Üroonkolojinin Temel Prensipleri ve Moleküler Biyolojisi Dr. Tahsin Turunç Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji A.D.
DNA Tüm organizmaların yapı ve fonksiyonlarını tek bir molekül belirler: Deoksiribonükleik asit (DNA) DNA 3 unsurdan oluşur Baz (pirimidin veya pürin) Şeker (2-deoksiriboz / riboz) Fosfat
DNA DNA her bireyin genetik bilgisini kodlar Germ hücreleri hariç canlıdaki tüm hücreler aynı DNA ya sahiptir DNA nükleer matriks içinde yer alır ve 2 zincirin birbirini tamamladığı çiftli sarmal yapıdadır Adenin (A), Guanin(G), Sitozin(C), Timin(T) A-T, G-C bazları eşleşir
DNA DNA RNA RNA: transkripsiyon protein: translasyon
Genom Gen: Hücre içindeki kodlayıcı DNA dizileri Hücre fonksiyonlarının yürütülmesini sağlayan bilgileri içerir Organizmanın şeklinden işlevlerine kadar tüm özellikleri genetik yapısına (genomuna) bağlıdır Bir DNA da 30.000-50.000 gen Farklı bireylerde genlerin %99.9 u benzer
DNA Mutasyonu DNA sırasının değişmesi/bozulması: mutasyon Nokta mutasyon: tek nükleotidin başka nükleotid ile değişmesi Delesyon: DNA dizisi kaybı Insersiyon: DNA dizisi eklenmesi Translokasyon: DNA dizisinin genomun bir bölgesinden diğerine yer değiştirmesi
DNA Mutasyonu DNA mutasyonu sonucu 3 olasılık: - DNA Tamiri - Hücre ölümü: Apoptozis - Hatalı DNA ya rağmen bölünme Proteinlerin yapı ve fonksiyonlarında bozulma Karsinojenez (onkogenler)
Onkogenler Hücre büyümesi ile ilgili genler (proto-onkogenler) mutasyona uğrayıp hiperaktif hale gelmeleri durumunda onkogen olarak adlandırılırlar İlk olarak malign transformasyona yol açan ve Retrovirüs olarak adlandırılan RNA virüslerinde tanımlanmışlardır
Protoonkogenler Onkogenlere nasıl dönüşür? Proto-Onkogen Onkogen 1.Mutasyon 2. Anormal Aktivite 3.Gen Translokasyon 4. Amplifikasyon (Sıra değiştirme) (Yer değiştirme) Anormal aktivite (Kro. Bölünmesinde hata)
Onkogenlerin fonksiyonları 1. Büyüme faktörleri (Örnek; Epithelium growth factor EGF ve platelet derived growth factor PDGF) 2. Büyüme faktör reseptörleri (Örnek; PDGFR) 3. Sinyal aktarımı (Örneğin; Ras, Raf, & MEK) 4. Transkripsiyon Faktörleri (Örnek; Jun, Fos, Elk-1 & myc)
Onkogenler Onkogenlerin kansere yol açma mekanizmaları: 1. Hücre proliferasyonu (Örnek; Ras, Raf, EGF) 2. Hücre farklılaşması (Örnek; PML/RAR ) 3. Hücre yaşamı (Örnek; Pl-3/AKT - BCL-2 aktivatörleri Apoptosis & hücre yaşamının sürdürülmesini inhibe ederler)
Tümör Supresör Genler Normalde hücre büyümesinin ve hücre döngüsünün düzenlenmesinde, DNA tamirinde ve hücre haberleşmesinde rol alırlar Bu genlerdeki bozukluk, organizma genetik olarak anormal hücreleri yok edemediği için kansere yol açar Kanser oluşması için tümör supresör genin her iki kopyasının da inaktive olması gerekir
Tümör Supresör Gen Fonksiyonları Onkogenlerin etkilerinin antagonize edilmesi Transkripsiyon faktörlerinin düzenlenmesi Hücre siklusunun düzenlenmesi (p53, Rb, INK-4 geni) Apoptozis indüksiyonu
Tümör Supresör Genler Retinoblastoma (Rb) p53 Wilms tümör geni (WT-1) Von Hippel Lindau (VHL) PTEN
Hipermetilasyon Metilasyon CG sıralı dinükleotidlerde oluşur. CG sıralı dinükleotidler CpG adaları adı verilen düzenleyici bölgelerde kümeleşir CpG dinükleotidlerinin metilasyonu transkripsiyon aktivitesini azaltır DNA metilasyonu hangi genlerin aktif olacağını düzenler
Hipermetilasyon Metilasyon epigenetik bir değişikliktir ve DNA sıralamasını bozmaz Metilasyon ile inaktif hale gelen genler demetilasyon ile tekrar aktifleştirilebilir CpG metilasyonu tümör supresör genlerin inaktivasyonuna sebep olarak karsinojeneze yol açabilir Normalde metilasyonlanan genlerde metilasyonun bozulması da karsinojeneze yol açabilir
Kalıtımsal Kansere Yatkınlık Aile öyküsü kanser gelişiminde önemli bir risk faktörüdür Genetik kalıtım / ortak çevresel etmenler Tüm kanserlerin ~%1 i kalıtımsal Belirli malignitelere kalıtımsal yatkınlığı olan hastalarda yapılan araştırmalar hem kalıtımsal tümör sendromları hem de sporadik kanserlerle ilişkili genlerin belirlenmesinde önem taşır
Kalıtımsal Kansere Yatkınlık Kalıtımsal kanserden sorumlu gen ile sporadik formdan sorumlu olan gen birbiriyle aynı Knudson hipotezi: Kalıtımsal ve sporadik kanserler arasındaki tek fark, kalıtımsal kanser hastaları tümör supresör geninin iki kopyasının birinde bozukluk ile doğarlar
Knudson Hipotezi Spontan Malignite (iki inaktivasyon) II II II Herediter Malignite (tek inaktivasyon) II II
Non-herediter Mutasyon Herediter Mutasyon
Polimorfizm VHL, WT1 gibi genlerde görülen mutasyonlar nadir görülür Fakat, genetik anomaliler düşünülenden çok daha sık (İnsan gen haritasının çıkarılması) > 10 milyon genetik varyant mevcut Polimorfizm: Normal insanlarda bulunan genlerin sık görülen varyantları Polimorfizm: Kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara yatkınlığa sebep olabilirler
Polimorfizm Polimorfik varyantların büyük çoğunluğu fonksiyonel olarak anlamsız Toplumda yaygın olarak görülürler, mevcut hastalıkların seyrine olumsuz yönde katkıda bulunabilirler İki çeşit polimorfik varyant mevcuttur: 1. Mikrosatellit tekrarlar CAG tekrarları (AR-Prostat kanseri ilişkisi) 2. Single nükleotid polimorfizmler (SNP) Amino asit sırasında değişikliğe yol açabilir
Hücre Döngüsü Tek yönde ilerleyen 4 basamaktan oluşan bir süreçtir Amaç: Hücre genomunun yanlışsız replikasyonu (kopyalanması) ve iki yavru hücreye aktarılması DNA hasarı Hücre döngüsünde duraklama DNA Tamiri ve Apoptozis Hücre döngüsünün düzenlenmesindeki bozukluk: -Hızlı anormal hücre proliferasyonu -Kanserin büyüme ve yayılması
Hücre Döngüsü G1: DNA sentezine hazırlık (RNA sentezi) S: DNA sentezi (DNA miktarı 2 kat) G2: Hücre bölünmesine hazırlık (DNA, RNA ) M: Hücre bölünmesi G0: Hücre döngüsünde G1 öncesi sessiz dönem (terminal farklılaşmasını tamamlamış, geçici olarak hücre döngüsü duraklamış hücreler) 2 ana kontrol noktası: G1-S ve G2-M
Hücre Döngüsünün Kontrolü 2 kontrol noktasında dururlar: G1-S (DNA sentezinden önce), G2-M (Mitozdan önce) Bu dinlenme periyotları CDK ve tümör supresör proteinlerin aktivitelerinin azalmasıyla olur Varsa genetik defektler düzeltilir p53: Hücre döngüsünde yer alan en önemli tümör supresör gen
Hücre Döngüsü Hipoksi ve DNA hasarı hücre döngüsünde duraklama Siklinler Hücre siklusunun çeşitli fazlarını aktive eden proteinler Siklin bağımlı kinazlara (CDK) bağlanarak onları aktif hale getirirler (Tirozin kinaz vb.) Aktif CDK lar: DNA replikasyonu ve mitoz basamaklarında görev alan proteinlerin fosforilasyonunu katalize eder (Hücre döngüsü ilerler)
Hücre Döngüsü Hücre döngüsünün her fazında bir sonraki faza ilerlemeyi sağlayan farklı siklin-cdk kinaz kompleksleri görev yapar CDK aktivitesinin kontrolü 4 yolla olur: siklinlerin peryodik transkripsiyonu, negatif düzenleyici fosforilasyon, nükleustan sitoplazmaya taşınma, CDKI ler Siklin bağımlı kinaz inhibitörleri (CDKI), siklin-cdk komplekslerinin negatif düzenleyici proteinleri olarak işlev görür (p15, p16, p18, p19, p21, p27, p57, prb)
Hücre Döngüsünün Kontrolü p53 yolağı hücrenin stres altında olduğu ve hasar gördüğü durumlarda (radyasyon, hipoksi, kemoterapötikler, onkogenler) aktifleşir p53 aktivasyonu bir CDKI olan p21 transkripsiyonunu tetikler ve hücre döngüsü G1-S fazında duraklar Bu aşamada DNA tamir edilir veya hücre apoptozise gider
Hücre Döngüsünün Kontrolü p53 aktivasyonu ile stres halinde DNA replikasyonu engellenir (gardiyan molekül) ve mutant DNA replikasyonu olasılığı en aza indirgenir p53 mutasyonu olması durumunda hücresel koşullar dur sinyali verse dahi hücre döngüsü devam eder Çeşitli kanserlerde en sık görülen mutasyon p53 mutasyonudur
Mutasyon sonucu sentezlenen anormal p53, normal p53 ten çok daha uzun ömürlü Aşırı miktarda biriken anormal p53 proteini, kısa ömürlü olan normal p53 ile birleşir Sonuç olarak normal p53 fonksiyonu engellenir Mutant p53 (+) olan tümörlerde prognoz kötü ve tedavi daha başarısız
Hücre Döngüsü ve Kanser Kanser: Kontrol edilemeyen hücre çoğalması Çoğalmayı baskılayıcı mekanizmalarda bozukluk Kontrolsüz çoğalma ve apoptozisin baskılanması karsinojenez sürecinin iki önemli etkeni Sınırsız bölünme yeteneği Metastaz
Hücre İçi Haberci Sistemleri Hücre dışından gelen uyarıların algılanarak sinyalin hücre içine iletilmesi ve cevap oluşturulmasında rol alırlar Karsinogenezde görülen denetimsiz büyüme ve çoğalma sinyal iletim yollarını ilgilendirebilir Sinyal iletiminin bileşenleri: reseptör, reseptörü aktive eden sinyal molekülü (ligand), aktive olan reseptörün başlattığı sinyal iletim yolağındaki efektör moleküller
Hücre İçi Haberci Sistemleri Reseptör aktivasyonu sonucu oluşan hızlı etkiler protein fosforilasyonuyla, uzun süreli ve daha kalıcı etkiler ise gen transkripsiyonunun etkilenmesi ile ortaya çıkar Büyüme faktörü gibi ligandlar membran reseptörlerine, steroid hormonlar ve nitrik oksit gibi ligandlar ise hücre membranını geçerek hücre içi reseptörlere bağlanırlar
Hücre İçi Haberci Sistemleri Reseptör tirozin kinaz aracılı iletim yolları MAP kinaz aracılı iletim yolları Ras/Raf/MEK/ERK/ sinyal iletim yolağı PI/3 kinaz aracılı sinyal iletim yolağı Jak/STAT proteinleri aracılı sinyal iletim yolağı G protein aracılı sinyal iletim yolağı
Hücre İçi Haberci Sistemleri Membran yerleşimli proteinlere reseptör tirozin kinazlar (RTK) denilir İnsulin, büyüme faktörleri (EGF, VEGF, PDGF, FGF) reseptörleri RTK ların sitoplazmik kısımda aktivasyondan sorumlu tirozin kinaz bölgesi bulunur RTK aktivasyonu ile reseptör kendini fosforile eder İkinci aşamada fosforlanan bölgeye adaptör proteinler bağlanarak uyarının hücre içine aktarılmasını sağlar RTK aktivasyonunun sonlanmasında fosfatazlar rol alır Sürekli ve kontrolsüz RTK aktivasyonu karsinojenez sürecinde rol alır
Reseptör tirozin kinaz aracılı iletim yolağı
Apoptozis Apoptozis: (yunanca kökenli) yaprak dökümü Çok basamaklı programlanmış hücre ölümü Kemoterapötik ajanlar ve radyoterapi, etkilerini apoptozisi indükleyerek gösterir Apoptozis sinyal yolları ve molekülleri önemli tedavi hedefleri arasında rol alır
Apoptozis Anormal DNA lı hücreleri yok eder Normal doku kaybından sorumludur (Yaşlanmış ve yararsız hale gelmiş normal hücrelerin ortamdan yok edilmeleri) Nükleer büzülme ve DNA fragmantasyonu ile karakterize
Apoptozis Apoptozise uğrayan hücrenin komşu hücrelerle bağlantısı kesilir Hücre büzülür ve hücre yüzeyindeki spesifik yapıtaşları kaybolur Çekirdek büzülür ve kromatin yoğunlaşır Hücre membranı bol kıvrımlı hal alır, ancak intaktır DNA fragmantasyonu olur Mitokondri porlarının açılmasıyla litik süreç başlar ve apoptotik cisimler oluşur Apoptotik cisimler fagositlerin içine alınır ve lizozomal yol ile hızla yıkılır
Apoptozis Mitokondri (intrinsik yolak) ya da ölüm reseptörleri (ekstrinsik yolak) aracılı olarak başlatılabilir İntrinsik yolda hücreye gelen dış sinyaller mitokondriden proapoptotik moleküllerin salınımına yol açar (sitokrom c ve Smac/DIABLO-second mitochondria derived activator of caspases) Ekstrensek yolaktaki ölüm reseptörleri TNF reseptör süper-ailesinde yer alırlar ve sitoplazmik kısımlarında ölüm aktivatörleri taşırlar (TRAIL-TNF related apoptosis inducing ligand, FAS-L)
Apoptozis Kaspazlar: proteolitik etkili proteinlerdir ve apoptoziste ortaya çıkan morfolojik değişiklikleri tetiklerler Sitoplazma içinde inaktif proenzim halinde bulunurlar (prokaspaz) Apoptozisi tetikleyen başlangıç sinyalini takiben prokaspazlar aktif kaspaz haline geçer ve yaklaşık 1 saat içinde birbirini takip eden olaylar zinciri ile (kaspaz aktivasyonu kaskadı) hücre ölümü gerçekleşir Başlangıç kaspazları: Kaspaz 8 (ekstrinsik yol) ve 9 (intrinsik yol) Effektör kaspazlar: Kaspaz 3 ve 7
Apoptozis Bcl-2 proteinleri kaspaz aktivasyonunda önemli rol oynar p53 tümör baskılayıcı proteini hücre döngüsünün durdurulması ve apoptoziste etkin rol oynar Apoptozisi inhibe eden proteinler (IAP) kaspazlara bağlanarak kaspaz aktivitesini inhibe ederler IAP lar normal dokuda bulunmazlar ancak birçok tümör dokusunda bulunurlar
Apoptozis Tümör tedavisi Kanserli hücrelerde genlerdeki değişiklikler hücrelerin apoptozis ile yok olma ihtimalini ortadan kaldırarak yaşam sürelerini uzatır Apoptozis arttırılarak kanser hücreleri yok edilebilir Apoptozis reseptör yolağındaki bozukluğun düzeltilmesi Kemoterapi Rekombinant ölüm reseptör ligandları (FAS-L ve TRIAL)
Metastaz Metastaz: Kanser hücrelerinin köken aldıkları bölgeden farklı doku ve organlara yayılması Kanserden ölümleri %90 nından sorumlu Metastaz basamakları Anjiyogenez İnvazyon Migrasyon-motilite Ekstravazasyon Proliferasyon
Normal Hücreler Kanserli hücreler
Kanser
Anjiyogenez
İnvazyon
Migrasyon
Anjiyogenez Tümör kitlesi 1-2 mm3 hacime ulaşınca oksijen ve besin desteği sağlamak için yeni damar yapımını (neovaskülarizasyon) uyarır Anjiyogenik ajanlar / inhibitör faktörler arasındaki denge anjiyogenez lehine bozulur Anjiyogenik ajanlar tümör hücrelerinden, monosit ve fibroblast gibi hücrelerden kollajen matriks yıkımı sonucu açığa çıkabilir
Anjiyogenik ajanlar Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) En önemlileri ve üzerinde en çok durulan faktör Yeni kan damarlarının oluşumunu indükler Tirozin kinaz yapısında 3 reseptörü vardır (VEGF-R1, VEGF- R2, VEGF-R3) VEGF-R aktivasyonu fosfolipaz-c, fosfoinozitol-3 kinaz ve ras GTPaz aktivatör gibi hücre içi sinyal iletim proteinlerini fosforile ederek endotel hücrelerinin proliferasyon, migrasyon ve diferasyonunu sağlar
Anjiyogenik Ajanlar Nitrik oksit (NO) anjiyogenezin VEGF bağımlı medyatörüdür VEGF, NO-sentaz enzimini uyarır (endotel hücre migrasyonunu arttırır) Hipoksik ortamlarda düzeyi hızla artan hipoxia-inducible transcription factor-1 (HIF-1) VEGF salınımında etkilidir
Anjiyogenik Ajanlar Platelet derived growth factor (PDGF) Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) Transforming growth factor-beta (TGF- ) Epidermal growth factor (EGF) Transforming growt factor-alpha (TGF- ) Hepatocyte growth factor (HGF)
İnvazyon Kanser hücresinin primer tümörden ayrılması (detachment) E-kadherin Kanser hücrelerinin matriks, endotel hücreleri ve subendotelyal bazal membrana tutunma aşaması (attachment) integrin, selektin, Ig benzeri adhezyon mol. Bazal membran ve ekstraselüler matriks komponentlerinin yıkımı (proteolitik enzimler) metalloproteazlar, plazminojen aktivatörleri (t-pa, u-pa), katepsinler
Metastazın Diğer Aşamaları Kanser hücresinin migratuar özellik kazanması motilite faktörleri (otokrin motilite faktörü) Ekstravazasyon proteoliz Proliferasyon anjiyogenez
Hedefe Yönelik Tedaviler Seçici olmaları nedeniyle tümör molekülüne yönelerek kanser hücresini öldürürken, normal hücrelerin sağlıklı bir ortamda devamına olanak tanır Kemoterapi ve radyoterapiye göre avantaj sağlar Günümüzde 4 temel molekül ile uygulanmakta Monoklonal antikorlar (mab) Küçük moleküller Peptid mimetikler Antisens oligonükleotidler
Hedefe Yönelik Tedaviler Anti-anjiyogenik tedaviler Anti-invazif tedaviler
Monoklonal Antikorlar Tümöre özgü yüzey proteinleri (reseptörler) veya sinyal molekülünü (büyüme faktörleri) hedefleyebilirler Bevacizumab: anti-vegf antikoru (Avastin, Avastatin) renal hücreli karsinom Prostat özgül membran antijeni (PSMA): proteolitik aktivitesi olan bir membran glikoproteini, P Ca hücrelerinde (+) Anti-PSMA antikorlar: görüntüleme, tedavi
Küçük Moleküllü Ajanlar ve Peptid Mimetikler Tirozin kinazlar :Hücre çoğalması, farklılaşması, anjiyogenez, hücre siklusunun düzenlenmesi ile ilgili sinyal iletim yollarına aracılık ederler Küçük moleküllü ajanlar tümör oluşumu sırasında düzenlenmesi bozulan bu kinazları hedefler Sunitinib, sorafenib: VEGFR TK inhibitörleri (RHK)
Antisens Oligonükleotidler 17-22 nükleotid uzunluğunda kimyasal olarak değiştirilmiş, tek iplikli DNA benzeri moleküllerdir Belirlenmiş bir genin mrna sına tamamlayıcı olarak tasarlanmıştır Hedeflenen genin ekspresyonunu engeller Kanser hücrelerinde membran reseptörleri, sinyal iletim yolakları, hücre siklüsü ajanları v.b hedeflenebilir
Anti-anjiyogenik tedaviler Trombospondin Anjiostatin Endostatin İnterferonlar Matriks metalloproteinaz inhibitörleri Maspin
Ürolojik Kanserlerle İlişkili Tümör Sendromları Sendrome Tümör Kromozom Gen Wilm s Tümörü Wilm s 11p13 WT1 Von Hippel-Lindau Berrak hüc. RCC 3p25 VHL Feokromositoma Hered Papiller RCC Papiller RCC 7q31 MET Birt-Hogg-Dubé Papiller RCC 7p11.2 FLCN MEN II Feokromositoma 10q11 RET Herediter PCa Prostat kanseri 1q24-25, 1,8 MSR1 17, 20, X ELAC2 RNASEL
Von Hippel-Lindau Sendromu Berrak hücreli RCC, retinal anjiyoma, feokromositoma, MSS hemanjiomları, epididimal kistadenom, pankreas adacık tümörleri 3p25: VHL tümör supresör geni Sporadik berrak hücreli RCC hastalarının %80 ninde de VHL geninde genetik değişiklikler mevcut
Von Hippel-Lindau Sendromu VHL proteini Hücre siklusu ve anjiyogenezin düzenlenmesi İyi oksijenlenmiş hücrede HIF- yı yıkar HIF- VEGF, PDGF, TGF- ve EPO yapımını indükler Anaerob şartlarda yaşam, anjiyogenez, metastaz
Mesane Kanseri En sık görülen 9p kayıpları (%50-60) (Bu kromozomun kolları üzerinde normalde tümör baskılayıcı genler yer alır) Rb tümör baskılayıcı geni kaybı (%20-30) p53 mutasyonu (%60) C-myc onkogeninin aşırı ekspresyonu H-ras onkogeni VEGF EGRF CD44 adhezyon molekülü kaybı
Prostat Kanseri Herediter Prostat ca: Bir ailenin 3 bireyinde veya 3 nesilde veya 55 yaşından genç iki bireyde prostat kanseri görülmesi %5-10 u herediter Erken yaşta ortaya çıkanların %40 ı herediter En sık 1. kromozomda mutasyon
Androjen reseptör geninde nokta mutasyonlar 8. kromozom delesyonu Ras p21 onkogeni E-cadherin gen kaybı (adhezyon ) VEGF Telomeraz PTEN tümör baskılayıcı geninin kaybı
Böbrek Kanseri Kalıtımsal ve sporadik görülür Kalıtımsal: %1-2 Sıklıkla bilateral ve multifokal 3. kromozom kısa kolunda anormallik VHL hastalığı olanlar VHL tümör baskılayıcı genindeki kayıplar
Böbrek Kanseri c-myc onkogeni p53 mutasyonu Rb mutasyonu VEGF Angiostatin