Veteriner ilaç kalıntıları ve mikotoksin analizlerinde kullanılan tarama ve doğrulama teknikleri : Temel ilkeler Prof. Dr. Şeref GÜÇER 16 Ekim 2007
Analitik Problem: Veteriner ilaç kalıntıları SCREENING CHAPTER 12 FOOD SAFETY, VETERINARY AND PHYTOSANITARY POLICIES AGENDA ITEM 10:PROHIBITION OF SUBSTANCES AND RESIDUES CONTROLS Country Sesion:Republic of Turkey 24-26 April 2006
SCREENING CHAPTER 12 FOOD SAFETY, VETERINARY AND PHYTOSANITARY POLICIES AGENDA ITEM 10:PROHIBITION OF SUBSTANCES AND RESIDUES CONTROLS Republic of Turkey 24-28 April 2006 19Substances Analysed in Laboratories Bornova VCRI; antibacterial substances (Group B1), CAP and nitrofurans (group A6). Pendik VCRI; nitroimidazoles (A6), anthelmintics (B2a), anticoccidials and imidazoles (B2b), NSAID (B2e), fumagillin in honey (B2f) and confirmation of chloramphenicol and nitrofurans (A6). Etlik CVCRI; stilbens/steroid (A1, A3), antithiroid agents (A2), resorcylic acid lactons (A4) and beta agonists (A5) and pesticides (B2c, B3a, B3b). İzmir PCL; heavy metals (B3c) and naphtalene analysis in honey. Ankara PCL; lead (Pb) in milk (b3c), mycotoxins (B3d) and dyes (malachite green in fish) (B3e).
Tarama ve Doğrulamada Kullanılan Analitik Metotlar Tarama Metotları Sadece hatalı karar oranı %5 den (β-hatası) küçük olan ve izlenebilirliği,geçerliği kanıtlanmış analitik metotlar tarama amaçlı kullanılabilir.(2002/657/ec) Tarama Metotları: ELISA RIA TLC LC-UV LC-DAD GC-FID Son senelerde LC-MS
Commission Decision 2002/657/EC: criteria for suitable confirmatory methods for organic residues or contaminants Doğrulama metotları örnek içindeki analitin kimyasal yapısı hakkında bilgi sunmalıdır. Bunun sonucu olarak spektroskopik dedektör kullanmayan kromatografik metotlar doğrulama metodu olarak kullanılamazlar. Eğer metod uygun ön hazırlama,ayırma işlemlerini içerip, Spektroskopik dedektörleri kullanırsa doğrulama metodu olarak kullanılabilir. Aşağıda belirtilen metot veya metot kombinasyonları Doğrulama amacıyla kullanılmaktadır.
Commission Decision 2002/657/EC: criteria for suitable confirmatory methods for organic residues or contaminants D. Barceló, IIQAB-CSIC, Barcelona, Spain Measuring technique Directive 96/23/EC (Annex 1 ) Substances Limitations LC-MS or GC-MS A) Substances having anabolic effect and unauthorized substances B) Veterinary and human drugs and other contaminants Only if following either an on-line or an off-line chromatografic separation Only if full scan tecniques are used or using at least 3(group B) or 4 (group A) identification points for techniques that do not record the full mass spectra LC or GC with IR Groups A and B Specific requirements for absorption in IR spectrometry have to be met LC-full-scan DAD Group B Specific requirements for absorption in UV spectrometry have to be met LC-fluorescence Group B Only for molecules that exhibit native fluorescence and to molecules that exhibit fluorescence after either transformation or derivatisation 2-D TLC-full scan UV/VIS Group B Two-dimensional HPTLC and cochromatography are mandatory GC-ECD Group B Only if two columns at diferent polarity are used LC-immunogram Group B Only if at least two different chromatographic systems or second, independent detection method are used LC-UV/VIS (sinlge wavelenght) Group B Only if at least two different chromatographic systems or second, independent detection method are used
Doğrulama basamakları Referans standardı Analit/Örnek Belirtme hipotezi Referans Standardın Özellikleri DENEYSEL İRDELEME Analitin özellikleri İRDELEME Karılaştırma verileri Metodlar, Klavuzlar Uzman olarak Analizci Önceki veriler Belirtme ve karar B.L. Milman,Trends Anal.Chem. 24(2005)493-508
For the confirmation of drugs and other contaminants of Annex 1 of Directive 96/23/EC and Commision Decision 2002/657/EC, a minimum of 3 identification points are required List of specific criteria applied in LC-MS-MS: LC retention time two MRM transitions ratio MRM transitions
Kütle Spektrometrik tayini için Performans Kriterleri ve diğer şartlar Kütle spektometrik metotları ister on-line isterse de at-line kromatografik uygun ayırmalar sonrası doğrulama metodu olarak kullanılması uygundur. Kromatografik ayırımlar GC-MS yöntemlerinde gaz kromatografik ayırımlar kapiler kolonların kullanımı ile yapılmalıdır. LC-MS yöntemlerinde ise ayırma işlemi için uygun sıvı kromatografisi kolonları ile yapılmalıdır. Analitin alıkonma süresinin dahili standardın alıkonma süresine oranı kalibrasyon çözeltisinden elde edilen alıkonma GC için ±%0.5 ve LC için ±%2.5 tolerans sınırlarına karşılık gelmelidir. Kütle spektrometrik tayin Kütle spektrometrik tayin Tam iyon taramalı veya Seçilmiş iyon izlemeli (SİM ), tekniklerle olduğu gibi Seçilmiş reaksiyon taramalı (MS-MS tekniği), Yüksek rezolüsyonlu kütle spektrometresi (HRMS) Nisbi iyon intensiteleri için maksimum izin verilen tolerans değerleri belirlidir. SIM için teşhis noktaları ve kütle fragmentleri sınıfları arasındaki ilişkiler gösterilmiştir. 3. Organik kalıntılar ve bulaşanlar için doğrulayıcı metotlar
Kimyasal bileşiklerin belirlenmesi Belirlenmenin prensipleri: 1.En iyi kalitenin belirlenmesi-karşılaştırılacak mutlak özelliklerin ayı anda ve aynı alette ölçülmesi veya gözlenmesi, 2.Analit ve standartın aynı alette aynı koşullarda birebir veya belirli bir zaman aralığından sonra iki yolla incelenmesi, (1)Değişimin öngörülen tolerans aralığına düşmesi (2) Özelliğin benzerlik/farklılığı için istatiksel Testler 3. Analitin özelliğini ve referans verininkinin karşılaştırılması
Farklı analitik limitlerin grafik sunumud X S = Kontamine örneğin ort.yanıt değeri S B =Kör örneğin SD (Lab-içitekrar gerçeklenebilirlik koşulları altında tayin edilen) S S =Kontamine örneğin SD (Lab-içi tekrar gerçeklenebilirlik koşulları altında tayin edilen) α=hatalı uygun olmayan sonuç oranı β=hatalı uygun sonuç oranı CCα=Karar limiti CCβ=Tayin yeterliği
Farklı analitik limitlerin grafik sunumu X B = Kör örneğin ort.yanıt değeri X PL =İzin verilen düzeyde analit içeren örneğin ort. Konsantrasyonu X S =Kontamine örneğin ort. Konsantrasyonu S PL =İzin verilen düzeyde analit içeren örneğin SD si (Lab-içi tekrar gerçeklenebilirlik koşulları altında tayin edilen) S S =Örneğin SD si (Lab-içi tekrar gerçeklenebilirlik koşulları altında tayin edilen)
Detection Method: ELISA http://microvet.arizona.edu/courses/mic419/toolbox/elisa3.jpg Bind antibody to well Block Add antigen Add enzyme linked antibody Add substrate for enzyme http://microvet.arizona.edu/courses/mic419/toolbox/elisa3.jpg
İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) Mobil faz: Apolar çözgen Sabit faz:polar katı yüzey Moleküller polaritelerine göre Ayrılırlar.
Bağıl Değer (R f ) Çözgen sınırı R f = Maddenin katettiği yol Çözgenin katettiği yol Yüksek R f değeri = Apolar madde Düşük R f value = Polar madde Çözgenin katettiği yol Maddenin Katettiği yol Başlangıç
2D TLC
Gaz Kromatografisi
ALEV İYONLAŞMA DEDEKTÖRÜ (FID) Eksoz Baca Çakmak Toplayıcı Elektrod Polarize Elektrod Hidrogen Girişi Kolundan Ayrılanlar
HPLC
Overall SIVI KROMATOGRAFİSİ SINIFLAMASI H 2 O çözünmez H 2 O çözünür Apolar Iyonik Adsorpsiyon RPLC Ters faz Dağılma NPLC Normal faz Iyon Değiştirme MW ~10,000 kadar
Quadrupole Mass Spectrometer
Uçuş zamanlı Kütle Spektrometresi
Tek dalgaboylu UV dedektör
Elektron çarpma spektra
Kimyasal iyonlaşmalı MS kaynağı Yüksek enerjili elektronlar CH 4 CH 4 CH 4 + CH 3 + CH 2 + CH CH + 4 + 3 + + CH CH 4 4 CH C 2 + 5 H + 5 + + CH H 2 3 Örnek molekülü MH CH C C 2 2 + 5 H H + 5 + 5 + MH + MH + MH + MH2 + CH4 + MH2 + C2H + M + C H 2 6 4 Molecule Ions
Mikotoksin Analizleri Tarama metoduna örnek
BAZI AFLATOKSİNLERİN KİMYASAL YAPILARI Aflatoksin B1 Aflatoksin B2 Aflatoksin M1 Aflatoksin G1 Aflatoksin G2 Aflatoksin M2
TÜRK GIDA KODEKSİNDE AFLATOKSİNLERE AİT LİMİTLER Aflatoksin Tipi Gıda Maddesi Kabul Edilebilir En Yüksek Değer (ppb= µg/kg) B 1 M Baharatlar 5 B 1 M Hububatlar 2 B 1 M Hububat unları 2 B 1 M Tüm gıda maddeleri 5 M 1 M Peynir 0,25 M 1 M Süt ve süt ürünleri 0,05 M 1 M Bebek mamaları ve devam formülleri 0,02 (B 1 + B 2 +G 1 +G 2 ) M Bebek gıdaları ve hazır karışımlar 0,01 (B 1 + B 2 +G 1 +G 2 ) M Tüm gıda maddeleri 10 M : Mikotoksinler Avrupa'da aflatoksin limitleri 01.01.1999 tarihi itibarıyla: aflatoksin B1=2 ppb, Toplam aflatoksin (B1+B2+G1+G2) =4 ppb
ANALİZ ŞEMASI 50 g numune 4g NaCl/100 ml su ile karıştırılır 150 ml Metanol eklenerek karıştırılır Whatman-4 süzgeç kağıdından süzülür 5 ml filtrat+15 ml fosfat tampon çözeltisi eklenir (20 ml numune) İmunoafinite kolonu 10 ml fosfat tampon çözeltisi ile şartlandırılır 20 ml numune geçirilir 20 ml su ile yıkanır 1,5 ml metanol+1,5 ml su ile elue edilir Kaynak: Journal of AOAC-International vol.88, No.2, 2005 HPLC ANALİZİ
HPLC ÖLÇÜM ŞARTLARI HPLC-Floresans Analitik kolon Kolon sıcaklığı 40 C Shimadzu LC-10A (RF-10A XC Floresans Dedektör) Inertsil OD3V (4,6 150 mm, 5 µm; GL Sciences, Japonya) Akış hızı 1 ml/dak. Enjeksiyon hacmi Floresans dalga boyu Mobil Faz (izokritik) Analiz süresi 50μL 362 nm (Uyarma), 455 nm (Emisyon) 45:55 v/v Metanol:Su(100 μl HNO 3 + 120 mg) KBr) 15 dk
ANALİTİK ÖZELLİKLER-I LOD (μg/kg) LOQ (μg/kg) Aflatoksin G2 0,01 0,05 Aflatoksin G1 0,03 0,11 Aflatoksin B2 0,02 0,08 Aflatoksin B1 0,03 0,09 Toplam 0,10 0,32
ANALİTİK ÖZELLİKLER-II Konsantrasyon Aralığı Kalibrasyon Denklemi %RSD R 2 Aflatoksin G2 0,125-2,5 y=154405x- 5465,5 1,80 0,9989 Aflatoksin G1 0,1375-2,75 y=116565x- 5223,5 1,93 0,9989 Aflatoksin B2 0,1275-2,55 y=202118x- 7680,9 2,53 0,9989 Aflatoksin B1 0,125-2,5 y=194612x- 7065,1 2,95 0,9989
STANDART ÖRNEK KROMATOGRAMI G2 G1 B2 B1 5μg/L karışım
ÖRNEK KROMATOGRAMI B1 G1 B2
PUL BİBER ÖRNEKERİNDE AFLATOKSİN DÜZEYLERİ AFLATOKSİN MİKTAR (μg/kg) B1 7,25 ± 0,08 B2 0,31 ± 0,01 G1 1,95 ± 0,03
Laboratories of BUTAL The laboratories of BUTAL are; 1) Material-Textile Laboratory 2) Chemical and Environmental Laboratory 3) Food and Agricultural Chemistry Laboratory which serve for the needs of industry according to its scope of accreditation ISO EN 17025.
Material-Textile Laboratory Analysis of textiles Physical tests Chemical Analyses Analysis of leather Physical tests Chemical Analyses
Chemical and Environmental Laboratory Analysis of water and waste water Analysis of waste oil Hazardous waste analysis Coal analysis Fuel oil analysis Biodiesel analysis Measurement of stack gases Noise measurement
Food and Agricultural Chemistry Laboratory Analysis of food stuff Soil analysis Feed analysis List of testing,analyses and Industrial services can be reached through website: www.butal.tubitak.gov.tr
Research & Development 1) In-house methods BUTAL ÇM-007 Determination of PCP in Textile Materials 2002-03 BUTAL ÇM-001 Determination of Heavy Metals in Textiles 2003-01 (Sb, Cr, Co, Cu, Ni) BUTAL ÇM-002 Determination of Heavy Metals in Textiles 2003-01 (Pb, Cd) BUTAL ÇM-003 Determination of Heavy Metals in Textiles 2003-01 (As) BUTAL ÇM-004 Determination of Heavy Metals in Textiles 2003-01 (Hg) BUTAL ÇM-005 Determination of Heavy Metals in Textiles 2003-01 (Cr(VI))
Research & Development 2) Developed Equipment Dynamic seam fatigue tester Horizontal flammability tester According to directive of 95/28 EC Length direction and width direction extension tester for socks
Training and Scientific Activities Seminars and courses, - Biodiesel - Textile test and analysis - Chromatography methods - Spectroscopic methods In-plant group training programs - The circular knitting principle and determination of the source of the fault on the knitted fabrics - Cleaner production - Biodiesel test and analysis
Training and Scientific Activities Workshop, symposium and conferences - Textile auxiliary chemicals - Training of trainers in the field of textiles - Quality and process control in textiles - UNIDO In-Plant group training: textile processing testing and quality control - UNIDO In-Plant group training: Processing and finishing of cotton textiles are organised at the premises of BUTAL for local and international participants.