IVD Sadece in Vitro Diagnostic Kullanım için Candida albicans Real-TM El Kitabı Kalitatif Tespiti için Real Time PCR kiti Candida albicans REF F1-100FRT REF TF1-100FRT 100
ADI Candida albicans Real-TM GİRİŞ Candida albicans bir diploid mantardır, bu maya ve ipliksi hücreler gibi her ikisi ve insanlarda fırsatçı oral ve genital enfeksiyonların bir nedensel ajanı olarak yetişir. C. albicans tarafından da dahil olmak üzere sistemik mantar enfeksiyonları (fungemias) immün sistemi baskılanmış hastalarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenleri olarak ortaya çıkmıştır (örneğin AIDS, kanser kemoterapisi, organ veya kemik iliği transplantasyonu). Buna ek olarak, C. albicans tarafından hastane kökenli enfeksiyonlar önemli sağlık sorunları nedeni haline gelmiştir. KULLANIM AMACI Candida albicans Real-TM kiti, ürogenital swablar,idrar, prostat sıvısı ve diğer biyolojik malzemelerde Candida albicans 'in kalitatif tespiti için bir testtir. TAHLİL PRENSİBİ Candida albicans Real-TM kiti, iki ana proses esasına dayanmaktadır: Örneklerden DNA izolasyonu ve Real Time Amplifikasyon. Candida albicans DNA, Real Time amplifiye örneklerden ekstrakte edilir ve Internal (iç) kontrol ve Candida albicans DNA için spesifik floresan reporter boya probları kullanılarak tespit edilir. Internal (iç) Kontrol, olası inhibasyon reaksiyonunu tanılamak için ve her biri tek tek işlenen numuneler için bir amplifikasyon kontrolü olarak hizmet vermektedir. IC, Candida albicans DNA'dan farklı bir kanalda tespit edilir.
SAĞLANAN MALZEMELER Modül No.1: Real Time PCR kit (F1-100FRT) Part N 2 Candida albicans Real-TM : Real Time Amplifikasyon PCR-mix-1-FL, 1,2 ml; PCR-mix-2-FRT, 2 x 0,35 ml; TaqF Polymerase, 2 x 0,03 ml; Pos C+, 0,2 ml; Negative Control C-, 1,2 ml;* Internal Control IC, 1,0 ml;** DNA-buffer, 0,5 ml; 110 test için reaktifler içerir Modül No.2: Complete Real Time PCR test with DNA purification kit (TF1-100FRT) Part N 1 DNA-sorb-A : Numune Hazırlama Lysis Solution, 2 x 15 ml; Sorbent, 2 x 1,0 ml; Washing Solution, 2 x 50 ml; DNA-eluent, 2 x 5 ml; Transport medium, 15 ml. 100 test için reaktifler içerir Part N 2 Candida albicans Real-TM : Real Time Amplifikasyon PCR-mix-1-FL, 1,2 ml; PCR-mix-2-FRT, 2 x 0,35 ml; TaqF Polymerase, 2 x 0,03 ml; Pos C+, 0,2 ml; Negative Control C-, 1,2 ml;* Internal Control IC, 1,0 ml;** DNA-buffer, 0,5 ml; 110 test için reaktifler içerir *izolasyon prosedürü esnasında Ekstraksiyon Negatif Kontrolü olarak kullanılmalıdır. **10 µl Internal Kontrol DNA izolasyonu esnasında doğrudan numune/lysis karışımına eklenir ( DNA-Sorb-A REF K-1-1/A protokolüne bakınız). REF K-1-1 protokol).
SAĞLANMAYAN GEREKLİ MALZEMELERr Alan 1 : Numune Hazırlama DNA ekstraksiyon kiti (Modül No. 1) Biyolojik kabin "eppendorf" tip tüpler için masaüstü mikrosantrifüj Kuru hava bloğu, Vorteks mikser, Pipetler 1,5 ml'lik polipropilen steril tüpler, Biyolojik tehlikeli atıklar için atık kabı, buzdolabı, Dondurucu Alan 2: Real Time Amplifikasyon Real Time Thermal cycler Reaksiyon Tüpleri Çalışma İstasyonu Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli steril pipet uçları 1,5/2,0 ml tüpler için rotorlu masaüstü santrifüj Vorteks mikser Dondurucu, buzdolabı MUHAFAZA KOŞULLARI Candida albicans Real-TM 2-8 C'de saklanmalıdır. TaqF Polymerase saklanmalıdır Kiti 16 C. DNA-sorb-A 2-8 C de saklanmalıdır. Part N 3 MTB Real-TM -8 C'de muhafaza edilmelidir. Kit, 2-8 C de nakliye edilebilir ancak alındıklarında hemen 2-8 C de ve -16 C de saklanmalıdır. STABİLİTE Candida albicans Real-TM, etiketinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Ürün etiketinde basılı kontrol tarihine kadar performansını koruyacaktır. Işık, ısı veya neme maruz kalma kitin bazı bileşenlerinin raf ömrünü etkileyebilir, bunlardan kaçınılmalıdır. Hassasiyet azalabileceğinden, reaktiflerin tekrarlanan çözülme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır. KALİTE KONTROL Her lot, tutarlı ürün kalitesini sağlamak için; Sacace ISO 13485-Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemine uygun olarak, önceden belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir.
UYARILAR VE ÖNLEMLER In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Sadece In Vitro Diagnostic Kullanım için Kullanıcı her zaman aşağıdakilere dikkat etmelidir: Lysis Solution,guanidine thiocyanate* içerir. Guanidin tiyosiyanat solunduğunda veya yutulduğunda veya deri ile temas halinde zararlıdır. Asit ile temasında toksik gaz oluşturur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). Aeresol bariyerli steril pipet ucuları kullanın ve her prosedür için yeni pipet ucu kulanın. Ekstrakte pozitif malzemeleri (numuneler, controller ve amplikonlar) diğer reaktiflerden uzak tutun/mufaza edin ve bunları reaksiyon karışımına ayrı bir alanda ekleyin. Bütün bileşenleri tahilile başlamadan önce oda sıcaklığında iyice çözün. Bileşenler çözündüğünde karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin. Reaktif ve örnekler ile çalışırken, atılabilir eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruyucu kullanın. İşlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın. Laboratuar çalışma alanlarında, sigara içmeyin, herhangi bir şey yemeyin- içmeyin, kozmetik uygulamayın veya kontakt lenslere elle dokunmayın. Son kullanım tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. Tüm numuneleri ve kullanılmayan reaktifleri,yerel yönetim kurallarına uygun olarak imha edin.. Örnekler potansiyel enfeksiyöz olabilir, işlemleri uygun biyogüvenlik uygulamaları ile bir güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirin. Dökülen/ saçılan tüm numune veya reaktifleri temizleyin ve %0.5 lik sodyum hipoklorit veya diğer uygun dezenfektanlarla dezenfekte edin. Numune veya reaktiflerin deri, göz veya mukoza zarları ile temasından kaçının. Deri, göz veya mukoza zarları ile temas olması halinde, hemen su ile yıkayın ve acilen tıbbi yardım alın. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine verilebilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır.. Laboratuvar süreci tek yönlü olmalı; Ekstraksiyon Alanında başlamalı ve sonra Amplifikasyon ve Tespit alanlarına gidilmeli/ yönlenmelidir. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin. Bu kitteki bazı bileşenler koruyucu olarak sodyum azid içerir. Reaktif transferi için metal tüp kullanmayın. * Sadece Modül No.2
ÜRÜN KULLANIM SINIRLARI Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostic kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu (UNI EN ISO 18113-2:2012).teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile sıkı uyum optimum PCR sonuçları için gereklidir. Kutu ve tüm bileşenlerin etiketleri üzerinde yazılı olan son kullanım tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanım tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA Candida albicans Real-TM, aşağıdakilerden ekstrakte DNA analizi yapabilir: selvikal, uteral swablar: Swabı nükleaz içermeyen 1,5 ml'lik tüpe yerleştirin ve 0,2 ml Transport medium ekleyin. Swabları medium içimde 15-20 sn. çalkalayın. idrar sedimenti: 10-20 ml ilk idrar steril kap içerisine alınır. 3000 x g 'de 30 dk. santrifüjleyin, 200 µl solüsyon bırakarak süpernatantı dikkatlice ayırın. Sedimenti resüspanse edin. Süspansiyonu DNA ekstraksiyon için kullanın. Prosesin, numuneler alındıktan hemen sonra gerçekleştirilmesi önerilir. Numuneler 24 saatten fazla olmamak koşulu ile 2 8 C de muhafaza edilir ya da 20/80 C dondurulur. Klinik örneklerin taşınması, etiyolojik ajanların taşınmasına yönelik ülke, federal, eyalet ya da yerel yönetmeliklere, uymak zorundadır. DNA İZOLASYON Herhangi bir ticari RNA / DNA izolasyon kiti, burada belirtilen IVD-CE "NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA" paragrafındaki örnek türleri için valide ise, kullanılabilir. Sacace Biotechnologies aşağıdaki kitleri kullanmanızı önerir: DNA-Sorb-A (Sacace, REF K-1-1/A); Lütfen, DNA ekstraksiyonunu, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirin. 10 Internal (iç) Kontrol 'ü DNA izolasyon prosedürü esnasında doğrudan numune/lysis karışımına ekleyin. (Not: Sacace Internal Control tüm ürogenital enfeksiyon Real Time kitleri için aynıdır.)
NUMUNE VE RAKTİF HAZIRLAMA (modül no.2 ile sağlanan reaktifler) 1. Lysis Solution ve Washing Solution (+2-8 C de muhafaza edildikleri için) buz kristalleri yok olana kadar 60 65 C' ye kadar ısıtılmalıdır. Prepare required quantity of 1.5 ml polypropylene tubes including one tube for Negative Control of Extraction. 2. Her tüpe 10 µl Internal Control ve 300 µl Lysis Solüsyon ekleyin. 3. Uygun tüpe 100 µl numunelerden ekleyin. 4. Kontrolleri aşağıdaki gibi hazırlayın : Cneg etiketli tüpe 100 µl of C (amplifikasyon kiti ile sağlanan Neg Kontrol) ekleyin. Cneg. 5. Bütün tüpleri vorteksleyin ve 5 dk. 65 C'de inkübe edin. 5-7 sn. santrifüjleyin. Eğer numune tamamen çözünmezse, tüpün maksimum (12000-16000 g.) hızda 5 dk. yeniden santrifüjlenmesi önerilir. Süpernatantı DNA ektraksiyon için, yeni bir tüpe aktarın. 6. Sorbenti kuvvetlice vorteksleyin ve her tüpe 20 µl ekleyin. 7. 5-7 sn. vorteksleyin ve bütün tüpleri, oda sıcaklığında 3 dk. inkübe edin. Bu adımı tekrarlayın. 8. Bütün tüpleri 30 sn. 5000 g'de santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak, her tüpten pelleti dağıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. 9. Her tüpe 500 µl Washing Solution ekleyin. Çok kuvvetli vorteksleyin ve 30 sn 10000 g'de santrfifüjleyin. Her bir tüpten süpernatantı ayırın ve kaldırın. 10. 9. adımı tekrarlayın ve bütün tüpleri kapakları açık halde 65 C'de 5-10 dk. inkübe edin. 11. Pıhtıyı, 100 µl DNA-eluent ile resüspanse edin. 65 C 'de 5 dk. inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 12. Tüpleri, 12000 g'de 1 dk. inkübe edin. 13. Süpernatant, amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon ekstraksiyon ile aynı gün gerçekleştirilmezse, işlenmiş numuneler 5 günden fazla olmamak koşulu ile muhafaza edilebilir veya 20 /-80 C'de dondurulabilir. PROTOKOL 1. Numuneler(N) ve kontroller (N+2) için reaksiyon tüplerini, gereken sayıda hazırlayın. 2-8 C'de 2. Her numune için yeni bir steril tüpte 10*(N+1) µl PCR-mix-1, 5,0*(N+1) µl PCR Buffer Flu, 0,5*(N+1) µl TaqF DNA Polymerase ve 0,5*(N+1) µl UDG- Enzyme hazırlayın. Vorteksleyin ve 2-3 saniye santrifüjleyin. 3. Her tüpe 15 µl Reaction Mix ve uygun tüpe 10 µl ekstrakte DNA örneği ekleyin. tube. Pipetleme ile karıştırın. 4. Her panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol ile etiketli tüpe, 10 µl DNA-buffer ekleyin; Amplifikasyon Pozitif Kontrol etiketli tüpe, 10 µl of Positive Control C+ ekleyin; 5. Tüpleri thermalcycler'a yerleştirin.
Amplifikasyon 1. Enstrümanınızda aşağıdaki gibi bir sıcaklık profili oluşturun: Rotor-tipi Cihazlar 1 Plate- veya modüler tipi Cihazlar2 Adım Sıcaklık Sıcaklık Süre Tekrarlar С С Süre Tekrarlar 1 95 15 dk. 1 95 15 dk. 1 95 5 95 5 2 60 sn. 20 5 60 sn. 20 5 72 sn. 15 72 sn. 15 95 sn. 5 95 sn. 5 sn. 20 sn. 30 3 60 72 sn. floresan sinyal tespiti 15 40 60 72 sn. floresan sinyal tespiti 15 40 1 Örneğin; Rotor-Gene 3000/6000/Q sn. (Corbett Research, Qiagen) sn. örneğin,sacycler-96 (Sacace), CFX/iQ5 (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied Biosystems), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer) Floresan, 2.Cycling evresinde (60 C), FAM/Green ve JOE/Yellow/Hex/Cy3 floresan kanallarda tespit edilir. JOE/Yellow/HEX/Cy3 floresan kanal. Candida albicans Candida albicans FAM (Yeşil) kanalı, JOE (Sarı)/HEX/Cy3 kanalında IC DNA üzerinde tespit edilir. JOE/Yellow/HEX/Cy3 kanalda tespit edilir. ENSTRÜMAN AYARLARI Rotor-tip enstrümanlar Calibrate/Gain Kanal Optimisation Eşik Çizgisi Diğer Ayarlar/ Outlier Removal Slope Correct FAM/Green 5 FI ila 10 FI 0,1 %5 Ka JOE/Yellow 4 FI ila 8 FI 0,1 %5 Ka Plate -tip enstrümanlar Eşik çizgisi, yalnız pozitif örneklerin sinyal birikiminin sigmoid eğrilerini geçmeli ve taban çizgisini geçmemelidir; aksi takdirde eşik çizgi seviyesi yükseltilmelidir. Eşik çizgisini, floresan eğrilerinin linear ve negatif numunelerin eğrilerinin geçmediği yerde ayarlayın. Cycle eşik çizgisi sınır değeri, Ct Numune Ct sınır değeri Florofor için Rotor-tip Plate-tip kanal enstrümanlar enstrümanla C+ FAM/Green 33 36 r JOE/Yellow/HEX/Cy3 30 33 Klinik numuneler, C- JOE/Yellow/HEX/Cy3 30 33
VERİ ANALİZLERİ Floresan sinyal yoğunluğu iki kanalda tespit edilir: Candida albicans DNA amplifikasyon ürününün siyali, FAM/Green kanalda tespit edilir. Internal Control amplifikasyon ürününden gelen sinyal, JOE/Yellow/HEX/Cy3 kanalında tespit edilir. JOE/Yellow/HEX/Cy3 kanal. Sonuçların Yorumlanması Sonuçlar, eşik çizgisi ile floresan eğrinin geçişi (veya geçmeyişi) ile, enstrüman yazılımı vasıtası ile yorumlanır. Yorumlama Prensibi Candida albicans DNA, FAM kanalda Ct değeri var ise, numune içinde tespit edilir. Floresan eğrisi, üstel floresan artış alanında eşik çizgisini geçmelidir. Ct değeri JOE kanalda 33'ten daha küçükken, Ct değeri FAM kanalda yoksa (floresan eğrisi eşik çizgisini geçmiyor), numunede Candida albicans DNA tespit edilmez. JOE kanaldaki CT değeri, belirtilen sınır değerden (Ct>33) daha büyük veya yok iken, numunenin Ct değeri FAM kanalda yoksa, sonuç geçersizdir.. Bu gibi numuneleriin PCR analizinin tekrar edilmesi gereklidir. Eğer, sadece Ekstraksiyon Kontrol (Tablo 2) doğruysa ve bunun yanı sıra sonuçlar amplifikasyon Pozitif ve Negatif kontroller için elde edilmişse, analiz sonuçları güvenilir kabul edilir. Tablo 2. Kontrol Sonuçları Kontrol Kontrol Evresi Ct kanal Fam Ct kanal Joe Yorumlama NCE DNA izolasyon NEG POS Geçerli sonuç NCA Amplifikasyon NEG NEG Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon POS POS Geçerli sonuç
KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ Internal Kontrol (IC) tanımlanmış miktarı,her bir numunenin ekstraksiyon prosesini kontrol etmek ve olası inhibasyon reaksiyonunu tanımlamak için, her numune ve kontrolün numune hazırlama prosedürünün başlangıcından itibaren işleme konulur. Ekstraksiyon Negatif Kontrol (NCE), aplifikasyon negatif kontrol (NCA), pozitif amplifikasyon kontrol (C+), numune hazırlama, amplifikasyon ve tespit adımlarının doğru gerçekleştirilip geçekleştirilmediğini doğrulamak için her çalışmada gereklidir. Eğer kontroller beklenilen aralıkların dışındaysa ( Kontrol Sonuçları tablosuna bakınız), çalışmadaki numuneler ve kontroller, numune hazırlama adımından itibaren yeniden işlenmelidir. SPESİFİKASYON LAR Hassasiyet Candida albicans Real-TM PCR kitinin analitik hassasiyeti, aşağıdaki tabloda belirtilmiştir. Klinik malzeme DNA ekstraksiyon kiti Analitik hassasiyet, GE/ml* Swabla r: DNA-sorb-A 5 x 10 2 * Belirtilen transport mediumda yer alan klinik numunenin 1 ml başına mikroorganizmanın Genom eşdeğerleri (GE). Özgünlük Candida albicans Real-TM PCR kitinin analitik özgünlüğü, sıkı reaksiyon koşullarıyla birlikte spesifik primerler ve probların seçimiyle sağlanır Primerler ve problar, sekans karşılaştırma analizi ile gen bankalarında yayınlanan tüm sekanslara mümkün olan homolojiler açısından kontrol edilmiştir. İnsan DNA'sının yanı sıra aşağıdaki mikroorganizmaların DNA panelinin de, inceleme esnasında nonspesifik tepkileri yok idi: Gardnerella vaginalis, Lactobacillus spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Candida albicans, Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma genitalium, Neisseria flava, Neisseria subflava, Neisseria sicca, Neisseria mucosa, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, HSV tip1 ve 2, CMV, ve HPV. bu
SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyon Negatif Kontrol için, zayıf ya da olmayan IC (Joe/Hex/Cy3 kanal) sinyali. PCR inhibe edilmiştir. Önerilen DNA ekstraksiyon metodunu kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Bütün tüpleri ekstrakte DNA pipetlemeden önce, 2 dk. maksimum (12000-16000 g) hızda yeniden santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice alın. Pelleti dağıtmayın, sorbent reaksiyonu inhibe eder. Reaktif muhafaza koşulları talimatlara uygun değil. Muhafaza koşullarını kontrol edin. Yanlış DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyon aşamasndan başlamak üzere analizi tekrarlayın. PCR koşulları talimatlara uygun değil. Protokolde belirtilen IC tespit floresan kanalını seçin ve PCR koşullarını kontrol edin. IC, reaktif pipetleme esnasında numuneye eklenmemiş. DNA ekstraksiyon prosedürü esnasında dikkatli olun. 2. Zayıf ya da olmayan Pozitif Kontrol sinyali. PCR koşulları talimatlara uygun değil. Manuelde belirtilen floresan kanalını seçin ve aplifikasyon prosedürünü kontrol edin. 3. Ekstaksiyon Negatif Kontrolü ile Fam (Green) sinyal. DNA ekstraksiyon prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir. Bütün yüzeyleri ve enstrümanları sodyum hipoklorid ve etanol ile dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü esnasında sadece filtreli pipet uçları kullanın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. Yeni reaktif setleriyle DNA ekstraksiyonunu tekrarlayın. 4. PCR Negatif Kontrol (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal yok. PCR hazırlama prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir. Bütün yüzeyleri ve cihazları sodyum hipoklorid ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile dekontamine edin. and ethanol or special DNA decontamination reagents. Pozitif Kontrolü en son pipetleyin. Yeni reaktif setleriyle PCR hazırlamayı tekrarlayın.
KULLANILAN SEMBOLLERİN ANLAMLARI Liste Numarası Dikkat! Lot Numarası <n> testleri için yeterlilik içerir in Vitro Diagnostic Kullanım için Kullanım Versiyon Saklama NCA Negatif kontrol Amplifikasyon Üretici NCE Ekstraksiyon Negatif Kontrol Ekstraksiyon Kullanım için talimatlara bakınız C+ Pozitif Kontrol Amplifikasyon Son Kullanım Tarihi IC Internal (iç) kontrol * SaCycler Sacace Biotechnologiestescilli markasıdır. * CFX and iq5 Bio-Rad Laboratories tescilli markasıdır. * Rotor-Gene Qiagen tescilli markasıdır. * MX3005P Agilent Technologies tescilli markasıdır. * ABI Applied Biosystems tescilli markasıdır. * LineGeneK Bioer tescilli markasıdır. * SmartCycler Cepheid tescilli markasıdır. Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, 44 22100 Como Italy Tel +390314892927 Fax +390314892926 mail: info@sacace.com web: mail: info@sacace.com web: www.sacace.com