T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ

1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ BİTKİSEL KÖKENLİ BİYOTEKNOLOJİK ÜRÜNLER Hazırlayan Nisa KARTAL Danışman Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Tezi Mayıs 2013 KAYSERİ

i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Nisa KARTAL

ii YÖNERGEYE UYGUNLUK Bitkisel Kökenli Biyoteknolojik Ürünler adlı bitirme ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmıştır. Hazırlayan Nisa KARTAL Danışman Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI

iii Bitkisel Kökenli Biyoteknolojik Ürünler adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Nisa KARTAL Danışman Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ONAY : Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. ve / / Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

iv TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım boyunca yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren, ilgi ve anlayışını eksik etmeyen, tez danışmanım Sayın Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ve Arş. Gör. Berrak Altınsoy a sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmalarım boyunca yardımını esirgemeyen arkadaşım Murat Sade' ye ve başta abim Yusuf Kartal, yengem Tuğba Kartal, kız kardeşim Seda Kartal olmak üzere hayatıma yön veren aileme sonsuz teşekkürler.

v BİTKİSEL KÖKENLİ BİYOTEKNOLOJİK ÜRÜNLER Nisa KARTAL Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Mayıs 2013 Danışman: Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ÖZET Biyoteknolojik ürünler, monoklonal antikor veya hücrelerin genetik değişimlerinin, rekombinant DNA teknolojisi ile yapıldığı ürünlerdir. Bitkisel kökenli biyoteknolojik ürünler günümüzde bitkilerin moleküler seviyede iyileştirilmesi için kullanılmaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan bitki türlerinin korunması ve çoğaltılması zor olan bitkilerin üretimi de amaçlanmaktadır. Bugüne kadar uygulanan ıslah programlarında daha çok ürün kalitesi ve miktarının artırılmasına çalışılmıştır. Kültür bitkilerine hastalık ve zararlılar ile olumsuz şartlara karşı dayanıklılık kazandırılması her zaman ikinci planda bırakılmıştır. Bu nedenle kültür bitkilerine başta hastalık ve zararlılara karşı olmak üzere, uygun olmayan şartlara dayanıklılık kazandıracak yeni ıslah yöntemlerinin geliştirilmesi zorunlu hale gelmiştir. Dünya da giderek artan gıda ihtiyacını karşılamak ve açlık sorununa çare bulmak için karşımıza GDO kavramı çıkmaktadır. Genetiği değiştirilmiş bitkiler her yıl genişlemeye devam etmektedir. Ekimi yapılan transgenik bitkilerin önemli bir çoğunluğunu bitki sağlığına yönelik olarak geliştirilenler oluşturmaktadır. Soya, mısır, patates, kabak ve papaya günümüzde dünyada ekimi yapılan transgenik bitki türleridir. Bu çalışmada bitkisel kökenli biyoteknolojik ürünlerin nasıl üretildiği, üretilen bitkilerin ve bitkilerden elde edilen ürünlerin ne amaçla üretildiği, genetiği değiştirilmiş organizmaların insan sağlığı üzerine etkisi, zararları ve yararları anlatılmıştır. Anahtar Kelime : Biyoteknoloji, bitkisel biyoteknoloji, bitkisel ürün, GDO

vi HERBAL BASED BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTS Nisa KARTAL Erciyes University, Faculty of Pharmacy Department of Pharmaceutical Biotechnology Graduation Project, May 2013 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ABSTRACT Biotechnological products are made by monoclonal antibody or cells genetical changes with recombinant DNA technology. Nowadays, herbal based biotecnological products used for improving plants at the molecular level. In addition, the protection of plants species which are disappearing and the production of plants that are difficult to replicate intented. Breeding programs implemented so far mostly been studied to increase the product quality and quantity. It was always taken second place to gain resistance to adverse conditions, pests and diseases. So that a new breeding methods has become mandatory requirements to gain resistance to adverse conditions, pests and diseases. To concept of GMO is seen for to resolve the food needs and to remedy the problem of hunger in the world. Genetically modified crops contiunes to expend each year. A significant majority of the cultivation of transgenic plants is from plant health developments. Nowadays, soybean, corn, patato, squash and papaya are transgenic herbals species in the world. In this study, how herbal based biotechnological crops are produced, what produced plants and these product from plant are purposed, the effects of GMOs on human health harms and benefits are described. Key words: Biotechnology, plants biotecnology, herbal products, GMO.

vii İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK...i YÖNERGEYE UYGUNLUK...ii KABUL ONAY...iii TEŞEKKÜR...iv ÖZET...v ABSTRACT...vi İÇİNDEKİLER...vii TABLOLAR LİSTESİ...ix ŞEKİLLER LİSTESİ...x KISALTMALAR...xi 1. GİRİŞ ve AMAÇ...1 2. GENEL BİLGİLER...3 2.1. Bitki Biyoteknolojisi...4 2.2. Bitki Rejenerasyonu...5 2.2.1. Organogenesis...5 2.2.2.Somatik Embriyogenesis...7 2.2.3. Protoplast Kültürü ve Somatik Melezleme...8 2.2.4. Haploid Bitki Üretimi...10 2.2.4.1.Erkek Gametten Haploid Uyartımı...10 2.2.4.1.1. Arter Kültürü...10 2.2.4.2.Dişi Gametten Haploidi Uyartımı...13 2.2.4.2.1.Ovül ve Ovaryum Kültürleri...13 2.2.5. Sekonder Metabolit Üretimi...16 2.2.5.1. İlaç Olarak Kullanılan Sekonder Metabolitler...17 2.2.5.2. Besin Katkı Maddeleri Olarak Kullanılan Sekonder Metabolitler...18 2.2.5.3. Parfümeri ve Zirai Mücadelede Kullanılan Sekonder Metabolitler...18

viii 2.2.5.4.Sekonder Metabolitlerin Üretimi...19 2.2.5.5. Bitki Doku ve Hücre Kültürü ile Sekonder Ürünlerin Üretimi...20 2.2.5.5.1. Kök kültürleri...20 2.2.5.5.2. Sürgün Kültürleri...21 2.2.5.5.3. Embriyo Kültürleri...21 2.2.5.5.4. Kallus Kültürleri...22 2.2.5.5.5. Hücre Süspansiyon Kültürleri...23 2.2.5.6. Biyodönüşüm (Biyotransformasyon)...23 2.2.6. Somaklonal Varyasyon...24 2.2.7. Agrobacterium Aracılığıyla Gen Aktarımı...25 2.2.7.1. Bitkilere Gen Aktarımı...27 2.2.8. Herbisitlere Dayanıklı Transgenik Bitki Geliştirilmesi...29 2.2.9. Böceklere Dayanıklı Transgenik Bitkilerin Geliştirilmesi...31 2.2.10. Hastalıklara Dayanıklılığın Arttırılması...32 2.2.10.1. Patojenik Bakterilere ve Funguslara Dayanıklı Bitki Üretilmesi...32 2.2.11. Erkek Kısır Bitkilerin Elde Edilmesi...33 2.2.12. Bitkilerden Rekombinant Protein Üretimi...35 2.2.13. Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar (GDO)...35 2.2.13.1. GDO ların Potansiyel Faydaları...37 2.2.13.2. GDO ların Potansiyel Riskleri...40 2.2.13.3. GDO ların İnsan Sağlığına Etkisi...41 2.2.13.4. GDO lu Ürünlere Örnekler...42 3.TARTIŞMA VE SONUÇ...43 4. KAYNAKLAR...48 ÖZGEÇMİŞ...52

ix TABLOLAR LİSTESİ Tablo 2.1. Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar... 5 Tablo 2.2. Ovül ve ovaryum kültürleri ile haploid embriyo uyartımı yapılan bitkilerden bazı örnekler... 14 Tablo 2.3. Eksik polenler ile tozlama ile haploid embriyo uyartımlarına bazı örnekler 15 Tablo 2.4. İlaç sanayisinde kullanılan bazı önemli bitkisel kökenli maddeler... 17 Tablo 2.5. Endüstride kullanılan bitkisel kökenli diğer doğal ürünler... 18 Tablo 2.6. Bitki hücre kültürleri tarafından üretilen bazı doğal bileşikler... 19 Tablo 2.7. Bitki hücre kültürleri tarafından üretilen ve ekonomik değeri yüksek bazı sekonder metabolitler... 20 Tablo 2.8. Kök ve sürgün oluşturmak üzere farklılaşan kallus kültürlerinde biriken bazı sekonder metabolitler... 22 Tablo 2.9. Bazı sekonder metabolitlerin bitki hücre süspansiyon kültürlerinde ve kaynak bitkideki verim oranları... 23 Tablo 2.10. Bitki hücre kültürlerinde biyodönüşüme dair bazı örnekler... 24 Tablo 2.11. Herbisitlerde etken madde ve etki sistemleri... 30 Tablo 2.12. Bazı Kültür Bitkilerindeki Tüylülüğün Zararlı Böcekler Üzerine Etkileri. 31 Tablo 2.13. Varyantların bitki düzeyinde seçimi ile elde edilen hastalığa dayanıklı bitkiler... 33

x ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 2.1. P.trifoliata genotipinden elde edilen kallus görünüşü... 6 Şekil 2.2. C. airantium genotipinden elde edilen kallus görünüşü... 6 Şekil 2.3. Yoncada yaprak eksplantından somatik embriyogenesis ile bitki rejenerasyonu... 8 Şekil 2.4. Tütün bitkisine ait tek çekirdekli mikrospor (kültüre başlandığı aşamada), (b) Bir haftalık inkübasyon süresi sonunda mitoz bölünme geçirmiş ve birbirine benzer yapıdaki iki çekirdeğe sahip mikrospor, (c) İki haftalık kültürlerde oluşan çok çekirdekli mikrospor, (d) Embriyo gelişme yönünde bölünen bir mikrospor, (e) Mikrokallus görünümüne dönüşen çok hücreli bir mikrospor, (f) Çok hücreli bir mikrospor (embriyoid), (g) Küçük ölçekli bir haploid kallus, (h-j) Tütün anterlerinde polen embriyogenesisinin değişik aşamaları... 12 Şekil 2.5. Haploid kavun bitkiciklerinin görünümü... 15 Şekil 2.6. KYRT1 suşu kullanılarak LK1 kültüvarının Agro-vakum infiltrasyonu sonucu elde edilen geçici GUS ekspresyonu... 28 Şekil 2.7. C58C1 suşu kullanılarak LK1 kültüvarının Agro-vakum infiltrasyonu sonucu elde edilen geçici GUS ekspresyonu... 28 Şekil 2.8. EHA 101 suşu ile transforme edilmiş, 5 mg/l PPT içeren ortamda seleksiyona tabi tutulmuş Er kültüvarının explantları... 28 Şekil 2.9. Herbisitlere dayanıklı kültür bitkilerinin geniş spektrumlu herbisit kullanımındaki etkinliğinin şematik olarak gösterimi... 30 Şekil 2.10. Frenk soğanında (Allium schoenoprasum L.) sitoplazmik erkek kısır bir bitkinin (solda) ve fertil bir bitkinin çiçekleri... 34

xi KISALTMALAR ABD DNA GD GDO GMO : Amerika Birleşik Devletleri : Deoksiribonükleik Asit : Genetiği Değiştirilmiş : Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar : Geneticaly Modified Organization HEPA : High Efficiency Particulate Arresting mrna : Mesajcı Ribonükleik Asit NAA RNA rrna TDZ trna : Naftalen asetik asit : Ribonükleik Asit : Ribozomal Ribonükleik Asit : Thidiazuron : Taşıyıcı Ribonükleik Asit

1 1. GİRİŞ ve AMAÇ Biyoteknoloji, insan ve çevre sağlığını olumsuz etkilemeyecek yöntemler ile, biyolojik sistemlerin bilim ve mühendislik ilkelerine dayalı olarak ürün ve hizmet üretiminde kullanılmasıdır. Monoklonal antikor veya hücrelerin genetik değişimlerinin, rekombinant DNA teknolojisi ie yapıldığı ürünlere biyoteknolojik ürün denir (5). Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır (42). Biyoteknoloji çok disiplinli ve geniş kapsamlı bir bilim dalıdır. Bu nedenle disiplinler arası ortak çalışmalar önem taşımaktadır. Biyoteknoloji birçok alanda, gerek sanayi boyutunda, gerekse bilimsel boyutta çok geniş uygulama alanları bulunmaktadır. Eski çağlardan beri bilinen klasik alkollü içkiler vb. üretimlerinden, günümüzde teknolojik gelişmelerin ışığında yeni ve spesifik ürünlerin üretimine kadar birçok alanda kullanıldığı gıda sanayi, biyoteknolojinin en önemli uygulama alanlarından birisini oluşturmaktadır (44). Yüksek miktar ve kalitede ürün üretmek amacıyla geleneksel kültür çeşitlerinin veya bunların yabani akrabalarının genetik yapıları değiştirilmektedir. Üretimi 1996 yılında başlayan GDO ların ekim alanı günümüze kadar 73 kat artarak 1,7 milyon hektardan 125 milyon hektara ulaşmıştır. 2009 yılında GDO lu tarım ürünlerinin piyasa değerinin 7,5 milyar $ olduğu tahmin edilmektedir. 12,3 milyonu gelişmekte olan ülkelerde olmak üzere toplam 13,3 milyon çiftçi transgenik ürün yetiştirmektedir (45). Genetik modifikasyonların hedefleri; Tarımsal ilaç kullanımında azalma

2 Herbisit ve böceklere karşı dayanıklılık sağlanması Azot fiksasyonu ve ürün miktarının geliştirilmesi Geç olgunlaşma, raf ömrünün uzatılması Besinsel özelliklerin geliştirilmesi Kısır bitki üretimi Verimde artış Çevresel koşullara tolerans (kuraklık, tuzluluk) Uygun olmayan iklim ve toprak koşullarında bile ürün alınabilmedir (45). Bu çalışmada çeşitli bitki biyoteknolojisi kitapları ve uluslar arası yayınlanmış makalelerden elde edilen bilgilerden faydalanılarak bitkisel kökenli biyoteknolojik ürünlerin önemi, kullanım faydaları, üretim aşamaları ve üretim yöntemlerini içeren bir kaynak oluşturulması amaçlanmaktadır. Genetiği değiştirilmiş organizmaların ne amaçla üretildiği, insan sağlığına fayda ve zararlarının incelenmesi hedeflenmiştir.

3 2. GENEL BİLGİLER Tarih öncesi çağlardan, birkaç yüzyıl öncesine kadar bitkiler sadece yiyecek kaynağı olarak, mikroorganizmalar fermente besinlerin üretiminde, hayvanlar ise hem iş gücü hem de besin kaynağı olarak kullanılıyordu. Ancak bilimin hızlı gelişimi ve buna bağlı olarak biyoteknoloji kavramının hayatımıza girmesi ile bu yararlanımın ne kadar sınırlı olduğu anlaşılmıştır (1). İlk olarak 1917 yılında bir Macar mühendis Karl Ereky tarafından ortaya atılan biyoteknoloji terimi o dönemde, canlıların yardımı ile yapılan tüm üretim işleri olarak tanımlanmıştı. Günümüzde ise özel bir kullanıma yönelik olarak ürün veya işlemleri dönüştürmek veya meydana getirmek için biyolojik sistem ve canlı organizmaları veya türevlerini kullanan teknolojik uygulamalar olarak tanımlanmaktadır. Biyoteknoloji, çok küçük dozda etkili moleküller olan biyoterapötiklerin endüstriyel boyutta üretimini sağlar (2). Biyoteknolojik ürün, monoklonal antikor veya hücrelerin genetik değişimlerinin, rekombinant DNA teknolojisi ile yapıldığı üründür. Biyoteknolojik ürünler, insan ya da hayvan dokusu veya mikrobiyolojik kökenli materyalleri içerir (3). Bu materyaller; bakteri, mantar, böcek, bitki, memeli hücre hatları, böcek, bitki ve memeli virusları, fare, balık gibi çok hücreli organizmalardır (4). Biyoteknoloji uygulama alanları; biyosüreç teknolojisi ile alkollü içeceklerin üretimi, antibiyotik üretimi, memeli hücre kültürleri, ilaç üretimi, enzim teknolojisi ile enzim immobilizasyonu, yarı sentetik penisilin üretimi, nişasta ve selüloz hidrolizi atık teknolojisi ile atıkların yeniden kullanılabilmesi, atıklardan yeni ürünlerin üretilmesi, çevre teknolojisi ile kirliliğin kontrolü, atık toksinlerin uzaklaştırılması, yenilenebilen kaynak teknolojisi ile bitki ve hayvan materyallerinin tamamının kullanılması ziraat ve hayvancılıkta besin değeri yüksek, hastalığa dirençli, yüksek kalite ve verimde genetik mühendisliği ile geliştirilmiş bitkilerin oluşturulması, hayvancılıkta ürün artırımını

4 sağlamak, sağlık alanında yeni ilaçların oluşturulması, hastalık tanılarının geliştirilmesi, aşıların geliştirilmesi, gen tedavisi, antibiyotik üretimi, aşı üretimi, gıda teknolojisi ile çeşitli gıda ürünleri, koruyucu üretimi olarak sayılabilir (4). 2.1. Bitki Biyoteknolojisi Bitki biyoteknolojisi, çeşitli doku kültürü ve genetik mühendisliği tekniklerini kullanarak bitkilerin moleküler seviyede iyileştirilmesini amaçlamaktadır. Örneğin; bugün kültürü yapılan birçok bitki türünün ürettiği etken maddeler laboratuvarda üretilmektedir. Yine, tarımsal önemi olan genler değişik organizmalardan izole edilerek kültür bitkilerine kolaylıkla aktarılabilmektedir (5). Dünya nüfusunun beslenmesinde en çok kullanılan yaklaşık 30 bitki grubu içinde en önemlileri tahıllar, baklagiller, endüstri bitkileri, sebzeler ve meyve ağaçlarıdır. Ancak buğday, çeltik, mısır ve patatesin üretim miktarlarının toplamı diğer ürünlerin toplamından daha fazladır. Bununla beraber dünya florasında yaklaşık 250 bin bitki türünün bulunduğu fakat bunlardan sadece 3000 adedinin besin değerine sahip olduğu bildirilmektedir (5). Bitkilerin önemi; yeryüzündeki birincil üreticilerdir, birincil besin kaynağıdır. Havadaki oksijen dengesini sağlarlar, çevre dengelerini düzenlerler, erozyonu önlerler, sessiz fabrikalardır; tıp, kâğıt, boya, kozmetik vb. sanayi uygulamalarında ve enerji alanında kullanılırlar (7). Bitki doku kültürü; aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları=eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir. Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır (5).

5 Tablo 2.1. Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar (9) Tarih Çalışmalar Araştırıcılar 1902 1904 1917 1920 1922 1924 1934 1934 1942 1946 1953 1954 1957 1958 1960 1962 1965 1967 1968 1970 1971 1978 1983 1986 1990 1995 İlk izole edilmiş hücrelerin kültürü Olgun embriyoların kültürü Biyoteknoloji teriminin ilk defa kullanımı Oksinin tanımlanması Kök ve sürgün uçlarının laboratuvarda çoğaltımı İlk embriyo kurtarma tekniği (mısır) İlk sürekli kök kültürleri (domates) İlk kallus kültürleri İlk kallus kültürlerinden sekonder metabolit eldesi Sürgün uçlarından (apikem meristem) ilk bitki eldesi DNA nın yapısının belirlenmesi Hücre süspansiyonlarından ilk bitki eldesi İlk sitokinin tanımlanması ve organ oluşumunda sitokin/oksin oranının öneminin ortaya konulması İlk somatik embriyogenesis (havuç) Enzimler kullanılarak ilk canlı protoplast izolasyonu MS besin ortamının geliştirilmesi Tek hücreden bitki rejenerasyonu İlk haploid bitkinin üretimi (anter polen kültürü) B5 ortamının geliştirilmesi HEPA filtrelerin kullanılmaya başlanması Protoplastlardan ilk bitki rejenerasyonu Cinsler arası ilk somatik melezleme Transgenik ilk bitkinin elde edilmesi (tütün) Transgenik ilk bitkinin tarla testleri (tütün) Sentetik tohum geliştirme ve hızlı dondurma yoluyla gemplazm muhafazası çalışmalarının başlaması İlk rekombinant insan gıdası Haberlandt Hanning Karl Ereky Went ve ark. Kotte ve Robbins Dieterich White Gautheret Gautheret Ball Watson ve Crick Muir ve ark. Skoog ve Miller Steward ve ark. Cocking Murashige Skoog Vasil Hlderbrandt Bourgin ve Nitsc Gamborg ve ark. - Nagata ve Tabake Melchers ve ark. Murai ve ark. - - (Falvr Savr, domates) 2.2. Bitki Rejenerasyonu 2.2.1. Organogenesis Farklılaşmış hücrelerden adventif organ gelişiminin tek kutuplu olarak seyretmesine organogenesis denir. Bahsi geçen organ yapıları kök ya da sürgün primordiyumudur. Oluşması beklenen yapı tek kutuplu (unipolar) olduğundan bağımsız bir iletim sistemi yoktur, dolayısıyla eksplanta bağımlıdır. Rejenerasyon ortamından oluşmakta olan organlar (kallus, kök ya da sürgün) ihtiyacı olduğu su, mineral vs. anaç doku vasıtasıyla

6 temin ederler. Eksplant yüzeyinde (genellikle kesi yerlerinden) meydana gelen doku farklılaşması (kallus oluşumu) da organ üretimini tetikler, tüm bu süreçler organogenesis olarak adlandırılmaktadır (10). Sistem yaygın olarak kallus aracılığıyla doku oluşumu olarak seyretmektedir. Bu süreç indirekt organogenesis (indirect organogenesis) olarak adlandırılmaktadır. Bazı durumlarda kallus dokusu oluşmadan direkt organ üretimine de tanık olunabilir (direkt organogenesis). Her iki rejenerasyon tipi genel olarak önce sürgün üretimi daha sonra da köklendirme aşamasını takip eder (10). Şekil 2.1. P.trifoliata genotipinden elde edilen kallus görünüşü (17) Şekil 2.2. C. airantium genotipinden elde edilen kallus görünüşü (17) Solanacea türleri in vitro çalışmalarda model olarak kullanılmaktadır. Totipotensi ilk olarak Nicotiana tabacum türünde tek hücrelerden olgun bitkilerin elde edilmesi ile gösterilmiştir (12). Kesilen arterlerin in vitro kültürü ile haploid bitkilerin ilk başarılı üretimi Datura innoxia (13) da gerçekleştirilmiştir..izole edilen protoplastlardan ilk bitki rejenerasyonu N. tabacum ile gerçekleşmiş (14) ve ilk somatik melezleme iki Nicotiana türü (N. glauca ve N. langsdorfii ) arasında yapılmıştır (15).

7 Organogenesis hücre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tanıdığı için, generatif yoldan çoğaltılması zor olan bitki türlerinin üretiminde büyük kolaylıklar sağlamaktadır. Bu grup bitkiler arasında, süs bitkilerini en başta sayabiliriz (5). 2.2.2.Somatik Embriyogenesis Doku kültürüyle bitki rejenerasyonu iki şekilde yapılmaktadır. Birincisi; hücre veya dokulardan değişimlere neden olacak uygulamalarla sürgün taslakları oluşturmak, ikincisi ise somatik embriyogenesistir. Bu embriyolar somatik embriyo olarak adlandırılır ve zigotik embriyolar gibi gelişim gösterirler. Aralarındaki asıl farklılık elde ediliş yöntemlerinden kaynaklanmaktadır. Zigotik embriyolar döllenmiş zigottan geliştikleri için elde edilen bitkiler açılım gösterirken somatik embriyolardan elde edilen bitkiler genetik olarak klon oluşturmaktadır (18). Somatik embriyogenesis birçok bitki türünün, özellikle de orman ağaçlarının hızlı klonal çoğaltılmasında önemli bir potansiyele sahiptir. Teorik olarak tek bir eksplant sınırsız sayıda embriyo üretebilir. Bu sınırsız üretim, anaç bitkiden alınan kısıtlı miktardaki materyale bağlı olan çelikle çoğaltım karşısında çok büyük bir avantaja sahip olmaktadır (19). Somatik embriyogenesis yağ palmiyesini de içine alan bazı bitki türlerinde ticari olarak kullanılmaya başlanmıştır. Yağ palmiyesi tohumla çoğaltılmakta olup, bitkiler yüksek oranda heterozigot olduğundan dolayı elde edilen döllerde büyük varyasyon gözlenmektedir. Ayrıca, bu bitkinin tek bir meristemi bulunmakta ve çelikle klonal çoğaltımı da mümkün olmaktadır (20). Somatik embriyogenesisin belki de en önemli kullanım alanı bitkilere gen aktarımıdır. Bitkilere gen aktarımında değişik yöntemler geliştirilmiş olmakla birlikte, en yaygın olarak kullanılanı bitkilerin doğal genetik mühendisi olarak adlandırılan Agrobacterium tumefaciens bakterisidir. Bu bakteri aracılığıyla tarımsal öneme sahip birçok gen, iki çenekli bitkilere kolaylıkla aktarılabilmiştir. Son yıllarda süper binary vektörlerin kullanılmasıyla A. Tumefaciens ın tek çenekli bitkilere de gen aktarım yeteneğine sahip olduğu anlaşılmış olup, bu bakteri aracılığıyla transgenik arpa, mısır ve çeltik bitkileri elde edilmiştir (5).

8 Şekil 2.3. Yoncada yaprak eksplantından somatik embriyogenesis ile bitki rejenerasyonu. a) I. Protokolde yaprak eksplantından elde edilen kalluslar üzerinde gelişen somatik embriyolar (bar=1mm), b) II. Protokolde yaprak eksplantından elde edilen kalluslar (bar=11mm) c,d) II. Protokolde kalluslar üzerinde gelişen somatik embriyo ve bitkicik gelişimi (bar=8mm) e,f) somatik embriyolardan elde edilen bitkiler ve bitkilerin dış koşullara alıştırılması (bar=9mm, 20mm) (18) 2.2.3. Protoplast Kültürü ve Somatik Melezleme Çok hücreli dokularda bitki hücreleri birbirlerine hücreler arası bağlarla bağlanırlar. Bir hücrenin duvarı uzaklaştırıldığında geriye kalan kısmına protoplast denir. Protoplastlar izotonik ortamlarda canlılığını sürdürüp, yeni duvar oluşturup, mitozla bölünebilir, yeni hücre grupları (mikrokallus) ve daha sonra da yeni bitkiler oluşturabilirler. İzole edilen protoplastlar yüksek bitkilerde elde edilebilen yegane tekli hücre kaynağını oluştururlar (5).

9 Protoplast çalışmalarının temel amacı bir adet hücreden bitki elde edebilmektir. Teorik olarak her bitki türünden ve bir türün her dokusundan protoplast elde etmek mümkündür. Fakat izole edilen her protoplasttan bitki elde etmek mümkün olmamakla birlikte bu konudaki bildirimler gün geçtikçe artmaktadır (6). En çok kullanılan protoplast kaynağı yaprak mezofil hücreleridir. Monokotiledonlara göre (örnek: buğdaygiller) dikotiledonlar (örnek: baklagiller) mezofil hücrelerini içeren yapraklar genellikle daha uygun bir izolasyon materyali verirler (5). Protoplast izolasyonundan sonra ortaya çıkabilecek davranışlar 5 kategoride değerlendirilebilir. Bunlar sırasıyla: a. Strese tepki: Enzim etkisi sonucu bitki hücresinin kendi savunma mekanizmasını geliştirmesi, b. Tamir mekanizması: Hücre zarında ve zar proteinlerinde oluşan zararın giderilmesi, yeni zarın oluşturulması, c. Adaptasyon: Organellerin ve sitoplazmanın morfolojik ve fonksiyonel olarak adaptasyonu, d. Hücre bölünmesi: Hücre hayat döngüsünün yeniden başlaması, hücre bölünmesi ve kallus oluşumu, e. Morfogenesis: Organize hücre gelişmesi, bölünmenin uyarılması ve değişimin başlayarak organize doku ve daha sonra bitkilerin oluşturulmasıdır (8). Bir çok bitki türünde protoplasttan bitki rejenerasyonu öncelikle çok yüksek oranda genotipe daha sonra donör doku ve hücrelerin tip ve özelliklerine bağlıdır. Solanacea familyası protoplastlardan bitki rejenerasyonunda en başarılı olanıdır. Son yıllarda tahıllar ve odunsu bitkilerde başarılı sonuçlar alınmıştır. Fakat özellikle dane baklagillerde protoplastlardan bitki rejenerasyonunda hala zorluklar vardır (8). Bütün türler için uygun bir sistem yoktur ve her tür, hatta her çeşit veya genotip için optimum sistem ayrı ayrı deneylerle tespit edilmelidir. Eğer üzerinde daha önce çalışılmamış bir türde protoplast izole etmek ve uygun kültür ve rejenerasyon şartları tespit edilmek isteniyorsa öncelikle en çok kullanılan metotlar ve besin ortamları denenmelidir (5). Örnek olarak, şeker pancarında sadece stoma gard hücrelerinin protoplast kaynağı olarak kullanılması halinde başarı elde edilebilmektedir (11). Yine

10 havuç yaprak sapı protoplastları veya Vicia faba sürgün ucu protoplastları ancak aljinat içinde gömülerek kültürü yapıldığında sonuç başarılı olmaktadır. Benzer şekilde tütün mezofil protoplastları yeni bir teknik olarak ince aljinat tabakalarında kültüre alındıklarında sürgünlerin elde edilmesine kadar geçen süre 5-6 haftadan 2 haftaya düşürülebilmektedir (5). Protoplast kültürü ve somatik melezleme bitki ıslahında daralan genetik varyabiliteyi genişletmede en ümitli metotlardan birisi olarak görülmektedir. Özellikle yabani türlerde rastlanan hastalık ve zararlılara dayanıklılık genlerinin füzyon yoluyla kültür bitkilerine aktarılması çok büyük avantajlar ortaya koyabilir (5). Hızlı ve olumlu gelişmelere rağmen tahıllar, baklagiller ve ağaçlar ile iğne yapraklıların da içinde bulunduğu önemli bitki grupları protoplast izolasyonu, kültürü ve somatik melezlemeler bakımından geri kalmış olup bu bitki grupları üzerinde daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Özellikle uzak akraba türlerinin melezlenmesinde pratikte bazı problemler ortaya çıkmaktadır (5). 2.2.4. Haploid Bitki Üretimi Somatik hücrelerindeki kromozom sayısı, ait oldukları bitki türünün gamet hücrelerinde bulunan kromozom sayısı kadar olan bitkilere haploid bitkiler adı verilmektedir (5). İlk kez 1922 yılında Blakeslee ve araştırma grubu tarafından Datura stramonium bitkisinde yapılan bir çalışmada doğal olarak ortaya çıkan ve haploid olarak isimlendirilen bir bitkide kromozom sayısının, gamet hücrelerinde bulunması gereken sayıda olduğu belirlenmiştir. Bunun ardından 1929 yılında Kostoff, iki farklı tütün türünün melezlenmesi sonucunda (Nicotiana tabacum ve N. langsdorfii) doğal olarak haploidlerin oluştuğunu rapor etmiştir. Bu ilk bilgilerin verilmesinden sonra pek çok sayıdaki bitki türünde doğal partenogenesis yoluyla veya değişik tekniklerin deneysel olarak uygulanmasıyla haploid bitkilerin oluşumu üzerinde çalışmalar yoğunlaşmıştır (5). 2.2.4.1.Erkek Gametten Haploid Uyartımı 2.2.4.1.1. Arter Kültürü İlk kez 1953 yılında Tulecke, Ginkgo biloba bitkisine ait olgun polenlerin kültür koşullarında haploid kallus oluşturmak üzere uyarılabileceğini gözlemlemiştir. 1964 yılında ilk önemli gelişmeyi Guha ve Maheshwari gerçekleştirmiş, Datura innoxia

11 bitkisinin kültüre alınan anterlerinde mikrosporlardan haploid embriyo oluşumu sağlanmıştır (16). Sonraki yıllarda Bourgin ve Nitsch (1967), Nicotiana tabacum türünde anter kültürü yoluyla tam bir haploid bitkiyi elde etmeyi başarmışlardır. Bu aşamadan sonra birçok bitki türünde erkek gametten haploid bitki elde etme amacıyla çalışmalar yapılmış, günümüze değin yaklaşık 250 farklı bitki türünde in vitro androgenesis tekniğinden başarılı sonuçlar elde edilmiştir (5). Anter kültürü, özellikle Solanaceae familyası üyelerinin çoğunda başarılı sonuçlar vermektedir. Cruciferae, Gramineae ve Ranunculaceae familyalarına ait değişik türlerden haploid bitkiler elde edilebilmektedir (21, 22). Bunlardan başka çeltik ve mısır türlerinde de başarılı sonuçlar rapor edilmektedir (23).

12 Şekil 2.4. Tütün bitkisine ait tek çekirdekli mikrospor (kültüre başlandığı aşamada), (b) Bir haftalık inkübasyon süresi sonunda mitoz bölünme geçirmiş ve birbirine benzer yapıdaki iki çekirdeğe sahip mikrospor, (c) İki haftalık kültürlerde oluşan çok çekirdekli mikrospor, (d) Embriyo gelişme yönünde bölünen bir mikrospor, (e) Mikrokallus görünümüne dönüşen çok hücreli bir mikrospor, (f) Çok hücreli bir mikrospor (embriyoid), (g) Küçük ölçekli bir haploid kallus, (h-j) Tütün anterlerinde polen embriyogenesisinin değişik aşamaları (5).

13 2.2.4.2.Dişi Gametten Haploidi Uyartımı 2.2.4.2.1.Ovül ve Ovaryum Kültürleri Döllenmemiş yumurtalığın ya da yumurta hücrelerinin kültüre alınmasıyla haploid embriyo ve bitki oluşumuna ovaryum veya ovül kültürleri adı verilmektedir. Dişi gametten hareketle haploid bitki elde etme çalışmaları 1950 li yılların sonunda hıyarda spontan partenogenetik haploid bitki elde edilmesine yönelik çalışmalarla başlamıştır (24). Bu ilk uygulamalarda tam olgun olmayan hıyar meyveleri hasat edilmiş, su üzerinde yüzdürme yoluyla hafif oldukları belirlenen tohumlardan embriyo kültürleri yapılmış ve 13 adet ilk hıyar haploid bitkileri elde edilmiştir (5). 1980 li yıllarda ovul ve ovaryum kültürlerine olan ilgi yoğunlaşmış ve değişik familyalardan birçok bitki türünde haploid embriyo uyartımına yönelik çalışmalar yapılmıştır. Arpada yapılan bir çalışmada; antesisten önceki dönemde, polenlerin tek çekirdekli, iki çekirdekli ve üç çekirdekli olduğu aşamalarda aynı çiçekte bulunan yumurtalıklar kültüre alınmıştır. Haploid embriyo uyartımı için en elverişli dönemin, iki veya üç çekirdekli polenlere sahip çiçeklerden izole edilen yumurtalıkların içinde bulunduğu dönem olduğu belirlenmiştir. Buna karşılık, buğday ve tütünde aynı çiçeğin polenlerinin tek çekirdekli olduğu dönemde alınan yumurtalıkların haploid bitkiler oluşturduğu belirlenmiştir (5).

14 Tablo 2.2. Ovül ve ovaryum kültürleri ile haploid embriyo uyartımı yapılan bitkilerden bazı örnekler (5) Bitki Türü Kültüre Alınan Kısım Kaynaklar Allium cepa Ovül Keller, 1990 Allium porrum Ovaryum Özzambak, 1992 Beta vulgaris Ovül Hossemans ve Bossoutrot, 1983; Bornman, 1985; Doctrinal ve ark., 1989 Cucumis melo Ovül Dryanovska ve Ilieva, 1983 Cucurbita pepo Ovül Metwally ve ark, 1998 Gerbera jamesonii Ovül Sitbon, 1981; Meynet ve Sibi, 1984 Cagnet ve Sitbon, 1981; Cai ve Zhou, 1984 Helianthus annuus Hordeum vulgare Ovaryum Ovaryum Mix, 1985; Ahmim ve Vieth, 1986; Gelebarth ve San, 1987; Cappadocia ve ark., 1988 San Noeum, 1976; Wang ve Kuang, 1981; Huang ve ark., 1982; Gu ve Cheng, 1984 Lilium davidii Ovaryum Gu ve Cheng, 1983 Nicotiana rustica Ovaryum Zhu ve Wu, 1979 Nicotiana tabacum Ovaryum Wu ve Cheng, 1982 Oryza sativa Ovaryum Asselin de Beauville, 1980; Zhou ve Yang, 1980; Kuo, 1982; He ve Yang, 1987 ve 1988 Petunia axillaris Ovül De Verna ve Collins, 1984 Triticum aestivum Ovaryum Zhu ve Wu, 1979; Gussakovskaya ve Najar, 1990 Zea mays Ovaryum Ao ve ark., 1982; Truong-André ve Demarly, 1983

15 Tablo 2.3. Eksik polenler ile tozlama ile haploid embriyo uyartımlarına bazı örnekler(5) Bitki Türü Uygulama Kaynaklar Actinidia deliciosa Işınlanmış polen Pandey ve ark., 1990 Brassica oleracea Işınlanmış polen Doré, 1989 Cichorium intybus Türlerarası tozlama Doré ve ark., 1996 Citrullus lanatus Işınlanmış polen Gürsöz ve ark., 1991 Sarı ve ark., 1994 Cucumis ficifolius Türlerarası tozlama Zagorcheva ve ark., 1987 Cucumis sativus Işınlanmış polen Sauton, 1989 Cucumis melo Türlerarası tozlama Işınlanmış polen Işınlanmış polen Niemirowicz-Szczytt ve Dumas de Vaulx, 1989 Çağlar ve Abak, 1995 Dumas de Vaulx, 1979 Sauton, 1987 Sarı ve ark., 1992a Daucus carota Işınlanmış polen Rode ve Dumas de Vaulx, 1987 Fragaria ananassa Işınlanmış polen Caranta, 1992 Malus domestica Işınlanmış polen Zhang ve Lespinasse, 1991 Petunia hybrida Polen ışınlama Raquine, 1985 Solanum tuberosum Kolhisin Montelongo-Escobedo ve Rowe, 1969 Şekil 2.5. Haploid kavun bitkiciklerinin görünümü (25)

16 Haploid bitkilerin elde edilmesindeki temel yaklaşım kuşkusuz bu bitkilerin kromozom setlerinin iki katına çıkartılması (katlanması) ve %100 homozigot safhaların hızla geliştirilmesidir. Günümüzde kromozom katlaması için bitki ıslahçıları tarafından en yaygın kullanılan kimyasal madde, kolhisindir. Bu madde Liliaceae familyasına ait Colchicum automnale L. (güz çiğdemi) bitkisinin köklerinden elde edilen, alkaloid yapısında kuvvetli bir zehir olup; alkol, kloroform ve soğuk suda eriyen, buna karşılık sıcak suda ve eterde erimeyen bir maddedir (5). Dihaploidizasyon için değişik bitki türlerinde farklı yöntemler uygulanmıştır. Bunlar aşağıda özetlenmiştir: Mısır ve güzelavrat otunda olduğu gibi kallus dokusu veya hücre süspansiyonuna kimyasal madde uygulamaları, Kuşkonmaz, gerbera ve buğday da olduğu gibi kolhisinin kültür ortamına katılması, Buğday, arpa ve çim türlerinde olduğu gibi haploid bitkilerin köklerine kolhisin uygulaması, Şeker pancarı, pamuk, patlıcan ve biber de olduğu gibi haploid bitkilerin aksiller tomurcuklarına kolhisin uygulaması, Kavun, karpuz ve hıyar da olduğu gibi in vitro bitkiciklerin veya bunların çeliklerinin belli bir süre kolhisin çözeltisi içinde bekletilmesi, Kavunda olduğu gibi tepe tomurcuklarının kolhisin çözeltisi içerisine in vivo koşullarda bandırılması (25). 2.2.5. Sekonder Metabolit Üretimi Besin ve enerji sağlama gibi yaşamsal değer taşımamakla beraber, başta ilaç sanayi olmak üzere; kimya, besin, kozmetik ve zirai mücadele sektörlerinde ekonomik açıdan çok önemli ve yeri doldurulamaz bazı kimyasallar bitkilerden elde edilmektedir (5). Sekonder metabolitlerin bitkilerdeki önemli işlevleri şu şekilde özetlenebilir: Kuraklık, tuzluluk, UV ışınları vs. gibi değişik çevresel etkenlerin oluşturduğu stres ortamına karşı koyma, Herbivorlara (böcekler, sürüngenler vb.) karşı savunma, Mikroorganizmalara (bakteriler, viruslar, mantarlar vb) karşı savunma,

17 Bazı metabolik ve daha gelişmiş ekonomik işlevler (5). 2.2.5.1. İlaç Olarak Kullanılan Sekonder Metabolitler Tarihle ilgili erişilebilen yazılı kaynaklarda, ilk insanların çeşitli hastalıkların tedavisi içi bitkilerden yararlandıkları belirtilmektedir. Elbette bu kullanım biçimi etken madde olan sekonder üründen çok, bitkinin kendisine veya değişik yollarla elde edilen özütlerine dayanmaktadır. Bugün bile Dünya nüfusunun çoğunluğu için bitkiler ilaçların hammaddesi olarak kullanılmaktadır. Özellikle gelişmekte olan ülkelerde nüfusun %80 ı sağlık gereksinimlerini ilk etapta tıbbi bitkilerden sağlamaktadır. Dünya nüfusunun %80 inin gelişmekte olan ülkelerde yaşadığı düşünülürse toplam Dünya nüfusunun %64 ü bitkileri tedavi amaçlı kullanmaktadır. Gelişmiş ülkelerde ise reçeteli ilaçla satılan ilaçların yaklaşık %25 i bitkisel kökenli kimyasallardır. Şüphesiz, bu ilaçların keşfedilmesinde halk arasında değişik hastalıkların tedavisinde kullanılan bitkilerin, yani kocakarı ilaçlarının, araştırılması ve değerlendirilmesi büyük katkı sağlamıştır. Vinkristin, vinblastin, rezerpin, kinin ve hatta aspirin bugünkü ekonomik ve sağlık açısından önemlerini bu araştırmalara borçludurlar (5). Tablo 2.4. İlaç sanayisinde kullanılan bazı önemli bitkisel kökenli maddeler (5). İlaç Etken Maddesi Elde Edildiği Bitki Tedavi işlevi Atropin Digoksin Digitoksin Emetin Efedrin Filokarpin Hiyosiyamin Kinin, Kinidin Kodein Reserpin Vinkristin,Vinblastin,Aymalisin Atropa belladona Digitalis lanata Digitalis purpurea Cephalis spp. Efedra sinica Pilocarpus jaborandi Hyoscyamus niger Cinchona ledgeriana Papaver somniferum Rouwolfia serpentina Catharanthus roseus Antikolinerjik Kardiatonik Kardiovasküler Amipli dizanteri tedavisi Bronş açıcı Kolinerjik Antikolinerjik Sıtma tedavisi Öksürük kesici, analjezik Antihipertansif Kanser tedavisi

18 2.2.5.2. Besin Katkı Maddeleri Olarak Kullanılan Sekonder Metabolitler İnsanoğlu için yaşamsal değeri tartışılmaz olan bitki primer metabolitlerinin yanı sıra, tat ve koku verici maddeler de besin endüstrisinde önemli yer tutmaktadır. Sentetik katkı maddelerinin mutajenik, karsinojenik ve teratojenik etkilerinin ortaya çıkışı ile birlikte; et, süt, meyve, sebze, deniz ürünleri ve meşrubat sektörlerinde doğal ürünlere duyulan talep giderek artmaktadır. Tat ve koku vericiler tek bir kimyasal olabildiği gibi birçok kimyasalın karışımı da olabilirler. Örneğin, Thaumatococcus danielli den elde edilen tatlandırıcı thaumatin, bir tek kimyasaldan ibarettir. Zingiber officinale den elde edilen zencefilde ise gingeroller adı verilen aromatik bileşikler ve geranial ve neral gibi uçucu bileşikler işin içine girmektedir (5). 2.2.5.3. Parfümeri ve Zirai Mücadelede Kullanılan Sekonder Metabolitler Bitkisel kökenli ürünlerden özellikle parfüm olarak yararlanılması da çok eski tarihlere kadar dayanmaktadır. Örneğin, Rosa (gül) bitkisi türlerinden gül yağı, Lavandula bitkisinden lavanta ve Jasminum türlerinden yasemin ilk çağlardan beri bilinen ve bugün bile parfüm ve kozmetik sanayinde önemli yeri olan bitkisel ürünlerdir (5). Tablo 2.5. Endüstride kullanılan bitkisel kökenli diğer doğal ürünler (5). Ürün İşlevi Elde Edildiği Bitki Besin Kinin Monellin Mirakulin Glisirrizin (Meyan) Krosetin Betalain Likopein Humulon, lupuon Vanilin Parfüm ve Kozmetik Yasemin yağı Gül yağı Lavanta yağı Zirai Mücadele Piretrin, sinetrin, yasmolin Nikotin Anakardik asit Acılaştırıcı Tatlandırıcı Tatlandırıcı Tatlandırıcı Renklendirici Renklendirici Renklendirici Acı ve koku verici Koku verici Parfüm Parfüm Parfüm ve kozmetik İnsektisit İnsektisit molluskusit Cinchona ledgeriana Dioscorephyllum cumminsii Synsepalum dulcifilum Glycyrrhiza glabra Crocus sativa Beta vulgaris Lycopersicum esculentum Humulus lupulus Vanilla plenifolia Jasminum spp. Rosa damascena Lavandula officinalis Chrysanthemum cinerariaefolium Nikotiana tabacum Anacardicum occidentale

19 2.2.5.4.Sekonder Metabolitlerin Üretimi Tablo 2.6. Bitki hücre kültürleri tarafından üretilen bazı doğal bileşikler (5). Alkaloidler Flavonoidler Lignin Steroidler ve türevleri Antrakinonlar Kalkonlar Naftokinonlar Taninler Benzokinonlar Kinonlar Nükleik asitler Terpenler Diantronlar Ksantonlar Organik asitler Terpenoidler Fenoller Lateks Peptidler Vitaminler Bu ürünler arasında, özellikle ilaç yapımında kullanılan kimyasalların bulunması, bazı drogların ana bitkiden ziyade bu bitkinin hücre kültürleri tarafından üretimini ekonomik açıdan cazip kılmaktadır. Doğal bileşiklerin bu alternatif yöntem ile üretimi bazı büyük avantajlar sağlamaktadır. Bunlar şu şekilde özetlenebilir: Ana bitkinin kültürü veya toplanması esnasında karşılaşılan çevresel etkenlerin (iklim, coğrafi zorluklar, ulaşım güçlükleri, mevsimsel kısıtlamalar vs.) ortadan kaldırılması, Arz-talep dengeleri göz önüne alınarak gerektiği zaman yeterli üretimin sağlanabilmesi ve böylece piyasanın düzenli bir şekilde kontrolü, Daha basit kalitede ve verimlilikte üretim, Kültürü yapılan bitkiler için daha az arazi kullanımı, Politik baskılardan uzak, daha serbest bir üretim (5)

20 Tablo 2.7. Bitki hücre kültürleri tarafından üretilen ve ekonomik değeri yüksek bazı sekonder metabolitler (26). Kimyasal Sınıfı Metabolitin Adı Elde Edildiği Bitki Tropan alkaloidleri Atropin Atropa belladona İndol alkaloidleri Kinolin alkaloidleri İzokinolin alkaloidleri Fenilpropanoidler İzoprenoidler Steroidler Terpenoidler Hiyosiyamin, skopolamin Nikotin Aymalisin, vinblastin Kinin, kinidin, kinkonidin Tebain Kodein, morfin Emetin Antosiyaninler Antrokinonlar Kapsaisin Piretrin, yasmolin Digoksin,digitoksin Kolesterol, diosgenin Saponinler Datura spp.,hyoscyamus spp. Nicotiana tabacum Catharanthus roseus Cinchona ledgeriana Papaver bractetaum Papaver somniferum Cephaelis ipecacuanha Daucus carota Gallium mullago Capsicum anuum Chrysanthemum cinerariaefolium Digitalis lanata ve D. purpurea Dioscorea deltoidea Ginseng panax 2.2.5.5. Bitki Doku ve Hücre Kültürü ile Sekonder Ürünlerin Üretimi 2.2.5.5.1. Kök kültürleri Bitki tarafından üretilen metabolitin sentez yerinin köklerde bulunduğu durumlarda, bu organdan alınan parçaların, teorik olarak, ana bitkideki kök hücreleri kadar veya daha yüksek düzeyde olması beklenir. Ancak çok az bitki hücre kültüründe sınırsız büyüme ile birlikte metabolit üretiminin sağlandığı bildirilmiştir. Son yıllarda, bir bitki patojeni olan Agrobacterium rhizogenes ile yapılan çalışmalar bu kültürlerinde köklü değişiklik sağlamıştır. Toprak grubu bakterisi olan bu patojen Ri-DNA adı verilen küçük DNA parçasına bitki genomuna aktararak tüylü kök fenotipinin ortaya çıkmasına neden olmaktadır. Solanaceae familyası üyelerinde ve özellikle Datura ve Nicotiana türlerinde tüylü kök kültürleri ile piridin (nikotin, anatabin) ve tropan (atropin, skopolamin, hiyosiyamin) alkaloidlerinin yüksek oranda üretimi sağlanmıştır. Tropan alkaloidlerinin asıl sentez yerlerinin kökler olduğu ve sadece Solanaceae türlerinde (Atropa, Datura, Hyoscyamus) bulunduğu da hatırda tutulmalıdır. Transformasyonla elde edilen tüylü kök kültürleri ile metabolitlerin, özellikle de alkaloidlerin üretimi

21 sadece Solanaceae türleri ile sınırlı kalmamaktadır. Peganum harmala (üzerlik otu) bitkisinin doku, transforme olmamış kök ve hücre süspansiyon kültürlerinde betakarbolin alkaloidlerinin (harmin, harmol, harmaline ve harmalol) üretimi çok düşük düzeyde kalırken transforme olmuş kök hücrelerinde bu metabolitlerin miktarı yüksek bulunmuştur. Şeker pancarından (Beta vulgaris) betalainler, Senecio türlerinden pirolizidin alkaloidleri, Cinchona ledgeriana dan kinin ve kinidin, trasnforme olmuş kök hücresi kültürleri ile üretilen sekonder metabolitleri örnek olarak verilebilir (5). 2.2.5.5.2. Sürgün Kültürleri Bitkilerde sekonder metabolit birikimi ile sürgün primordiumlarının oluşumu arasındaki ilişkiden yola çıkarak, sürgün kültürleri ile madde üretimi ayrıntılı olarak irdelenmiştir (5). Örneğin, Catharanthus roseus bitkisiden elde edilen çoklu sürgün kültürleri indol alkaloidleri (katharantin ve vindolin) ana bitkidekinden daha yüksek oranda üretmektedir (27). Atropa belladona nın koltuk altı tomurcuklarından, sürgün ucundan veya yaprak disklerinden başlatılan multiple (çoklu) sürgün kültürlerinde tropan alkaloidlerinin sentezlendiği gözlenmiştir (28). 2.2.5.5.3. Embriyo Kültürleri Şayet bir metabolit embriyoda üretiliyor veya birikiyorsa bu metabolitin üretimi embrio kültürleri ile gerçekleşebilir. Ancak burada kastedilen kaynak bitkiden çıkarılıp kültürü yapılan embriyodan ziyade, somatik embriyo kültürleridir (5). Somatik embriyo kültürleri lipidler gibi depo maddelerinin üretimi veya araştırılmasında faydalı kaynaklardır. Papaver somniferum (haşhaş) bitkisinin embriyo kültürlerinde 45 gün sonra depo lipidi, triaçilgliserol birikimi olduğu gözlenmiştir (29). Doymamış yağ asidi gama-linoleik asidin bazı tedavi edici işlevlerinden dolayı (migren, yüksek tansiyon gibi) özellikle Boragi naceae familyası üyelerinin somatik embriyo kültürleri ile bu maddenin üretimi hedeflenmektedir (5).

22 2.2.5.5.4. Kallus Kültürleri Kallus kültürleri, ana bitkiden kesilip çıkartılan ve bölünme özelliğini yitirmemiş organ veya doku parçalarının karbon kaynağı (genellikle sakkaroz) ve bitki büyüme düzenleyicileri (genellikle bir oksin ve sitokinin) içeren yarı katı besi ortamında büyütülmesi sonucu oluşan morfolozik düzensizliğe sahip kütleler olarak tarif edilebilir. Dolayısı ile kallus kültürünün başlatıldığı doku parçasının orjini sekonder metabolitlerin üretiminde önem kazanmaktadır. Örneğin, tropan alkaloidlerinin üretimi hedefleniyorsa, Solanaceae familyası üyelerinin kök dokularında bu maddelerin biriktiği bölgeler seçilmelidir (5). Tablo 2.8. Kök ve sürgün oluşturmak üzere farklılaşan kallus kültürlerinde biriken bazı sekonder metabolitler (5). Bitki Türü Sekonder Metabolit Kaynaklar Kök oluşturan kallus kültürleri Atropa belladona Calystegia sepium Dubosia spp. Hyosyamus spp. Cephaelis ipecacuanba Papaver bracteatum Valeriana officinalis Solanum spp. Linum flavum Sürgün oluşturan kallus kültürleri Atropa belladona Papaver somniferum Cinchona ledgeriana Digitalis purpurea Citrus paradisi Tropan alkaloidler Tropan alkaloidleri Tropan alkaloidleri Tropan alkaloidleri İzokinoline alkaloidleri İzokinoline alkaloidleri Terpenoidler Streoidal alkaloidler Fenolik bileşikler Traopan alkaloidleri İzokinolin alkaloidleri Kinolin alkaloidleri Steroidler Fenilpropanoidler Hartmann ve ark.,1986 Jung ve Tebfer, 1987 Deno ve ark., 1987 Hashimoto ve ark.,1982 Teshima ve ark., 1988 Zito ve Staba, 1987 Violon ve ark., 1984 Kokata ve Radwan, 1979 Berlin ve ark.,1986 Hiraoka ve Tabata, 1974 Yoshikawa ve Furuya, 1985 Anderson ve ark., 1982 Hagimori ve ark., 1984 Barthe ve ark., 1987

23 2.2.5.5.5. Hücre Süspansiyon Kültürleri Hücre süspansiyon kültürleri tek hücrelerin veya küçük çapta hücre gruplarının sıvı büyüme ortamında dağılım gösterdiği bitki hücre kültürü teknikleridir (5). Tablo 2.9. Bazı sekonder metabolitlerin bitki hücre süspansiyon kültürlerinde ve kaynak bitkideki verim oranları (29). Metabolit Bitki Türü Metabolit Verimi (% Kuru Ağırlık) Süspansiyon Kültürü Kaynak bitki Aymalisin Catharanthus roseus 1,0 0,3 Serpentin Catharanthus roseus 0,8 0,5 Glutatyon Nicotiana tabacum 1,0 0,1 Nikotin Nikotiana tabacum 3,4 2-5 Diosgenin Dioscorea deltoidea 2,0 2,0 Rosmarinik asit Coleus blumei 15,0 3,0 2.2.5.6. Biyodönüşüm (Biyotransformasyon) Bitki teknolojisinin en ilgi çekici konularından birisi de biyodönüşümdür. Biyodönüşüm aynı zamanda bitki doku ve hücre kültürleri ile sekonder metabolitlerin üretiminin önemli bir ögesidir (5). Sözcük anlamı olarak biyodönüşüm organik bileşiklerin işlevsel gruplarının canlı hücreler veya bu hücrelerden izole edilen enzimler tarafından değiştirilerek farkı kimyasal yapıya sahip ürüne dönüştürülmesi olayıdır. Biyodönüşümü gerçekleştirecek hücrelerde yer alan enzimler ortama ilave edilen öncül (veya substrat) üzerinde bir takım kimyasal tepkimelerin gerçekleşmesinde rol oynarlar. Daha önce öncüller kısmında belirtildiği gibi hücre kültürlerinin büyüdüğü ortama bir öncül madde (substrat) ilave edildiğinde, hücreler öncelikle bu maddeleri bünyesine alacak ve daha sonraki basamakta son ürünü oluşturmak için substratta bir takım dönüşüm mekanizmaları meydana gelecektir. Birçok bitki doku ve hücre kültür sistemlerinde (organ, kallus, süspansiyon, protoplast ve tutuklanmış hücre kültürleri gibi) biyodönüşümün, çoğu kez, bir tek enzimin rol oynadığı tek basamaklı mekanizmadan

24 ibaret olduğu bilinmektedir. Yine de birçok enzimin rol oynadığı çok basamaklı biyodönüşüm olayları da rapor edilmiştir (30). Tablo 2.10. Bitki hücre kültürlerinde biyodönüşüme dair bazı örnekler (5) Bitki Türü Substrat Ürün Cannabis sativa Catharanthus roseus Datura innoxia Digitalis lanata Lavandula angustifolia Mentha spp. Mentha spp. Mucuna pruriens Papaver somniferum Papaver somniferum Peganum harmala Salix alba Kannabidiol Anhidrovinblastin Hidrokinon Digitoksin Monoterpenoid aldehitler Menton Menton Tirozin Kodeion Tebain Triptamin Salisilik alkol Kannabielsionlar Vinblastin Arbutin Digoksin Alkoller Neomenton İzomenton L-DOPA Kodein Neopin Seratonin Salisin 2.2.6. Somaklonal Varyasyon Somaklonal varyasyon bitki doku kültüründe genetik kararsızlık sonucunda ortaya çıkan kalıtımsal değişikliklerdir. Bu durum, özellikle doğal varyasyonun çok az ya da varyasyon meydana getirmenin zor olduğu durumlarda (ör. aseksüel olarak üreyen bitkilerde) melezleme yapmaksızın kromozom komplementlerinin değiştirilerek verim ve kalite karakterlerinin iyileştirilmesinde büyük önem taşımaktadır. Ancak, şu anda bu yolla geliştirilen bitki sayısı oldukça sınırlıdır (24). In vitro da rejenere edilen patates bitkilerinde sap, yaprak ve yumru karekterleri ile fotoperyot ihtiyacı ve meyve verimi gibi özellikler yönünden ebeveynlerini geçen (% 8,2) klonlar tespit edilmiştir. Şeker kamışında in vitro kültürde ortaya çıkan mutasyonlardan yararlanılarak kaim ve sert yapraklara, yaprak yüzeyinde yüksek silisyum depolama kapasitesine, daha kuvvetli kardeşlenme, daha yavaş gelişme ve daha dik büyüme özellikleri ile yüksek şeker verimine sahip bitkiler elde edilmiştir. Çeltik bitkisi doku kültüründe rejenere edildiğinde değişik özellikler yönünden mutasyonlar meydana gelmektedir. In vitroda ortaya çıkan somaklonal varyasyondan

25 yararlanılarak, çeltik yanıklığı (Pyricularia oryzae )'na, yatmaya ve tane dökmeye dayanaklı, harmanlaması kolay ve pişme kalitesi çok iyi olan "Dama" isimli bir çeltik çeşidi geliştirilmiştir. Buğdayda bitki boyu, kardeş sayısı, başak ve tane karakterleri, tohum verimi, hasat indeksi ve gliadin depo proteinleri gibi özellikler yönünden rejenere edilmiş bitkiler arasında geniş varyasyon görülmüş ancak, varyasyonların çoğu negatif yönde olmuştur. Ayrıca, Norstar buğday çeşidinde soğuğa tolerans yönünden ebeveynlerini geçen somaklonlar tespit edilmiştir (24). 2.2.7. Agrobacterium Aracılığıyla Gen Aktarımı Yıllardır ıslahçılar ve yetiştiriciler, arzu edilen karakterlere göre bitki tiplerini seçerek çoğaltmışlardır. Ancak, son yıllarda doğanın en etkili genetik mühendisi olan Agrobacterium bakterisi araştırıcılar tarafından arzu edilen genetik özelliklerin hızlı ve etkili bir şekilde bitkilere aktarımı için genetik olarak değiştirilmiştir (32). İlk transgenik bitki, 1980 lı yıllarda Agrobacterium aracılığıyla tütün protoplastlarından elde edilmiştir. Bu başarı 3 önemli buluş sonucunda gerçekleşmiştir: Gen aktarımında kullanılan Agrobacterium vektörlerinin elde edilmesi, Yeni bir bitki oluşturma yeteneğindeki bitki hücrelerine gen aktarım yöntemlerinin geliştirilmesi Seçici işaret (markör) genlerinin geliştirilmesidir (5). Günümüzde, bitkilere gen aktarımında en yaygın olarak kullanılan araç Agrobacterium tumafaciens bakterisidir. Bu bakteri sayesinde hemen hemen tüm kültür bitki türlerinde transgenik bitkiler elde edile bilmiştir. Başlangıçta, buğdaygilleri de içeren tek çenekli bitkilere Agrobacterium aracılığıyla yapılan gen aktarım çalışmalarında istenilen başarıya ulaşılamamış, bu engelleri aşabilmek için elektroporasyon, mikroenjeksiyon ve partikül bombardımanı gibi doğrudan gen aktarım teknikleri geliştirilerek, oldukça başarılı sonuçlar alınmıştır. Ancak, son yıllarda geliştirilen süper binari Agrobacterium vektörleri sayesinde mısır, çeltik, arpa ve buğday gibi tek çenekli buğdaygillere de başarılı gen aktarımı yapılabilmiştir (5). Agrobacterium, Rhizobiaceae familyasından toprakta yaşıyan gram-negatif bir bakteridir. İki çenekli (dikotiledon) bitkilerde A.tumafaciens kök boğazı uruna, A.rhizogenes ise saçak kök oluşumuna neden olmaktadır. Ur (tümör) oluşumuna bazı