Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 9 MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR E UROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 2 İçindekiler Bölüm 9 MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması Deneysel 3 Giriş 3 Bitki spesifik PCR : Soya - Lektin 6 Bitki spesifik PCR : Mısır - Zein 9 Genetik yapısı değiştirilmiş bitkilerin saptanması için Tarama metodu 12 35S Promotörün Saptanması 12 nos Terminatörün Saptanması 14 MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready soyanın nested PCR ile spesifik saptanması 17 MON810 mısırın saptanması 17 Bt-176 Mısırın Saptanması 21 Roundup Ready Soyanın Saptanması 25
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 3 Deneysel Giriş Aşağıdaki protokoller, işlenmiş ve işlenmemiş materyalde genetiği değiştirilmiş (GDO) organizmaları, GDO olmayan örneklerle (soya ve mısır) karşılaştırarak, PCR a dayalı tarama (35S promotör ve nos terminatör kullanılarak) ve spesifik tanımlama (Roundup Ready soya, MON810 mısır ve Bt-176 mısır) yöntemlerini açıklamaktadır. Bu yöntemlerde sonuçlar, örnekte hedef dizinin varlığı/yokluğu şeklinde araştırılmakta ve yalnızca nitel sonuç vermektedir. Ekipmanlar Mikro pipetler Termal cycler Setüstü Santrifüj (Mikrosantrifüj) Vorteks karıştırıcı Reaksiyon tüpleri için taşıyıcı raf 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüpleri 1,5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri UV lambalı çeker ocak bulunan ayrı bir steril oda DİKKAT Bütün ekipmanlar DNA bulaşıksız olmalı ve kullanımdan önce sterilize edilmiş olmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, filtreli pipet uçları kullanılmalıdır. Çözeltiler datp CAS 1923-31-7 dctp CAS 102783-51-7 dgtp CAS 93919-41-6 dttp CAS 18423-43-3 10x PCR tampon solusyonu (genellikle Taq Polimerazın satın alındığı firma tarafından sağlanır)
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 4 25 mm MgCl 2 Taq DNA Polimeraz 5 ve 3 primer solusyonları Mineral yağ (kapak ısıtmasız PCR kullanıldığında gereklidir) Nükleaz ari su 4mM dntp Stok çözeltisi dntpler eşit konsantrasyonlarda datp, dctp, dgtp, dttp içeren önceden karıştırılmış stok çözelti olarak veya her biri ayrı konsantre stoklarından sağlanabilir. Herbiri ayrı ayrı olan stoklar kullanıldığında, her dntp, son konsantrasyonda 4 mm dntp stok çözeltisi olacak şekilde steril deiyonize suda çözülür. Tüplere dağıtılır ve 20 C de saklanır. dntp ler bir kaç ay stabildir. 20 µm primer çözeltisi olarak kullanacak oligonükleotidler genelde liyofilize şekilde elde edilir ve son konsantrasyonu 20 µm olacak şekilde seyreltilir. 20 µm primer çözelti, sağlandığı firmanın açıklamaları doğrultusunda hazırlanır - 1 µm=1 pmol/µl ise 20 µm=20 pmol/µl - X nmol primer + 10X µl steril su = 100 pmol/µl = 100 µm - 65C de 5 dakika inkübe edilir, karıştırılır ve 65C de 3 dakika daha inkübe edilir. - Dilüsyon 1:5 Bir ependorf tübe 400 µl steril su hazırlanır ve primer çözeltisinden 100 µl eklenir (100 µm) Son konsantrasyon: 20 µm Küçük miktarlara bölünerek tüplere dağıtılır ve 20C de saklanır. Bu saklama koşulunda primerler en az 6 ay stabildir. Liyofilize primerler 20C da 3 yıl boyunca stabil olarak sakalnabilir. 10X PCR tamponu 500 mm KCl, 100 mm Tris HCl (25C de ph 9,0) ve %1 Triton X-100 içeren 10X PCR tampon solusyonu genelikle Taq DNA polimeraz ile birlikte temin edilir ve kullanıma hazırdır. Tampon her kullanımdan önce karıştırılmalı ve kısa süreli santrifüj edilmelidir. Tüplere dağıtılan tampon solusyonu 20C da saklanır ve bir kaç ay stabildir.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 5 25 mm MgCl2 Çözeltisi PCR düzeyi MgCl 2 çözeltisi genellikle Taq DNA polimeraz ile temin edilir ve kullanıma hazırdır. Çözelti her kullanımdan önce vorteks ile karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir ( uzu süreli saklama sonucu oluşabiliecek konsantrasyon değişimini önlemek için). 20C de saklanır. Nükleaz içermeyen su Master reaksiyon karışımı ve DNA nın seyreltilmesi için kullanılacak olan steril, nükleaz içermeyen, deiyonize su, küçük miktarlarda tüplere dağıtılarak kullanılır. Her analiz serisi için, yeni tüpler hazırlanmalıdır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 6 Bitki spesifik PCR : Soya - Lektin Soya DNA sının belirlenmesi lektin geni kullanılarak gerçekleştirilir. Eğer örnekte çoğaltılabilir soya DNA sı bulunuyorsa GMO3/GMO4 primerleri kullanılarak PCR ile belirlenir. GMO3 VE GMO4 lerin Özellikleri GMO3 GCCCTCTACTCCACCCCCATCC Uzunluk 22 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6471,6 Erime Noktası* (G/C) 65,1 GMO4 GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG Uzunluk 23 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6981,1 Erime Noktası* (G/C) 59,6 *50 mm lık [Na+] varlığında Kontroller Her PCR analizi icin kontrol deneylerinin yapılması önemlidir. Negatif kontroller, PCR çözeltilerinde DNA ile kontaminasyonun varlığını kontrol etmek üzere düzenlenir. Karakterize edilecek örneklere ait pozitif kontroller PCR analizinin verimliliğini/etkinliğini ve spesifikliğini belirlemek için önemlidir. Aşağıdaki kontroller her PCR analiz performansı için tanımlanmak zorundadır. Pozitif kontrol: Geleneksel/genetik modifikasyona uğratılmamış soyadan izole edilmiş saf DNA Negatif kontrol : Lektin geni içermeyen diğer türlerden izole edilmiş saf DNA Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı, master karışımın negatif kontrolü Master Karışım Hazırlama 10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 1 de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 7 Takip eden prosedür, 48 µl GMO3/GMO4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren bir reaksiyon için uygundur. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında buz içinde muhafaza edilir. Tablo 1. GMO3-GMO4 master karışım Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid GMO3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid GMO4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOPLAM 48 µl 480 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 1 deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir GMO3-GMO4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48 er µl dağıtılır Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir PCR Programı* (GMO3-GMO4) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 30 sn Bağlanması (Annealing) 63C 30 sn Uzaması (Extension) 72C 30 sn Döngü Sayısı 40 Son Uzaması (Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 8 * NOT: Kurs sırasında, Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600, ABI 9700 thermocycler (PCR cihazı) kullanılacaktır. Farklı model ya da marka bir cihaz kullanıldığında PCR programlarının gerekli şekilde uyumlanması ve test edilmesi koşuluyla aynı sonuçlar elde edilecektir 1. PCR Ürünlerinin Analizi Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra, PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agarsz jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt da 1 saattir. Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak ölçmek için kenardaki kuyucuklara yüklenerek yürütülür. Yürütmeden sonra UV transillüminatör ışığında jeldeki DNA lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir. Sonuçların Yorumlanması GMO3 ve GMO4 primer dizisi doğal lektin geninin saptanmasında soyanın internal kontrolü olarak kullanılır. Amplifiye edilen DNAnın soyaya ait olduğu, 118 bp büyüklüğünde lektin spesifik bandı ile doğrulanır. Pozitif kontrol 118 bp büyüklüğünde bir bant verecektir.negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünür bir bant vermeyecektir. Eğer pozitif/negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller beklenen sonuçları veriyor ve örnekler 118 bp büyüklüğünde bir bant vermiyorsa bu örnekte çoğaltılabilir soya DNA sı bulunmuyor demektir. Bu bölümün konusu olan protokoller nitel yöntemlerdir. Bu nedenle de sonuçlar var/yok şeklinde alınır. 1 JRC ve WHO bu el kitabında adı geçen yahut kurs esnasında kullanılan hiç bir cihazın kullanımını özel olarak telkin etmemektedir. Laboratuarlarımızda gerçekleştirilen analizler, alternatif ekipmanın s stem gereklilikleri göz önünde tutularak kolayca yinelenebilmelidir
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 9 Bitki spesifik PCR : Mısır - Zein Mısır DNA sını tanımlamak için zein geni kullanılır. Eğer örnekte çoğaltılabilir mısır DNA sı bulunuyorsa ZEIN3/ZEIN4 primerleri kullanılarak PCR ile belirlenir. ZEIN3 ve ZEIN4 lerinin Özellikleri ZEIN 3 AGTGCGACCCATATTCCAG Uzunluk 19 Molekül Ağırlığı (g/mol) 5772,3 Erime Noktası* (G/C) 55,2 ZEIN 4 GACATTGTGGCATCATCATTT Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6410,9 Erime Noktası* (G/C) 51,7 *50 mm lık [Na+] varlığında Kontroller Pozitif Kontrol : Geleneksel mısırdan izole edilmiş saf DNA Negatif Kontrol : Zein geni içermeyen diğer türlerden izole edilmiş saf DNA Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı Master karışımın negatif kontrolü Master Karışım Hazırlama 10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 2 de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. Takip eden prosedür, 48 µl ZEIN3/ZEIN4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren bir reaksiyon için uygundur. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında buz içinde muhafaza edilir.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 10 Tablo 2. ZEIN3/ZEIN4 master karışımı Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid ZEIN3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid ZEIN4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOPLAM 48 µl 480 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 2 deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir ZEIN3/ZEIN4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüj edilir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48 er µl dağıtılır Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir PCR Programı (ZEIN3/ZEIN4) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 96C 1 dk Bağlanması / Uzaması (Annealing / 60C 1 dk Extensıon) Döngü Sayısı 40 Son Uzaması (Final Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 11 PCR Ürünlerinin Analizi Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra, PCR ürünleri etidiyum bromid ile boyanmış agaroz jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt da 1 saattir. Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak ölçmek için kenardaki kuyucuklara yüklenerek yürütülür. Yürütmeden sonra UV transillüminatör ışığında jeldeki DNA lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir. Sonuçların Yorumlanması ZEIN3 ve ZEIN4 primer dizisi doğal zein geninin saptanması suretiyle mısır için internal kontrol olarak kullanılır. Amplifiye edilen DNAnın mısıra ait olduğu, 227 bp büyüklüğünde zein spesifik bandı ile doğrulanır. Pozitif kontrol 227 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir.negatif kontrol ve hedef olmayan kontrol görünür bir bant vermemelidir. Eğer pozitif/negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa bu deney için seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller beklenen sonuçları veriyor ve örnekler 227 bp büyüklüğünde bir bant vermiyorsa bu örnekte çoğaltılabilir mısır DNA sı bulunmuyor demektir. Bu bölümün konusu olan protokoller nitel yöntemlerdir. Bu nedenle de sonuçlar var/yok şeklinde alınır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 12 Genetik yapısı değiştirilmiş bitkilerin saptanması için Tarama metodu Genler promotör ve terminatörlerin düzenleyici etkileri ile kontrol edilir. 35S promotör (CaMV den elde edilen) ve nos terminatör (A. tumefaciens bakterisinden elde edilen) gen aktarımında en çok kullanılan düzenleyicilerdir. Araştırılan örneğin içeriğindeki soya ve/veya mısırda bu düzenleyivi dizinlerinden birinin tespit edilmesi GDO varlığını gösterir. Roundup Ready soyada 35S promotör ve nos terminatör dizinlerinin her ikisinin de tanımlanması mümkünken, Mon810 ve Bt-176 mısırda yalnızca 35S promotör bulunur. 35S Promotörün Saptanması p35s-cf3 ve p35s-cr4 lerin Özellikleri p 35S-cf3 CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6414,5 Erime Noktası* (G/C) 57,4 p 35S-cr4 TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7544,2 Erime Noktası* (G/C) 56,3 *50 mm lık [Na + ] varlığında Kontroller Pozitif kontrol : Referans materyal DNA sı (% 0,5 GD mısır) Negatif kontrol : %0 oranında GDO mısır içeren referans materyalden elde edilen DNA Hedef içermeyen kontrol : Master karışım negatif kontrolü, DNA yerine yalnızca su içerir. Master Karışım Hazırlama 10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 3 de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 13 Takip eden prosedür, 48 µl p35s-cf3/p35s-cf4 master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi içeren bir örnek reaksiyon için geçerlidir. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında buz içinde muhafaza edilir. Tablo 3. p35s-cf3/p35s-cf4 master karışım Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid p35s-cf3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid p35s-cr4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOPLAM 48 µl 480 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 3 deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir p355-cf3/p355-cf4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48 er µl dağıtılır Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir PCR Programı (p35s-cf3/p35s-cf4) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 25 sn Bağlanması (Annealing) 62C 30 sn Uzaması (Extension) 72C 45 sn Döngü Sayısı 50 Son Uzaması (Extension) 72C 7 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 14 PCR Ürünlerinin Analizi Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agaroz jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt da 1 saattir. Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak ölçmek için kenardaki kuyucuklara yüklenerek yürütülür. Yürütmeden sonra UV transillüminatör ışığında jeldeki DNA lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir. Sonuçların Değerlendirilmesi p355-cf3/p355-cr4 primer çifti CaMV 355 promotörü saptanmasında kullanılır, elde edilen ürün 123 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu promotör Roundup Ready soya ve Bt-176 mısır gibi bir çok transgenik bitkinin gen ekspresyonunu düzenler. Pozitif kontrol 123 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünen bir bant vermemelidir. Pozitif ve negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Eğer kontroller beklenen sonuçları veriyor ve örnekte 123 bp büyüklüğünde bir bant gözlemleniyorsa örnekte modifiye DNA bulunuyor demektir. nos Terminatörün Saptanması HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r lerinin Özellikleri HA-nos 118-f GCATGACGTTATTTATGAGATGGG Uzunluk 24 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7462,8 Erime Noktası* (G/C) 56,2 HA-nos 118-r GACACCGCGCGCGATAATTTATCC Uzunluk 24 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7296,9 Erime Noktası* (G/C) 61,2 *50 mm lık [Na] varlığında
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 15 Kontroller Pozitif Kontrol : Referans materyalden elde edilen DNA (%0,5 GD RR Soya) Negatif Kontrol: Referans materyalden elde edilen DNA (%0 GD soya) Hedef içermeyen kontrol: Master karışımın negatif kontrolü, DNA yerine yalnızca su içerir. Master Karışım Hazırlama 10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontrolleri içerir) gerekli çözeltiler Tablo 4 de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. Takip eden prosedür, 48 µl HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışımı ve 2 µl DNA çözeltisi içeren reaksiyon için geçerlidir. Çözeltilerin tümü master karışımın hazırlanması sırasında buz içinde muhafaza edilir. Tablo 4. HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışım Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid HA-nos 118-f 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid HA-nos 118-r 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOPLAM 48 µl 480 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 4 deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir HA-nos 118-f ve HA-nos 118-r master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48 er µl dağıtılır Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir PCR Programı (HA-nos 118-f/HA-nos 118-r)
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 16 Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 25 s Bağlanması (Annealing) 62C 30 s Uzaması (Extension) 72C 45 s Döngü Sayısı 50 Son Uzaması (Extension) 72C 7 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur. PCR Ürünlerinin Analizi Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agaroz jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt da 1 saattir. Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak ölçmek için kenardaki kuyucuklara yüklenerek yürütülür. Yürütmeden sonra UV transillüminatör ışığında jeldeki DNA lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir.. Sonuçların Değerlendirilmesi HA-nos 118-f/HA-nos 118-r primer çifti nos terminatörün saptanmasında kullanılır, elde edilen ürünler 118 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu terminatör, Roundup Ready soya, Bt-11 mısır gibi gibi birçok transgenik bitkide bulunur. Pozitif kontrol 118 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünen bir bant vermemelidir. Pozitif ve negatif kontroller beklenen sonuçları vermiyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Eğer kontroller beklenen sonuçları veriyor ve herhangi bir örnekte 118 bp büyüklüğünde bir amplifikasyon bandı gözlemleniyorsa bunun anlamı örneğin genetik modifiye DNA içerdiğidir.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 17 MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready soyanın nested PCR ile spesifik saptanması MON810 mısırın saptanması Bu saptama sistemi MON810 mısır için özeldir. Hedef elementler, yüksek veya arttırılmış transkripsiyon düzeyi için yapısal birer düzenleyici olan CaMV 35S promotör ve ısı şok protein geni hsp70 exon/intron1 bölgesi dizilimleridir. mg1, mg2, mg3, mg4 lerin Özellikleri mg1 TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7665,1 Erime Noktası* (G/C) 59,6 mg2 TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7560,2 Erime Noktası* (G/C) 57,9 mg3 ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7472,2 Erime Noktası* (G/C) 61,2 mg4 GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC Uzunluk 25 Molekül Ağırlığı (g/mol) 7722,9 Erime Noktası* (G/C) 59,6 *50 mm lık [Na + ] varlığında
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 18 Kontroller Pozitif kontrol: Referans materyal DNA sı (%0,1 MON810 Mısır) Negatif kontrol : Referans materyalden elde edilen DNA (%0 GD mısır) Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı master karışımın negatif kontrolü Master Karışım Hazırlama I 10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 5 de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. Bir örnek için mg1/mg2 içeren master karışım 48 µl ve DNA çözeltisi 2 µl olmak üzere toplam hacim 50 µl dir. Master karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır. Tablo 5. Master karışım I (mg1/mg2) Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid mg1 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid mg2 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 48 µl 480 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 5 deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir mg1/mg2 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48 er µl dağıtılır Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 19 PCR Programı (mg1/mg2) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 45 sn Bağlanması (Annealing) 60C 50 sn Uzaması (Extension) 72C 50 sn Döngü Sayısı 35 Son Uzaması (Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur Master Karışım Hazırlama II 10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 6 da verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. Bir örnek için 49 µl mg3/mg4 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye edilmiş DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl dir. Master karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır. Tablo 6. Master karışım I (mg3/mg4) Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 33,75 µl 337,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid mg3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid mg4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 49 µl 490 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 6 daki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir mg3/mg4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 49 ar µl dağıtılır Üzerlerine 1 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 20 Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir PCR Programı (mg3/mg4) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 45 sn Bağlanması (Annealing) 60C 50 sn Uzaması (Extension) 72C 50 sn Döngü Sayısı 40 Son Uzaması (Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur. PCR Ürünlerinin Analizi Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agaroz jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt da 1 saattir. Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak ölçmek için kenardaki kuyucuklara yüklenerek yürütülür. Yürütmeden sonra UV transillüminatör ışığında jeldeki DNA lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir. Sonuçların değerlendirilmesi mg1/mg2 ve mg3/mg4 primerleri MON810 içeren ürünlerin nested PCR ile spesifik saptanması amacıyla tasarlanmıştır. Amplifikasyon ürünü olarak gözlemlenecek son nested PCR bandı 149 bp büyüklüğündedir. Pozitif kontrol 149 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünür bir bant vermemelidir. Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler 149 bp büyüklüğünde bir bant veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içermektedir.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 21 Bt-176 Mısırın Saptanması Hedef gen bölgesi, bitkiyi European Corn Borer gibi zararlı böceklerden koruyan cryia(b) dir. CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3, CRYIA4 lerin Özellikleri CRYIA 1 CGGCCCCGAGTTCACCTT Uzunluk 18 Molekül Ağırlığı (g/mol) 5394,6 Erime Noktası* (G/C) 59,5 CRYIA 2 CTGCTGGGGATGATGTTGTTG Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6519,2 Erime Noktası* (G/C) 57,6 CRYIA 3 CCGCACCCTGAGCAGCAC Uzunluk 18 Molekül Ağırlığı (g/mol) 5397,6 Erime Noktası* (G/C) 61,7 CRYIA 4 GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6479,2 Erime Noktası* (G/C) 57,6 *50 mm lık [Na + ] varlığında Kontroller Pozitif kontrol : Referans materyal DNA sı (%0,1 GD Mısır) Negatif kontrol : Referans materyal DNA sı (%0 GD mısır) Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı master karışımın negatif kontrolü Master Karışım Hazırlama I 10 örneklik bir seri için için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 7 de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 22 Bir örnek 48 µl CRYIA1/CRYIA2 içeren master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl dir. Master karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır. Tablo 7. CRYIA1/CRYIA2 master karışımı Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid CRYIA1 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid CRYIA2 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 48 µl 480 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 7 deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir CRYIA1/CRYIA2 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48 er µl dağıtılır Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir PCR Programı (CRYIA1/CRYIA2) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 40 sn Bağlanması (Annealing) 60C 40 sn Uzaması (Extension) 72C 40 sn Döngü Sayısı 25 Son Uzaması (Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içine konur.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 23 Master Karışım Hazırlama II 10 örnek için gerekli çözeltiler Tablo 8 de verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. İkinci PCR da bir örnek için 49 µl CRYIA3/CRYIA4 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye edilmiş DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl dir. Master karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır. Tablo 8. CRYIA3/CRYIA4 Master karışımı Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 33,75 µl 337,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid CRYIA3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid CRYIA4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 49 µl 490 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 8 deki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir CRYIA3/CRYIA4 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 49 ar µl dağıtılır Üzerlerine 1 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 24 PCR Programı (CRYIA3/CRYIA4) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 40 sn Bağlanması (Annealing) 60C 40 sn Uzaması (Extension) 72C 40 sn Döngü Sayısı 35 Son Uzaması (Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içerisine konur. PCR Ürünlerinin Analizi Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agaroz jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt da 1 saattir. Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak ölçmek için kenardaki kuyucuklara yüklenerek yürütülür. Yürütmeden sonra UV transillüminatör ışığında jeldeki DNA lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir. Sonuçların Değerlendirilmesi CRYIA1/CRYIA2 ve CRYIA3/CRYIA4 primer çiftleri nested PCR ile sentetik cryia(b) geninin spesifik saptanması için tasarlanmıştır. Bu primer çifti kullanılarak elde edilen amplifiye ürün 189 bp büyüklüğünde bir bant verir. Bu gen Bt-176 mısır, Bt-11 ve benzerleri gibi diğer GD organizmalarda bulunur. Pozitif kontrol 189 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünür bir bant vermemelidir. Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler 189 bp büyüklüğünde bir bant veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içeriyordur.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 25 Roundup Ready Soyanın Saptanması Hedef gen, Roundup herbisidine direnç sağlayan CP4 EPSPS dir. GMO9, GMO5, GMO8 ve GMO7 lerin Özellikleri GMO5 CCACTGACGTAAGGGATGACG Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6479,4 Erime Noktası* (G/C) 59,5 GMO9 CATGAAGGACCGGTGGGAGAT Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6559,4 Erime Noktası* (G/C) 59,5 GMO7 ATCCCACTATCCTTCGCAAGA Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6309,6 Erime Noktası* (G/C) 55,8 GMO8 TGGGGTTTATGGAAATTGGAA Uzunluk 21 Molekül Ağırlığı (g/mol) 6579,8 Erime Noktası* (G/C) 51,7 *50 mm lık [Na] varlığında Kontroller Pozitif kontrol : Referans materyal DNA sı (%0,1 GD soya) Negatif kontrol : Referans materyal DNA sı (%0 GD soya) Hedef içermeyen kontrol: DNA yerine suyun kullanıldığı master karışımın negatif kontrolü
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 26 Master Karışım Hazırlama I GMO5/GMO9 10 örneklik bir seri için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 9 da verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. İlk PCR da bir örnek için 48 µl GMO5/GMO9 içeren master karışım ve 2 µl DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl dir. Master karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır. Tablo 9. Master karışım I (GMO5/GMO9) Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 32,75 µl 327,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid GMO5 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm oligonükleotid GMO9 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 48 µl 480 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 9 daki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir GMO5/GMO9 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 48 er µl dağıtılır Üzerlerine 2 µl DNA solüsyonu eklenir Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 27 PCR Programı (GMO5/GMO9) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 30 sn Bağlanması (Annealing) 60C 30 sn Uzaması (Extension) 72C 40 sn Döngü Sayısı 25 Son Uzaması (Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içerisine konur. Master Karışım Hazırlama II GMO7/GMO8 10 örnek için (pozitif/negatif/hedef içermeyen kontroller dahil) gerekli çözeltiler Tablo 10 da verilen bilgilere göre karıştırılarak hazırlanır. İkinci PCR da bir örnek için 49 µl GMO7/GMO8 içeren master karışım ve 1 µl ön amplifiye edilmiş DNA çözeltisi olmak üzere toplam hacim 50 µl dir. Master karışım hazırlandığı sürede bütün çözeltiler buzda tutulmalıdır. Tablo 10. Master karışım II GMO7/GMO8 Son Konsantrasyon Tek örnek için master karışım 10 örnek için master karışım Steril deiyonize su 33,75 µl 337,5 µl 10xPCR Tamponu 1x 5 µl 50 µl 25mM MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4mM dntps 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm oligonükleotid 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl GMO7 20 µm oligonükleotid 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl GMO8 Taq DNA polimeraz 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl Toplam 49 µl 490 µl Bir adet 1,5 ml lik ependorf tüp hazırlanır Tablo 10 daki prosedür adımları takip edilerek sırasıyla bütün ayraçlar eklenir GMO7/GMO8 master karışımı pipetle yavaşça karıştırılır ve kısa süreli santrifüjlenir 0,2 ml lik PCR reaksiyon tüplerine karışımdan 49 ar µl dağıtılır Üzerlerine 1 µl DNA solüsyonu eklenir
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 28 Yavaşça çalkalanır ve kısa süreli santrifüj edilir Reaksiyon tüpleri PCR cihazına yerleştirilir PCR Programı (GMO7/GMO8) Sıcaklık Zaman İlk Denatürasyon 95C 3 dk Denatürasyon 95C 30 sn Bağlanması (Annealing) 60C 30 sn Uzaması (Extension) 72C 40 sn Döngü Sayısı 35 Son Uzaması (Extension) 72C 3 dk Soğutma 4C Amplifikasyondan sonra örnekler kısa süreli santrifüj edilir ve buz içerisine konur. PCR Ürünlerinin Analizi Hedef dizilimin çoğaltılmasından sonra PCR ürünleri etidiyum bromidle boyanmış agaroz jel elektroferezi kullanılarak analiz edilir. 8 µl PCR ürünü, 2 µl yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra örnekler agaroz jele (%1,5) yüklenir. Elektroforez yürütmesi 100 Volt da 1 saattir. Boyut markörleri (100 bp ladder, 15 µl) jelde amplikon bantların büyüklüğünü tam olarak ölçmek için kenardaki kuyucuklara yüklenerek yürütülür. Yürütmeden sonra UV transillüminatör ışığında jeldeki DNA lar görüntülenir. Deney sonuçlarını kalıcı olarak kaydetmek amacıyla jelin fotoğrafı çekilebilir. Sonuçların Değerlendirilmesi GMO5/GMO9 ve GMO7/GMO8 primer çiftleri nested PCR ile Roundup Ready soyada bulunan modoıfıye gen kasetinin spesifik saptaması için kullanılır. Bu primer çifti kullanılarak elde edilen amplifiye ürün 169 bp büyüklüğünde bir bant verir. GMO5 ve GMO7 primerleri CaMV 35S promotör bölgesine komplementerdir. GMO9 primeri Agrobacterium sp CP4 suşuna ait CP4 EPSPS geni ile ve GMO8 primeri de CTP EPSPS geni ile komplementerdir. Pozitif kontrol 169 bp büyüklüğünde bir bant vermelidir. Negatif kontrol ve hedef içermeyen kontrol görünür bir bant vermemelidir.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması 29 Pozitif kontrol ve negatif kontrolde beklenen sonuçlar alınamıyorsa seçilen örneklerin PCR analizi doğru ve geçerli değildir. Kontroller ve örnekler 169 bp büyüklüğünde bir bant veriyorsa örnekler genetik modifiye DNA içeriyordur.