STATİN UYGULANAN FARELERİN AORTA VE KORPUS KAVERNOZUM DOKULARINDA RHO-KİNAZ ENZİMİNİN EKSPRESYONU VE AKTİVİTESİNİN İNCELENMESİ

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI STATİN UYGULANAN FARELERİN AORTA VE KORPUS KAVERNOZUM DOKULARINDA RHO-KİNAZ ENZİMİNİN EKSPRESYONU VE AKTİVİTESİNİN İNCELENMESİ Halil Mahir KAPLAN YÜKSEK LİSANS TEZİ ADANA-2007

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI STATİN UYGULANAN FARELERİN AORTA VE KORPUS KAVERNOZUM DOKULARINDA RHO-KİNAZ ENZİMİNİN EKSPRESYONU VE AKTİVİTESİNİN İNCELENMESİ Halil Mahir KAPLAN YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Yard. Doç. Dr. M. Ata SEÇİLMİŞ Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından TF2006YL3 no lu proje olarak desteklenmiştir. ADANA-2007

TEŞEKKÜR Çalışmalarımız için gerekli bilimsel ortamı sağlayan tez yöneticisi hocam Yard. Doç. Dr. M. Ata SEÇİLMİŞ ve bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. Ergin ŞİNGİRİK e, araştırmanın tüm aşamalarında maddi, manevi büyük desteği için Prof. Dr. Kansu BÜYÜKAFŞAR a, araştırma görevlisi arkadaşlarım Arş.Gör.Dr. Özlem YORULMAZ ÖZÜ ye, Arş.Gör.Dr. Nalan TİFTİK e, Hakan KURT a, Arş.Gör.Dr. Havva KUBAT a, Arş.Gör.Dr. Sencer YURTSEVER e Arş.Gör. Mehtap PEKTAŞ a, ayrıca emeği geçmiş tüm teknik ve idari personele yardımları ve katkılarından dolayı teşekkür ederim. Bu çalışma Ç.Ü. Araştırma Fonu tarafından, TF2006YL3 no lu proje olarak desteklenmiştir. iii

İÇİNDEKİLER KABUL ve ONAY ii TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vi ÇİZELGELER DİZİNİ viii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ix ÖZET xi ABSTRACT xii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİ 3 2.1. Statinler 3 2.2. Rho/Rho-kinaz sinyalizasyon yolağı 6 2.2.1. Rho proteinleri 6 2.2.2. Rho-kinaz 8 2.3. Vasküler doku ve Rho/Rho-kinaz sinyalizasyon yolağı ilişkisi 13 2.4. Rho/Rho-kinaz yolağının korpus kavernozum dokusundaki fonksiyonu 15 3. GEREÇ VE YÖNTEM 17 3.1. Kullanılan Kimyasal Ajanlar 17 3.2. Organ Banyosu Deneyleri 18 3.3. Western-blot Deneyleri 19 3.3.1. Homojenizasyon 19 3.3.2. Protein Miktar Tayini 19 3.3.3. Western-blot 20 3.4. Sonuçların Değerlendirilmesi 20 4. BULGULAR 22 iv

4.1. Kontrol ve statin uygulanan farelerin kan lipid seviyeleri 22 4.2. Torasik aorta bulguları 22 4.2.1. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik aortalarına ait fenilefrin kasılmaları 22 4.2.2. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik aortalarına ait KCl kasılmaları 23 4.2.3. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik aortalarına ait Y-27632 gevşemeleri 24 4.2.4. Torasik aorta ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli vazoaktif ajanlara ait pec50 değerleri 25 4.2.5. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik aortalarında yapılan Western blot analizleri 26 4.3. Korpus kavernozum bulguları 28 4.3.1. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin korpus kavernozum dokularına ait fenilefrin kasılmaları 28 4.3.2. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin korpus kavernozum dokularına ait KCl kasılmaları 29 4.3.3. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin korpus kavernozum dokularına ait Y-27632 gevşemeleri 30 4.3.4. Korpus kavernozum ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli ajanlara ait pec50 değerleri 31 4.3.5. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin korpus kavernozum dokularında yapılan Western blot analizleri 32 5. TARTIŞMA 35 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 38 7. KAYNAKLAR 39 ÖZGEÇMİŞ 44 v

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Asetil KoA dan kolesterole dönüşüm şeması. KoA: koenzim A, PP: pirofosfat. 4 Şekil 2. Rho aktivitesinin düzenlenmesi 29. PKN,;protein kinaz N. 7 Şekil 3. Kontraktil stimülasyon ve Ca 2+ sensitizasyonu 31. PKC; protein kinaz C, PKN; protein kinaz N, ILK; integrin-bağlı kinaz, CPI-17; 17kDa protein kinaz C- potentiated inhibitory protein of type 1 of protein fosfataz, [Ca 2+] i; sitozolik Ca 2+ konsantrasyonu, DAG; diasilgliserol, RhoK; Rho-kinaz, MYPT-1; miyozin hedef alt ünite, MLCP; miyozin hafif zincir fosfataz. 8 Şekil 4. Rho-kinaz ve düzenlenmesi. PH; plekstrin homoloji bölgesi, RB; Rho bağlayıcı bölge, AA; araşidonik asit, GTP-Rho; Rho nun aktif formu.. 9 Şekil 5. Düz kas kasılmasının regülasyonu. ZIPK; zipper-interactig protein kinaz, DMPK; miyotonik distrofi protein kinaz, PAK; p21-aktivated protein kinaz, PKC; protein kinaz C, PKN; protein kinaz N, ILK; integrin-bağlı kinaz, CPI-17; 17kDa protein kinaz C-potentiated inhibitory protein of type 1 of protein fosfataz, [Ca 2+] I; sitozolik Ca 2+ konsantrasyonu, DAG; diasilgliserol, GPCRs; G protein-bağlı reseptörler, IP3; inozitol-1,4,5- trisfosfat, MLC20; 20-kDa regülatör miyozin hafif zincir, MLCK; Ca 2+ -kalmodülin-bağımlı miyozin hafif zincir kinaz, MLCP; miyozin hafif zincir fosfataz, MYPT1; miyozin fosfataz hedef alt ünitesi 1, M20; 20-kDa MLCP nin katalitik olmayan alt ünitesi, PI3K-C2α; sınıf 2 fospfatidilinozitol 3-kinaz ın α izoformu, PLC; fosfolipaz C, PP1c; katalitik alt ünite 1 protein fosfataz, RhoGEF; GDP-GTP değiştirici faktör, RhoK; Rhokinaz ın ROCKI ve ROCK II izoformu 31. 12 Şekil 6. Kontrol ve statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen torasik aorta halkalarında fenilefrin (10-8 -10-4 M, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt eğrileri. Kasılmalar KCl (80mM) kasılmasının % si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. 23 Şekil 7. Kontrol ve statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen torasik aorta halkalarında KCl (10-80 mm, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt bar grafikleri. Kasılmalar fenilefrin (10-4 M) kasılmasının %'si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. ***: P< 0.001. 24 vi

Şekil 8. Kontrol ve statin (30 mg/kg rosuvastatin, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen torasik aorta halkalarında Y-27632 (10-9 -10-5 M, n=10) ye ait gevşeme eğrileri. Gevşemeler fenilefrin kasılmasının yüzdesi olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. *: P< 0.05. 25 Şekil 9. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan farelerin torasik aortasında ROCK2 expresyonu. K: kontrol, S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5). 27 Şekil 10. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan farelerin fenilefrinle kastırılmış torasik aortasında p-mypt seviyeleri. K: kontrol, S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5). 28 Şekil 11. Kontrol ve statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen korpus kavernozum dokularında fenilefrin (10-8 -10-4 M, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt eğrileri. Kasılmalar KCl (80mM) kasılmalarının % si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. 29 Şekil 12. Kontrol ve statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen korpus kavernozum dokularında KCl (10-80 mm, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt bar grafikleri. Kasılmalar fenilefrin (10-4 M) kasılmalarının % si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. 30 Şekil 13. Statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan ve uygulanmayan farelerin kavernoz dokularında Y-27632(10-9 -10-5 M, n=10) ye ait gevşeme eğrileri. Gevşemeler fenilefrin kasılmasının % si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. *: P< 0.05. 31 Şekil 14. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan ve uygulanmayan (Kontrol) farelerin korpus kavernozum dokularındaki ROCK2 expresyonu. K: kontrol, S: rosuvastatin alan gurubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5). 33 Şekil 15. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan ve uygulanmayan (Kontrol) farelerin fenilefrin ile kastırılımış korpus kavernozum dokularındaki p-mypt seviyeleri. K: kontrol, S: rosuvastatin alan gurubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5). 34 vii

ÇİZELGELER DİZİNİ 4 Tablo I. Doğal ve sentetik statinler 10 Tablo II. Rho kinaz substratları 22 Tablo III. Kontrol ve rosuvastatin uygulanan farelerin 30. günlerindeki kan lipid düzeyleri Tablo IV. Torasik aorta ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli vazoaktif ajanlara ait pec50 değerleri 26 Tablo V. Korpus kavernozum ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli ajanlara ait pec 50 değerleri 32 viii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ HMG-KoA α enos inos nnos ROCK2 YDL DDL Ç-DDL GTP GDP KCl Ca +2 COX GAPs GDIs GEF ZIPK DMPK PAK PKC PKN ILK 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A Alfa Endotelyal nitrik oksid sentaz İndüklenebilir nitrik oksid sentaz Nöronal nitrik oksid sentaz Rho-kinaz enzim izofromu Yüksek dansiteli lipoprotein Düşük dansiteli lipoprotein Çok düşük dansiteli lipoprotein Guanozin trifosfat Guanozin difosfat Potasyum klorür Kalsiyum Siklooksijenaz GTPaz aktive edici proteinler GTPaz ayırıcı inhibitörler Guanin nükleotid değiştirici faktör Zipper-interacting protein kinaz Miyotonik distrofi protein kinaz p21-aktivated protein kinaz Protein kinaz C Protein kinaz N İntegrin-bağlı kinaz ix

CPI-17 type 1 of protein fosfataz [Ca 2+] I DAG GPCRs IP3 MLC20 MLCK MLCP MYPT1 M20 PI3K-C2α PLC PP1c RhoGEF NO cgmp p-mypt MBS 17kDa protein kinaz C-potentiated inhibitory protein of Sitozolik Ca 2+ konsantrasyonu; Diasilgliserol G protein-kenetli reseptörler İnozitol-1,4,5- trisfosfat 20-kDa regülatör miyozin hafif zincir Miyozin hafif zincir kinaz Miyozin hafif zincir fosfataz Miyozin fosfataz hedef alt ünite MLCP nin 20-kDa katalitik olmayan alt ünitesi Sınıf 2 fosfatidilinozitol 3-kinaz ın α isoformu Fosfolipaz C Tip 1 protein fosfatazın katalitik alt ünitesi GDP-GTP değiştirici faktör Nitrik oksid Siklik guanozinmonofosfat Fosforillenmiş miyozin fosfataz hedef alt ünite Miyozin bağlayıcı alt ünite x

ÖZET Statin Uygulanan Farelerin Aorta ve Korpus kavernosum Dokularında Rho-kinaz Enziminin Ekspresyonu ve Aktivitesinin İncelenmesi Bu çalışmada, bir HMG-KoA redüktaz inhibitörü olan rosuvastatinin (30 mg/kg/gün, 30 gün boyunca) kronik olarak uygulamasının fare torasik aorta ve korpus kavernozum (CC) dokularında Rho-kinaz enzim ekspresyonu ve aktivasyonu üzerine olası etkileri hem Western blot analizleri hem de izole organ banyosu deneyleri ile incelendi. 30 günlük uygulama sonrasında rosuvastatin verilen farelerin serum total kolesterol düzeyleri, rosuvastatin verilmeyen farelere göre anlamlı olarak düşüktü. Rosuvastatin verilen farelerden izole edilen aortta bir α 1 adrenoseptör agonisti olan fenilefrine verilen kasılma yanıtları değişmezken, bu grupta KCl yanıtlarının azaldığı görüldü. Bu farelerin CC larında rosuvastatin uygulaması fenilefrine ait EC 50 değerini arttırdı. Rosuvastatin alan gruptan izole edilen hem aorta hem CC dokularında Rho-kinaz enziminin selektif inhibitörü olan Y- 27632 ye verilen gevşeme yanıtları kontrole göre anlamlı bir şekilde arttı. Bununla birlikte rosuvastatin alan farelerin torasik aorta ve CC dokularında Rho-kinaz enzim ekspresyonu veya aktivasyon düzeyleri kontrole göre farklı değildi. Çalışmamızın sonuçları, farelerde rosuvastatin uygulamasıyla HMG-KoA redüktaz enziminin kronik inhibisyonunun bu hayvanlardan izole edilen korpus kavernozum dokusunda, fenilefrine verilen kasılma yanıtlarında bir baskılanmaya ve torasik aortasında KCl ye verilen kasılma yanıtlarında bir azalmaya neden olduğunu ve bu uygulamanın her iki dokuda Rho-kinaz enziminin selektif inhibitörü olan Y-27632 ye verilen gevşeme yanıtlarını arttırdığını göstermektedir. Anahtar kelimeler: Rosuvastatin, Rho-kinaz, Y-27632, Torasik aorta, Korpus kavernozum xi

ABSTRACT Investigation of Expression and Activity of Rho-kinase Enzyme In The Aorta and Corpus Cavernosum Isolated From Statin-Treated Mice In this study, we investigated the effects of chronic inhibition of HMG-CoA reductase with rosuvastatin intake (30 mg/kg/day, via gastric gavage, 30 days) on Rho-kinase enzyme expression and activation by Western blot analysis and isolated organ bath experiments on the thoracic aorta and corpus cavernosum(cc) in the mice. In the rosuvastatin-treated mice, serum total cholesterol level was significantly lower than the untreated mice. Contractile responses of the aorta obtained from rosuvastatin-treated mice to α 1 -adrenoceptor agonist phenylephrine were not changed while KCl-induced contractions were decreased when compared to those of untreated group. Contractile responses of the CC obtained from rosuvastatin-treated group to phenylephrine were not changed while EC 50 for phenylephrine was significantly increased. Relaxant responses to Rho-kinase inhibitor Y-27632 were significantly increased in both thoracic aorta and CC obtained from rosuvastatin-treated mice. In western blot analysis, expression and activation levels in rho-kinase were not different in the aorta and CC from mice treated with rosuvastatin when compared to those of untreated mice. These findings suggest that chronic inhibition of HMG-CoA reductase by rosuvastatin not only leads to decrease in the contractile responses to KCl in the thoracic aorta and to phenylephrine in the CC but also increase in the relaxant responses to Rho-kinase inhibitor Y-27632 in the aorta and CC isolated from mice. Key words: Rosuvastatin, Rho-kinase, Y-27632, Thoracic aorta, Korpus cavernosum xii

1. GİRİŞ HMG-KoA (3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A) redüktaz enziminin inhibitörleri olan statinler güçlü kolesterol düşürücü ilaçlardır ve hiperkolesterolemili hastalarda en çok tercih edilen gruptur. Son zamanlarda yapılan bazı çalışmalarda, bu ilaçların vasküler sistem üzerine olumlu tesirlerinde kolesterol düşürücü etkilerinden başka mekanizmaların da rol oynadığı ileri sürülmektedir. Bu çalışmalarda, statinlerin kolesterol düşürücü etkilerinden başka, onların enos, inos ve nnos enzimlerini modüle ettikleri, lökosit ve trombositlerin göçünü engelledikleri, damar düz kas hücrelerinde gevşemeye neden oldukları, antioksidan etki gösterdikleri, anjiyotensin II nin neden olduğu kalp hipertrofisini ve fibrozisini engelledikleri, antiinflamatuar etkiye sahip oldukları ve hücre duvarında sinyal ileti sisteminde rol alan küçük G proteinlerinin modifikasyonunu önledikleri gösterilmişitir 1-8. Küçük G proteinlerinin modifikasyonunun engellenmesi HMG-KoA redüktaz enzimi üzerinden L-mevalonatın metabolik yolu ile açıklanabilir. L-mevalonat katabolizmasının statinler tarafından önlenmesi, farnesilpirofosfat (FPP) ve geranilgeranilpirofosfat (GGPP) yolu ile oluşan ara ürünleri de engeller. FPP ve GGPP ile prenilasyon, hücre içi organizasyon ve hücre membranı yapımı için önemlidir 9. Ayrıca küçük, Ras a benzer Rab, Rac, Rap ve Rho gibi proteinlerin modifikasyonu da FPP ve GGPP ye bağlıdır 10. Rho ve onun alt efektör molekülü olan Rho-kinaz enziminin düz kas kasılma mekanizmasında önemli bir rolü vardır. Monomerik GTP azların Ras süperfamilyasının Rho subfamilyası üyesi olan küçük GTP az Rho, agonist stimülasyonuyla indüklenen Ca 2+ sensitizasyonundan sorumludur ve onun alt efektörü Rho-kinaz, miyozin fosfataz aktivitesini inhibe ederek düz kas hücrelerinde kasılmanın devamlılığını sağlar 11-14. Yapılan bir çalışmada, serivastatinin küçük bir G proteini olan RhoA nın stoplazmadan hücre membranına translokasyonunu engellediği gösterilmiştir 15. Diğer bir çalışmada, Rho proteininin α 1 adrenerjik reseptör sinyalizasyon kaskatında gerekli olduğu gösterilmiştir 16. RhoA proteininin aktive edildiği durumlarda bu proteinin sitozolden mebrana transloke olduğu ve bunun sonucunda Rho-kinaz enziminin aktive edildiği bilinmektedir 12. Sonuç olarak, statin uygulanması Rho/Rho-kinaz aracılı 1

cevapları baskılayabilir ve bu anlamda terapötik bir katkı oluşturabilir. Bu nedenle, çalışmamızda, bir statin olan rosuvastatinin kronik uygulanmasıyla farelerin aorta ve korpus kavernozum düz kaslarının reaktivitesinde ortaya çıkabilecek olası değişiklikleri incelemeyi amaçladık. Bu amaçla, adı geçen dokularda Rho-kinaz enzim ekspresyonu ve aktivitesi hem izole organ banyosu deneyleriyle fonksiyonel olarak hem de Western blot analizleriyle doğrudan değerlendirildi. 2

2. GENEL BİLGİ 2.1. Statinler Statinler, 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A (HMG-KoA) redüktaz enziminin substratı olan HMG-KoA'ya ve onun yarı indirgenmiş metabolitine yapısal olarak benzediklerinden; adı geçen enzimi kompetitif bir şekilde inhibe ederler 17. Bu olay sonucu, karaciğer hücrelerindeki kolesterol ve lipoprotein düzeyinin düşmesi, bu hücrelerin yüzeyindeki DDL (düşük dansiteli lipoprotein) reseptörlerinin dansitesinde (yoğunluğunda) artmaya (reseptör upregulasyonuna) yol açar. Böylece, söz konusu ilaçlar hem lipoprotein sentezini azaltmak ve hem de apo-b içeren lipoproteinlerin (başta aterojenik DDL olmak üzere) karaciğer hücrelerine ve diğer hücrelere girişini ve orada yıkımını arttırmak suretiyle kanda DDL kolesterolü ve total kolesterol düzeyini düşürürler. Hipertrigliseridemiyi de bir dereceye kadar düşürebilirler. Öte yandan antiaterojenik nitelikte olan YDL (yüksek dansiteli lipoprotein) düzeyinde artma yaparlar. Ancak hipertrigliseridemiyi düşürücü ve YDL kolesterolünü yükseltici etkinlikleri diğer bir hipolipidemik ilaç grubu olan fibrat türevlerine göre daha düşüktür. Statinler hiperkolesterolemi, familyal apo-b100 eksikliği ve hipertrigliseridemi ile hiperkolesteroleminin birlikte olduğu karma hiperlipidemiye bağlı koroner kalp hastalığı ve inmeye karşı primer ve özellikle sekonder profilaksi için kullanılırlar. Bu amaçla, statinler genellikle düşük dozda kullanılırlar. Statinlerin DDL düzeyinde yaptıkları düşme, iyon değiştirici reçinelerin yaptığından fazladır. Bu bakımdan halen en güçlü etki yapan ilaçlardır. Ailesel olmayan hiperkolesterolemi olgularında, lovastatin ile yapılan incelemeler bu ilacın DDL kolesterolü ve total kolesterol düzeyini % 31-40 oranında düşürdüğünü göstermiştir. Heterozigot ailesel hiperkolesterolemisi olgularında da buna yakın (% 23-35) oranda düşme meydana gelir. Seyrek görülen ve diğer ilaçlara yeterli cevap vermeyen homozigot ailesel hiperkolesterolomili çocuk ve genç erişkinlerde total kolesterol düzeyinde yaptıkları düşme daha azdır (% 6-20); bu olgularda hepatositlerin DDL reseptörlerinin oluşmadığı dikkate alınırsa, cevabın düşük oluşu, söz konusu ilaçların terapötik etki mekanizmasında DDL reseptörü upregulasyon'unun katkısının önemini gösterir. Bu ilaçlar normal kimselerde de plazma kolesterol düzeyinde belirgin düşme 3

yaparlar. Halen bir kısmı kullanımda olan farklı moleküler yapıda statinler bulunmaktadır. Mevastatin bu ilaçların bir prototipi olarak kabul edilmektedir (Tablo 1). Tablo I. Doğal ve sentetik statinler. Doğal / yarı sentetik Sentetik mevastatin Fluvastatin lovastatin atorvastatin simvastatin serivastatin pravastatin rosuvastatin pitavastatin nisvastatin krilvastatin Oral olarak alınan statinler etkilerini HMG-KoA redüktaz enzimini kompetitif bir şekilde inhibe ederek gösterirler. Bu enzim HMG-KoA'nın L-mevalonat a dönüşmesini katabolize eder ve bunun inhibisyonu sonucu statinler L-mevalonat ın oluşturacağı kolesterolü önlemiş olur (Şekil 1). Şekil 1. Asetil KoA dan kolesterole dönüşüm şeması. KoA: koenzim A, PP: pirofosfat 4

Statinlerin klinik etkinliklerinin yüksek oluşu ve diğer ilaçlara göre yan tesirlerinin daha az oluşu nedeniyle belirgin bir uyum sorunu yaratmamaları, diğer kolesterol düşürücü ilaçlara göre üstünlük sağlayabilecek özelliklerdir. Uzun süreli denemelerle ateroskleroz gelişmesini yavaşlatarak koroner arter hastalığı gelişme riskini azaltırlar. Koroner arter hastalığı bulunan, akut myokard infarktüsü geçirenler dahil, hastalarda sekonder profilaksi sağladıkları ve kardiyovasküler olay insidensini ve mortaliteyi azalttıkları gösterilmiştir. Ayrıca, bu ilaçların aterosklerotik lezyonların gelişmesini yavaşlattıkları ve hatta geriletebildikleri koroner anjiyografısi ile de doğrulanmıştır. Bundan başka, statinler serebral damarlardaki ateroskleroz gelişmesini yavaşlatarak inme ve geçici iskemik atak insidensini azaltırlar 18. Statinlerin pleitropik etkisi HMG-CoA redüktaz enzimi üzerinden L- mevalonatın metabolik yolu ile açıklanabilir. L-mevalonat katabolizmasının engellenmesi ile statinler, farnesilpirofosfat (FPP) ve geranilgeranilpirofosfat (GGPP) yolu ile oluşan ara ürünleri de engellemiş olur (şekil 1). FPP ve GGPP ile prenilasyon, hücre içi organizasyon ve hücre membranı yapımı için önemlidir. Ayrıca, Ras a benzer Rab, Rac, Rap ve Rho gibi proteinlerin modifikasyonu da FPP ve GGPP ye bağlıdır 9. Ras a benzer proteinler GTP ye bağlanıp hücrelerin çoğalması, farklılaşması ve migrasyonu üzerinde önemli etkiye sahiptir 10. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda anjiyotensin II ile indüklenen hücre içi süperoksit anyon üretiminde RhoGDIα ve Rac1 proteinlerinin hücre memranındaki aktivitelerinin de rol oynadığı gösterilmiştir. Statin uygulaması ile bu proteinlerin hücre membranında birbirlerine bağlanması engellenmiştir. Böylece, hücre içi süperoksit anyonlarının oluşumu önlenmiştir 15. Bir çalışmada, statinler sıçanların mesenter arterlerinde ve aorta dokularında endotelyum kaynaklı gevşeme oluşturmuştur. Bu cevapların nitrik oksid (NO) salınımına ve siklooksijenaz ın (COX) gevşetici ürünlerine bağlı olduğu ortaya konmuştur. Sonuç olarak statinlerin gevşetici etkisinde mevalonat ve tirozin kinaz yolağınının rolü olduğu gösterilmiştir 18. Statinlerin kardiyovasküler hastalıklara karşı koruyucu etkisine enos enzimini upregüle etmesi de katkıda bulunur. Yapılan bir çalışmada Rosuvastatinin enos enzimini upregule ettiği ve iskemik felçten koruduğu göserilmiştir 2. 5

2.2 Rho/Rho-kinaz sinyalizasyon yolağı 2.2.1. Rho proteinleri Rho proteinleri monomerik GTP azların Ras süperfamilyasının Rho subfamilyası üyeleridir. Rho geni ilk olarak 1985 de bir deniz salyangozu olan Aplysia dan bir Ras homoloğu olarak klonlanmış ve bunu kısa süre sonra üç insan homoloğu RhoA, RhoB, RhoC nin bulunması izlemiştir 19. Küçük molekül ağırlıklı GTP bağlayıcı proteinler, 20-40 kda lık monomerik G proteinleridir. Memeli Rho ailesi en az 10 farklı üyeden oluşur. Bunlar: Rho izoformları olan RhoA, RhoB, RhoC, RhoD, RhoE, RhoG; Rac izoformları olan Rac1, Rac2; Cdc42 izoformu ve TC10 izoformudur 20. RhoA, RhoB ve RhoC nin efektör bölgeleri aynı aminoasid dizilimine sahiptirler ve bu GTP az proteinlerin hücresel fonksiyonları benzerdir. Rho nun açıklanan bir çok fonksiyonu RhoA ile yapılan çalışmalara dayanmaktadır 21. RhoA, vücutta en fazla bulunan ve en çok çalışılan bir Rho proteini alt tipidir 22,23. Küçük G proteinleri olan Rho alt tipleri GDP, GTP, GTP az aktivitesi ve efektörleri ile etkileşmekten sorumlu aminoasit dizilimine sahiptirler. Sentezlendikten sonra lipidler ile posttranslasyonel değişikliklere gereksinim duyarlar. Bu lipid yapıları genellikle, palmitoil (P), farnesil (F) ve geranilgeranil dir (GG). Küçük G proteinlerinin lipid modifikasyonu, bunların aktivitelerini yerine getirebilmeleri için gereklidir 24. Rho nun aktive olabilmesi için geranilgeranile olmuş C-terminal ucu ile membrana tutunması gerekir. Guanin nükleotid değişiminden sonra, Rho; Rho-kinaz (ROCK), protein kinaz N, rhophillin, rhotekin, citron, p140 mdia ve fosfolipaz D gibi alt efektörlerlerini aktive eder 25. Küçük G proteinlerinin GDP-bağlı inaktif ve GTP-bağlı aktif olmak üzere birbirine dönüşebilen iki formu vardır. Bu dönüşüm üç grup protein tarafından düzenlenir (Şekil 2). Bunlar: 1- GTPaz aktive edici proteinler (GAPs, Rho nun intrinsik GTPaz aktivitesini arttırarak GTP bağlı Rho nun inaktivasyonunu kolaylaştırır). 2- GTPaz ayırıcı inhibitörler (GDIs, bazı Rho ailesi GTPazlarının membrana bağlanmalarını inhibe eder. Nükleotid ayrılmasını ve böylece aktivasyonunu önler). 6

3- Guanin nükleotid değiştirici faktör (GEF, inaktif GDP-Rho yu aktif GTP-Rho ya Dönüştürür) 26,27. Rho aktivitesi aynı zamanda çok sayıda G proteini ile kenetli reseptörler tarafından da düzenlenebilir 28. Şekil 2. Rho aktivitesinin düzenlenmesi 29. PKN; protein kinaz N İstirahat halindeki hücrelerde, Rho-GDP disosiyasyon inhibitörü (Rho GDI), GDP-Rho ya bağlanır ve GDP-Rho nun membrandan sitozole geçmesini sağlar. Hücreler bazı agonistlerle stimüle edildiğinde, GDP-Rho GTP-Rho ya dönüşür. Bu dönüşüm GTP-GDP değişim reaksiyonunu stimüle eden guanin nükleotid değişim faktörünün (GEFler) aktivasyonu aracılığıyla gerçekleşir 21. GTP-Rho, daha sonra geranil geranillenmiş C terminal kuyruğu aracılığı ile hücre membranına yönlendirilir ve spesifik hedefleriyle etkileşir. GTPaz aktive edici proteinler (GAPs) negatif regülatörler olarak görev yaparlar. Bu proteinler Rho nun intrinsik GTPaz aktivitesini azaltarak Rho yu inaktif hali olan Rho-GDP ye dönüştürürler. Rho heterotrimetrik G proteinleri ile kenetli olan reseptörlerin bazı agonistler tarafından uyarılması sonucu bir takım fonksiyonlar görür 30. Rho proteinleri agonist stimülasyonuyla indüklenen Ca 2+ duyarlaşmasından sorumludur ve miyozin fosfataz aktivitesini inhibe ederek fonksiyon gösterir (Şekil 3) 21. Ayrıca, Rho/Rho-kinaz yolağı stres liflerinin oluşumu, trombosit agregasyonu, lenfosit 7

ve fibroblast adezyonu, sitokinez ve hücre migrasyonu, düz kas kasılması, aktin hücre iskeleti reorganizasyonu, hücre şekil değişikliği, proliferasyon ve hipertrofi gibi hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde önemli göreve sahiptir 11-14. Şekil 3. Kontraktil stimülasyon ve Ca 2+ sensitizasyonu 31. PKC; protein kinaz C, PKN; protein kinaz N, ILK; integrin-bağlı kinaz, CPI-17; 17kDa protein kinaz C-potentiated inhibitory protein of type 1 of protein fosfataz, [Ca 2+] i; sitozolik Ca 2+ konsantrasyonu, DAG; diasilgliserol, RhoK; Rho-kinaz, MYPT-1; miyozin hedef alt ünite, MLCP; miyozin hafif zincir fosfataz. 2.2.2. Rho-kinaz Rho-kinaz yaklaşık 1388 aminoasit dizisinden oluşur. Bu dizide, amino (N) ve karboksil (C) uçları bulunmaktadır. Rho kinaz, aynı zamanda, ROCKα veya ROCK2 olarak isimlendirilir. ROKβ (aynı zamanda ROCK1 olarak da bilinir) Rho kinazın bir izoformudur 12,21. İnsanda ROCK1 ve ROCK2 genleri sırasıyla 18. kromozom (18q11.1) ve 2. kromozomda (2p24) yer almaktadır 43. Rho-kinaz enziminin vasküler düz kas hücrelerinde Ca 2+ duyarlığında rol aldığı bildirilmiştir 14. ROCK2 nin beyin ve kalpte, ROCK1 in akciğer karaciğer, dalak, böbrek ve testiste daha fazla ekprese edildiği bildirilmiştir. Rho-kinaz enziminin hemen hemen her dokuda varlığı gösterilmiştir 12,21,32,33,34. 8

Rho kinazın N-terminalinde kinaz bölgesi vardır. Orta bölgesinde kuramsal olarak kangal gibi kıvrılmış (coiled-coil) bölge ve C-terminal bölgesinde plekstrin homoloji bölgesi bulunur (Şekil 4). Aktive olmuş Rho, Rho-kinazın kangal gibi kıvrılmış bölgesinin C-terminal parçasıyla etkileşerek kinaz bölgesini aktive eder 35. Bu olay sonucu aktive olan Rho-kinaz aşağıda, tablo II de, gösterilmiş olan substratları fosforile ederek çeşitli hücre içi olaylara katkıda bulunur 31,36-40. Şekil 4. Rho-kinaz ve düzenlenmesi. PH; plekstrin homoloji bölgesi, RB; Rho bağlayıcı bölge, AA; araşidonik asit, GTP-Rho; Rho nun aktif formu. 9

Tablo II. Rho kinaz substratları Substratlar Fonksiyonları Hücresel Yanıtlar Miyozin fosfatazın miyozin bağlayıcı alt ünitesi Miyozin fosfatazın inhibisyonu Düz kas kasılmasında Ca 2+ duyarlaşması Stres lifleri oluşumu, fokal Miyozin hafif zinciri Miyozinin F-aktine adezyon oluşumu, nörit bağlanmasında artış retraksiyonu, hücre kasılması, hücre motilitesi CPI-17 proteini Miyozin fosfatazın inaktive Düz kas kasılmasında Ca 2+ edici aktivitesinin duyarlaşması aktivasyonu Kalponin F-aktine bağlanmada azalma Düz kas kasılmasında Ca 2+ duyarlaşması Ezrin Radiksin Moesin Ezrin Radiksin Moesin (ERM) aktivasyonu Mikrovillus oluşumu Addusin F-aktine bağlanmada artış Membranal olaylar (ruffling), hücre motilitesi İntermediyer flamentler Flamentlerin sitokinez için Flamentlerin dağılımı (GFAB, vimentin) ayrılması Na + /H + değiştiricisi Değiştirici aktivitenin aktivasyonu Stres lifleri oluşumu LIM kinaz Kinaz aktivitesinde artış Kofilinin fosforilasyonu CRMP-2 --- Büyüme konisi kollapsı ZİPK(zipper interacting kinaz) Miyozin fosfatazın inhibisyonu Düz kas kasılmasında Ca 2+ duyarlaşması Vasküler düz kas hücrelerinin agonistle indüklenen kasılmasında Rho-kinazın bir subtratı olan miyozin hafif zincirinin (MLC) fosforilasyon derecesi kasılma gücünün belirleyicisidir. MLC fosforilasyonun miktarı Ca 2+ /kalmodulin bağımlı miyozin hafif zincir kinaz (MLCK) ve miyozin fosfataz (MYPT) arasındaki dengeye bağlıdır 41. Miyozin fosfataz (MP) üç alt üniteden oluşur: 10

1. Miyozin bağlayan alt ünite (myosin binding subunit, MBS). Bu alt ünite miyozin fosfataz target, MYPT, olarak da bilinir, 2. 37 kda tip 1 fosfataz katalitik alt ünite, 3. 20 kda katalitik olmayan alt ünite. Miyozin fosfataz, miyozin bağlayıcı alt ünite üzerinden fosforillenmiş miyozin hafif zincirine bağlanır ve onu defosforile eder. Rho kinaz MBS i fosforile ederek miyozin fosfataz (MP) ı inhibe eder. Bu enzim MBS i çeşitli bölgelerinden fosforile eder bunlardan treonin 696 (T696) ve treonin 853 (T853) major olan bölgelerdir ve T853 ü T696 dan üç kat daha fazla fosforile eder (Şekil 5) 31. Rho kinaz aynı zamanda miyozin hafif zinciri (MLC) ni de fosforile ederek kasılma işlemine katkıda bulunur 36. 11

Şekil 5. Düz kas kasılmasının regülasyonu. ZIPK; zipper-interactig protein kinaz, DMPK; miyotonik distrofi protein kinaz, PAK; p21-aktivated protein kinaz, PKC; protein kinaz C, PKN; protein kinaz N, ILK; integrin-bağlı kinaz, CPI-17; 17kDa protein kinaz C-potentiated inhibitory protein of type 1 of protein fosfataz, [Ca 2+] I; sitozolik Ca 2+ konsantrasyonu, DAG; diasilgliserol, GPCRs; G protein-bağlı reseptörler, IP3; inozitol-1,4,5- trisfosfat, MLC20; 20-kDa regülatör miyozin hafif zincir, MLCK; Ca 2+ -kalmodülin-bağımlı miyozin hafif zincir kinaz, MLCP; miyozin hafif zincir fosfataz, MYPT1; miyozin fosfataz hedef alt ünite, M20; 20-kDa MLCP nin katalitik olmayan alt ünitesi, PI3K-C2α; sınıf 2 fospfatidilinozitol 3-kinaz ın α izoformu, PLC; fosfolipaz C, PP1c; katalitik alt ünite 1 protein fosfataz, RhoGEF; GDP-GTP değiştirici faktör, RhoK; Rho-kinaz ın ROCKI ve ROCK II izoformu 31. 12

2.3. Vasküler doku ve Rho/Rho-kinaz sinyalizasyon yolağı ilişkisi Trombin, anjiyotensin II, trombosit kaynaklı büyüme faktörü ve serotonin gibi çeşitli vazoaktif ajanlar Rho/Rho-kinaz sinyal yolağını aktive ederler. Fasudil ile uzun süre tedavi sonucunda vasküler düz kas hücresinin kasılabilirliğini, fibroblast proliferasyon ve migrasyonunu, inflamatuar hücrelerin vasküler duvara göçü gibi kritik basamakların inhibe edilebileceği düşünülmektedir. Rho kinaz ile aracılık edilen sinyal yolağı vasküler hastalıkların patolojisinde büyük önem taşır 14. NO, cgmp bağımlı protein kinaz aracılığıyla damar düz kasında gevşeme oluşturur. Yapılan bir çalışmada rekombinat cgmp ile cgmp-bağımlı protein kinazın RhoA yı fosforilleyerek inhibe ettiği gösterilmiştir. Sıçan aortasında yapılan bu çalışmada, bir Rho-kinaz inhibitörü olan Y-27632 nin endotelyumlu dokularda fenilefrin ile oluşturulan kasılmaları endotelyumsuz olanlara göre nispeten daha güçlü bir şekilde inhibe ettiği gösterilmiştir. Ayrıca sodyum nitroprusiyatın fenilefrinle indüklenen RhoA translokasyonunu geri çevirdiği bulunmuştur. Buna karşın, endoteli sağlam aorta ringlerinde, nitrik oksid sentaz inhibitörleri ve guanilat siklaz inhibitörleri varlığında, fenilefrin kasılmalarının Y-27632 ye verdiği gevşeme yanıtları küntleşmiştir 42. Bütün bu bulgular, intakt sıçan aortasında, nitrik oksidin Rho-kinaz ın kastırıcı etkinliği üzerinde inhibitör bir etkisi olduğunu telkin etmektedir. Sıcaklık düşürülerek oluşturulan mikrotübül depolimerizasyonunun, Rho kinaz aktivasyonu aracılığıyla sıçan aortasında kasılmaları arttırdığı hücresel mikrotubül ağının veziküler transport, sinyal iletimi ve hücre bölünmesi gibi çeşitli hücresel olaylarda görev aldığı bildirilmiştir 43. RhoA ve mitojenle-aktive olan kinaz gibi intrasellüler sinyalizasyon yolaklarının, sfingozin 1-fosfat (SIP) ile aktive edildiği bulunmuştur. SIP, aktive olmuş trombositlerden salıverilen bir lipiddir. Vasküler düz kas hücre kültürlerinde SIP sinyalinin, hücre proliferasyonunu uyardığı gösterilmiştir 44. Diğer taraftan Rho kinaz ile aracılık edilen Ca 2+ duyarlaşmasında sfingozil fosforilkolinin ayrı bir sinyal yolağı olduğu bildirilmiştir 45. Tavşan baziler arterinde yapılan bir çalışmada, Rho-kinaz enziminin selektif bir inhibitörü olan Y-27632 endotelin-1 ile indüklenen kasılmaları inhibe etmiştir 14. Ek olarak Rho/Rho-kinaz yolağı sığır serebral arterindeki Ca 2+ duyarlığından da sorumludur 45. Rho kinaz enzimini ve kısmen protein kinazı da inhibe eden fasudilin in 13

vivo olarak hayvanlara verildiğinde vazodilatör etki oluşturduğu gösterilmiştir. Bu ajan, günümüzde, serebral vazospazmın tedavisinde denenmektedir. Aynı zamanda, bu bileşik, izole vasküler düz kaslarda agonistle olan kasılmaları inhibe eder. Naguma ve ark. in vivo olarak uygulanan fasudilin Rho kinazı inhibe ettiğini göstermişlerdir. Aynı ekip yaptıkları çalışmada fasudilin saflaştırılmış Rho kinaz için güçlü bir in vitro inhibitör olduğunu göstermiştir 46. Aortokoroner ya da infrainguinal bypass ameliyatı yapılan hastalardan alınan safen veni in vitro ortamda arteryel basınç koşullarında perfüze edildiğinde fenilefrin ve serotonine duyarlılığın arttığı görülmüştür. Bu duyarlık Y-27632 ile önlenebilmiştir 47. Trombinin insan umblikal veninde hızlı ve geçici bir RhoA aktivasyonuna neden olduğu gösterilmiştir. Buna artmış miyozin hafif zincir fosforilasyonu, F-aktin stres lifleri oluşumu ve artan permeabilite eşlik etmiştir. Y-27632 ile Rho kinazın inhibisyonu, bütün bu etkileri belirgin olarak azaltmıştır 48. Bir bakteri toksini olan lipopolisakkaritin kastırıcı reseptörlerin sinyalizasyon yolağında bir etki yapacağı düşünülmüş ve Büyükafşar ve arkadaşları tarafından bu toksinle muamele edilen sıçanların mezenter arterinde ROCK2 nin kontrole göre daha fazla eksprese edildiği ve bu artışın endotelin-1 ile indüklenen vasokonstriksiyonun güçlenmesine aracılık edebileceği bildirilmiştir 54. Koroner bypass ameliyatı yapılan 15 hastadan izole edilen endoteli uzaklaştırılmış internal torasik arterlerde serotonin ve histamin ile oluşturulan kasılmalar hidroksifasudil ile belirgin olarak inhibe edilmiştir. Serotoninle indüklenen kasılmalar süresince MBS (miyozin fosfatazın miyozin bağlayıcı alt ünitesi) ve CPI-17 (C-kinaz ile aktive olan fosfataz inhibitörü) fosforilasyonu belirgin olarak artmıştır. Hidroksifasudil MBS fosforilasyonunu inhibe ederken CPI-17 fosforilasyonunu inhibe etmemiştir 49. Vasküler düz kas hücrelerinin medyadan subendotelyal bölgeye göçü (migrasyonu), balon anjiyoplasti ve ateroskleroz sonucu gelişen intimal kalınlaşmada önemli rol oynar. Aktive olmuş trombosit ve hücrelerin bir ürünü olan lizofosfatidik asid (LPA), düz kas hücre büyümesine ve çeşitli hücrelerin göçüne neden olur. LPA ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü aracılığıyla oluşan düz kas göçü Rho/Rho-kinaz aracılığıyla olmaktadır. Bununla birlikte söz konusu göçte Rho/Rho-kinazın farklı alt inici sinyal yolakları yer almaktadır. LPA aracılı düz kas göçü MLC fosforilasyonu ile 14

bağlantılı iken trombosit kaynaklı düz kas göçü MLC fosforilasyonundan bağımsız olarak bulunmuştur 50. Rho/Rho-kinaz yolağı bozuklukları sıklıkla ölüme neden olan hipertansiyon, vasküler spazm ve arteriyosklerozun patolojisinde yer almaktadır. Rho-kinaz aktivitesini spesifik olarak inhibe eden probların kullanılması bu patolojik durumların tedavisinde yararlı olacaktır. İlk olarak, Ca 2+ -bağımlı kastırıcı mekanizmaları hedef alan Ca 2+ kanal blokerlerine ek olarak, spesifik Rho-kinaz inhibitörleri ile Rho/Rho-kinaz yolağının modüle edilmesi düz kası gevşetmek için gelişmiş bir metod olabilir. İkincisi, birçok iskemik hastalık patogenezi ve vasküler bozuklukla bağlantılı olan ateroskleroz geri dönüşümlüdür ve Rho-kinaz inhibisyonu ile tedavi edilebilir 21. 2.4. Rho/Rho-kinaz yolağının korpus kavernozum dokusundaki fonksiyonu Korpus kavernozum düz kasının kasılmasında, Rho nun Ca 2+ duyarlaşmasında rol aldığı gösterilmiştir. Wang ve ark. direk olarak permeabilize edilmiş tavşan ve insan korpus kavernozumunda Ca 2+ duyarlaşmasını göstermişlerdir ve onu bu yolağın fazlaca eksprese edilen moleküler komponenti olarak belirlemişlerdir. Yapılan bir çalışmada Y- 27632, fenilefrinle kastırılmış kavernozal şeritleri doza bağımlı bir şekilde gevşetmiştir. Bu bulgular, kastrasyonu takiben Rho/Rho-kinaz yolağının korpus kavernozumda aktive olduğu ve testosteron kaybı sonucu erektil disfonksiyona katkıda bulunduğunu telkin etmektedir. Hem ROKα (ROCK II) hem de ROKβ izoformlarının korpus kavernozumda varlığı gösterilmiştir 51. İn vivo sıçan modelinde bir Rho kinaz inhibitörü olan Y-27632 korpus kavernozum basıncını artırmıştır, yani ereksiyona neden olmuştur 52. Yapılan bir başka çalışmada, Rho-kinaz enziminin fare vas deferensinda eksprese edildiği gösterilmiş ve bu enzimin inhibitörü olan Y-27632 nin erektil disfonksiyonun tedavisinde yararlı olabileceği bildirilmiştir 34. Diğer bir çalışmada, korpus kavernozumda NO aktivitesindeki artışın Rho-kinaz aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Buna göre NO nun erektil fonksiyonu kısmen Rho/Rho-kinaz aracılı Ca 2+ duyarlığını inhibe ederek sağladığı düşünülmektedir. Y- 27632 ile tedavi edilen deney hayvanlarından elde edilen korpus kavernozum preparatları düşük voltajdaki elektriksel saha stimülasyonu ile potansiyalize edilmiş cevaplar oluşturmuştur 52. Bu bulgular Rho/Rho-kinaz inhibisyonunun NO aktivitesini 15

artırdığını gösterir. Ayrıca, diğer vasküler yataklardan elde edilen verilerle uyumlu olarak, sıçan korpus kavernozumunda da Rho-kinazın α-adrenerjik ve endotelin-1 ile indüklenen kasılmalara aracılık ettiği gösterilmiştir 53. 16

3. GEREÇ ve YÖNTEM Deneylerde Ç.Ü. Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezinden (TIBDAM) sağlanan 8 haftalık balb/c albino türü erkek fareler kullanıldı. Çalışmalara başlamadan önce Ç.Ü Tıp Fakültesi Etik kurulundan onay alındı. Deney hayvanları 12 saat karanlık 12 saat aydınlık ortamda, % 45-65 nem oranı 22±1 C sabit oda ısısı sağlanan Ç.Ü Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarında barındırıldı. Farelere yem ve su kısıtlaması yapılmadı. Fareler kontrol ve ilaçlı olarak iki gruba ayrıldı. İlaçlı gruba uygulanacak ilaç Rosuvastatin (Crestor) Astra Zeneca dan temin edildi. Rosuvastatin suda çözülerek 30 gün boyunca günde 1 kez yaklaşık 30 mg/kg dozunda enjektör yardımı ile farelerin midelerine verildi. Kontrol grubuna sadece su uygulandı. 30 gün sonunda fareler servikal dislokasyonla öldürüldü. Farelerin toraksı açılarak kalbin sağ ventrikülünden enjektör ile 2 mililitre civarında kan alındı. Kanlar eppendorf içerisine alınarak 2000 RPM de 10 dakika santrifüj edildi. Üstte berrak renkte ayrılan serum pipetle başka bir eppendorfa alınıp kan-lipid seviyeleri tayini için -30 0 C de dondurularak saklandı. Torasik aorta ve penis dokuları hızlı bir şekilde izole edildi. Dokular oda sıcaklığında, içinde Krebs solüsyonu bulunan bir petri kabına alındı ve çevre dokulardan temizlendi. Bir farenin torasik aortundan yaklaşık 3 mm kalınlığında halkalar hazırlandı. Bir aorttan ortalama 4 preparat elde edildi. Her bir farenin penisinden glans penis, üretra ayrılıp her iki korpus kavernozum dokusu arasındaki fibröz septum kesildi. Tunika albuginea intakt bırakılarak iki ayrı korpus kavernozum preparatı elde edildi. 3.1. Kullanılan kimyasal ajanlar Rosuvastatin (Crestor) Astra Zeneca İlaç Sanayi ve Tic. Ltd. Şti. firmasından, sodyum klorür, potasyum klorür, magnezyum sülfat, potasyum dihidrojen fosfat, sodyum hidrojen karbonat, glukoz, magnezyum sülfat, kalsiyum klorür, glisin, tris base, tris hidroklorür, tween 20, sodyum dodesil sülfat, metanol, 1-bütanol, amonyum persülfat, akrilamid, TEMED, 2-merkaptoetanol, bromofenol blue, gliserol Merck 17

firmasından, L-fenilefrin hidroklorid, asetilkolin klorür, etilen dinitrit tetra asetik asid disodyum, leupeptin, pepstatin, fenilmetilsülfonilflorid (PMSF), dithiothreitol (DTT), benzamidin, sığır serum albumini, aktin primer, aktin sekonder antikorları Sigma firmasından temin edildi. Y-27632 TOCRIS Bioscience, bradford protein assay solüsyonu, nitroselüloz membran Biorad dan, görüntüleme solüsyonu ECL plus Amersham firmasından, Rock-2 primer, Rock-2 sekonder, p-mypt primer, p-mypt sekonder antikorları Santa Cruz dan alındı. 3.2. Organ banyosu deneyleri İzole torasik aorta ringleri ve korpus kavernoz dokuları % 95 O 2, % 5 CO 2 karışımıyla sürekli olarak gazlandırılmış 37ºC de PH sı 7.4 olan Krebs solüsyonu (mm olarak NaCl 118, KCl 4.8, CaCl 2 2.5, KH 2 PO 4 1.2, NaHCO 3 24, glikoz 11, MgSO 4 1.2, Na 2 EDTA 0.01) içeren izole organ banyosuna konularak izometrik transdusere asıldı. Aort preparatlarına 0.3 G, korpus kavernozum preparatlarına ise 0.5 G ön gerim uygulandı ve bir saatlik dengelenme süresi boyunca 20 dakikada bir Krebs solüsyonuyla yıkandı. Dokuların tonusundaki değişiklikler force displacement transducer (COMMAT, Ankara, Türkiye) aracılığı ile izometrik olarak ölçüldü ve Biopac kayıt sistemi (Biopac systems Inc., CA, USA) ile veriler bilgisayar ortamında elde edildi. Her iki gruptan (kontrol ve rosuvastatin grubu) elde edilen aorta ringleri ve korpus kavernozum dokularında Rho-kinaz enzim etkinliğindeki olası değişiklikleri kaydetmek amacıyla fonksiyonel organ banyosu deneyleri yapıldı. Bu amaçla, dokular fenilefrinle (korpus kavernozum için 5x10-5 M, aorta için 10 6 M) kastırılarak, dokuların selektif Rho-kinaz inhibitörü olan Y-27632 (10-9 -10-5 M) ye verdiği gevşeme yanıtları kaydedildi. Bir başka deney grubunda, fenilefrine ait doz cevap eğrilerinin oluşturmak amacıyla, dokular, fenilefrin kasılmalarından önce, KCl (80 mm) ile kastırıldı ve kasılma maksimum düzeye erişince taze Krebsle yıkanarak ortamdaki KCl uzaklaştırıldı. Bu işlemden sonra, dokular 40 dakika taze Krebste inkübasyona bırakıldı. Bu sürenin sonunda, dokuların fenilefrin (10-8 -10-4 M) ile doza bağımlı kasılma yanıtları elde edildi ve taze Krebsle yıkanarak 40 dakika inkübasyona bırakıldı. Daha sonra, dokular fenilefrin (10-6 M) ile kastırıldı ve kasılma maksimumuna ulaşıldığında; sıvı azotla dondurulup, Rho-kinaz aktivasyonun bir göstergesi olan p-mypt düzeylerinin 18

Western blot analizleri ile doğrudan tayini için saklandı. Ayrı bir deney grubunda, KCl ile oluşturulacak kasılma cevapları kaydedilmeden önce, KCl kasılmalarını değerlendirmek için, dokular fenilefrin (10-4 M) ile önceden kastırıldı. Bundan sonra, dokular taze Krebs solusyonu ile yıkanarak 40 dakika inkübasyona bırakıldı. Bu sürenin sonunda, sonra KCl (10-80 mm) ye verilen konsantrasyona bağımlı kasılmalar kaydedildi. Bu işlemden sonra dokular taze krebsle yıkanarak 40 dakika inkübasyona bırakıldı. Daha sonra, bu dokulardaki enzim aktivasyonunu tespit etmek amacıyla, preparatlar fenilefrin (10-6 M) ile kastırıldıktan sonra sıvı azotla dondurulup Western blot analizleriyle p-mypt düzeylerinin tayini için saklandı. 3.3. Western blot deneyleri 3.3.1. Homojenizasyon Proteaz enzim inhibitörü içermeyen stok solüsyon (TRIS-HCl 50mM, NaCl 400mM, EGTA 2mM, EDTA1mM, PH:7.5) hazırlandı. Bu stok solüsyon içerisine DTT (1mM), PMSF (10µM), leupeptin (10µg/ml), pepstatin (1 µg/ml), benzamidin (1mM ) eklendi. Her bir doku üzerine 300µl soğuk homojenizasyon solüsyonu eklenerek homojenize edildi. Eppendorf içerisine alınan homojenatlar 10.000 RPM de 10 dakika santrifüj edildi. Üstte ayrılan kısımlar (süpernatantlar) alındı, alttaki çökeltiler (pelletler) atıldı. 3.3.2. Protein miktar tayini Bradford yöntemi ile protein miktar tayini yapıldı. Sığır serum albumini (1µg/ml) kullanılarak 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10 (µg/ml) konsantrasyonlarda standart hazırlandı. Her bir örnekten 10 µl alınarak distile su ile 100 µl ye tamamlandı. Standart ve örneklerin üzerine 1ml bradford solüsyonu eklendi ve vorteksle karıştırıldıktan sonra spektrofotometrede 595 nanometre dalga boyunda absorbans miktarları manuel olarak ölçüldü. Prism programında çizilen standart eğriye göre protein miktar tayini µg/µl cinsinden yapıldı. 19

3.3.3 Western-blot %10 luk SDS poliakrilamid jel hazırlanarak önceden yerleştirilmiş olan camların arasına döküldü. Üzerine 1-bütanol dökülerek alt jelin donması için 45 dakika beklendi. Bu sürenin sonunda, camlar arasındaki bütanol pastör pipeti yardımıyla distile su ile yıkandı. Üst jel (dh 2 O, %30 Akrilamid, 1M Tris (Ph 6.8) 62mM, %10SDS, %10Amonyum persülfat, TEMED) hazırlandı. Alt jelin üzerine döküldü, 10 kuyucuklu taraklar takıldı. 30 dakika beklendikten sonra taraklar çıkarıldı. Protein homojenatları, sample buffer (TRIS-HCL 0.125M, SDS 0.14M, gliserol % 20, bromofenol blue 0.03mM, 2-merkaptoetanol 0.2mM) ile eppendorfların içerisinde eşit miktarda karıştırıldıktan sonra eppendorflar 5 dk. kaynar suda bekletildi. Bu işlemden sonra, hesaplanan miktarda protein jel kuyucuklarına pipet yardımıyla yüklendi. Elektroforez tankı içerisine running solüsyonu (10X running buffer: 0.025M Trıs base, 0.192M glisin, %0.1 SDS, distile su) doldurularak üst jele 50Volt, alt jele 150 volt uygulanarak, 4-8 0 C de dikey elektroforez yapıldı. Bio Rad minijel elektroforez sistemi kullanıldı. İşaret boya olarak kullanılan bromfenol mavisi jelin alt ucuna ulaştığında elektroforez işlemi sonlandırıldı. Jeller camlardan ayırıldı. Özel Western delikli transfer sandviçi içine sırayla sünger, filtre kağıdı, jel, nitrosellüloz membran, filtre kağıdı, sünger olacak sekilde konularak sandviç kapatıldı. Elektroblot solüsyonu (100ml 10X running buffer +700ml distile su +200ml metanol) ile dolu tank içerisinde 4-8 C de 90 miliamperde 16 saatte elektroblot işlemi yapıldı. Sandviç açılarak membran ayrıldı, 1 saat kapatıcı (blocking) solüsyonu ile muamele edilerek nonspesifik proteinlerin bağlanması sağlandı, TBS-T solüsyonu (tris-base, NaCl, tween-20) ile yıkandı ve primer antikorla 3 saat muamele edildi. Primer antikorun bağlandığı proteinleri belirlemek amacıyla, örnekler primer antikora özgü peroksidaz enzimi ile konjuge sekonder antikorla muamele edildi. TBS-T ile yıkanan membranların görüntüleme solüsyonu (ECL plus) ile florasan ışık vermesi sağlandı. Membrandaki bu ışıma ile karanlık odada negatif film yakıldıktan sonra, filmler banyo edildi. Protein bant görüntüleri, görüntüleme sistemi ile, bilgisayar ortamına aktarıldı ve İmage Mode programı kullanılarak bantların yoğunluğu ölçüldü. 3.4. Sonuçların değerlendirilmesi 20

Dokuların gevşeme yanıtları kasılmaların yüzdesi olarak ifade edildi. Kasılmalar ise KCl veya fenilefrin kasılmalarının % si olarak ifade edildi ve standart hataları ile birlikte (± SEM) gösterildi. Western-blot tekniği ile elde edilen bantların analizi için Scion İmage programı kullanıldı. Western blot deneylerinde eşitmiktarda protein yüklenildiğinin kontrolü için ROCK2 ve p-mypt bantlarının dansiteleri aktin bantlarının dansitelerine oranlandı. Rock2/aktin, p-mypt/aktin bant dansite oranlarının istatistiksel analiz için Graph-Pad Prism (CA, USA) istatistik programı kullanılarak karşılaştırıldı. Grafiklerin çizimi ve istatistiksel analiz için bilgisayar ortamında Graph-Pad Prism (CA, USA) programı kullanıldı. İstatistiksel karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve post hoc testi olarak Bonferoni kullanıldı. Ayrıca, gerektiğinde, iki ortalama arasındaki farkı karşılaştırmak için student t testinden faydalanıldı. 0.05 den küçük P değerleri anlamlı olarak kabul edildi. 21

4. BULGULAR 4.1. Kontrol ve statin uygulanan farelerin kan lipid seviyeleri Farelere günde bir kez 30 gün boyunca 30 mg/kg rosuvastatin verilmesiyle deneklerin 30. gündeki kan lipid düzeyleri ile ilgili veriler total kolesterol, düşük dansiteli lipoprotein (DDL), yüksek dansiteli lipoprotein (YDL), trigliserid, çok düşük dansiteli lipoprotein (Ç-DDL) ölçüldüğünde bunlardan sadece total kolesterolün anlamlı olarak azaldığı görüldü (Tablo III). Tablo III. Kontrol ve rosuvastatin uygulanan farelerin 30. günlerindeki kan lipid düzeyleri. Kan lipid düzeyi (mg/dl) Total DDL YDL Trigliserid Ç-DDL kolesterol Kontrol grup n= 26 79.8±5.6 10.7±1.8 54.0±2.6 101.6±12.6 20.3±2.5 Statin uygulanan grup n= 26 67.0±2.0* 9.8±1.3 78.3±26.0 103.9±9.1 20.7±1.8 DDL : Düşük dansiteli lipoprotein, YDL: Yüksek dansiteli lipoprotein, Ç-DDL: Çok düşük dansiteli lipoprotein. Değerler ortalama±ortalamanın standart hatası olarak verilmiştir. *: p<0.05. 4.2. Torasik aorta bulguları 4.2.1. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik aortalarına ait fenilefrin kasılmaları Kontrol ve rosuvastatin uygulanan farelerin aortik halkalarında oluşturulan fenilefrin (10-8 -10-4 M) kasılmaları birbirleriyle karşılaştırıldığında, rosuvastatin uygulanan grubtan elde edilen fenilefrin kasılmaları kontrole göre farklı değildi (Şekil 6). Ayrıca, her iki grubun fenilefrin kasılmalarının EC50 değerleri arasında da istatiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. 22

150 120 Kontrol Rosuvastatin % Kasılma 90 60 30 0-9 -8-7 -6-5 -4-3 Log [Fenilefrin] M Şekil 6. Kontrol ve statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen torasik aorta halkalarında fenilefrin (10-8 -10-4 M, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyonyanıt eğrileri. Kasılmalar KCl (80mM) kasılmasının % si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. 4.2.2. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik aortalarına ait KCl kasılmaları Bu deney grubunda, KCl nin 40 ve 80mM konsantrasyonlarında ortaya çıkan kasılma cevaplarının gözlenmiştir (Şekil 7). kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı 23

% Kasılması 350 300 250 200 150 100 *** *** Kontrol Rosuvastatin 50 0 10 20 40 80 mm KCl Şekil 7. Kontrol ve statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen torasik aorta halkalarında KCl (10-80 mm, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt bar grafikleri. Kasılmalar fenilefrin (10-4 M) kasılmasının %'si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. ***: P< 0.001. 4.2.3. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik aortalarına ait Y-27632 gevşemeleri Rho-kinaz enziminin selektif bir inhibitörü olan Y-27632 (10-9 -10-5 M) hem kontrol hem de rosuvastatin uygulanan farelerin aortik halkalarında konsantrasyona bağımlı gevşemelere neden oldu. Ancak, rosuvastatin alan grupta, Y-27632 nin oluşturduğu gevşetici cevapların istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı gözlendi (Şekil 8). 24

150 120 Kontrol Rosuvastatin % Gevşeme 90 60 30 * 0-10 -9-8 -7-6 -5-4 -3 Log [Y27632] M Log[Fenilefrin]M Şekil 8. Kontrol ve statin (30 mg/kg rosuvastatin, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen torasik aorta halkalarında Y-27632 (10-9 -10-5 M, n=10) ye ait gevşeme eğrileri. Gevşemeler fenilefrin kasılmasının yüzdesi olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. *: P< 0.05. 4.2.4. Torasik aorta ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli vazoaktif ajanlara ait pec50 değerleri Rosuvastatin uygulanan grubun aortik halkalarında fenilefrinin EC50 değerleri kontrole göre farklı değilken, KCl ye ait EC50 değerleri kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde artmıştı. Ayrıca, Y-27632 nin EC50 si kontrole göre azalmıştı (Tablo IV). 25

Tablo IV. Torasik aorta ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli vazoaktif ajanlara ait pec50 değerleri. pec 50 değerleri Kontrol 30 mg/kg Rosuvastatin Fenilefrin 6.82±0.05 (n=8) 6.80±0.05 (n=10) p>0.05 KCl 2.62±0.07 (n=10) 2.10±0.05 (n=10) * p<0.05 Y-27632 6.31±0.03 (n=10) 6.76±0.01 (n=10) *** p<0.001 pec50: -LOG(EC50). 4.2.5. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik aortalarında yapılan Western blot analizleri Western blot deneylerinden elde edilen bulgular incelendiğinde, 30 gün boyunca rosuvastatin uygulanan farelerin torasik aortasında ROCK2 enzim expresyonu kontrole göre anlamlı değildi (Şekil 9). Ayrıca, rosuvastatin alan farelerden izole edilip fenilefrinle kastırılmış dokularda Rho-kinaz enzim aktivitesinin bir ölçüsü olan p- MYPT düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmedi (Şekil 10). 26

Şekil 9. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan farelerin torasik aortasında ROCK2 expresyonu. K: kontrol, S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanılmıştır (n=5). 27

Şekil 10. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan farelerin fenilefrinle kastırılmış torasik aortasında p-mypt seviyeleri. K: kontrol, S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5). 4.3. Korpus kavernozum bulguları 4.3.1. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin korpus kavernozum dokularına ait fenilefrin kasılmaları Kontrol ve Rosuvastatin uygulanan farelerin kavernozal dokularında fenilefrin (10-8 -10-4 M) kasılmaları KCl (80 mm) kasılmalarının % si olarak değerlendirilip karşılaştırıldığında, her iki grup arasında anlamlı bir farklılık bulunamadı (Şekil 11). 28