3. Bölüme devam VİRUSLERİN ÜRETİLMELERİ Viruslar eskiden deney hayvanları ve embriyolarda üretilirken, artık hücre kültürleri kullanılabilmektedir. Hayvan viruslarının üremesi için 3 yöntem: Deney hayvanları Embriyonlu yumurta Hücre kültürleri
Deney Hayvanları Bazı viruslar laboratuvar hayvanlarını enfekte eder ve virusun cinsine ve ya hayvana verilişine göre çeşitli dokularda hastalık yapar. Maymunlarda da insana benzer hastalıklar görülmekte ancak maymunlar model organizma olarak kullanılamaz. Maymunlar daha çok patogenezi incelemek için model organizma olarak kullanılırlar. Virusların üretilmesinde en sık fareler kullanılır. Çünkü,üremeleri hızlı, kolay ve düşük maliyetlidir. Ancak farelerin duyarlı olduğu virus spektomu sınırlıdır. Virusler için konağın sınırlı olması, virusun kapsid veya zarf proteinlerine, reseptör varlığına bağlıdır. Ayrıca virusun üremesi, hücre içinde replike olabilmesi için gerekli faktörlerin hücre içinde bulunup bulunmaması da önemlidir. Deney hayvanları daha çok ilaç ve aşı denemelerinde test için kullanılır.
Embriyonlu Yumurta Bazı viruslerin incelenmesi, serolojik testler ve aşı üretiminde kullanılır. Daha çok tavuk embriyosu kullanılır, bunun yanı sıra kaz ve ördek embriyosuda kullanılır. Bir tavuk yumurtası 40 C de nemli bir ortamda embriyonik dönemi 21 günde tamamlar. Embriyonun gelişmesi sırasında oluşan membran ve keselerde virusler çoğaltır.
Embriyonun gelişimi sırasında 4 yolla virus inokülasyonu yapılabilir: Sarı kese ekimi(6-7. günde) : Özellikle kuduz virusu, riketsiya ve klamidyalar üretilebilir. Amniyotik kese ekimi(8-9. gün) : Bazı viruslerin ilk izolasyonu için kullanılır. Amniyotik kesenin epitel hücreleri paramiksoviruslerin üremesi için uygundur. Koryoallontaik kese ekimi(9-11. gün) Koryoallantoik memran ekimi(11-13. gün) : Bu keseyi çevreleyen epitel hücrelerinden oluşan membranda virusler ürerler. Membran yüzeyi ve kesedeki sıvı miktarının fazla olması önemli bir avantajdır.
HÜCRE KÜLTÜRLERİ Klinik örneklerden virüs izolasyonu, virüslerin üretilmeleri ve tanımlanmaları, aşı hazırlanması için kullanılır. Hücre kültürleri için daha çok hızlı ve kolay üreme yeteneğinde olan embriyonik, kanser vs. dokuları tercih edilir. Hücre kültürü hazırlanması Doku parçalara ayrılır Proteolik bir enzimle(tripsin,kollajenaz) muamele edilir. Hücreler ayrılmış olur. Zengin sıvı bir vasat içinde cam veya polistren tüplere düz tabanlı şişelere ya da shell vial adı verilen özel tüplere konularak katı yüzeyde üremeleri sağlanır. EMEM adında bir medyum kullanılır. Hücre üremesini artırmak için %20 oranında fetal dana serumu eklenir. Tampon olarak bikarbonat, antibiyotikler, antimikotikler eklenebilir. EMEM içinde tüp ve şişelere inoküle edilir.katı yüzeye tutunarak üremeye başlar. Tek tabakalı monolayer kültür oluşur. Primer hücre kültürü oluşmuş olur. Bu kültürden tekrar tripsinojenle muamele edilip fenotipik ve genotipik özellikleri değişmeden pasajlama yapılabilir.(diploid hücre kültürü)
Devamlı hücre kültürleri de yapılabilir(cell line). Primer ve diploid hücre kültürleri orijinal konağın fenotipik ve genotipik özelliğini aynen taşırlar(öploid2n) devamlı kültür taşımaz.(anöploid n ) Hücre kültürleri morfolojik özelliklerine göre; Fibroblast benzeri Epitel benzeri Epiteloid ya da epitelyal olarak ayrılır.
Virüslerin oluşturduğu sitopatik etki tipleri Litik enfeksiyon oluşturan virüsler hücrede fizyolojik,biyokimyasal, morfolojik değişikliklere yol açar bu etkilere sitopatik etki(cpe) denir. 1. Piknozis;virüs çoğalması sonunda hücre yuvarlaklaşır, çekirdek elektron-yoğun hale gelir, hücre parçalanır. 2. Agregasyon;hücreler yuvarlaklaşır, üzüm salkımı haline gelir. 3. Sinsitya-füzyon ve dev hücre oluşumu;virüsler füzyon proteinleri yardımıyla hücreler arasında köprü oluşturur.(sinsitya) birçok hücre biraraya gelir çok çekirdekli dev hücreler oluşur. Bunu zarflı virüsler yapar. 4. Minimal etki; virüsün yaptığı etki mikroskopta görünmez, indirek yöntemlerle varlığı saptanır. Hemadsorbsiyon(hücre yüzeyinde virüse özgül hemaglütinin antijenlerinin belirlenmesi ve eritrositlerin hücre yüzeyine adsorbe olması) ve viral interferenstir (CPE yapan başka bir virüs verilir hücreye girişinin önlenmesi CPE etkisini oluşturmaması esasına dayanır.)en çok kullanılan iki yöntemdir. 5. İnklüzyon cisimciği oluşumu; inklüzyon cisimcikleri, viral replikasyon ürünlerinin biraraya toplandığı bölgelerdir. Histolojik boyalarla ışık mikroskobunda görülebilir.
Virüslerin tek basamaklı üreme eğrisi Bir döngü virüs üremesi deneyi yapılır. Tek tabaka halinde üremiş bilinen sayıdaki hücreleri enfekte edecek miktarda virüs ekimi yapılır. Her hücre başına 10 enfektif virüs partikülü verilmektedir. Hücrelerin virüs ile enfekte edilmesinden sonra, belirli zamanlarda hem hücre içi hem de hücre dışı enfeksiyoz virüs ölçümü yapılarak alınan değerlerle üreme eğrisi oluşturur. Eklips dönemi; adsorbe ve penetre olan virüsler kapsidi ve zarfı soyulmuş olduğundan, enfeksiyoz olamayn özelliktedir bu yüzden çok az miktarda virüs saptanır. Latent dönem; enfeksiyon başlangıcından ilk hücre dışı virüsün saptanmasına kadar geçen süre
VİRÜSLERİN TİTRASYON YÖNTEMLERİ Elektron mikroskobunda enfektif virüsle (fiziksel virüs) enfektif olmayan eksik virüs ayırt edilemez. Bunun için aşağıdaki yöntemler kullanılır; Toplam virüs miktarının saptanması Elektron mikroskobisi(em);saflaştırılmış yüksek derecede konsantre virüs partiküllerinin ml deki sayısı EM ile saptanabilmektedir.yapay virüs partikülleryle virüs süspansiyonu karıştırılır. Virüs sayısı yapay virüs sayısıyla oranlanarak gerçek sayı bulunur. Hemaglütinasyon(HA) testi;hem enfeksiyoz olan hem olmayan virüsler hemaglutinasyon yapabilirler. Seri sulandırma yapılan virüslere eritrositler eklenir ve HA oluşumu izlenir. HA oluşturan son virüs sulandırımındaki virüs miktarına, 1 HA ünitesi denir. Enfektif virüs miktarının saptanması Plak yöntemi; enfektif virüsün tek bir hücreye girmesi, çevredeki hücreleri enfekte etmesi, bu bölgedeki hücrelerin ölmesiyle zon oluşması yöntemidir. Tek bir virüsün bir plak oluşturduğu varsayılır. Enfektif virüs partikülü sayısı plak oluşturan ünite olarak ifade edilir. Enfekte olan hücreler ölü etraftaki hücreler canlıdır vital boyalar kullanılarak plak zonlar tespit edilir.( noble agar kullanılarak etraftaki hücrelerin enfekte edilmesi engellenir.) Doku kültürü enfektif doz-50 tayini ; ekim yapılan hücre kültürlerinin %50 sinde sitopatik etki oluşturan en yüksek virüs sulandırımı TCID 50 olarak kabul edilir. Bu yöntemin esası, doku kültürlerinde enfeksiyon oluşturabilen virüslerin en yüksek dilisyonu saptamaktır.
Pok (pock) yöntemi,bazı virüsler embriyonlu yumurtanın koryoallantoik membranında pok adı verilen lokalize lezyonların oluşumuna neden olur. Membranda oluşan her bir pok, bir enfeksiyoz virüs partikülünü ifade eder. Dolayısıyla membran üzerindeki pok sayısı belirlenerek orjinal virüs süspansiyonundaki enfektif virüs miktarı pok oluşturan ünite olarak hesaplanır. Fokus (focus) yöntemi, bazı onkojenik RNA virüsleri hücrelerde hem ürerler hem de proliferasyona neden olurlar. Fokus adı verilen prolife hücrelerden odaklar oluşur. Bu fokuslar sayılarak enfektif virüs miktarı saptanır.