açmaktadır [41, 103]. Bu nedenle, sadece immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak belli bir TGF-β tipinin varlığının ortaya konulması biyolojik bir aktivite kanıtı olarak kabul edilmemelidir [54]. İnsanlarda, üç tip TGF-β mevcuttur: TGF-β1, TGF-β2 ve TGF-β3 [15, 20, 52, 54-56, 61, 68, 69, 71-73, 75, 79, 88, 104]. Her biri farklı bazı biyolojik roller üstlenen bu ajanların etkileri hedef hücre tipine ve hücre çoğalmasının mevcudiyetine göre farklılıklar göstermektedir [54, 89]. Normal siyatik sinir yapısında bulunan Schwann hücrelerinin sitoplazmalarında TGF-β1 ile TGF-β3 ve az miktarda TGF-β2 mevcuttur [54, 78, 79]. Moroca ve ark. [54] nın domuzlar üzerinde gerçekleştirdikleri bir çalışmada, dokuda mevcut olan değişik tipteki TGF-β oranlarının yaşla ilişkili olarak da değişiklikler gösterdiği saptanmıştır. Şöyle ki; yeni doğanlarda TGF-β1 ve TGF-β3, 6-12 aylık hayvanlarda TGF-β2 ve 24-36 aylıklarda ise TGF-β1 lehine bir üstünlük sözkonusu idi [54]. İlginç bir şekilde, bazı hedef hücre tiplerinin değişik TGF-β tiplerinin belli bir oranda birarada mevcut oldukları koşullarda duyarlı hale geldikleri iddia edilmiştir [4]. TGF-β1 trombosit, makrofaj, lenfosit ve fibroblast gibi farklı hücreler tarafından yapımı gerçekleştirilebilen bir sitokindir [20, 25, 69, 80, 104]. Biyolojik aktiviteleri konusında çok sayıda çalışma yapılan bu ajanın ektoderm kökenli hücreler için antiprolifaratif ve fibroblast gibi mezenşim kökenli hücreler için ise proliferasyonu stimüle edici bir işlev gördüğü ileri sürülmüştür [25, 87, 88]. Yine, Schwann hücre

28 proliferasyonu ve farklılaşmasında TGF-β nın önemli bir rol oynadığı ileri sürülmüştür [20, 59, 68, 69, 72, 73, 78, 89, 91, 106]. Fibroblastlar tarafından kollajen sentez ve depolanması ile karekterize fibrojenik bir aktiviteye sahip olduğu için doku fibrozisi açısından önem taşımaktadır [37, 55, 56, 69, 72, 79, 80, 104]. Fibrotik kutanöz hastalığı olan kişilerde, normal kişilere kıyasla daha fazla miktarlarda TGF-β1 proteininin mevcut olduğu saptanmıştır [25]. Sıçanlarda, travmatik siyatik sinir hasarı sonrası gelişen rejenerasyon esnasında sütür hattının proksimal ve distalinde mevcut olan Schwann hücreleri tarafından TGF-β oluşumunun indüklendiği düşünülmektedir [20, 75]. Hem fibroblastların ve hem de fibroblast ürünlerinin (kollajen, matriks metalloproteinazları ve TGF-β1 gibi sitokinler) yara iyileşmesi ve skar oluşumunda önemli bir rol üstlendikleri kabul edilmektedir [37, 47, 56, 72, 79, 80, 83, 99, 104]. Sıçanlarda, siyatik sinir dejenerasyon alanlarında TGF-β1 düzeyi artmakta ve aksonal rejenerasyon geliştikçe TGF-β1 düzeyinde düşme olmaktadır [78]. Yapılan deneysel çalışmalarda, sistemik ya da topikal TGF-β1 uygulanması neticesi kollajen sentezindeki artışa bağlı olarak skar oluşumunda artış ve yara iyileşmesinde belirgin bir hızlanma sağlandığı bildirilmiştir [72, 79, 80, 97]. Diğer yandan, nötralize edici TGF-β antikorları kullanılarak hücre proliferasyonu ile ekstrasellüler matriks ve skar oluşumunun azaltılması mümkün olmuştur [15, 79, 80, 106]. Son yıllarda, bazı araştırıcılar TGF-β1 in nötralize edilmesi durumunda tip 1 kollajen yapımının azaldığını ve periferik sinir rejenerasyonunda önemli ölçüde bir artış sağlandığını ifade etmişlerdir [15, 56, 73]. Rogister ve ark. [73], TGF-β1 in Schwann hücreleri tarafından sinir büyüme faktörü (NGF) mrna salınımını da değiştirmek suretiyle rejenerasyon üzerinde etkili olduğunu ileri

29 sürmüştür. Yine, TGF-β1 aktivitesinin spesifik antikorlar ile suprese edilmesine alternatif bir seçenek olarak, dışarıdan TGF-β3 uygulamak suretiyle TGF-β1 düzeyinde göreceli bir azalmaya neden olunması da skar oluşumunu azaltmaktadır [79]. Bu nedenle, TGF-β3 ün TGF-β1 i antagonize etmek suretiyle, skar oluşumu üzerine inhibe edici bir etki gösterdiği düşünülmektedir [55, 79]. Öte yandan, TGF-β tiplerinin sadece doku ya da sistemik dolaşımdaki düzeyi de reseptör profilleri de son derece önem taşımaktadır [79, 80]. Periferik sinir sisteminde, değişik lokalizasyonlarda TGF-β proteini ve reseptörlerinin mevcut olduğu gösterilmiştir [89]. Schwann hücrelerinde TGF-β grubu sitokinlere ait reseptörlerin mevcudiyeti, bu ajanların adı geçen sinir hücreleri üzerinde trofik bir etkiye sahip olduğunu akla getirmektedir [89]. Yapılan çalışmalarda, TGF-β nın Schwann hücre proliferasyonunda rol oynadığı ileri sürülmüştür [28, 89]. TGF-β reseptörlerinden tip 1 in fibrotik aktiviteden ve tip 2 nin ise antiproliferatif etkiden sorumlu olduğu, fibroblastlar tarafından kollajen sentezinin regülasyonunda bu reseptörler arasındaki dengenin çok önemli olduğu ileri sürülmüştür [10, 79, 80, 89]. Sözkonusu dengenin tip 2 reseptörler lehine bozulmuş olduğu durumlarda, doğal olarak kollajen yapımında ve skar oluşumunda bir azalma beklenmelidir. Bazik Fibroblast Büyüme Faktörü (bfgf) Mitotik çoğalma, kemotaksis ve hücre farklılaşması üzerine stimüle edici bir rolü olan bfgf multipotansiyel polipeptid dir [24, 27, 31, 36, 39, 40, 58, 81, 94, 106, 107]. Yapılan çalışmalar bfgf in hücre proliferasyonunu hızlandırdığını ortaya koymuştur [36, 106, 108]. Özellikle, fibroblastlar ve kondrositler üzerinde etkili olup kartilajinöz matriks sentez ve stabilizasyonundan sorumludur [39, 94, 108]. Shah ve

30 ark. [81], bfgf in düşük konsantrasyonlarda proteoglikan sentezini stimüle ettiğini ve yüksek konsantrasyonlarda ise inhibe ettiğini rapor etmiştir. Literatürde, protein yapısındaki bu sitokinin periferik sinir sistemindeki lokalizasyonuyla ilişkili çok fazla çalışma mevcut değildir. Son yıllarda gerçekleştirilen elektron mikroskobik çalışmalar, bfgf ün siyatik sinir üzerinde Schwann hücrelerinin nukleusları içinde ve Ranvier düğümlerinde daha yoğun bir şekilde lokalize olduğunu göstermiştir [31, 40, 58]. Yine, miyelin kılıfı ve akson sitoplazması içinde de az miktarda mevcut olduğu saptanmıştır [40]. In vitro olarak yapılan çalışmalarda, bfgf ün Schwann hücreleri üzerine etki ederek hücre çoğalmasında rol oynayan otokrin ve parakrin aktivitelerin gelişmesine yol açtığı görülmüştür [59, 105]. Hücre kültür çalışmalarında DNA sentezi için bfgf ün TGF-β1 ile birlikte uygulanması durumunda mitojenik yanıtın maksimal düzeye ulaştığı saptanmıştır [106]. Işık-elektron mikroskobik ve immünohistokimyasal incelemeler kullanılarak gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda, eksojen olarak uygulanan bfgf ün direkt olarak aksonlar üzerine olan etkisi neticesi aksonal rejenerasyonu sağladığı ve sinir rejenerasyonunu hızlandırdığı ortaya konulmuştur [24, 36, 40, 59]. Shaw ve ark. [81] bfgf ün periferik sinir kesisi sonrası öncü Schwann hücrelerinde olagelen apoptoz u engellemek suretiyle olumlu bir etki gösterdiğini ileri sürmüştür. MELATONİN İlk kez 1958 yılında Lerner ve ark. [44] tarafından tanımlanan endojen MLT in çoğu pineal gland da sentezlenmektedir. Fotik stimülasyon ile hipotalamus daki suprakiazmatik nukleus aktive olmakta ve spinal kord yolu ile superior servikal ganglion (SCG) a gelen nöral ileti sonucu pineal gland daki pinealosit hücrelerinin

31 sekretuar fonksiyonları başlamaktadır. Son yıllarda, sistemik dolaşımda mevcut olan bazı sitokinlerin de fotik stimülasyon gibi pineal gland üzerinde düzenleyici bir role sahip oldukları iddia edilmektedir [100]. Bu sentez işleminde; N-asetil transferaz (NAT) enzimi ile hidroksi indol-o-metil transferaz (HIOMT) enzimi rol oynamaktadır [1, 9, 21, 64, 67]. Pinealosit lerde üretilen MLT; çok hızlı bir şekilde bu hücrelerin komşuluğunda yer alan kapillerler e bırakılmak suretiyle sistemik kan dolaşımına karışmaktadır [21]. MLT sentez ve salınımı; gece maksimum düzeyde ve gündüz ise minumum düzeydeki seyri ile karekterize sirkadiyen salınım ritmi göstermektedir [53, 62, 84, 102, 107]. Yine, yaş ile yakın bir ilişki göstermekte olup yaşlanma ile MLT sentez ve salınımında azalma olmaktadır. Erişkin bir insanda geceleyin ölçülen serum MLT düzeyi 50-70 pg/ml dir [62, 66]. Yaşlılarda, günlük sirkadiyen salınım ritmi tama yakın kaybolmakta ve geceleyin MLT düzeyinde artık artış olmamaktadır [65, 67]. Pineal gland dan sistemik kan dolaşımına verilen MLT karaciğer ve böbreklerde metabolize olmaktadır [62, 65]. MLT hormonu hedef dokulardaki etkisini, bu dokularda yer alan spesifik reseptörler aracılığı ile göstermektedir. MLT in çok değişik etkileri olduğu ileri sürülmektedir: serbest radikal giderici, rejenerasyonu stimüle edici, nöroprotektif, anti-toksik, uyku ritmi ve endokrinolojik aktivite düzenleyicisi, osteoblastik aktiviteyi hızlandırıcı, immüniteyi güçlendirici, anti-kanserojen, antiepileptik ve hipotermik etkisi [1, 62, 64-67, 84, 102, 107]. Yapılan deneysel çalışmalarda, Px uygulanan hayvanlarda doku kollajen içeriğinde artış olduğu ve MLT verilince ise kollajen yapımı suprese olduğu bildirilmiştir [16-18]. Ha ve ark. [30] sıçan kullanarak gerçekleştirdikleri bir deneysel diyabetik nefropati modeli çalışmasında, MLT uygulanması sonucu glomerüler TGF-β1 düzeyindeki artışın engellendiğini saptamışlardır.

32 GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışma Ege Ünivesitesi Tıp Fakültesi Deneysel Cerrahi ve Araştırma Laboratuvarı nda gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, 200-220 g ağırlığında toplam 80 adet Wistar cinsi erkek sıçan kullanılmıştır. Hayvanlarda iki seri deney gerçekleştirilmiştir. DENEY GRUPLARI ayrılmıştır: Deney I. Bu çalışmada, 30 sıçan her biri 10 ar sıçandan oluşan 3 gruba Grup Ia (normal kontrol grubu, n=10): Diğer gruplarda gerçekleştirilen herhangi bir tedavi şeklinin uygulanmadığı sıçanlardan oluşmuştur. Grup Ib (serum fizyolojik grubu, n=10): MLT yerine serum fizyolojik verilen sıçanlardan oluşmuştur. Grup Ic (MLT grubu, n=10): Uygun dozda MLT verilen sıçanlardan oluşmuştur. ayrılmıştır: Deney II. Bu çalışmada, 50 sıçan her biri 10 ar sıçandan oluşan 5 gruba Grup IIa (sham-kontrol grubu, n=10): Px grubundan farklı olarak pineal bezin intakt bırakıldığı cerrahi grupta yer alan sıçanlardan oluşmuştur. oluşmuştur. Grup IIb (Px grubu, n=10): Px işleminin gerçekleştirildiği sıçanlardan

33 Grup IIc (Px + serum fizyolojik grubu, n=10): Px işlemi sonrası serum fizyolojik verilen sıçanlardan oluşmuştur. Grup IId (sham-kontrol + serum fizyolojik grubu, n=10): Px işlemi uygulanmaksızın cerrahi işlemin diğer bölümlerinin gerçekleştirildiği ve daha sonra serum fizyolojik verilen sıçanlardan oluşmuştur. Grup IIe (Px + MLT grubu, n=10): Px işlemi sonrası 30 μg/100 g vücut ağırlığı dozunda MLT verilen sıçanlardan oluşmuştur. Daha sonra tüm sıçanlarda cerrahi olarak bilateral sinir kesisi (nörotomi) + sütür anastomozu işlemi uygulanmıştır. Bu çalışmada uygulanan tüm cerrahi işlemler intraperitoneal dihydrothiazine (8 mg/kg Rompun ) + ketamine (60 mg/kg Ketalar ) kokteyli kullanılarak elde olunan genel anestezi altında ve aynı cerrah (MT) tarafından gerçekleştirilmiştir. CERRAHİ İŞLEMLER Pinealektomi (Px). Sinir kesisi ve anastomoz işleminden 3 hafta önce sıçanlar Px ya da sham kontrol işlemine tabi tutulmuştur. Px işlemi, Byliss ve Bates [6] tarafından tanımlandığı şekilde genel anestezi altında orta hat cilt insizyonunu takiben mini matkap kullanılarak sajital ve lambdoid sütürlerin arasında kalan kare şeklinde bir kemik pencere açılmak suretiyle gerçekleştirilmiştir. Daha sonra dura mater iridektomi forsepsi yardımıyla sajital sinüs lateralinde ve ona paralel olacak şekilde açılmıştır. Dura mater açıldıktan sonra pineal bez komşu venöz sinüslerin travmatize edilmemesine özen gösterilerek çıkarılmıştır. Sham-kontrol grubunda yer alan hayvanlarda ise pineal bezin çıkarılması işlemi dışında kalan Px prosedürü ile ilişkili olan tüm işlemler aynen uygulanmıştır.

34 Nörotomi + sütür anastomozu. Genel anestezi altında deneklerin her iki siyatik siniri posterior uyluk yaklaşımı ile ortaya konulmuş ve bistüri yardımıyla nörektomi işlemi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra cerrahi lup yardımıyla 10-0 naylon kullanılarak dört adet epinöral sütür atılarak primer anastomoz uygulanmıştır. Bu cerrahi işlemin tamamlanmasından sonra adale ve cilt 4-0 naylon sütür materyali kullanılarak anatomik olarak kapatılmıştır. Hayvanlar tekrar kafeslerine alınmış ve iyileşmeleri sağlanmıştır. İLAÇ UYGULAMASI Nörotomi ve sinir anastomozu işlemi uygulanan deneklere subkütan ilaç enjeksiyonları şu şekilde yapılmıştır: i) 0.1 ml/100 g vücut ağırlığı dozunda serum fizyolojik içinde % 2 lik etil alkol (serum fizyolojik grubu) ve ii) 30 μg/100 g vücut ağırlığı dozunda serum fizyolojik içindeki MLT çözeltisi. Enjeksiyonlar sütür anastomozu işlemi sonrası 2 ay süreyle her gün 17.00-18.00 saatleri arasında yapılmıştır. Hayvanlar, çalışma bitiminde morfolojik değerlendirme amacıyla sinir spesimenlerinin çıkarılması işlemi gerçekleştirilinceye kadar 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık (AK=12:12) ortamda tutulmuştur. ELEKTROFİZYOLOJİK İNCELEME Her grupta yer alan hayvanlar üzerinde Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı Laboratuvarı nda deney aşamasına ait toplam 9 cerrahi mortalite dışında kalan tüm sıçanların siyatik sinir aksiyon potansiyelleri kaydedilmiştir. Bu amaçla siniri uyarmak ve sinyal kaydetmek için paslanmaz çelik iğne elektrotlar, elektrostimülasyon için Grass marka S4G modeli bir stimülatör ve elektriksel izolasyon