TÜBİTAK-BİDEB Kimya Lisans Öğrencileri (Kimyagerlik, Kimya Öğretmenliği, Kimya Mühendisliği) Araştırma Projesi Eğitimi Çalıştayı KİMYA-2 ÇALIŞTAY 2011 ANTİ-BAKTERİYEL BOYAR KAPLAMA ÇÖZELTİSİ HAZIRLANMASI PROJE EKİBİ GRUP BAKTERIYOFAJ Emre YAVUZ Deniz DEMİRKAPI Berna BATTAL PROJE DANIŞMANLARI Prof.Dr.Mehmet KANDAZ Doç.Dr.Mustafa SÖZBİLİR KEPEZ/ÇANAKKALE 20-28 TEMMUZ-2011 1
2
İÇİNDEKİLER SAYFA NO Proje Kapağı.. 1 İçindekiler.. 2 Proje Özeti.. 3 Giriş.. 5 Deneysel Çalışma.. 7 Sonuç ve Değerlendirme.. 11 Kaynaklar.. 18 Kısa Özgeçmiş.. 20 3
ÖZET Boyar maddeye kimyasal etkileşimlerle gümüş bağlayarak anti-bakteriyel etki kazandırıldı. Gümüşe duyarlı maddenin karakterizasyonu (bağlanmanın gerçekleştiği) UV-vis uygulamasıyla tespit edildi. Elde edilen kaplamada partikül boyutu (DLS) ölçümü yapıldı. Kaplamanın bakteriyel etkisi Gram(+) S. aureus (ATCC 25923) ve E. faecalıs (ATCC 29212) ve Gram (-) E. Colı (ATCC 25922) ve P. aerugınosa (ATCC 27853) bakterileri üzerinde test edildi. Hazırlanan çözelti çeşitli yüzeylere uygulanarak yüzey tutunumu kontrol edildi. PROJE AMACI Anti-bakteriyel etkiye sahip boyar maddenin sentezi, çeşitli yüzeylere uygulanması ve anti-bakteriyel etkisinin tespiti. PROJE HEDEFLERİ Boyar maddeye gümüş partiküllerinin bağlanması ve boyar maddeye antibakteriyel özelliğin kazandırılmasını sağlamak, çeşitli yüzeylerde ince bir film tabakası oluşturularak uygulanabilirliğinin gözlenmesi ve antibakteriyel etkisinin Gram(+) S. aureus (ATCC 25923) ve E. faecalıs (ATCC 29212) ve Gram (-) E. Colı (ATCC 25922) ve P. aerugınosa (ATCC 27853) bakterileri üzerine etkisinin tespitidir. 4
1.GİRİŞ Ağır metal iyonları arasında gümüş, yüksek antimikrobiyal aktivitesi ve dikkat çekecek derecedeki düşük insan toksisitesi ile en yararlısıdır [1]. Antimikrobiyal aktivitesinin ilk modern tanımı gümüş kaplarda Aspergillus niger yetiştiremediğini gözlemleyen Raulin tarafından 1869 da yapılmıştır [2]. Kolloidal gümüşün, Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (Food and Drug Administration, FDA) tarafından yara tedavisi için etkili olduğu 1920 lerde kabul edilmiştir. Mikrobiyal bulaşma, çeşitli alanlarda özellikle medikal cihazlarda, ilaçlarda, sağlık hizmetlerinde, hijyenik uygulamalarda, su arıtma sistemlerinde, hastane ve diş cerrahisi ekipmanında, tekstilde, gıda paketlemede, gıda saklamada en ciddi sorunlardan biri olarak büyük önem taşımaktadır. Antimikrobiyaller, birçok malzemeye kalite ve güvenlik kazandırmaları nedeniyle akademik araştırmalarda ve endüstride ilgi çekmektedir [3]. İnsanoğlunun bakteriler, küfler, mayalar ve virüsler gibi mikroorganizmalar tarafından yaşadıkları çevrede sık sık enfekte olması çeşitli doğal ve inorganik maddeleri içeren antibakteriyel malzemelerin araştırılmasını yoğunlaştırmıştır. Katalik aktivite, optik özellikler, elektronik özellikler, antimikrobiyal aktivite ve magnetik özellikler gibi fizikokimyasal karakteristiklerinden dolayı metal nanopartiküller, kapsamlı olarak çalışılmaktadır [4]. Metal nanopartiküller arasında gümüş nanopartiküllerin inhibitör ve bakterisidal etkilere sahip oldukları bilinmektedir [5]. İnert doğası ve güçlü antimikrobiyal etkisi nano gümüşü gıda işleme ve medikal ekipman endüstrisinde cazip bir seçenek haline getirmiştir. Nano gümüşün medikal plastiklerde ve gıda işlemede antimikrobiyal kullanımının iki ana nedeni vardır. Bunlardan biri, bakterilerin ve mantarların nesnenin fiziksel özellikleri üzerindeki etkilerini durdurmak, diğeri ise infeksiyon kaynağı olabilecek zararlı bakterilerin gelişimini önlemektir [6]. Gümüş, antibakteriyel özelliğe sahip elementtir. Dolayısıyla bu kaplamalar antibakteriyel özellikler gösterirler. Gümüşün birçok alandaki mikroorganizmayı inaktif hale getirici ve bakterinin canlılık faaliyetini sonlandırıcı etkisi olduğu bilinmektedir. Bu nedenle gümüş temelli bileşikler birçok bakteri uygulamalarında kullanılmaktadır. Genellikle, ağır metallerin içindeki yüzey proteinlerinde bulunan thiol gruplarıyla reaksiyona giren iyonlar yaydıkları bilinmektedir. Bu proteinler bakteri hücre zarının dışına çıkarlar ve hücre zarı üzerinden besleyicilerin geçişini sağlarlar.[7] 5
Gümüş, thiol gruplarındaki proteinlerle etkileşime girerek onları etkisiz hale getirir ve zar geçirgenliğini düşürerek hidrojen katyonuyla yer değiştirerek böylece bakteri hücrelerinin ölümüne neden oldukları bilinmektedir. Şekil 1 de Escherichia coli hücresi ve 12 saat boyunca gümüş nitrat ortamında bulunan E. Coli görülmektedir. Gümüşe maruz kalan bir bakteri hücresinde, hücre zarı ile hücre duvarı arasında boşluk oluşur. Daha sonra hücre duvarı granüllerle çevrilir ve bu granüller hücre duvarını yok ederek hücrenin ölmesine neden olurlar. Sekil 1: a) Sağlıklı E. Coli bakterinin iç yapısı b) Gümüşe maruz kalan E. Coli bakterisi (1) Yüzey teknolojisi günümüzde korozyona dirençli, fiziksel ve mekanik özellikleri gelişmiş, dekoratif özellikli malzemeler üretmek amacıyla kullanılan bir teknolojidir. Malzemelerin yüzey özelliklerinin geliştirilmesi için kullanılan kaplama teknolojisi, bu malzemelerin üretimi için uygun bir yöntemdir. Malzemelerin partikül büyüklüğünü azaltmak, biyouyumluluklarını arttırmak için etkili ve güvenilir bir yoldur. Nitekim nanoteknoloji boyut kısıtlamalarını gidermeye yardım etmektedir. Bunun yanında nanomalzemeler, biyobilim ve tıp gibi farklı alanlardaki uygulamaların kolaylaştırılmasında daha iyi verim elde etmek için modifiye edilebilmektedir [8]. Nano ölçekli metal partiküllerin biyoaktivitesi ve moleküler problar olarak kullanımı ilginin giderek arttığı araştırma alanları arasında yer almaktadır. Normal metal ile karşılaştırıldığında geniş yüzey alanına ve yüksek reaktiviteye sahip nano ölçekli metal partiküller dikkate değer fiziksel, kimyasal ve biyolojik özellikler gösterir. Nano Ag nin biyosidal ajanların özel bir sınıfı olarak kullanımına giderek artan bir ilgi vardır [9]. 6
Gümüş nanopartiküllerin düşük konsantrasyonlarda antimikrobiyal etki gösterdikleri, antibakteriyel özelliklerin nanopartiküllerin yüzey alanı ile ilişkili olduğu, partikül boyutunun küçülmesinin dolayısıyla yüzey alanının artışının antibakteriyel aktivite için daha fazla etki sağladığı belirlenmiştir [10]. Nanomalzemelerin bol uygulama alanları olmasına rağmen, bu malzemelerin insan sağlığı ve çevre üzerindeki etkileri konusunda ciddi bilgi eksikliği mevcuttur. Nanomalzemelerin risk takdiri için nanopartiküllerin toksisitesi hakkında sınırlı çalışmalar bulunmaktadır [11]. Anti-bakteriyel kaplama çözeltisinin kullanım alanları öncelikli insanların sürekli etkileşim içerisinde bulundukları yerler olup; kapı kolları, toplu tasıma araçları, metal paralar, lavabolar, duşakabin kenarları, mutfak tezgahları, anahtarlıklar, telefon kapakları, bilgisayar klavye-mouse gibi çeşitli yüzeylerde kullanılmaktadır. DENEYSEL ÇALIŞMA Cihazlar UV spektroskopi : Farklı derişimlerde gümüş içeren boyar maddeler, etilalkolde 1:10 oranında seyreltildikten sonra ayrı ayrı kuvars küvete alındı ve UV-Spektroskopisi (Perkin Elmer, Lambda 35 UV/VIS Spectrometer) ile UV-spektrumları elde edilmiştir. Zetasizer: Gümüş içeren boyar madde çözeltisinden çözücü uçurularak kalan katı film su içerisinde disperse edilerek kuvars küvete alındı ve Particle Size Analyzer ile kompleksin partikül boyutu (DLS) ölçüldü. Kullanılan kimyasallar Boyar madde (Ftalosiyanin) Etilalkol Metilalkol Tetrahidrofuran AgNO 3 7
Gram(+) S. aureus (ATCC 25923) E. faecalıs (ATCC 29212) Gram (-) E. Colı (ATCC 25922) P. aerugınosa (ATCC 27853) MUELLER-HINTON Broth sıvı besiyeri MUELLER-HINTON Agar katı besiyeri Araç ve gereçler: Cam kavanoz (10 adet) Balon joje Beher Manyetik karıştırıcı Balık Santrifüj tüpü Spatül Pens Pipet Petri kabı (4 adet) Pamuklu silgiç (4 adet) Cetvel Terazi 8
Yöntem RS RS N N N N M N N N N SR AgNO 3 /MeOH H 2 O SR M= Zn = HS M= Zn M'=Ag + Sekil.2 Reaksiyon Mekanizması Bu proje de boyar madde olarak görünür bölgede absorpsiyon yapan ftalosiyanin boyar maddesi, Ag sensörü olarak kullanılmıştır. Amaç AgNO 3 toksik etkisinden dolayı gümüşü boyar maddeye kimyasal zayıf iyon-dipol bağlarıyla seçici olarak bağlayıp boyar maddenin bakteri ile yüzeyden etkileşim yaparak bakteri hücre duvarındaki proteinlerde bulunan sülfür donör atomları ile kimyasal etkileşime girerek bakteriyi inaktif hale getirmek (ölümü) hedeflenmiştir. Direkt olarak kullanılamayan Ag ü boyar maddenin yüzeyine (1:4 veya fazlası) bağlayarak boyar maddenin yüzeyi büyük oranda Ag ile kaplanmıştır. Bu çalışmada boyar maddenin alkolde çözünmesi gümüşün bağlanmasını kolaylaştırmıştır. 1:4 oranında su/etoh ile AgNO 3 çözülerek boyayla etkileşime sokulmuştur. Reaksiyon-1: 0,004 g AgNO 3 2 ml suda çözüldü. Üzerine 50 ml etilalkol ilave edilerek manyetik karıştırıcıda yarım saat karıştırıldı. 1:10 oranında etanolle seyreltilerek UV-Vis spektrumu alındı. Reaksiyon-2: 0.006 g AgNO 3 2 ml suda çözüldü. Üzerine 50 ml etilalkol ilave edilerek manyetik karıştırıcıda yarım saat karıştırıldı. 1:10 oranında etanolle seyreltilerek UV-Vis spektrumu alındı. Reaksiyon-3: 0,01 g AgNO 3 2 ml suda çözüldü. Üzerine 50 ml etilalkol ilave edilerek manyetik karıştırıcıda yarım saat karıştırıldı. 1:10 oranında etanolle seyreltilerek UV-Vis spektrumu alındı. 9
Reaksiyon-4: 0,004 g AgNO3 3 ml suda çözüldü. Üzerine 50 ml etilalkol ilave edilerek manyetik karıştırıcıda yarım saat karıştırıldı. 1:10 oranında etanolle seyreltilerek UV-Vis spektrumu alındı. Reaksiyon-5: 0,008 g AgNO3 3 ml suda çözüldü. Üzerine 50 ml etilalkol ilave edilerek manyetik karıştırıcıda yarım saat karıştırıldı. 1:10 oranında etanolle seyreltilerek UV-Vis spektrumu alındı. Şekil.3 Farklı derişimlerde hazırlanan 5 farklı çözelti Projemizde Ag+ ün boyar maddeye bağlandığı UV-Vis spektrometredeki değişimlerle izlendi. Oluşan kompleksin UV-Vis ve başlangıç maddenin UV-Vis i farklı olduğundan boyanın Ag bağlama(sensor) özelliği belirlenmiştir. Gerçekleştirdiğimiz reaksiyonlarda gümüşün en iyi bağlandığı system için (reaksiyon-5) partikül boyutu ölçüldü. Kompleksin partikül boyutunu tespit etmek için, çözgeni uçurulmuş kompleks suda disperse edilerek Particle Size Analyzer da ölçüm yapılmıştır. Projenin üçüncü aşaması boya yüzeyine bağlanan Ag içeren boyanın bakteri ortamına antibakteriyal etkisi incelenmiştir. Bu işlem disk difüzyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. 4 petri kabındaki besiyerlerinin her birine Gram(+) S. aureus (ATCC 25923) ve E. faecalıs (ATCC 29212) ve Gram (-) E. Colı (ATCC 25922) ve P. aerugınosa (ATCC 27853) bakterileri ekildi. Hazırlanan farklı çözeltiler 6mm çapındaki disklere 0.5 ml emdirildi. 1 gün sure ile 37 de etüvde bekletilerek disk çevresindeki bakteri oluşumu yorumlanarak anti-bakteriyolojik etki tespit edildi. Bu çalışma THF çözücüsü kullanılarak da yapılmıştır. Fakat boyalı yüzeyleri THF nun çözme etkisinin ve deformasyona sebep olduğu görülmüştür. Bu sebepten dolayı çözücüyü değiştirme metodu denenmiş böylece başarılı olunmuştur. 10
SONUÇ VE DEĞERLENDİRME UV-Vis Sonuçlarının Değerlendirilmesi Sekil.4 Reaksiyon-1 UV-Vis Spektrumu 11
Sekil.5 Reaksiyon-2 UV-Vis spektrumu Şekil.6 Reaksiyon-3 UV-Vis spektrumu 12
Şekil.7 Reaksiyon-4 UV-Vis spektrumu Şekil.8 Reaksiyon-5 UV-Vis spektrumu 13
Spektrumlarda görüldüğü gibi gümüşün miktarı arttıkça sisteme en uygun bağlanması reaksiyon-5 te görülmektedir. DLS Sonuçlarının Değerlendirilmesi Kaplama çözeltisinin Particle Size Analyzer ölçümleri sonucunda partikül boyutunun yaklaşık 530 nm olduğu tayin edilmiştir. 14
Anti-bakteriyel Özelliğinin İncelenmesi Sekil.9 Petri kabına bakterilerin ekilip, disklerin yerleştirilişi 15
Şekil.10 Petri kabına bakterilerin ekilip, disklerin yerleştirilişinden 24 saat sonra S.A E.F E.C P.A 1:Reaksiyon-5 12 mm 10 mm 10 mm 11 mm 2:THF sistem-1 16 mm 15 mm 15 mm 15 mm 3:THF sistem-2 20 mm 19 mm 20 mm 17 mm 4:THF system-3 12 mm 11 mm 9 mm 11 mm 5:Reaksiyon-4 12 mm 11 mm 9 mm 11 mm THF 13 mm 15 mm 19 mm 14 mm G 18 mm 20 mm 16 mm 19 mm V 15 mm 23 mm _- - Tablo1: Deney sonuçlarının bakteri çeşitlerine göre değerlendirilme tablosu. THF çözgeni tabloda görüldüğü gibi kendi başına antibakteriyel özellik gösterdiği görülmektedir. Çözgenli sistem kaplama olarak yüzeye uygulandığında yüzey deformasyonuna sebep olduğundan dolayı kaplama çözgeni olarak kullanılması uygun olmamıştır. Etilalkollü sisteme baktığımızda (4. Ve 5. Reaksiyon) referans olan antibiyotiklere göre düşük etki göstermiş olsalarda antibakteriyel etkinliği resimde ve tabloda görüldüğü gibi önemsenebilecek ölçüdedir. 4. ve 5. reaksiyonlarda 5. Reaksiyonun antibakteriyel etkinliği tabloda görüldüğü gibi daha fazladır. 16
Hazırlanan Çözeltilerin Farklı Yüzeylere Kaplanması: Şekil.11 Kaplama Çözeltisinin Farklı Yüzeylere Uygulanması Şekil.12 Kaplama Çözeltisinin Kapı Koluna Uygulanması Etanollü sistem ve THF li sistemin farklı yüzeylere uygulandı. Fakat THF li sistemin yüzeye zarar verdiği resimde de görülmektedir. Bu sebeple THF li system yerine sağ resimde de görüldüğü gibi etanollü sistem uygun görülmüştür. 17
KAYNAKLAR [1] SCHIERHOLZ, J.M., LUCAS, L.J., RUMP, A., PULVERER, G., Efficacy of silver-coated medical devices, Journal of Hospital Infection, 40:257-262, 1998. [2] CLEMENT, J.L., JARRETT, P.S., Antibacterial silver, Met Based Drugs, 1(5-6):467-482, 1994. [3] KENAWY, el-r., WORLEY, S.D., BROUGHTON, R., The chemistry and applications of antimicrobial polymers: A state-of-the-art review, American Chemical Society, 8(5):1359-1384, 2007. [4] SAHAHVERDI, A.R., FAKHIMI, A., SAHAHVERDI, H.R., MINAIAN, S., Synthesis and effect of silver nanoparticles on the antibacterial activity of different antibiotics against Staphylococcus aureus and Escherichia coli, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 3:168-171, 2007. [5] CHO, K.H., PARK, J.E., OSAKA, T., PARK, S.G., The study of antimicrobial activity and preservative effects of nanosilver ingredient, Electrochimica Acta, 51:956-960, 2005. [6] SIMPSON, K., Using silver to fight microbial attack, Plastics Additives & Compounding, September/October, 32-35, 2003. [7] http://www.eng.auburn.edu/users/hurstkm/nanosilver.pdf [8] KIM, J.S., KUK, E., YU, K.N., KIM, J.H., PARK, S.J., LEE, H.J., KIM, S.H., PARK, Y.K., PARK, Y.H., HWANG, C.Y., KIM, Y.K., LEE, Y.S., JEONG, D.H., CHO, M.H., Antimicrobial effects of silver nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3:95-101, 2007. [9] LOK, C.N., HO, C.M., CHEN, R., HE, Q.Y., YU, W.Y., SUN, H., TAM, P.K.H., CHĠU, J.F., CHE, C.M., Silver nanoparticles: Partial oxidation and antibacterial activities, J Biol Ġnorg Chem, 12:527-534, 2007. [10] BAKER, C., PRADHAN, A., PAKSTIS, L., POCHAN, D.J., SHAH, S.I., Synthesis and antibacterial properties of silver nanoparticles, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 5(2):244-249, 2005. [11] BRAYDICH-STOLLE, L., HUSSAIN, S., SCHLAGER, J.J., HOFMANN, M.C., In vitro cytotoxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells, Toxicological Sciences, 88(2):412-419, 2005. 18
KATKIDA BULUNANLAR Çalıştay koordinatörü Prof. Dr. Mehmet AY a Danışman Hocalarımız Prof.Dr.Mehmet KANDAZ-Doç.Dr.Mustafa SÖZBİLİR e ve Ayrıca katkılarından dolayı; Doç.Dr.Cahit AKGÜL Neşe DİŞÇİOĞLU Emre SEFER Diğdem ERDENER Funda YILDIRIM Memduh BİLMEZ e çok teşekkür ederiz 19
ÖZGEÇMİŞLER Berna BATTAL 1989 yılının Aralık ayında Ankarada doğdu. İlk ve orta öğrenimini Anadolu İlköğretim okulunda, lise eğitimini ise Prof.Dr.Şevket Raşit Hatipoğlu Lisesinde almıştır.2006 yılında liseden mezun olduktan sonra Gazi Üniversitesi Kimya Mühendisliği bölümünü kazandı. Halen aynı üniversitenin 4. Sınıfında eğitim - öğretim hayatına devam etmektedir. Laboratuar stajını Maden Tetkik ve Arama Genel Müdürlüğünde, işletme stajını Aselsanda yapmıştır. Bildiği yabancı dil İngilizcedir. Deniz DEMİRKAPI 1988 yılının Ağustos ayında İstanbulda doğdu. İlk ve orta öğrenimini Recaizade Ekrem İlköğretim okulunda, lise eğitimini ise Beyoğlu Fındıklı Lisesinde(yabancı dil ağırlıklı) almıştır.2006 yılında liseden mezun olduktan sonra Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümünü kazandı. 24. Ulusal Kimya Kongresinde ve 3. Ulusal Anorganik Kimya Kongresinde poster sunumu yaptı. Bildiği yabancı dil İngilizcedir. Emre YAVUZ 1989 yılının nisan ayında Rizede doğdu. İlk ve orta öğrenimini Atatürk İlköğretim okulunda, lise eğitimini ise Hasan Sağir Lisesinde almıştır. 2006 yılında liseden mezun olduktan sonra 2008 yılında Akdeniz Üniversitesi Kimya Bölümünü kazandı. Halen aynı üniversitenin 4. Sınıfında eğitim - öğretim hayatına devam etmektedir. Laboratuar stajını Nano-en AR-GE Mühendislik Danışmanlık San.LTD.STİ. yaptı. 20
21
22
23