Leishmaniasis Türkiye deki Durum ve Tanı Prof.Dr. Seray Özensoy Töz Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı seray.ozensoy.toz@ege.edu.tr
Leishmaniasis Irak Savaşında 2000 Amerikan Askerinde KL Dünya Sağlık Örgütü önemli hastalıklar listesinde Günümüzde daha yaygın hale gelmesinin nedenleri Seyahatler Savaşlar Bağışık yanıtın azaldığı durumlar Libya da çalışan bir Türk mühendisinde KL (L. major)
38 ilde rapor edildi. Olguların %40 ı Akdeniz Bölgesi nden
2007 2009 KL Vakalarının İlçelere Göre Dağılımı Risk altındaki populasyon 45.913.361
Klinik (Kala-Azar, VL) Genelde 0-12 yaş arası çocuklarda daha nadir erişkinde Kuluçka Dönemi : 10 gün - 2.5 yıl (3-8 ay) Akut - Subakut - Kronik- Asemptomatik seyredebilir Klinik bulgular Ateş Kirli, soluk renk Halsizlik, iştahsızlık Kilo kaybı Büyük dalak ve karaciğer Mikro LAP Diş eti kanamaları Laboratuvar Bulguları Anemi Lökopeni Trombositopeni Albümin/Globülin oranının ters dönmesi Yüksek eritrosit sedimentasyonu
Leishmaniasis Tanısı Klinik Klinik bulgular (VL ve KL ye özgü) Öykü (seyahat, gece açıkta yatma, eşlik eden immüniteyi etkileyebilecek hastalık ve durumlar..) Coğrafi bölge Laboratuvar Mikroskobik direkt tanı ve kültür Serolojik tanı (indirekt tanı) DNA ya dayalı direkt tanı Tedavi izleminde tanı yöntemleri Epidemiyolojik çalışmalarda tanı yöntemleri Örnek gönderme
Sağlık Bakanlığı Genelgesi (2003) KL Olgularında Laboratuar Yaklaşımı KL klinik tanısıyla uyumlu her olgu parazitolojik olarak doğrulanmalı Parazitolojik olarak doğrulama, en sık direk mikroskobik bakı (smear) veya kültür yöntemleri ile yapılır Direkt Mikroskopik Bakıda kullanılacak materyalin elde edilmesi: Lezyon % 70 lik alkol ile iyice temizlenir Lezyon kenarı iki parmak arasında sıkılır ve bir bistüri ( tercihen No:15) ile 0.5 cm uzunluğunda ve 2-3 mm derinliğinde bir insizyon yapılır Gazlı bez ile kan damlası alınır, basıya devam edilerek kanama önlenir Bistürü ucu ile insizyonun iç kısmına kazıma işlemi yapılır ve mümkün olduğunca kansız seröz örnek alınır Örnek lam üzerine yayılır, fikse edildikten sonra Giemsa ile boyanır 100 lük immersiyon objektifi ile mikroskopta incelenir Hücre içerisinde veya dışarısında Leishmania amastigot şekillerinin görülmesi ile parazitolojik tanı konur Etken gösterilerek kesin tanı konulamazsa, KL şüphesinin ortadan kaldırılması ve diğer deri hastalıkları ile ayırıcı tanısının yapılabilmesi için dermatoloji uzmanına yönlendirilir Parazitolojik doğrulamanın yapılamadığı olguların, bir dermatoloji kliniğinde yeniden değerlendirilmesi uygundur.
KL hastasında örnek alımı
Örnekten, NNN besiyerine ekim Yayma preparat hazırlama Giemsa boyama
Kültür: NNN By 24 0 C 5 gr bakteriyolojik agar 2 gr pepton 1 gr NaCl 225 ml distile su Karışım otoklavlanır ve 50 o C ye soğutulur 35-40 ml defibrine tavşan kanı ile karıştırılır ve 45 o C eğimle soğutulur Pasaj sırasında katkılar (Pbss, RPMI, serum fizyolojik)
Deri Leishmaniasisi Laboratuvar Tanısı Preparat Giemsa Boyama Amastigot NNN Besiyerine ekim 6-21 gün Promastigot DNA Esaslı Yöntemler PZR KL tanısında serolojik tanının yeri????
Visseral Leishmaniasis Laboratuvar Tanısı Direkt tanı: parazitin doku örneklerinde görülmesine dayanır PZR: Parazite özgü DNA sekansı çoğaltılmaktadır Kültür: NNN besiyerinde vektörde yaşayan promastigot şekli üretilir
Serolojik Testler- Indirekt Fluoresan Antikor Testi (IFAT) Duyarlılığı en yüksek testlerden birisi Enfeksiyonun çok erken evrelerinde oluşan antikorları saptayabilir 1/50 titrenin üzerindeki titreler anlamlı olabilir ve 1/128 titrenin üzerinde pozitif değerlendirilir Diğer parazitler (Trypanosoma) ile çapraz reaksiyon verebilse de ülkemiz için sorun oluşturmaz Kültürde üretilen promastigotlar ile antijen hazırlanabilir
Serolojik Testler Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Duyarlılığı yüksek Kültürde üretilen Leishmania promastigotlarından antijen hazırlanır ve serum örneği ile çalışılır Epidemiyolojik çalışmalar için basit, hızlı ve ucuz ve çok sayıda örnek birarada çalışılabilir
KL ve VL de ELISA absorbans değerleri ZeyrekFY, Korkmaz M, Ozbel Y, Serodiagnosis of anthroponotic cutaneous leishmaniasis (ACL) caused by Leishmania tropica in Sanliurfa Province, Turkey, where ACL Is highly endemic. Clin Vaccine Immunol;14(11):1409-15. 2007 KL absorbans değerleri VL serumlarına oranla anlamlı olarak düşük (p=0.000) 3.000 2.500 2.000 KL de Absorbans değerleri; (1) Ülseratif lezyonlarda (2) Birden çok lezyon olunca 95% CI ELISA 1.500 1.000 500 0 NT-CL UT-CL VL Control Group
Serolojik Testler - Direkt Aglütinasyon Testi (DAT) Serumda bulunan antikorların promastigotları aglütine etmesine dayalı, gözle değerlendirilebilir İnsanlarda ve köpeklerde VL tanısında yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip Geçirilmiş olgular, akut ve subklinik olgular arasında bir ayrım yapamaz Antijen uzun süre liyofilize halde saklanabilir ve özel cihaza gereksinim göstermez Özel konjugeye gerek yok Endemik bölgelerde rutin tanıda ve epidemiyolojik çalışmalarda rahatlıkla kullanılabilir
Serolojik Testler -Formol Gel Test Ucuz ve basit Diğer sensitivite ve spesifitesi yüksek olan testlere göre yetersiz Bir damla serum %30 formaldehid ile karıştırılır ve 20 dk da beyaz opak bir presipitasyon oluşursa pozitif Enfeksiyon başlangıcından 3 ay sonra pozitifleşir Tedaviden 6 ay sonra negatifleşir Enfeksiyona spesifik olmayıp yükselen IgG ve IgM değerlerini göstermektedir Günümüzde aynı bulguları veren bir çok enfeksiyon ajanı olması nedeniyle kullanımı DSÖ tarafından uygun bulunmamaktadır
Serolojik Testler - Western Blot Sakru N, KorkmazM, Ozbel Y, Ertabaklar H, Sengul M, Toz SO, Investigation of asymptomatic visceral leishmaniasis cases using western blot in an endemic area in Turkey. New Microbiol. 2007 Jan;30(1):13-8. VL hastalarının yaşadığı köylerdeki 82 kişinin serum örnekleri çalışıldı Diğer serolojik testlerle negatif bulunan 6 kişi WB ile pozitif saptandı ve bu kişiler bir yıl süreyle izlenerek asemptomatik olarak değerlendirildi Seropozitif örneklerin WB analizi, a ve b bir yıl arayla iki kez örneklemeyi göstermekte 2 nolu örnek kanıtlanmış VL hastası
Serolojik Testler- Türkiye de rk39 Hızlı Tanı Testi Sonuçları Toz SO, Chang KP, Ozbel Y, Alkan MZ, Diagnostic value of rk39 dipstick in zoonotic visceral leishmaniasis in Turkey. J Parasitol. 2004 Dec;90(6):1484-6. VL hastalarında yüksek duyarlılıkta Bazı KL hastalarında da lezyon kenarından alınan sıvı örneğinde pozitif sonuç alınıyor, bu hastalardaki parazit L. infantum mu?? (yayınlanmamış bilgi) Kanin leishmaniasis tanısında da kullanılıyor Pozitif Negatif
DNA tabanlı tanı (Moleküler Tanı) Leishmania parazitinde kinetoplast ve nükleus DNA ları var DNA ya dayalı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) testinde kinetoplast DNA (kdna) veya nükleer DNA nın (ndna) bu parazite özgü bir bölümü çoğaltılıyor Çok sayıda örnek bir arada çalışılabiliyor Moleküler cut off???? Klasik PZR PZR-RFLP Genlerin türe özgü değişken bölümleri çoğaltıldıktan sonra restriction enzimleri ile kesilerek jelde görüntülenmesi Farklı türler ve aynı tür içindeki değişik gruplar saptanabilir Real Time PZR (Gerçek zamanlı PZR) Klasik PZR deki uygulama hataları azalır Prob kullanıldığı için duyarlılığı daha fazla
Laboratuvara örnek gönderme Mikroskobik bakı ve moleküler tanı: Boyalı ya da boyanmamış yayma preparat (KL de lezyon yayma, VL de kemik iliği yayma preparatı) Moleküler test için VL de EDTA lı kan ve Kİ örneği Kültür: EDTA lı tüpe alınmış lezyon aspirasyonu EDTA lı tüpe alınmış Kİ örneği Serolojik test: Serum örneği
Tanı testleri ile tedavi izlemi Parazitolojik izlem Kontrol kemik iliği aspirasyonu PCR (kan örneği ile) Serolojik izlem Serum örneklerinin saklanması ve eski ve yeni serumların paralel çalışılarak titredeki düşüşün takibi
Olgu 1: 50 yıl geç tanı konmuş bir KL hastası 5-6 yaşlarında yüzünde küçük bir sivilce gibi başlamış Kendisi bir Hekim ve bugüne dek Tüberküloz tedavisi görmüş Tedavi öncesi Mikroskobik bakıda parazit Tedavi sonrası görülmedi IFAT testi 1/1024 titrede pozitif Uzun süreli KL tedavisi ile iyileşme
Olgu 2 Libya da çalışan bir Türk mühendis 2 ay kadar önce kolunda ve bacağında 3 lezyon oluşuyor Alınan örnekte Leishmania paraziti görüldü Gerçek zamanlı PZR ile L. major olduğu saptandı
Olgu 3 2000/TIP-016 nolu BAP Denizli de proje için kan örneği alma sırasında iki yıldır Aplastik anemi tanısı ile takip edildiği öğrenilen 30 yaşında bayan hastanın Çalışmamızda; IFAT: 1/512 POZ, ELISA: POZ, Western Blot: spesifik ve aktif enfeksiyonu destekleyen bantlar Hastaya ulaşıldığında başka bir şehirdeki bir hematoloji biriminde yatmakta olduğu öğrenilmiştir 10 aydan bu yana halsizlik, aşırı kilo kaybı, 2 aydır terleme, üşütme şikayetleri olan hastanın fizik bakısında hepatomegali, 21 cm splenomegali, submental ve servikal lenfadenopatisi olduğu Laboratuvar değerlerinin Hb:6,7g/dl, Htc: %26, Plt:135000mm 3, BK:2000mm3 olduğu Anemi ve myeloproliferatif hastalık ön tanıları ile takip edildiği öğrenilmiştir.
Olgu 3: Retrospektif olarak Kİ tekrar incelendi (2000/TIP-016 nolu BAP)
Amaçlarımız.. (TUBİTAK 2007/107S154 projesi) Türkiye de leishmaniasis epidemiyolojisini anlamak Leishmaniasisin doğudan batıya yayılımının nedenlerini anlamak Hızlı ve hassas tanı için gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu testi geliştirmek Tanı sırasında Leishmania tür tayini yapmak
L. infantum ve L. tropica promastigot DNA ları ile ribozomal RNA geni internal transcribed spacer (ITS1) bölgesi gerçek zamanlı PZR optimizasyonu (TUBİTAK 2007/107S154)
Leishmania ribozomal RNA geninin, ITS1 bölgesinde tür ayrımının yapılabildiği gerçek zamanlı bir PZR testi (Tubitak/107S154 projesi )
Uluslararası referans örneklerinin de bulunduğu 42 Leishmania PZR ürününün sekans ve klustogram analizi (Tubitak/107S154 projesi )
(Tubitak/107S154 projesi )
Sonuçlar (Tubitak/107S154 projesi ) Klustogram analizlerinde, VL ve KL kaynaklı L.infantum örnekleri homojen bir grup oluşturdu VL, KL, KaninL kaynaklı L. tropica örnekleri değişkenlik göstererek birkaç gruba ayrıldı 128 kedi kanından izole edilen DNA örneğine ITS1 PZR uygulandı ve 16 tanesi pozitif bulundu, sekans analizinde L. major olarak değerlendirildi??????????? Bir grup örnekte, aynı hastadan izole edilen parazit DNA örnekleri ile lezyon/kemik iliği aspirat DNA örneklerinin PZR sonuçları farklı bulundu (farklı türler veya aynı yayma örneğinde iki tür) İki türle mix enfeksiyon mu var, ya da Türkiye de Leishmania hibrid suşları mı var? Bu durumu açığa çıkarabilmek amacıyla, farklı gen hedefleri ile çalışmalar planlamaktayız (Hsp70??????)
Kanin Leishmaniasis VL in en önemli rezervuarı köpeklerdir 1 VL olgusunun bulunduğu köylerde köpeklerde %20 oranında pozitiflik 5 VL olgusu saptanan Kuşadası nda kanin leishmaniasis araştırması sürerken Kuşadasında Köpekevi karşısında oturan bir ailede iki kişide VL saptandı
Türkiye de Kanin Leishmaniasis
Sağlık Bakanlığı Bildirimi zorunlu İlaç temin ediliyor KL Genelgesinin güncellenmesine ve VL Genelgesinin hazırlanmasına karar verildi VL de farkındalığı artırmak için tüm Devlet Hastaneleri Çocuk, Enfeksiyon Hastalıkları ve Dahiliye kliniklerine yönelik afiş ve broşür hazırlanarak dağıtılması önerildi
Parazitoloji AD Ahmet Özbilgin Ziya Alkan Yusuf Özbel Nevin Turgay Seray Özensoy Töz Tıbbi Biyoloji AD Cumhur Gündüz Aslı Tetik Teşekkürler