AllergyScreen İnsan serumundaki spesifik IgE analizine yönelik immunblot Kod No.: A 0062 Kod No.: A 0063 Kod No.: A 0064 Panel 10 RESP E (solunum allerjenleri) 10 allerjenli 12 test membranı Panel 10 PEDI A (pediatrik allerjenleri) 10 allerjenli 12 test membranı Panel 10 FOOD D (gıda allerjenleri) 10 allerjenli 12 test membranı in-vitro test, IVD medikal ürün direktifi 98/79/EC Madde 10 2-8 C de saklayınız MEDIWISS Analytic GmbH, Uerdinger Straße 3 D-47441 Moers
1. Kullanım amacı AllergyScreen-Testi, insan serumunda bulunan allerjen-spesifik Immunoglobulin E(IgE) nin semi-kantitatif tespiti için kullanılan bir immunblot testtir. 2. Genel E sınıfı immünglobulinler, ilk olarak 1964 yılında tanımlanmış olup Tip I allerjik reaksiyonların tetiklenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. B-limpositler, plazma hücrelerindeki dönüşüm sonrasında salgılarda, bağışıklıktan sorumlu ve kanda dolaşan değişik antikorlar salgılar. B-limpositlerin, antikor salgılayan plazma hücrelerindeki dönüşümü, yardımcı ve baskılayıcı hücreler(t-limpositın bir alt sınıfı) tarafından düzenlenir. Bu düzenleme başarısızlığa uğrarsa, bir B-limposit, zararsız bir antijenede dönüşebilir. Plazma hücreleriyle sonuçlanması Immünglobulin E sınıfı antikorlarını üretir. Bu immünglobulinler, kan dolaşımı yoluyla basofilik granülositlere ve Fcbölgeleri yoluyla spesifik reseptörlere bağlı olan mast hücrelerine doğru ilerler. Organizmanın spesifik allerjenle başka teması varsa bu ilerleme doğrudan IgE antikorlarına doğru olur ve komşu iki molekülü antijen bağlı fab bölgesi vasıtasıyla birbirine bağlar. Bu bağ formasyonu farklı vazoaktif aminleri, özellikle histamini, mast hücrelerinden bağımsızlaştırır ki diğer yüksek aktif medyatörlerle birlikte ürtikasyon, ürtiker(kurdeşen), dermatit, rinit (nasal mukoza enflamasyonu) ateş, astım ve anaflaktik şok gibi Tip I allerjik semptomlara neden olabilir. 3. Test prensibi Spesifik allerjenler, panelde bulunan nitroselüloz membran yüzeyine bağlıdır. Hasta serumu panel içerisine pipetlenip oda ısısında inkübe edilir. Bu sure zarfında allerjen spesifik IgE antikorları allerjenlerle reaksiyona girer ve allerjen vasıtasıyla nitroselüloz membranlara bağlanır. Bağlanmayan material yıkamayla uzaklaştırılır. Ardından, biotinli anti-human IgE antikor çifti ilave edilir ve oda ısısında inkübe edilir. Bu, ilk inkübasyonadan itibaren test alanındaki ilgili spesifik IgE ye bağlanır. Bağlanmayan dedektör antikorları yıkamayla uzaklaştırılır. Daha sonra alkalin fosfatla konjüge edilen streptavidin ilave edilir ve oda ısısında inkübe edilir. Bu, ikinci inkübasyondan itibaren test alanındaki biotine ve pozitif kontrole bağlanır. Bağlanmayan streptavidin konjugatı, yıkamayla uzaklaştırılır. Substrat ilavesi ve oda ısısında inkübasyon sonrasında, test membranlarındaki çökelti oluşumuyla sonuçlanan alkalin fosfat, spesifik bir enzimatik renk reaksiyonu oluşturur. Renklenme, doğrudan serum numunesinin spesifik antikor içeriğiyle orantılıdır. Değerlendirme, test membranının tamamıyle kurumasından sonra, membranın fotoğrafını çeken bir CCD kamera ile (HIZLI OKUYUCU) yapılır. 4. Sağlanan Reaktifler Her bir AllergyScreen test kiti şunları içerir: 1 x 12 10 test bölgesi üzerinde allerjen materyali bulunan nitroselüloz membranlarla kaplı plastik test membranları 1 x konsantre yıkama solüsyonu (TRIS/NaCl, %0.099 NaN 3 içerir), 1 x 500 ml yıkama solüsyonu, ph = 7,5 (20 ml) 1 x dedektör antikoru (beyaz kapaklı şişe), kullanıma hazır (4 ml) anti-human IgE antikorlarıyla konjüge edilmiş biotin, poliklonal % 0.099 NaN 3 içerir 1 x streptavidin-konjugat (kırmızı kapaklı şişe), kullanıma hazır (4 ml) Alkalin fosfatla konjüge edilmiş streptavidin %0.02 methylisothiazolinone ve %0.02 bromonitrodeksan içerir 1 x Substrat (mavi kapaklı şişe), kullanıma hazır (4 ml) BCIP / NBT (bromochloroindolyl fosfat/ Nitro Blue Tetrazolium), 12 x Pasteur pipetler (100 µl dereceli) 1 x Prospektüs
5. Gerekli fakat sağlanmayan materyaller 5.1. Reaktifler Distile veya deionize su. 5.2. Aksesuarlar Vorteks mikser; ölçüm silindiri (500 ml), 500 ml laboratuvar yıkama şişesi, 10 reaksiyon paneli (opsiyonel) alan yıkama tutucu; karanlıkta inkübasyon için inklübasyon kutusu (yıkama tutucu ve inkübasyon kutusundan oluşan system MEDIWISS Analytic ten tedarik edilebilir); shaker; ticari olarak mevcut klasik saç kurutma makinesi (opsiyonel), ölçme cihazı (HIZLI OKUYUCU) ve bilgisayar (Windows 98, Windows 2000 ME veya Windows 2000 PROF, USB portlu) ve yazıcı. Otomatik prosedür için BeeBlot (kapasitesi 12/36 reaksiyon kabı) da mevcuttur. 6. Uyarılar ve önlemler Mevcut kit, insan serumunda spefifik IgE-antikorların tespitine yönelik in-vitro diagnostik testler içerir. Bu nedenle hasta numuneleri muhtemel enfeksiyonlu olarak dikkate alınarak uygun emniyet önlemleri alınmalıdır. Allergy Screen dedektör antikorları ve AllergyScreen yıkama solüsyonu, koruyucu olarak sodyum azid içerir(0.0995). Deri ve mukoza membranıyla temas ettirmeyin. Kurşun veya bakır çubuklarla temas patlayıcı metal azidler oluşturabilir. AllergyScreen streptavidin konjugatı, koruyucu olarak subtoksik konsantrasyonlarında metilsotiazolinon ve bromonitrodeksan içerir. Kullanım sonrasında kişisel olarak tüm kit unsurlarının uygun şekilde atılmasından kullanıcı sorumludur. Muhtemel enfeksiyonlu numunelerle temas eden tüm reaktif ve materyaller uygun dezenfektanlara tabi tutulmalı veya en az bir saat 121 o C de otoklavlanmalıdır. Kit unsurlarının, başka lot numaralı bir kitinkilerle değiştirilmesi veya birleştirilmesi mümkün değildir. Dış ambalaj tahrip olduğunda bütünlüğü sağlamak için tek unsurlar test edilmelidir. Tahrip olmuş kit unsurları veya sızıntı bulunan şişeler kullanılmamalıdır. 7. Saklama talimatları Reksiyon panellerindeki test membranları plastik ambalajlarında kuru, serin ve karanlık bir ortamda saklanmalıdır. Tüm reaktifler 2-8 C de saklanmalıdır ve etiket üstünde bulunan son kullanma tarihinden once herhangi bir zaman kullanılabilir. Mikrobiyal kontaminasyon önlenmelidir. Son kullanma tarihini geçtikten sonra kalite garanti edilemez. Dilüe edilmiş yıkama solüsyonu, kullanımdan once 2-8 C de maksimum 8 hafta saklanabilir. Substrat solüsyonunun (AllergyScreen substrat) streptavidin konjugat solüsyonuyla (AllergyScreen streptavidin konjugat) kontaminasyonu, substrat renklenmesine neden olacağı için önlenmelidir. Benzer şekilde substrat, kendiliğinden oksidasyonla bozulma veya renklenmeye neden olacağı için direkt günışığından uzakta tutulmalıdır. Substrat renklenirse kullanım için uygun olmaz. 8. Reaktiflerin bozulma veya stabilitelerinin bozulma emareleri Substratın, panele ilave edilmeden once mor renk alması veya bulanıklaşması reaktifin bozulduğunu gösterir. 9. Numune toplama ve saklama AllergyScreen, insan serum numunelerinde test edilmek için geliştirilmiştir. Kan numuneleri, topuktan alınarak elde edilmeli ve serum, koagülasyondan sonra (30 40 dakika) 4000 g de 10 dakika santrifüjlemeyle ayrılmalıdır. Numunelerin tekrar tekrar dondurulup çözündürülmesinden ve mikrobiyal kontaminasyondan her aşamada kaçınılmalıdır. Isıtılarak inaktif hale getirilmiş, lipemik, hemolitik, sarılık taşıyan veya bulanıklaşmış numuneler hatalı sonuçlara neden olabilir. Test hemen yapılmayacaksa, numune 2-8 C de bir hafta kadar saklanabilir. Numuneler -20 C veya daha düşük ısıda daha uzun süre saklanabilir.
10. Test prosedürü 10.1. Genel bilgi Kullanımdan once tüm reaktifler ve paneller oda ısısına (20-22 C) getirilmelidir. Reaktifler kullanımdan once iyice karıştırılmalıdır. Sonuçların tekrarlanabilirliği, kesin pipetleme, inkübasyon süreleri ve ısılarına kesin olarak riayet edilmesi ve test membranlarının aynı şekilde yıkanmasına bağlıdır. Daha yüksek ısılar verilmekteyse, substratın gelişim zamanı(son aşama) C başına (> 25 C) (genel kural) ½ dakika azaltılmalıdır. Testi çalışılırken doğrudan günışığından sakınılmalıdır. Panellerin, inkübasyon sırasındaki buharlaşmadan kaynaklanan kaybı önlemek için kapalı tutulması tavsiye edilir. Paneller sadece elle tutulmalıdır. Reaksiyon yüzeyiyle temastan kaçınılmalıdır. Hasta verileri (laboratuvar numarası gibi) sabit kalem kullanılarak panel üzerine yazılmalıdır. Şart koşulan inkübasyon zamanı ve ısısından sapma hasta serumu için hatalı sonuçlara neden olur. Substrat inkübasyonu (dördüncü inkübasyon Bölüm 10.9 a bakınız) substratın kendiliğinden renklenmesini önlemek için karanlıkta yapılmalıdır. Test, sadece deneyimli personel tarafından yapılmalıdır. Lütfen, tıbbi laboratuvarlardaki emniyet kurallarına bakınız. Test protokolü sıkı biçimde takip edilmelidir. 10.2. Yıkama solüsyonunu hazırlama Herbir konsantre AllergyScreen yıkama solüsyonu şişesinin muhteviyatı 500 ml lik ölçülü silindire boşaltılır, çözündürülür ve distile suyla 500 ml yapılır ve laboratuvar yıkama şişesine nakledilir. Eğer gerekliyse konsantre içerisindeki kristalleri, 37 C de önceden ısıtılan su içerisinde çözündürün. 10.3. İlk inkübasyon Test için gerekli sayıda panel paketten çıkartılır, yıkama şişesi içerisindeki dilüe yıkama solüsyonu ile bir kaç saniye lavaboda yıkanır ve 250 µl hasta serumu pipetlenir. Her serum için yeni bir pipet kullanılmalıdır. Ardından, paneller oda ısısında (20-22 C) yatay shaker üzerinde 30 osilasyon/dakikada 45 dakika inkübe edilir. 10.4. Yıkama Paneller, hazırlanmış yıkama solüsyonu(yıkama şişesi) kullanılarak 5 saniye lavaboda yıkanır. Paneller aşağıya doğru çapraz tutulur. Membranlar bir kaç defa yıkama solüsyonuyla yıkanmalıdır. Paneller içerisindeki solüsyon birkaç saniye çalkalanırsa yıkama etkisi artar Bu işlem 10 panel alabilen yıkama tutucu kullanılarak veya otomatik western-blot analizörü kullanılarak (TECAN Profiblot 2in1) kolaylaştırılabilir. 10.5. İkinci inkübasyon Her panele 7 damla veya 250 µl tespit antikoru koyun. Panelleri, shaker da oda ısısında 45 dakika inkübe edin. 10.6. Yıkama Bölüm 10.4 te açıklandığı gibi yıkayın 10.7. Üçüncü inkübasyon Bundan sonra her panele, 7 damla veya 250 µl AllergyScreen streptavidin konjugatı koyun. Panelleri shaker da oda ısısında 20 dakika inkübe edin. 10.8. Yıkama Bölüm 10.4 te açıklandığı gibi yıkayın.
10.9. Dördüncü inkübasyon Daha sonra her panele 7 damla veya 250 µl AllergyScreen substrat koyun. Panelleri shakerda oda ısısında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra renk reaksiyonu test membranlarının akan su altında hafifçe yıkanmasıyla yokedilir. Membranlar, hava veya kurutma işlemini hızlandıracak bir saç kurutma makinesiyle kurutulur. Test membranı kuruduğunda mavi-mor arkaplan rengi kaybolur. Test membranları tamamen kuruyuncaya kadar test değerlendirmesi yapılmamalıdır. Kısa Test prosedürü A. Reaktifleri oda ısısına getirin (20 22 C). B. Konsantre AllergyScreen yıkama solüsyonunu 1:25 oranında dilüe edin. C. Panellerdeki membranları yıkama solüsyonuyla ıslatın. Her serum numunesinden 250 µl yi ilgili panel içerisine pipetleyip yatay shaker üzerinde (30 osilasyon/dakika) oda ısısında 45 dakika inkübe edin. D. Yıkama için, paneli çapraz tutarken dilüe yıkama solüsyonunu yıkama şişesinden test membranlarının üzerine akıtın. Panelleri bir kaç defa yıkama solüsyonuyla doldurun ve bir kaç saniye elle çalkalayın. E. 7 damla dedektör antikoru ilave edin; yatay shaker üstünde (30 os/m) oda ısısında, karanlıkta 20 dakika inkübe edin. F. Yıkayın (D şıkkına bakın) G. 7 damla streptavidin konjugatı ilave edin; yatay shaker üstünde (30 os/m) oda ısısından, karanlıkta 20 dakika inkübe edin. H. Yıkayın (D şıkkına bakın) İ. 7 damla substrat ilave edin; yatay shaker üstünde (30 os/m) oda ısısından, karanlıkta 20 dakika inkübe edin. J. Akan su altında yavaşça yıkayarak substrat reaksiyonunu durdurun. K. Membranları tamamen kurutun ve HIZLI OKUYUCU da değerlendirin. 11. Analiz 11.1. Membran konfigürasyonu P 10 RESP E P 10 FOOD D P 10 PEDI A AllergyScreen Panel 10 RESP E (Art. No. A 0062) membranı aşağıdaki 10 allerjeni içerir: control control control Pozitif Kontrol, house-dust mite I (Dermatophagoides pteronyssinus), house-dust-mite II (Dermatophagoides farinae), grass pollen early, grass pollen late, grain pollen, tree pollen early, tree pollen late, herb pollen 1, herb pollen 2, mould fungi AllergyScreen Panel 10 FOOD D (Art. No. A 0064) aşağıdaki 10 allerjeni içerir: Der. pternonyssi.(d1) Der. farinae (d2) egg white (f1) milk (f2) Der. pternonyssi.(d1) Der. farinae (d2) Pozitif kontrol, egg white, milk, tomatoes, hazelnut, peanut, sea fish, red meat, cacao, gluten, strawberry grass pollen early(gx1) tomatoes (f25) grass mix (gx) AllergyScreen Panel 10 PEDI A (Art. No. A 0063) aşağıdaki 10 allerjeni içerir: grass pollen late (gx2) hazelnut (f17) mould fungi (mx1) Pozitif kontrol, house-dust mite I (Dermatophagoides pteronyssinus), house-dust-mite II (Dermatophagoides farinae), grass mix, mould fungi, egg white, milk, α-lactalbumin, cacao, hazelnut, peanut grain pollen (gx4) peanut (f13) egg white (f1) tree pollen early (tx1) sea fish (fx3) milk (f2) tree pollen late (tx2) red meat (fx8) α-lactalbumin (f76) herb pollen 1 (wx1) cacao (f97) cacao (f97) Negatif kontrol test membranının yüzeyi allerjenle kaplanmamıştır (aşağıdaki bölge ilgili son allerjendir) Biotin-işaretli sığır serum albumin pozitif kontrol olarak uygulanmıştır (her test membranının üst tarafı) herb pollen 2 (wx2) gluten (f79) hazelnut (f17) mould fungi (mx1) strawberry(f44) peanut (f13) Allerjen sırası Şekil 1 de verilmektedir.
11.2. Serum bulguları Western-Blot çizgilerinin dijital fotografik değerlendirmesi software in geliştirme temelidir. Sistem, bir CCD kamera ile test membranlarının fotoğrafını çekerken yazılım programı allerjen çizgilerinin renklenmesini değerlendirir. Bu, dahili standart internal eğrili her membran çizgisinin ot polen standardı esasında hesaplanan integral yüzeyinde karşılaştırılarak ve bu sınıflar içerisinde gruplanarak elde edilir. Bu sınıflar, iu/ml deki spesifik IgE içeriği ile doğrudan ilgilidir. Membranlar üzerindeki enterferanslar yuvarlak bir disk ile ve bir cut-off değeriyle matematiksel olarak dikkate alınır. Ölçüm sonrasında alınan çıktı, kullanıcıya membran fotoğrafını sağlar, membranın densitometre eğrisi, sınıflar ve her allerjen bandı için konsantrasyon verileri iu/ml cinsindendir Her hastanın verileri sistem içerisinde saklanıp dokümante edilmektedir ve tekrar elde edilebillir. Her allerjen vakasında, test alanlarındaki renk yoğunluğu hasta serumunda bulunan spesifik IgE antikorlarının miktarıyla doğrudan orantılıdır. Ölçümü takiben membranlı panelin okuyucu içerisine konulmasıyla bilgi yöneticisi (Hızlı Okuyucu) kullanılarak kantitatif değerlendirme yapılır. Bir bilgisayar bağlantısıyla analiz sonuçları yazdırılabilir ve Test Sınıfı 0-6 ya gore tespit edilir. Okunmuş sınıflar Tablo 1 kullanılarak her allerjenin IgE içeriğine çevrilebilir. Ölçüme başlarken allerjen paneline bağlı olarak önceden tanımlanmış doğru testing kullanılmasına dikkat edilmelidir. Şekil 2: AllergyScreen de optik yoğunluk: Bir ELISA sistemiyle karşılatırıldığında, insan serumundaki ot IgE antikoru konsantrasyonu ile ot allerjeni çizgi korelasyonu Tablo1: Bulunan sınıflar ve hasta serumunun spesifik allerjenlerinin IgE içeriği arasındaki ilişki iu/ml Sinif Allerjen-spesifik IgE içeriği < 0.35 iu/ml 0 Yok veya güçlükle bulunmuş 0,35 0.69 iu/ml 1 Düşük 0.7 3,4 iu/ml 2 Artmış 3,5 17,4 iu/ml 3 Belirgin biçimde artmış 17,5 49.9 iu/ml 4 Yüksek 50 100 iu/ml 5 Çok yüksek > 100 iu/ml 6 Aşırı derecede yüksek
11.3. Kalite kontrol Her test membranı için bir pozitif kontrol sağlanmaktadır. Testin uygun biçimde yapılıp yapılmadığını kontrol etmek için kullanır. Pozitif kontrol için < 2.5 klas değeri varsa test geçerli değildir. Bu durumda, testi tekrarlamadan once lütfen aşağıdaki hususları kontrol ediniz: Reaktiflerin miyadı Kullanılan cihazın kalibrasyonunun doğru kalibrasyon dosyasıyla yapılıp yapılmadığı Tam test prosedürü Panelin Hızlı okuyucu cihaz içerisine tam olarak yerleştirilip yerleştirilmediği Kit unsurlarının kontaminasyon, bozulma veya sızıntı belirtisine yönelik görsel incelemesi Subtrat, siyaha döndüyse kullanılmamalıdır Kontrol verileri karşılanmıyorsa test tekrarlanmalıdır, lütfen distribütörünüzle görüşünüz. 11.4. Dokümantasyon Test membranları, kuruduktan ve hızlı okuyucuda değerlendirme tamamlandıktan sonra cımbızla panelden çıkartılabilir ve bir çalışma logunda dokümante edilebilir. Ölçüm verileri (test membranının fotoğrafı ve değerlendirme) bilgisayarın önceden seçilen bir direktörüsüne kaydedilir. Test edilen her serum verisi, bilgisayara bağlı grafik standart bir yazıcı kullanılarak yazdırılabilir. 12. İstatistik veriler: değişimler, hassasiyet, spesifite ve kesinlik Optik yoğunluğun Intra-test değişimi: ortalama değer %6,2 Optik yoğunluğun Inter-test değişimi: ortalama değer %3,1 Metodun spesifite ve hassasiyetini tespit etmek için 142 serumla klinik çalışma(1) çerçevesinde deri-prick testi ve AllerrgyScreen werde arasında 737 karşılaştırma yapılmıştır. Hassasiyet % 95.1 Spesifite: % 80.2 Doğruluk : % 88.3 Aynı zamanda bu çalışmada AllergyScreen ve bir ELISA tek test sistem arasında 881 karşılaştırma yapılmıştır. Hassasiyet % 84.3 Spesifite: % 95.0 Doğruluk : % 90.6 13. Spesifik IgE tespitlerinin klinik önemi hakkında açıklamalar Allerji teşhisi, sadece laboratuvar test sonuçları esasında değildir. Klinik profil(farklı in-vivo ve in-vitro testlerinde alınan sonuçlar) ile Anamnesis (klinik geçmiş) birleştirilinceye kadar tüm görünümü elde etmek mümkün değildir. Bu test sistemi kullanılarak tespit edilen sınıflar, hastaların, incelenen ayrı ayrı allerjenlere olan hassasiyet derecesi hakkında bir yorum yapmayı olanaklı kılar. Spesifik antikorların mevcudiyetinin tespiti deri testi gibi in-vivo metodların pratik ve önemli bir ilavesini temsil eder. Bununla birlikte in-vitro test Tip 1 allerjen-spesifik hassasiyeti tanımlamada sıkça görülen tek mümkün yoldur AllergyScreen, bu şekilde hasta serumundaki IgE antikorlarının spesifik immünolojik reaksiyonundaki spesifik allerjen çizgi sonuçlarına karşı belirgin bir pozitif renklenmedir. Bununla birlikte AllergyScreen, bu şekilde, hasta serumundaki IgE antikorlarının spesifik immünolojik reaksiyonunundaki spesifik allerjen çizgi sonuçlarına karşı belirgin bir pozitif renklenme oluşturur. Yinede bu, eğer klinik ilgi olmaksızın sadece hassaslaştırma varsa hastanın uygun allerjene karşı olan gerçek klinik resmini göstermesi için gerekli değildir. 14. Literatür: Kersten, W. (2002) : Vergleich des AllergyScreen (MEDIWISS Analytic, Moers) mit dem Hauttest (HAL, Düsseldorf -in-vivo) und dem CAP-System (Pharmacia, Freiburg -in-vitro). Allergologie 25/4:203-208 Renz,H. (2005): Diagnostic and analytical performance of a screening panel for allergy. Clin Chem Lab Med 2005, 43(9):963-966 MEDIWISS Analytic GmbH Gesellschaft für angewandte in-vitro Analytik mbh Uerdinger Straße 3 D-47441 Moers Tel.: +49 (0) 2841/88 90 470 Fax.: +49 (0) 2841/88 90 472 Pwahl@mediwiss-analytic.de Almanya da yapılmıştır