AKIM SİTOMETRİ PRENSİPLERİ İrem Akar Soycan (Becton Dickinson)

Flow sitometri; Belli bir hızda akan hücreleri eş zamanlı olarak farklı özelliklerine göre tanımlayan sistemdir. 2

Ortak özellikleri nedir? alg kromozomlar Kan hücreleri protozoa 3

Hücre Hakkında Bize Ne Söyler? Yaklaşık büyüklüğünü (Forward Scatter-FSC) Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC) Yaklaşık floresans miktarını (FL1, FL2, FL3 ve FL4) 4

FSC ve SSC Özellikleri Side Scatter Detektörü Hücrenin içsel yapısı Laserden gelen ışık kaynağı Forward Side Scatter Detektörü Hücre büyüklüğü Forward Scatter yüzeyden yansıyan ışınlar Hücrenin büyüklüğü ile ilişkilidir. Side Scatter içerden kırılıp yansıyan ışınlar Hücrenin granüllüğü ve içsel yapısı ile ilgilidir. 5

Eritrositleri uzaklaştırılmış tam kan örneği Side Scatter 600 800 1000 0 200 400 Nötrofiller Monositler Lenfositler 0 200 400 600 800 1000 Forward Light Scatter 6

Hücre Hakkında Bize Ne Söyler? Yaklaşık büyüklüğünü (Forward Scatter-FSC) Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC) Yaklaşık floresans miktarını (FL1, FL2, FL3 ve FL4) 7

Fluoresan ışık nedir? λ = 488 nm HO O λ 530 nm C Işık enerjisi CO 2 H Açığa çıkan ışık enerjisi Fluoresan Molekülü Antikor Florokrom laserden gelen enerjiyi emer. Florokrom tarafından emilen enerji; Vibrasyon ve ısı salınımı Uzun dalga boylu fotonların emisyonu ile açığa çıkar. 8

Floresans yoğunluğu Salınan enerjinin miktarı, hücrede bulunan bağlanma bölgelerinin miktarı ile doğru orantılıdır. FITC FITC FITC FITC FITC Hücrelerin Sayısı FITC FITC FITC FITC FITC Floresan Yoğunluğu 9

10 Görüntüleme..

Sitometri hangi sistemlerin varlığına ihtiyaç duyar? Sıvı Sistem Hücrelerin lasere taşınması ve tek tek lazerden geçişini sağlar. Optik Sistem Işık enerjisinin oluşmasını ve sonrasında da toplanmasını sağlar. Elektronik Sistem Optik sinyallerin veri aktarımını sağlamak üzere dijital sinyallere çevrimini sağlar. 11

Sıvı Sistem-FACS Calibur Hava Flitresi Hava Pompası Sheath Düzenleyici Flow Cell Sheath Sheath Filitresi Örnek geçiş düzenleyici Atık Örnek 12

Sıvı Sistem FACSCanto II FACSFlow tankı Hava Filitresi Compressor in wet cart Atık Tankı FACSCanto Wet cart Sheath Filitresi Sheath Regulator Flow Cell FACSCanto cihazı Plenum reservoir Sample Regulator Örnek tüpü 13

Sıvı Sistem:BD FACSAriaII Fluidic cart Cihaza sıvı akışını sağlar ve vakum oluşturur. 14

Optik Sistem:FACSCalibur 4C SSC 488/10 FL1 530/30 FL2 585/42 90/10 Beam Splitter FL4 661/16 DM 560SP 670LP DM 640LP Yarım Ayna Floresans toplama lensi FL3 Beam Combiner 15 488 nm Blue Laser Red Diode Laser ~635 nm Odaklayıcı Lens Flow Cell 488/10 FSC Diode

Optik Sistem: FACS CantoII-Aria II To PMT Waste line Fiber optics 633 nm Kırmızı Lazer Beam reshape Focusing Lens Collection lens Pin hole block 488 nm Mavi Lazer FSC Diode 405 nm Mor Lazer 488 / 10 FACSFlow Positive Differential Pressure 16

Optik Sistem:FACSCanto II-Aria II Trigons Octagon 17

Elektronik Sistem Optik sinyalleri voltaj değerlere dönüştürür. Voltaj değerinin yüksekliğini, genişliğini ve alanını hesaplar. Bilgi aktarımı görevi görür. 18

Voltaj değerinin oluşması Lazer Voltaj Zaman Lazer Voltaj Zaman Lazer Voltaj 19 Zaman

Hesaplanması.. Volt Yükseklik Alan 0 Genişlik Zaman (µ Saniye) 20

Verilerin Dijital Çevrimi Oluşan voltajların yükseklik değerlendirmeleri FSC Zaman Analogdan dijitale çevrim SSC FL1 Zaman Zaman Analogdan dijitale dönüştürücü GPIO Interface Zaman 0 Kanallar 1000 Zaman FL4 FL3 FL2 21 Zaman

Dot Plot List-Mode Data FSC SSC FL1 FL2 Event 1 Event 2 Event 3 30 60 638 840 100 160 245 85 300 650 160 720 1000 1000 800 840 800 FL2 600 400 FL2 600 400 200 0 85 200 0 0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 FL1 FL1 245 638 22

Özet FL2 Zaman SSC FL1 Zaman Veri işlemcisi FSC FSC SSC Zaman FL1 Zaman FL2 Zaman FL3 23 Zaman FL4

Örnek Hazırlama 100 ul tam kan veya kemik iliği eklenir 20 ul floresan eklenir Vorteks 15 dk inkübasyon 2 ml BD Lysis Buffer eklenir Vorteks 10 dk inkübasyon Santrifüj edilerek süpernatant uzaklaştırılır. Hücreler yıkanır ve analize geçilir. 24

Florokromların floresan yoğunlukları BD Anti-CD4 ün CompBeadler üzerindeki yoğunlukları FITC=1 PE-Cy7=4.9 APC=5.8 PE=4.3 PerCP-Cy5.5=1.5 Alexa700=0.91 APC-Cy7=1.2 PerCP=0.68 Pacific Blue=0.15 AmCyan=0.1 25

Florokromlar Antijenin düşük seviyede ifade edildiği durumlarda florokromun yüksek seviyede ışıma vermesi gerekir. 26

27

Neden Hücre Ayırırız? Bir ya da birkaç farklı hücre populasyonu izole etmek için; 28

Damla Oluşturulması Amplitude Akıma uygulanan şiddeti belirler Frequency Saniyede meydana gelen damla sayısınısıklığını belirler. Drop 1 Görüntünün en üst noktası ile meydana gelen ilk damlanın orta noktası arasındaki pixel sayısıdır. Gap Oluşan ilk bağımsız damla ile akım arasındaki pixel sayısıdır. 29

Hücre ayrıştırması(sorting):nasıl? Analiz edildiği an = hücrenin lazere çarptığı an Drop Delay; hücrenin A noktasından B noktasına ulaşması sırasında geçen süredir. Damla sayısı ile ifade edilir. A B Elektrik yüklendiği an = ayrılma noktası 30

Sorting Bir kablo yardımı ile akıma elektrik yüklenir Örneğin oluşturduğu ışık saçılımları ve floresan sinyalleri analiz edilir. Elektrik yüklü damlacıklar oluşur. plakalar aracılığı ile yüklü damlacık tüplere yönlendirilir. Yüklü olmayan damlacıklar atık tankına gider. 31 Sort edilmesi istenen partikülleri içeren yüklenmiş damlalar toplanır.

Sorting öncesi ve sonrası saflık değerlendirmesi Sort öncesi örnek dağılımı CD3+ TCR+ Quadrant Statistics Acquisition Date: 22-Apr-99 X Parameter: FL1 (Log) Y Parameter: FL2 (Log) Quad Events % Gated % Total UL 3 0.07 0.03 UR 68 1.66 0.68 LL 2071 50.67 20.71 LR 1945 47.59 19.45 CD3+ ve TCR+ Hücrelerin sort sonrası dağılımı Quadrant Statistics Acquisition Date: 22-Apr-99 X Parameter: FL1 (Log) Y Parameter: FL2 (Log) Quad Events % Gated % Total UL 0 0.00 0.00 UR 177 99.44 78.67 LL 0 0.00 0.00 LR 1 0.56 0.44 Saflık % si 32

Lösemide BCR-ABL t(9;22) Kromozomal translokasyonu (Philadelphia kromozomu) BCR ve ABL genlerinin füzyonuna neden olur. KML de >%95 (tanı kriteri) erişkin precursor B-ALL de %25-40 pediatric precursor B-ALL de %3-6 oranında görülmektedir. 33

BCR-ABL Kalitatif Araştırma Kiti Çekirdek bead füzyon gen 5' BCR geni ABL geni transkripsyon translasyon Hücre bead CBA BONCUĞU BAĞLI BCR ANTİKORU B A Lizatı FÜZYON PROTEİNİNİN YAKALANMASI Patents: Füzyon proteini Sitoplazma US 6,610,498 B1 (26 August 2003) US 6,686,165 B2 (3 February 2004) bead B PE FLOROKROMU İLE TESPİT EDİLMESİ 34

Veri Alımı : BCR-ABL negatif BCR-ABL pozitif 35

BCR-ABL nin tüm alt tiplerinin tanımlanması : 697 (t(1;19) (neg. kontrol) TOM-1, BCR-ABL + LAMA-84, BCR-ABL + AR230, BCR-ABL + (p190) (p210) (p230) 36

Translokasyonların tespitinde kullanılan diğer metodlar Sitogenetik FISH (RQ)-PCR 37

Metodlara ait Parametreler Metod Gereken Zaman Notlar Sitogenetik 3-10 gün Hücre kültürü ve birçok farklı ürün gerektirir. Manuel - Otomatize FISH PCR 1-2 gün, (gönderilirse 2-7 gün) 3 saat (gönderilirse 2-7 gün) Manuel Manuel - Otomatize 38

Foxp3 (259D klonu)(bd) hakkında Foxp3 T-regülatör hücrelerini tanımlamak için kullanılır. İnsan T-reg hücrelerini fonksiyonlarına göre belirlemek amaçlı CD127 ile birlikte kullanımı önerilmektedir. BD bünyesinde insan T-reg hücrelerini bütünüyle incelemek amaçlı Foxp3 (hücre içi) ve CD127 (yüzey) içeren kitler mevcuttur. Foxp3 259D klonu özgüllüğünden ötürü konu ile ilgili yayınlarda en çok görülen ürün olmuştur. 39

CD127; insan periferik kan tek çekiredekli hücrelerinden canlı T-reg hücrelerini ayırır. CD4+ kapılanmış hücrelerde CD127 ve CD25 işaretlenmesi gösterilmektedir. 40

T-reg hücrelerinin fenotipik analizleri Hücrelerin CD127 ve CD25 ifade etme özelliklerine göre incelenmiştir. CD4 - PerCP CD25 düşük /CD127 yüksek CD127 yüksek hücreler, Foxp3 ü neredeyse hiç ifade etmezler. CD25 yüksek /CD127 düşük CD4 - PerCP CD127 düşük hücrelerde Foxp3 ifadesi yüksektir. 41 İsotipik kontrol-apc Foxp3 APC Foxp3 APC

BD Stem Cell Enumeration Kit CD45 FITC/CD34 PE Ammonium Chloride Liziz solüsyonu 10x 7-aminoactinomycin-D (7- AAD) BD Trucount TM tüpleri Kit başına 50 test Okutma ve analiz için oluşturulmuş kalıplar 42

BD Trucount Mutlak Sayım Tüpleri Mutlak sayı vermek amaçlı BD Stem Cell Enumeration kit ile kullanılır. Lyophilize edilmiş ve bilinen sayıda floresan işaretli boncuk içeren pelletten meydana gelir. 43

Çalışılabilecek Örnek Tipleri Periferik Kan Kemik İliği Aferez Ürünü Kordon Kanı 44

Veri analizi.. Hesaplama için gereken veriler Kapı İstatistikleri Sonuçlar 45

Teşekkür Ederim.. İrem Akar Soycan 46