PROTEİN SAFLAŞTIRMA 1 Kromatografik Teknikler (Uygulama Örnekli) Doç. Dr. Münir TUNCER
ÖNSÖZ Başta biyoloji bölümleri olmak üzere, temel tıp bilimleri, biyokimya bölümleri, çevre ve gıda mühendisliği bölümleri; eczacılık, veterinerlik ve ziraat fakülteleri de dâhil olmak üzere, temel fen bilimlerinin hemen her alanından bilim insanları proteinlerin saflaştırılması ve karakterizasyonu ile ilgili çalışmalarını sürdürmektedirler. Bu çalışmaların sonucu olarak da son zamanlarda, ister doğal ister rekombinant proteinlerle ilgili olsun, Ülkemizde bazı çalışmalar giderek artmaktadır. Fakat bu çalışmaların yapılması esnasında yararlanılabilecek Türkçe bir kaynağın olmadığı da dikkat çekmektedir. Bu nedenle, proteinlerin saflaştırılmasında kullanılan kromatografik teknikleri teorik ve pratik olarak açıklayan bu kitabın hazırlanması gerekli görülmüştür. Bu Kitabın devamı niteliğinde olan Protein Saflaştırma 2: Elektroforetik Teknikler in yazımı ise devam etmekte olup, en kısa zamanda sizlere ulaştırılması için gayret gösterilmektedir. Özellikle lisansüstü öğrencilerinin yanı sıra, lisans öğrencileri ve araştırmacılara da yararlı olacağını umduğum bu kitap 11 bölümden oluşmaktadır. Kitabın ilk bölümünde proteinlerin saflaştırılması ile ilgili temel bilgilere yer verildikten sonra, takip eden bölümlerde ise hem düşük basınçlı hem de yüksek basınçlı kromatografi tekniklerinin temel prensipleri ele alınmıştır. Daha sonraki bölümlerde ise proteinlerin saflaştırılmasında ve karakterizasyonunda sıklıkla kullanılan her bir kromatografi tekniği, uygulama örnekleri ile birlikte ayrı ayrı ele alınmıştır. Kitabın hazırlanması ve basılması aşamasında gösterilen tüm özene karşın, kitapta bazı hataların da olabileceğini; bu tür hataların hoşgörü ile karşılanmasını ve eleştirilerin tarafıma iletilmesini bekler, kitabın genç meslektaşlarıma, öğrencilere ve hayatı protein olan bilim insanlarına yararlı olmasını dilerim. E-posta: munir.tuncer@gmail.com Mersin, 2008 Doç. Dr. Münir TUNCER
Bu kitabın hazırlanması süresince, Onlar için ayırmam gereken zamanlardan kısmak durumunda kaldığım çocuklarım; Merve ve A. Oğuzhan a
Doç. Dr. Münir TUNCER İÇİNDEKİLER SAYFA NO: 1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER 1.1. Giriş.. 1 1.2. Biyokimyasal Araştırmalara Genel Yaklaşım... 2 1.2.1. In Vivo Çalışmalar... 4 1.2.2. In Vitro Çalışmalar... 4 1.3. Enzimler Neden Saflaştırılmalıdır?..... 5 1.4. Protein Saflaştırmada Temel Faktörler...... 6 1.5. Enzimlerin ve Diğer Proteinlerin Kararlılıklarının Korunması. 6 1.5.1. Denatürasyonun Önlenmesi.. 7 1.5.2. Katalitik Bölge İnaktivasyonunun Önlemesi... 7 1.5.3. Proteolitik Parçalanmanın Önlenmesi.. 8 1.6. Proteinlerin Özütlenmesi (Ekstraksiyonu).... 9 1.6.1. Nükleik Asitler ve Lipitlerin Uzaklaştırılması... 11 1.7. Ön-fraksiyonlama Prosedürleri ve Yoğunlaştırma... 12 1.7.1. Çöktürme (Presipitasyon)..... 14 1.7.2. Ultrafiltrasyon... 17 1.7.3. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisi.... 19 1.7.4. Kuru Formdaki Sephadex G-25 İlavesi... 19 1.7.5. Diyaliz ve Liyofilizasyon.. 20 1.8. Rekombinant Proteinlerin Saflaştırılması..... 20 1.8.1. İnklüzyon Cisimleri.. 20 1.8.2. Etiketleme.... 21 1.9. Kromatografik ve Elektroforetik Teknikler..... 23 1.10. Saflaştırma Prosedürlerinin Takibi... 25 2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ 2.1. Giriş..... 27 2.2. Dağılma Katsayısı..... 27 2.3. Kromatografinin Mantığı...... 28 2.4. Kolon Kromatografisinin Kullanımı...... 29 2.5. Kromatografi Terminolojisi... 31 2.6. Kromatografi Sistemleri..... 32 2.7. Kolon Kromatografisinin Parametreleri..... 32 2.8. Kromatografik Sistemlerde Çözünürlük..... 34 2.8.1. Kapasite Faktörü... 36 2.8.2. Verimlilik..... 36 2.8.3. Seçicilik...... 38 2.9. Kuantifikasyon, İnternal ve Eksternal Standartlar..... 39 2.10. Kromatografik Sistemlerin Seçimi..... 40 3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ (LPLC) 3.1. Giriş... 43 3.2. Kullanılan Kolonların Özellikleri.... 44 3.3. Destek Materyalleri (Matriksler).... 45 3.4. Durgun Fazlar..... 46 3.5. Kolonun Paketlenmesi... 47 3.6. Paketlenmiş Kolonun Kontrolü..... 48 3.7. Örnek Materyalinin Hazırlanması..... 50 3.8. Örneklerin Kolona Yüklenmesi..... 51 3.9. Örneğin Kolondan Elüsyonu..... 53 3.10. Dedektörler ve Fraksiyonların Toplanması..... 56 4. YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC) 4.1. Giriş..... 59 4.2. HPLC nin Avantaj ve Sınırlamaları.... 59 4.3. HPLC Sistemleri... 60 4.4. Matriksler ve Durgun Fazlar.... 61 i
Doç. Dr. Münir TUNCER 4.5. HPLC Kolonları... 63 4.6. HPLC Kolonun Paketlenmesi... 66 4.7. HPLC Hareketli Fazları.... 67 4.8. HPLC Pompaları..... 68 4.9. Örnek Hazırlama..... 71 4.10. Örneklerin Kolona Yüklenmesi..... 72 4.11. Örneklerin Elüsyonu..... 74 4.12. Detektörler...... 76 4.12.1. Refraktif İndeks Dedektörleri..... 80 4.12.2. UV/Vis Spektrofotometrik Dedektörler.... 82 4.12.3. Flouresans Dedektörleri... 87 4.12.4. Konduktivite Dedektörleri... 88 4.12.5. Elektrokimyasal Dedektörler... 88 4.13. HPLC Uygulamaları... 89 5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ (GFC) 5.1. Giriş......... 91 5.2. GFC nin Temel Prensipleri........ 91 5.3. Matriksler..... 93 5.4. Deneysel Parametreler...... 93 5.5. Moleküllerin Davranış Özellikleri..... 95 5.6. Deneysel Koşulların Dizaynı.... 98 5.6.1. Performans.... 98 5.6.2. Matriks Seçimi....... 100 5.6.2.1. Deneyin Amacı..... 100 5.6.2.2. Ayrıştırılacak Olan Moleküllerin Özellikleri... 102 5.6.2.3. Örnek Materyalinin Özellikleri... 103 5.6.3. Kromatografi Koşullarının Seçimi... 103 5.6.3.1. Kolon Seçimi... 103 5.6.3.2. Akış Oranı... 105 5.6.3.3. Örnek Materyalinin Özellikleri... 105 5.6.3.4. Hareketli Faz...... 108 5.6.3.5. Optimizasyon... 108 5.7. Jel Filtrasyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi.... 109 5.7.1. Jelin Hazırlanması.... 109 5.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Dengelenmesi.... 111 5.7.3. Örneğin Kolona Yüklenmesi.... 111 5.7.4. Elüsyon.... 111 5.7.5. Kolonun Temizlenmesi.... 111 5.7.6. Kolonun ve Jellerin Korunması.... 113 5.8. GFC Uygulama Örnekleri... 114 6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ (IEC) 6.1. Giriş.... 117 6.2. İyon Değiş-tokuş Kromatografisinin Teorisi.... 117 6.3. İyon-değiştirici Matriksler.... 119 6.4. Fonksiyonel Yüklü Gruplar.... 120 6.5. Kapasite... 121 6.6. Deneysel Koşulların Dizaynı...... 122 6.6.1. İyon-değiştiricinin Seçimi...... 122 6.6.1.1. Ayrıştırma İşleminin Özgül Gereksinimleri.... 122 6.6.1.2. Örnek Bileşiklerinin Moleküler Büyüklükleri... 124 6.6.1.3. Örnek Bileşiklerinin Kararlılığı ve İzoelektrik Noktaları... 124 6.6.2. Başlangıç Koşullarının Dizaynı... 125 6.6.2.1. Başlangıç ph sının Seçilmesi... 125 6.6.2.2. Kuvvetli veya Zayıf İyon-değiştiricinin Seçimi... 129 6.6.2.3. Tampon Seçimi.... 130 6.7. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi... 133 6.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı... 133 ii
Doç. Dr. Münir TUNCER 6.7.2. İyon-değiştiricinin Miktarı ve Kapasitesi... 133 6.7.2.1. Kullanılabilir ve Dinamik Kapasitenin Belirlenmesi... 133 6.7.3. İyon-değiştiricinin Hazırlanması... 136 6.7.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü... 137 6.7.5. Örnek Materyalinin Hazırlanması ve Yüklenmesi... 137 6.7.6. Elüsyon...... 137 6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması.... 140 6.9. IEC Uygulama Örnekleri..... 141 7. ODAKLAMA KROMATOGRAFİSİ (KROMATOFOKUSİNG) 7.1. Giriş... 145 7.2. Odaklama Kromatografisinin Mekanizması... 146 7.2.1. ph Gradientinin Oluşturulması... 146 7.2.2. Proteinlerin Davranışları... 147 7.2.3. Odaklama Etkisi... 148 7.3. Materyaller ve Ekipmanlar... 149 7.4. Çözünürlüğü Etkileyen Faktörler... 150 7.5. Deneysel Koşulların Dizaynı... 153 7.5.1. Jel ve Tampon Seçimi... 153 7.5.2. İyon-Değiştiricinin Miktarı... 153 7.5.3. Jelin Hazırlanması... 153 7.5.4. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü... 153 7.5.5. Örnek Materyalin Hazırlanması ve Yüklenmesi... 154 7.5.6. Elüsyon... 154 7.6. Polybuffer ve Amfolitlerin Proteinden Ayrıştırılması... 155 7.7. Denatüre Edici Ajanların Varlığında Kromatofokusing... 156 7.8. Odaklama Kromatografisi Uygulamaları... 156 8. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ (AC) 8.1. Giriş... 159 8.2. Affinite Kromatografisinin Temel Prensipleri... 160 8.3. Materyaller.... 162 8.3.1. Matriks Materyalleri..... 162 8.3.2. Ligand Seçimi ve Ayırıcı-Kol...... 162 8.3.3. Ligandın Matrikse Bağlanması.... 164 8.3.4. Reaksiyona Girmeyen Reaktif Grupların Bloke Edilesi... 166 8.3.5. Bağlama Verimliliğinin Taranması... 167 8.4. Pratik Prosedürler..... 167 8.5. Affinite Kromatografisinin Uygulamaları..... 169 8.6. İmmünoaffinite Kromatografisi... 169 8.6.1. Temel Prensipler... 169 8.6.2. Poliklonal Antikorların (Antisera) Üretimi... 170 8.6.2.1. Poliklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları... 173 8.6.3. Monoklonal Antikorların Üretimi... 173 8.6.3.1. Monoklonal Antikorların Avantaj ve Dezavantajları... 177 8.6.4. İmmünoglobilinlerin Serumdan Fraksiyonlanması... 178 8.6.5. Antikorların Tutuklanması ve Proteinlerin Elüsyonu... 179 8.7. Grup-Özgüllüğü Göstern Ligandlarla Affinite Kromatografisi... 180 8.7.1. Lektin Affinite Kromatografisi.... 180 8.7.1.1. Konkanavalin A (Con A)... 181 8.7.1.2. Lentil Lektin... 182 8.7.1.3. Wheat Germ Lektin... 182 8.7.1.4. Helix pomatia Lektin... 182 8.7.2. Boya-Ligand Affinite Kromatografisi..... 183 8.7.2.1. Boya Kolonlarından Proteinlerin Elüsyonu... 184 8.7.2.2. Boya Adsorbentlerinin Temizlenmesi ve Korunması... 185 8.7.3. Heparin Affinite Kromatografisi..... 185 8.7.4. Kalmodulin Affinite Kromatografisi.... 186 iii
Doç. Dr. Münir TUNCER 8.7.5. Nükleotid Affinite Kromatografisi... 187 8.7.5.1. Poli U Affinite Kromatografisi... 187 8.7.5.2. Poli A Affinite Kromatografisi... 188 8.7.5.3. 5 AMP ve 2 5 ADP Affinite Kromatografisi... 188 8.7.6. Protein-A ve Protein-G ile Affinite Kromatografisi... 189 8.7.6.1. Protein-A Affinite Kromatografisi... 189 8.7.6.2. Protein-G Affinite Kromatografisi... 190 8.7.7. Küçük Ligandlar ile Affinite Kromatografisi... 191 8.7.7.1. Benzamidin Affinite Kromatografisi... 191 8.7.7.2. Lizin Affinite Kromatografisi... 192 8.7.7.3. Arjinin Affinite Kromatografisi... 192 8.8. Metal Şelat Affinite Kromatografisi..... 193 8.8.1. Matriks Materyalleri... 193 8.8.2. Kolonun Hazırlanması ve Dengelenmesi... 193 8.8.3. Örnek Materyalinin Yüklenmesi ve Elüsyonu... 194 8.9. Kovalent Kromatografisi.... 195 8.10. Affinite Kolonlarının Rejenerasyonu ve Saklanması... 197 9. HİDROFOBİK İNTERAKSİYON KROMATOGRAFİSİ (HIC) 9.1. Giriş.... 199 9.2. HIC nin Temel Prensipleri..... 200 9.3. HIC yi Etkileyen Faktörler.. 201 9.4. HIC ile RPC nin Karşılaştırılması... 203 9.5. HIC Adsorbentleri.. 204 9.6. Deneysel Koşulların Dizaynı...... 205 9.6.1. Stratejik Noktalar.. 205 9.6.2. HIC Jelinin Seçimi 206 9.6.3. Tarama Deneyleri. 207 9.7. Hidrofobik İnteraksiyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi... 208 9.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı... 208 9.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Kontrolü... 208 9.7.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması.. 208 9.7.4. Örnek Materyalinin Yüklenmesi... 210 9.7.5. Elüsyon...... 210 9.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması.... 213 9.9. HIC Uygulama Örnekleri....... 213 9.9.1. HIC nin Amonyum Sülfat Çökeltmesi ile Birlikte Kullanılması... 213 9.9.2. HIC nin IEC ile Birlikte Kullanılması 213 9.9.3. HIC nin GFC ile Birlikte Kullanılması.. 215 9.9.4. Tek-adımda Saflaştırma Tekniği Olarak HIC 215 10. TERS-FAZ KROMATOGRAFİ (RPC) 10.1. Giriş.... 217 10.2. RPC nin Temel Prensipleri.... 217 10.3. RPC Adsorbentleri 220 10.3.1. RPC Matriksleri 220 10.3.2. RPC Ligandları 222 10.4. RPC de Çözünürlük. 223 10.4.1. Bağlama Kapasitesi 224 10.5. Deneysel Koşulların Dizaynı.. 224 10.5.1. Kolon Uzunluğu... 224 10.5.2. Hareketli Fazın Akış Oranı... 225 10.5.3. Kromatografik İşlemin Gerçekleştirildiği Sıcaklık... 225 10.5.4. Hareketli Fazın Kompozisyonu... 226 10.5.5. Gradient Elüsyonu.. 228 10.5.6. RPC nin Kullanım Amacı... 229 10.5.6.1. Tuz Giderimi... 229 10.5.6.2. Yüksek Çözünürlüklü Saflaştırma... 230 10.5.6.3. Büyük-Ölçekli Preparatif Saflaştırma... 230 iv
Doç. Dr. Münir TUNCER 10.5.6.4. Saflaştırma İşleminin Basamakları... 230 10.6. RPC nin Gerçekleştirilmesi... 233 10.6.1. Kolon Materyalinin Seçimi... 233 10.6.1.1. Uygulamanın Gereksinimleri... 233 10.6.1.2. Örnek Bileşenlerinin Moleküler Kütleleri... 234 10.6.1.3. Örnek Bileşenlerinin Hidrofobisiteleri... 234 10.6.1.4. Örnek Bileşenlerinin Sınıfı... 235 10.6.2. Hareketli Faz Seçimi... 235 10.6.2.1. Organik Çözücü... 235 10.6.2.2. ph... 236 10.6.2.3. İyon-eşleştirme Ajanları... 238 10.6.3. Örnek Materyalinin Hazırlanması... 239 10.6.4. Hareketli Fazın Hazırlanması... 240 10.6.4.1. Hareketli Fazın Depolanması... 240 10.6.4.2. Organik Çözücünün İmhası... 241 10.6.5. Dedeksiyon... 241 10.6.5.1. Hayalet Pikler... 241 10.6.5.2. Hareketli Fazın Dengelenmesi... 242 10.6.6. Kolonun Dengelenmesi... 242 10.6.7. Elüsyon Koşulları... 243 10.6.8. Kolonun Rejenerasyonu, Temizlenmesi ve Korunması... 244 10.7. RPC Uygulama Örnekleri... 245 10.7.1 Doğal Olarak Sentezlenen Peptidler ve Proteinler... 246 10.7.1.1. Trombosit-Türevli Büyüme Faktörünün Saflaştırılması... 247 10.7.2. Rekombinant Peptidler ve Proteinler... 248 10.7.2.1. İnklüzyon Cisimlerinin Saflaştırılması... 249 10.7.2.2. Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörünün Saflaştırılması... 249 10.7.3. Kimyasal Olarak Sentezlenen Peptidler... 249 10.7.3.1. Fosforile PDGF α-reseptör-türevli py574α Peptidinin Saflaştırılması... 250 11. İNCE TABAKA ve KÂĞIT KROMATOGRAFİSİ 11.1. Giriş... 253 11.2. Temel Prensipler... 253 11.3. İnce-tabakaların Hazırlanması... 254 11.4. Örneğin Uygulanması... 255 11.5. TLC Tankları ve Plakanın Geliştirilmesi..... 257 11.6. Kesiksiz Plaka Geliştirme.... 259 11.7. Analitlerin Belirlenmesi..... 260 11.8. Kâğıt Kromatografi (PC)..... 261 11.8.1. Temel Prensipler...... 261 11.8.2. Deneysel Prosedür... 262 Ek-1: Amonyum sülfat ile çökeltme tablosu... 263 KAYNAKLAR... 265 v
Doç. Dr. Münir TUNCER vi
Doç. Dr. Münir TUNCER SEMBOLLER VE KISALTMALAR ε Kromoforun molar ekstinksiyon sabiti (molar absorbtivite) α Seçicilik faktörü β Volümetrik faz oranı ΔE Deneysel dalga boyundaki absorbans değişimi ½h Pikin yarı yüksekliği a Gaus pikinin birinci yarısının %10 yüksekliğindeki genişliği A Absorbans a Gaus pikinin birinci yarısının alanı A 280 A f APMSF A S AUFS b b BSA 280 nm deki absorbans Asimetri faktörü 4-Aminofenil-metilsülfonil florid Adsorbent yüzey alanı Tam ölçek sapma absorbans birimi (Absorbance Units for Full-Scale Deflection) Gaus pikinin ikinci yarısının %10 yüksekliğindeki genişliği Gaus pikinin ikinci yarısının alanı Bovin serum albümin C Protein derişimi (mg ml -1 ) CDI N,N -karbonildiimidazol C M C p C S d D d A Da d m DMSO E EDTA EGTA ELISA ES ETE FAB Analitin hareketli faz içindeki derişimi Enzim preparatındaki toplam protein yoğunluğu Analitin sabit faz içindeki derişimi Küvetin ışık yolu (cm) Örnek molekülünün diffüzyon kat sayısı Analitin yükleme noktasından (orijin) olan uzaklığı Dalton TLC de solvent (hareketli faz) ucunun, orijin noktasından olan uzaklığıdır Dimetil sülfoksid Standart protein solüsyonunun (1 mg ml -1 ) 280 nm deki absorbansı Etilendiamin tetra asetik asit Etilen glikol tetra asetik asit Enzim-linked immünosorbent assay Enzim-substrat kompleksi Eelektroforetik titrasyon eğrisi Hızlı atom bombardımanı F C Mobil fazın akış oranı (ml dk -1 ) FPLC Hızlı protein sıvı kromatografisi FSH Folikül stimüle edici hormon GFC Jel filtrasyon kromatografisi GLC Gaz-sıvı kromatografisi vii
Doç. Dr. Münir TUNCER GlcNAc h H HETP HIC HMW HPLC HPTLC I IEC I o IR k K kat K av K d kda KTE L L LH LMW LPLC M MPLC M r MS MW N n ODS OS PAGE PC PEG ph I pi PMSF R R f N-asetilglikozamin Pik yüksekliği Kuramsal levha yüksekliği Kuramsal levhaya yüksek denge Hidrofobik interaksiyon kromatografisi Yüksek moleküler kütleli standart proteinleri Yüksek performans sıvı kromatografisi Yüksek performanslı TLC Dedektör küvetinden geçen ışın şiddeti İyon değiş-tokuş kromatografisi Dedektör küvetine gönderilen ışın şiddeti İnfrared Kapasite (alıkonma) faktörü Toplam bağlama sabiti Katal (1 kat = 6 x 10 7 U ve 1 U = 1,7 x 10-8 kat dır). Ortalama dağılma kat sayısı Kromatografide dağılma kat sayısı Kilodalton Kromatografik titrasyon eğrisi Kolonun yatak uzunluğu Ligand Luteinizing hormon Düşük moleküler kütleli standart proteinleri Düşük basınç sıvı kromatografisi Kolona yüklenen bileşiklerin kütlesi Orta basınç sıvı kromatografisi Göreceli moleküler kütle Mas (kütle) spektrofotometre Moleküler kütle (ağırlık) Kuramsal levha sayısı Pik kapasitesi Oktadesilsilan Oktasilan Poliakrilamid jel elektroforezi Kâğıt Kromatografi Polietilenglikol İzoelektrik ph İzoelektrik nokta Fenil-metilsülfonil florid Dedektör tepkime değeri Gecikme faktörü (retantion factor) viii
Doç. Dr. Münir TUNCER RI Refraktif indeks RIA Radioimmünoassay RID Refraktif indeks dedektörü RPC Ters-faz kromatografi RP-HPLC Ters-faz HPLC R S Çözünürlük s Grafik kaydedicinin hızı (cm dk -1 ) SDS Sodyum dodesil sülfat SDS-PAGE Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi SFE Süperkritik sıvı ekstraksiyonu (Supercritical Fluid Extraction) t Örnek molekülünün göç zamanı t R Düzeltilmiş elüsyon zamanı TFCK Tosilfenilalanilklorometilketon TLC İnce tabaka kromatografisi t o Kolondan transit geçen bir analitin elüsyon zamanı t R Bir analitin kolondan elüsyonu (alıkonma) için geçen süre (= analite ait pikin tepe noktası = V e ) U Enzim ünitesi ū Hareketli fazın kolon boyunca lineer akış oranı UV Ultra Viole V Hacim (ml) V α İlk pikin elüsyon hacmi V R Düzeltilmiş elüsyon hacmi V D Farklı moleküler büyüklüklere ve K d değerlerine sahip iki madde için elüsyon hacimlerindeki fark V i K d değeri 1 e eşit olan molekül için kullanılabilir olan matriks içindeki mobil fazın hacmi Vis Görünür (visable) dalga boyu V M Kolondan transit geçen analitlerin elüsyon hacmi veya kolon içindeki mobil fazın toplam hacmi V max Reaksiyon hızının maksimum değeri V o Kolon materyalleri dışında kalan hareketli fazın hacmi; GFC için boşluk hacmi (enzimatik reaksiyonlar için reaksiyonun başlangıç hızı) V R Bir analitin kolondan elüsyon (alıkonma) hacmi (= analite ait pikin tepe noktası = t e ) V S Durgun faz hacmi V sep Kolon yatağının ayrıştırma hacmi V t Kolon yatak hacmi Son pikin elüsyon hacmi V ω w w 0,5 w B Gaus pikinin yükselme noktasındaki (0,607) genişliği (2σ) veya TLC de leke genişliği Gaus pikinin yarı yüksekliğinin genişliği Gaus pikinin taban genişliği (4σ) ix
Doç. Dr. Münir TUNCER x
1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER 1.1. Giriş İster akademik amaçlı çalışmalar için, isterse endüstriyel ve klinik uygulamalar için olsun, proteinlerin elde edildiği kaynaklar oldukça farklıdır. Protein kaynaklarının başlıca gruplarını ise mikroorganizmalar, bitkiler, hayvan dokuları ve rekombinant proteinler oluşturmaktadır. Protein kaynaklarının bu kadar farklı ve çeşitli olmasına rağmen, bu kaynaklardan elde edilen proteinler ister doğal isterse rekombinant olsunlar, genellikle benzer saflaştırma protokolleri ve teknikleri ile saflaştırılırlar (Şekil 1.1). Özgül bir proteinin saflaştırılması için uygulanacak prosedürler ise basit tek-adımlı çöktürmeden (presipitasyon), büyük-ölçekli üretim proseslerine kadar değişebilmektedir. Genellikle istenilen saflıktaki bir ürünün elde edilmesi için birden fazla saflaştırma basamağının uygulanması gerekmektedir. Başarılı ve randımanlı bir protein saflaştırma çalışmasının anahtarı ise en uygun tekniğin seçimine, seçilen tekniğin optimizasyonuna ve verimi artırmak ve saflaştırma protokolünün basamak sayısını minimuma indirmek için seçilen tekniklerin mantıklı bir şekilde kombinasyonuna bağlıdır. Özgül bir proteinin saflaştırılması için takip edilecek protokolün ve uygulanacak tekniklerin detayı ise bazı faktörlere bağlı olarak belirlenebilir. Bu faktörler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir: i. Hedef proteinin kaynağı ve proteinin kaynaktaki lokasyonu (intrasellüler, membrana-bağlı veya ekstrasellüler). ii. Hedef proteinin ekspresyon düzeyi. iii. Hedef proteinin fizikokimyasal özellikleri. iv. Saflaştırmanın amacı. Başlangıç materyalinde bulunan kirleticilerin (kontaminantların) çeşitliliği ve derişimleri ise örnek materyalinin elde edildiği kaynağa bağlı olarak değişecektir. Şayet, saflaştırılmak istenen hedef protein intrasellüler bir protein ise protein kaynağından bu proteini de içeren ham özütün elde edilmesi için seçilecek olan hücre parçalama yöntemi, protein kaynağının özelliklerine bağlı olmalıdır. Hedef proteinin intrasellüler ya da ekstrasellüler olmasına bağlı olarak, ham özütün önsaflaştırılmasında ve yoğunlaştırılmasında uygulanacak yöntemler de değişecektir. Bunun yanı sıra, hedef proteinin ekspresyon düzeyi de saflaştırma protokolü üzerinde etkili olacaktır. Örneğin, hedef proteinin ekspresyon düzeyinin düşük olması durumunda, çok fazla miktarda protein kaynağının özütlenmesi ve daha sonra da elde edilen protein özütünün kromatografik ayrıştırması (seperasyonu) için önemli bir oranda yoğunlaştırılması gerekebilir. Bunun aksine, şayet hedef proteinin ekspresyon düzeyi yüksekse, ham protein özütünün yoğunlaştırılmasına gerek kalmayabilir. Hedef proteinin fizikokimyasal özelliklerinin saflaştırma protokolü üzerine bir etkisinin olacağı ise gayet açıktır. Çünkü, protein karışımlarındaki protein moleküllerinin fraksiyonlanmasında, bu moleküllerin çözünme özelliği, moleküler büyüklüğü, yüzey hidrofobisitesi
2 Doç. Dr. Münir TUNCER ve elektriksel yükü gibi fizikokimyasal özelliklerindeki farklılıklardan yararlanılmaktadır. Ham özütlerden bazı rekombinant proteinlerin saflaştırılması gerektiği durumlarda ise hedef proteinin saflaştırılmasında yardımcı olmak amacı ile, protein mühendisliği teknikleri kullanılarak bu proteine oldukça belirgin bir fizikokimyasal özellik kazandıran bir etiket (işaret) bağlanabilir. Bu etiket ise bu rekombinant proteinin diğer kirleticilerden çok daha kolay olarak ayrıştırılmasında kullanılabilir (bkz. kısım 1.8.2). Protein üretimi (kaynak aracılığı ile veya kaynak içinde) Proteinlerin kaynaktan özütlenmesi Yoğunlaştırma / Ön-saflaştırma Yüksek çözünürlüklü kromatografik teknikler ile saflaştırma Şekil 1.1: Protein saflaştırmada takip edilen genel bir protokol şeması. Bu protokolden farklı yaklaşımların izlenmesi de elbette mümkündür. Saflaştırma protokolü üzerine etkisi olan diğer önemli bir faktör ise saflaştırmanın amacıdır. Şayet hedef proteinin saflaştırılması, tamamı ile akademik bir amaçla yapılıyorsa, bu durumda en önemli amaç, genellikle proteinin homojen olarak elde edilmesi olmaktadır. Bu durumda, homojen (saf) bir protein solüsyonunun elde edilmesi için gereken basamakların sayısı, prosedürün süresi, son-ürünün maliyeti ve verimliliği gibi konular ikinci planda kalmaktadır. Şayet hedef protein ticari bir uygulama amacı ile saflaştırılıyorsa, bu durumda saflaştırma prosedürünün maliyeti ve teknik faktörler çok daha önemli olmaktadır. Bunun yanı sıra hedef proteinin saflık derecesi, gerekli olan minimum düzeyde olacaktır. Saflaştırılmak istenen proteinin miktarı veya istenilen saflık derecesi de saflaştırma protokolünü etkileyecektir. Akademik amaçlı çalışmalarda, saflaştırılmış olan proteinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalarının yapılabilmesi için genellikle birkaç yüz miligram ile 1 g arasında saf protein yeterli olmaktadır. Bunun aksine, ticari bir uygulamada kullanılmak amacı ile saflaştırılmış olan proteinlere daha fazla miktarlarda gereksimin duyulmakta ve saflık düzeyleri ise uygulama amaçlarına göre değişmektedir (Tablo 1.1). Tablo 1.1: Saf bir proteinin, akademik veya ticari amaçla kullanılması durumunda gerekli olan miktarı (Boyer, 2000). Amaç Kütle spektrofotometre çalışması Protein dizileme/elektroforetik analiz Genel fonksiyon/fizikokimyasal çalışmalar Uygulama-araştırmaları için özel ticari proteinler In vitro diyagnostik testler için ticari enzim/antikor In vivo terapötik amaçlı kullanılan proteinler; Gauchers hastalığı gibi düşük-insidentli hastalıkların tedavisi In vivo terapötik amaçlı kullanılan proteinler; Diyabet ve hemofili gibi yüksek-insidentli hastalıkların tedavisi Büyük miktarlarda endüstriyel uygulamalar Gıda sanayi uygulamaları için/ile süt-türevi proteinlerin üretimi Miktar ng-μg düzeyinde (saf) μg düzeyinde (saf) mg-g düzeyinde (saf) yüzlerce mg 100 g (orta saflıkta) g-kg düzeyinde (orta/yüksek saflıkta) yüzlerce g 10 kg düzeyinde (yüksek saflıkta) 10 kg yüzlerce kg düzeyinde (yüksek saflıkta) >1000 kg düzeyinde (genellikle ham) >100 000 kg düzeyinde (farklı saflıkta) 1.2. Biyokimyasal Araştırmalara Genel Yaklaşım Protein çalışmalarında, genellikle kompleks bir karışımdan özel bir proteinin saflaştırılması gerekmektedir. Analitik ayrıştırmalarda amaç, proteinlerin tanımını ve küçük miktarda da olsa varlığını belirlemektir. Bu amaçla yapılan çalışmalarda, genellikle saflaştırılması gerçekleştirilen
1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER Doç. Dr. Münir TUNCER 3 proteinin geri-kazanılması gerekmez. Preparatif ayrıştırmalarda ise temel amaç, hedeflenen proteinin mümkün olduğunca saf olarak elde edilmesi ve maksimum düzeyde geri-kazanılmasıdır. Proteinin saf olarak elde edilmesi ise, daha sonra yapılacak olan fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin belirlenmesi için gereklidir. İstenilen proteinin ayrıştırılması ve saflaştırılması için analitik mi yoksa preparatif ayrıştırma tekniğinin mi kullanılacağı ise genellikle, preparatif tekniğin çok fazla miktarda örneğe ihtiyaç duyması ve büyük oranda geri-kazanımını gerektiren tekniklerin kullanılmasını gerektirmesine bağlı olarak belirlenir. Analitik ayrıştırma metodu genellikle, aranan proteinin karışım içerisinde bulunup bulunmadığının kalitatif olarak belirlenmesini sağlayan, kestirme bir yol olarak kullanılmaktadır. Bir karışım içerisinde aranan bileşiğin varlığından şüpheleniliyorsa, analitik ayrıştırma işlemi esnasında bu bileşik ile aynı davranan ve özellikleri bilinen bir bileşik (standart) kullanılır (bkz. kısım 2.9). Böylece, standart ile aranmakta olan bileşiğin asseyi (reaksiyon testi), yüksek çözünürlük gösteren bir teknik aracılığı ile aynı şartlar altında ve aynı muamele ile yapıldığında, standart bileşik muhtemelen aranan bileşik ile aynı davranışı gösterecektir. Bu teknik ise, aranmakta olan bileşiğin saflaştırma işlemleri sonrasında yapısal özelliklerini belirlemek için yapılan fiziksel metotların da gerekliliğini ortadan kaldıracaktır. Şayet, biyolojik materyallerde aranmakta olan bileşiğin kendine özgü bazı özellikleri varsa, bu bileşiğin kantitatif olarak tanımlanmasını sağlamak ve derişimini belirlemek için izolasyon ve saflaştırma (pürifikasyon) gibi ön-işlemlere gerek olmayabilir. Aranmakta olan bileşiğin kendine özgü özelliklere sahip olması, bunların enzim aktivite tayinlerinin (assey) ham özütlerden, intakt hücrelerden ve organellerden de yapılmasına olanak sağlamaktadır. Şayet, aranmakta olan bileşik, kendine özgü bazı özelliklere sahip değilse ya da bu özellikler henüz bilinmiyorsa, bu molekülün analizinin yapılmadan önce saflaştırılması gerekmektedir. Saflaştırma işlemlerinde kullanılan yöntemler ise hedef bileşiğin bir miktarının kaybına yol açmaktadır. Bu nedenle, saflaştırma işlemlerinde uygulanacak olan prosedürlerin sayısının mümkün olduğunca minimumda tutulması gerekmektedir. Aynı zamanda, saflaştırma işlemlerinde kullanılacak yöntemlerin, çok az miktardaki örneklerle çalışılması durumunda dahi, yüksek oranda çözünürlük sağlaması amaçlanmaktadır. Bileşiklerin ayrıştırılmasında, yüksek çözünürlük sağlayan teknikler ise genellikle az miktardaki örneklerle sağlanabildiği için, fazla miktardaki örneklerin uygulanmasına elverişli değildirler. Preparatif ayrıştırma işlemlerinde, normal prosedürlerin ilk basamağı yüksek ayrıştırma kapasitesine sahip bir metot olmasına rağmen, bu metot genellikle düşük çözünürlükte olmaktadır. Çöktürme, diyaliz, adsorbsiyon, sıvı-sıvı kromatografisi ve dağılma (partisyon) kolon kromatografisi gibi tekniklerin her birisinin bir diğerine göre avantajı bulunmakta ve belki de fazla miktardaki örnekler ile çalışma olanakları sunmaktadırlar. İyon değiş-tokuş, jel filtrasyon ve affinite kromatografisi, HPLC ve preparatif jel elektroforezi gibi yüksek çözünürlük sağlayan metotlardan bazıları ise daha sonraki aşamalarda saflaştırma işleminin son aşaması olarak kullanılabilmektedir. Saflaştırma işlemi esnasında kullanılan yöntemlerden çoğu, saflaştırılmaya çalışılmakta olan molekülün özelliklerinden yararlanılarak seçilmektedir. Bu nedenle, hedef molekülün özelliklerinin çoğunun kullanılmasına izin veren yöntemlerin seçilmesi, bir önceki saflaştırma yöntemine oranla molekülün saflığını biraz daha artırabilmektedir. Saflaştırma işlemlerinde kullanılan kromatografik teknikler ise daha sonraki bölümlerde ayrıntılı olarak ele alınmaktadır. Bir proteini saflaştırmak istediğimizde, teorik olarak birden fazla metodun kullanılması mümkün olabilir, fakat bu metotlardan birisini tercih etmek durumunda kaldığımızda ise pratikte en uygun olan metodu seçmek gerekmektedir. Saflaştırılmak istenen proteinin ayrıştırılmasında kullanılacak yöntem seçilirken, birkaç kriterin de göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Bu kriterler ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir:
4 Doç. Dr. Münir TUNCER i. Ayrıştırma işlemi, analitik mi yoksa preparatif amaçlı mı olacak? Buna bağlı olarak, metodun çözünürlüğü ve kapasitesi göz önünde bulundurulmalıdır. ii. Hedef proteinlerin çözünme özelliği, göreceli moleküler kütlesi ve elektriksel yükü gibi özellikleri göz önüne alınmalıdır. iii. Özel muameleler esnasında hedef proteinin kararlılığı göz önünde bulundurulmalıdır. iv. Literatür taraması yapılarak, başarılı şekilde uygulanmış olan saflaştırma yöntemleri göz önüne alınmalıdır. v. Uygulanacak yöntem için gerekli olan materyal ve deneyimin varlığı dikkate alınmalıdır. vi. Uygulanacak olan saflaştırma metodunun maliyeti dikkate alınmalıdır. Saflaştırma işlemine başlamadan önce, kullanılacak yöntemler incelenerek karar verilir fakat, bu arada projenin amacına uygun olan yöntemin seçilmesi kadar, elde var olan araç-gereçler de dikkate alınmalıdır. Saflaştırılmak istenen molekül ise ya in vivo ya da in vitro olarak bulunmaktadır. Buna rağmen, in vivo ve in vitro modeller arasındaki farklılıkları belirlemek oldukça zordur. In vivo tekniklerde genellikle mikroorganizmalar, multisellüler organizmalar ve bitkilerin tamamı, hayvanların tamamı ya da bu hayvanların organları kullanılmaktadır. 1.2.1. İn vivo Çalışmalar In vivo olarak biyokimyasal deneylerde, bütün bir bitkinin veya hayvanın kullanılması, hücre kültürü gibi yöntemlere alternatif olarak oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Hayvanlar, medikal veya klinik amaçlı çalışmalar için oldukça yaygın olarak kullanıldıkları gibi, tarımsal ve hayvancılık alanında; aşıların, antikorların ve hormonların üretiminde; kimyasal tanımlamaların yeterli olmadığı durumlarda ise ilaçların veya diğer biyolojik materyallerin test edilmelerinde kullanılmalarının yanı sıra, toksikoloji çalışmalarında da sıklıkla kullanılmaktadırlar. Hayvanlarla yapılan biyokimyasal çalışmaların çoğu yabancı maddelerin, ksenobiyotiklerin (ilaçlar ve besin katkı maddeleri gibi) metabolizmasının incelenmesi yönünde olmakla birlikte, elde edilen sonuçlar doğrultusunda, bazı maddelerin insan üzerinde kullanılmadan önce klinik deneylerinin tamamlanmış olması, gereği ile de hayvanlar kullanılmaktadır. Fareler, ratlar ve Gine domuzları ise üretim maliyetlerinin düşüklüğü ve denek olarak kullanımlarının kolaylığı nedeniyle, biyokimyasal çalışmalarda en çok kullanılan deney hayvanlarıdırlar. Bunun yanı sıra tavşanlar, kediler, köpekler, Marmoset maymunları ve babunlar da biyokimyasal deneylerde kullanılırlar. Son zamanlarda, bütün bir hayvanın deney amaçlı kullanılmasına olan tepkiler ve bu laboratuvar hayvanlarının yetiştirilmesi için gerekli olan harcamaların yani maliyetin yüksekliği, başka alternatif deney yöntemlerinin araştırılmasını zorunlu kılmıştır. Bunun için temel yaklaşım ise mümkün olan ve uygulanabilen durumlarda, bütün bir hayvanın yani in vivo deneylerin yerine in vitro deney koşullarının gerçekleştirilmesidir. 1.2.2. İn vitro Çalışmalar In vitro çalışmaları, biyolojik olarak üretilen materyallerin yapay, fiziksel ve kimyasal ortamlarda inkübasyonuna dayanır. In vitro terimi, enzim preparasyonları, izole edilmiş organeller, intakt mikroorganizmalar ve hayvan ve bitkilerin parçalanmış kısımları için de kullanılmaktadır. In vitro çalışmalarda ortam koşulları, hücrelerin, doku ve organ kültürlerinin, hayvan ve bitiklerin minimum düzeyde büyümeyi, farklılaşmayı ve gelişmeyi sağlayacak şekilde seçilebilir. Hücre ve doku kültürü metotlarının özel avantajı ise diğer bulaşıcı hücreler tarafından oluşturulan biyokimyasal ve fizyolojik sınırlamaları azaltmasıdır. Bu yaklaşım, biyolojik bilimlerde oldukça geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Bu yöntemin en temel avantajı ise, hücre kültürlerinde hücrenin gelişme potansiyelinin araştırılmasına olanak sağlamasıdır. In vitro deneysel çalışmalarının