Kullanım Talimatları SAS IgG-IEF Plus REF: 104100 (Çift Antikor) REF: 104200 (Tek Antikor)
KULLANIM AMACI SAS IgG IEF Plus Kiti, agaroz jel izoelektrik fokuslama ve immunoblotlama ile CSF de ve serumda IgG-spesifik oligoklonal bağlanmanın tanımlanmasını amaçlar. Helena BioSciences SAS IgG-IEF Plus Kit, Keir, G. et al 1 tarafından orginal olarak açıklanan yönteme dayalıdır. Beyin omurilik sıvısının analizi immunglobulin elektroforez paterni üzerinde oligoklonal bantları gösteren merkezi sinir sistemi içinde inflamatuar cevabın ispatını vermesine rağmen multiple sklerozun teşhisinde klinik bir tanıdır. 1994 yılında European Concerted Action komitesi, Multiple Sclerosis tanısı için serum ve CSF de oligoklonal bantların tespitinde en hassas yöntem olarak izoelektrik focusingi önermiştir. SAS IgG IEF Plus Kit, agaroz IEF jelde, ph 3-10 de izoelektrik noktasına göre serum veya CSF proteinlerini ayırır. Proteinler nitroselüloz alana transfer edilir, nitroselüloza immunofixe edilmiş IgG spesifik bantları görünür hale gelir. Paternler, CSF ve/veya serum da oligoklonal bantların varlığı ya da yokluğu karşılaştırarak kalitatif olarak yorumlanır. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER 1. IgG IEF Plus Jel Koruyucu olarak ph 3-10 thimersal agaroz ve ayırıcı içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. IgG IEF Anot Solüsyon 0.3M asetik asit içerir. Paket içindeki solüsyon kullanım için hazırdır. 3. IgG IEF Katot Solüsyon 1M NaOH içerir. Paket içindeki solüsyon kullanım için hazırdır. 4. IgG IEF Bloklama ajanı İnek sütünden elde edilmiş katı protein içerir. IgG-IEF Bloklama Ajanı için 2 solüsyon hazırlanır: Blok solüsyonu A: 50ml serum fizyolojik içinde 1g toz çözünür. Blok solüsyonu B: 50ml serum fizyolojikte 5 ml blok solüsyonu A çözünür. 5. IgG IEF Asetat Buffer Konsantre ph 5.1 de 0.2M asetat buffer içerir. Kullanımdan önce 25 ml saf su ile 2.5ml Asetat buffer konsantrasyonu dilue edin ve hemen kullanın. 6. IgG IEF Kromajen 3-Amino-9-etil-karbazole tozu içerir. 50ml saf metanol içinde şişenin içeriğini çözün. 5ml lik porsiyonlara bölerek Karanlıkta -20 C'de saklayın. Kromajeni, protein kontaminasyonu olmayacak şekilde özel hazırlanmış cam tüplerde muhafaza ediniz. 1
7. 104100 Kit için antikorlar: IgG IEF primer Antikor Koyun anti-insan IgG antiserum içerir ve paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. IgG IEF sekonder Antikor Koyun anti-koyun IgG peroksidaz konjugat içerir ve paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 8. 104200 Kit için antikorlar: IgG IEF Tek Antikor Koyun anti-insan IgG peroksidaz konjugat içerir ve paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 9. Diğer Kit Kompanentları Her kitte kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli kurutucu membranlar, Kurutucular A, C ve D, Elektrot Kağıt şeritler, Kağıt şerit kurutucuları ve kurutma kağıdı içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1.IgG IEF Plus Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulması :1) kristal görünüm jelin dondurulduğunu gösterir. 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal ya da fungal kaynaklı görünüm agarozun kontaminasyonunu belirtir. 2. IgG IEF Anot Solüsyonu Anot solüsyonu 15-30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 3.IgG IEF Katot Solüsyonu Katot solüsyonu 15-30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 4. IgG IEF Bloklama Ajanı Bloklama ajanı 15-30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. IgG-IEF bloklama ajanı kendiliğinden akan beyaz veya kirli beyaz topaklı bir toz, bu görünümün değişikliği veya olağandışı renklenme bozulmayı gösterebilir. 5. IgG IEF Asetat Buffer Konsantrasyonu Buffer konsantrasyonu 15-30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 6. IgG IEF Kromajen Kromajen 2-6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Dondurulmuş eşit olarak ayrılmış numuneler 6 ay boyunca stabildir. Kromajen solüsyonu testte kromajenin eksikliği veya bu görüntüsünden gelen değişiklik kırmızı-kahverengi bir renkli bozulmayı gösterebilir. 2
7. 104100 Kit için antikorlar: IgG IEF Primer Antikor Primer antikor solüsyonu 2-6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. IgG IEF Sekonder Antikor Sekonder antikor solüsyonu 2-6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 8. 104200 Kit için antikorlar: IgG IEF Tek Antikor Tek antikor 2-6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN ÖĞELER Kat. No. 311200 SAS-3 IEF Electrode Adapter Set 2kg ağırlığında 30 v hidrojen peroksit Metanol Saline Solution (0.85% NaCI) Saf su NUMUNE TOPLAMA VE HAZIRLAMA Tercih edilen numune taze toplanan CFS ya da serumdur. Numuneler -20 C de 2 haftaya kadar yada buzdolabında 2-6 C de 3 güne kadar stabildir. CFS numuneleri direk uygulanmalıdır. Serum numuneleri, CSF numunesindeki IgG konsantrasyonuna eşdeğer olacak şekilde serum fizyolojik ile dilue edilmelidir. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Paketten jeli çıkarın ve kağıt havlu üzerine yerleştirin. Jelin yüzeyini kurutma kağıdı C ile kurutun ve kurutma kağıdını atın. 2. Temiz bir cam plaka üzerine 1 elektrot fitilini koyun ve bir Pasteur pipet kullanarak çubuk boyunca yaklaşık olarak 1 ml anot solüsyonu uygulayın. Elektrot fitili tamamen ıslandığında, iki fitil kurutucu arasındaki kuruluğu kurutun. Jelin anot (+) kenarı boyunca bu fitili yerleştirin. Katot solüsyonu için bunu tekrar edin ve jelin katot (-) kenarı boyunca yerleştirin. NOT: Anot ve katot solüsyonlarını karıştırırken dikkat edin. 3. Jelin kenarındaki oklar ile örnek aplikasyon templaytını ayarlayın. Templaytın başına bir kurutucu A koyun ve iyi temas ettiğinden emin olmak için yarıkların arasını parmağınızla ovarak düzeltin. Kurutma kağıdını alın. NOT: Cihaza göre prosedürü izleyin. 3
4a. Bir REP biriminde Çalışma: i. Bir REP IEF elektrotu kullanın. Tank üzerine 1 ml distile su ekleyin. Dış katot elektrotun altında katot kağıt şeridi ve REP IEF elektrotun merkezi anot elektrotu altında anot kağıt şeridi konumuna jel bloğuna jeli yerleştirin. Katot elektrotun dışına bir kurutucu yerleştirin ve aşırı sıvı kurutucu olarak davrandığı için anot elektrotu dışında bir kurutucu yerleştirin. Kurutucunun jel ile temas halinde olduğundan emin olun. ii. REP cihazına aşağıdaki parametreleri programlayın (programın diğer tüm bölümleri bırakarak): Elektroforez Voltaj 600-800 volts Elektroforez Zaman 45:00 mm:ss Elektroforez Sıcaklık 10-20 C Bekleme Sıcaklık 16 C iii. Her bir yarığa 5μl örnek uygulayın, tank kapağını kapatın ve çalışmayı başlatmak için F1 tuşuna basın. 4b. Bir SPIFE / SAS-3 biriminde çalışma: i. Bir SPIFE/SAS-3 IEF elektrot montajı kullanın. 4a (i) da açıklanan şekilde jeli yerleştirin. ii. SPIFE/ SAS-3 içine aşağıdaki parametreleri programlayın: Elektroforez 45:00 mm:ss 10 C 900 volt Test sonu iii. Her bir yarığa 5μl örnek uygulayın, tank kapağını kapatın ve elektroforezi başlatmak için START tuşuna basın. 4c. SAS-1 Plus biriminde çalışma: i.soğutucu üzerine 400μL REP Prep boşaltın. Agaroz yukarıda kalacak şekilde, pozitif ve negatif kısımlar aynı hizaya gelecek şekilde ve soğutucu üzerine jeli yerleştirin, ilgili elektrot çubuklarını yerleştirin, jelde hava kabarcıkları önlemek için dikkat edin. ii. Buffer fitilleri ile temas etsinler diye elektrot kollarının üst kısmı üzerine elektrotları takın. iii. IgG-IEF elektroforezi gerçekleştirmek: Uygulama Numarası 0 Elektroforez Voltaj 600 volt Elektroforez Sıcaklığı 15 C Elektroforez Zamanı 60:00 mm:ss Inkübasyon OFF 4
4c. Konvensiyonel IEF sistemlerinde çalışma: i.eğer alternatif IEF sistemlerini kullanılırsa, aşağıdaki parametreler kullanılır: Güç Volts Limit Current Limit Run Time Run Temperature 10-20 watts 600-1200 volt 50mA 30:00 mm:ss 10...20 C ii. Her bir yarığa 5μl örnek uygulayın ve elektroforeze başlayın. Helena IEF tank (4065) için 400 Volt / 80 dakika. 4d. Helena IEF tankında çalışma: i. Aşağıdaki parametreler Helena IEF tankı ile kullanılmalıdır: Elektroforez Voltaj Elektroforez Zamanı 400 volt 80 mm:ss NOT: Fokusing için seçilmiş voltaja, zaman ve sıcaklık gerekli patern uzunluğuna göre her bir laboratuvar tarafından belirlenmelidir. Paternlerin jel yüzeyinde iyi yürümeleri ve birbirinden düzgün ayrılmaları ve birbirine girmemeleri için sıcaklık minimum düzeyde tutulmalıdır. Yatay jel yüzeyinde kırılma ve birikmeleri engellemek için yüksek fokuslama yapılmamalıdır, yüksek fokuslama proteinlerin sürüklenip katot bölgesine toplanmasına ve bant kaybına neden olur. Helena IEF tankı kullanıldığında soğutma cihazı kullanmadan önce 5 C soğutulmuş olmalıdır. 5. Fokuslamanın ardından, jeli bir kurutucu D kağıdının üzerine yerleştirin. Elektrot fitilleri kaldırın. 6. Saf su içinde transfer membranın bir sayfası ıslatılmalıdır. Membranı iki kağıt havlu arasına alın ve yavaşça fazla suyunu uzaklaştırın. Jel yüzeyi üzerine transfer membranını membranın üzerindeki kırmızı nokta jele temas edecek şekilde yerleştirin. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için jelin neminin memranla temas etmesini sağlayın. 10 saniye sonra membranı kaldırıp atın. 7. Saf su veya % 10 metanol solüsyonunda transfer membranını bir saniye önce ıslatın. Aşırı sıvıyı membrandan uzaklaştırmak için membranı dikey olarak tutarak fazla sıvının atılmasını sağlayın. Membranın kırmızı noktalı tarafı jel yüzeyine gelecek şekilde dikkatlice yerleştirin. Transfer membranını jeli zedelemeyecek ve hava kabarcığı kalmayacak dikkatlice hafifçe ovarak yayın. Üstüne bir kurutucu C, üç kurutucu D nin ve 2 kg yerleştirin. 30 dakika boyunca preslenmesini sağlayın. 8. Kurutma kağıtlarını kaldırın ve atın, membranı kırmızı noktalı yüzeyi yukarı gelecek şekilde boyama kabının içine atın. Membranın bütün yüzeyini kaplayacak şekilde 20 ml bloklama A solüsyonu ilave edin. 30 dakika boyunca yavaşça sallayın. 9. Saf su içinde bir kaç kez membranı yıkayın. 5
10a.ÇİFT ANTİKOR PROSEDÜRÜ 25ml bloklama B solüsyonu 25μl primer antikor ilave edin, membranı bu solüsyonda 30 dakika boyunca hafifçe sallayınız. Saf su içinde bir kaç kez ve son olarak tuz solüsyonu içinde 5 dakika boyunca membranı yıkayın. 25ml bloklama B solüsyonu içine 25μl sekonder antikor ilave edin, membranı bu solusyonda 30 dakika boyunca hafifçe sallayınız. 10b.TEK ANTİKOR PROSEDÜRÜ 15ml bloklama B solüsyonu 15μl single step antikor ilave edin, membranı bu solüsyonda 30 dakika boyunca hafifçe sallayınız. 11. Saf su içinde bir kaç kez ve son olarak serum fizyolojik içinde 5 dakika boyunca membranı yıkayın. Saf su içinde durulayın. 25ml asetat buffer (belirli şekilde diluent edilmiş) 5ml kromajen solüsyonu ve 25μl hidrojen peroksit solüsyonu içine membranı yerleştirin. Hafif sallayarak 20 dakika boyunca rengin oluşmasına izin verin. Bu adım sırasında kromajenin çökelmesinin ortaya çıkması normaldir. 12. Saf su içinde bir kaç kez membranı yıkayın ve kuru havada kurutun. SONUÇLARIN YORUMLANMASI IgG-IEF paternlerin yorumunun tam incelenmesi için, Andersson, M. et al, bakın. 2 IgG bantları membran üzerinde kırmızı / kırmızı kahverengi bir renk olarak görünür. Eşleştirilmiş serum / CSF numunelerinin karşılaştırılması her zaman standart prosedüre göre olmalıdır. Çeşitli hastalık durumlarında monoklonal veya oligoklonal IgG bantlar gösterir. Multiple Skleroz (MS) hastalarda genellikle serumda bantları olmadan CSF içinde oligoklonal IgG gösterir. Elde edilen paternlerin yorumlanması hastanın klinik geçmişinin yardımı ile yapılmalıdır. KALİTE KONTROL IgG IEF Kontrol (Kat. No. 102210) prosedürünün tüm aşamalarında doğrulamak için kullanılabilir. SORUN GİDERME İmmunoblotting ile takip edilerek izoelektrik fokusing ile ilgili en sık karşılaşılan sorunların bazıları için aşağıdaki tabloda ayrıntılı olası nedenler ve çözümleri verilmiştir. Gözlenen sorunun Numune hatlarının boyanmaması Arka planın aşırı derecede ve aynı tarzda boyanması Dengesiz olarak arka planın aşırı derecede boyanması Olası nedenler ve çözümleri a) Hiçbir numune uygulanmamış olabilir. b)birincil ve/veya ikincil antikor çıkartılmış olabilir. c) Hidrojen peroksit eklenmemiş olabilir. a) Engelleme adımı çıkartılmış olabilir. b)immunofiksaj ve renklenme adımları sırasında transfer membranının yetersiz yıkanmasından olabilir a) Çıkarılmış veya yetersiz ön-blot adımları olabilir 6
Soluk şekilde numune hatlarının boyanması Numune şeridinin yoğun boyanması Numune hattının bozulması/bulaşması Numune kuyusu içinde tümünün boyanması a) Yetersiz numune uygulanmış olabilir b)boyanma zamanı yetersiz kalmış olabilir c)eski veya kirlenmiş hidrojen peroksit eklenmiş olabilir d)yanlış depolanmasından dolayı antikorlar bozulmuş olabilir e) Okside kromajen (siyah görünecek) olabilir f) Asetat bufferın ph ı yanlış olabilir (5.0-5.2 olmalıdır) a) Aşırı numunenin uygulanan çözünmede kaybolması olabilir b)fazla gelişmiş(nadir) a) Soak-aways kullanılmaması olabilir b) Jelin aşırı soğuması nedeniyle jel yüzeyinde aşırı yoğunlaşma olabilir a) Elektroforez sırasında hiç bir gücün uygulanmamış olması Boyanmış numunede beyaz spotların görülmesi a) Pres aşamasında jel ve membran arasında hava kabarcığının olması b) Pre-ıslak membran kullanıldığına emin olunması ve bu kabarcıkların membran ve jel arasında kabarıklık yapması olması PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Hassasiyet Farklı bir bant CSF de 0.25mg/L ye eşdeğer IgG in bir konsantrasyonun da membran üzerinde görünür. Tekrarlanabilirliği a. Jel içi Tek bir CSF numunesi, tek bir jelin 20 hattında test edildiğinde bantların aynı paternini gösterdi. b. Jeller arası Aynı numune 3 faklı jelde test edildi ve jelin her biri üzerinde bantların aynı paterni gösterdi. Özgüllük Kitte kullanılan antikor, IgG için spesifik olarak gösterildi ve insan IgA veya IgM ile çapraz-reaksiyon vermez. 7
BİBLİYOGRAFİ 1. Keir, G. et al. Isoelectric focusing of cerebrospinal fluid immunoglobulin G: An annotated update. Ann. Clin. Biochem., 1990;27:436-443. 2. Andersson, M. et al. Cerebrospinal fluid in the diagnosis of multiple sclerosis: a consensus report. J Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 1994; 57:897-902. 8