T.C ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANABĠLĠM DALI HĠPOKSĠK-ĠSKEMĠK SEREBRAL HASAR OLUġTURULAN YENĠDOĞAN RAT MODELĠNDE ALLOPÜRĠNOLÜN KASPAZ 3 VE KASPAZ 8 AKTĠVĠTESĠ ĠLE NÖROPROTEKTĠF ETKĠSĠNĠN DEĞERLENDĠRĠLMESĠ YAN DAL UZMANLIK TEZĠ TEZ YÖNETĠCĠSĠ Prof. Dr. Mehmet Satar Uz. Dr. Kenan Özcan ADANA-2009
Bu çalıģma TIP.2005.LTP21 nolu proje ile Çukurova Üniversitesi AraĢtırma Fonu tarafından desteklenmiģtir. II
TEġEKKÜR Bu çalışmanın yapılması sırasında yakın ilgi ve desteklerini gördüğüm, başta tez danışmanım Prof. Dr. Mehmet Satar olmak üzere Prof. Dr. Nejat Narlı ya, Doç. Dr. Hacer Yapıcıoğlu Yıldızdaş a, Dr. Ferda Özlü ye, Dr. Erdal Taşkın a, Dr. Necmiye Canacankatan a, Yenidoğan Yoğun bakım Ünitesi çalışanlarına, Vet. Dr. Kenan Dağlıoğlu na, DECAM Laboratuvar çalışanlarına ve her zaman yanımda olan aileme, eşim ve çocuklarıma içtenlikle teşekkür ederim. Dr. Kenan Özcan III
ĠÇĠNDEKĠLER SAYFA NO TEŞEKKÜR II-III İÇİNDEKİLER IV-V TABLO LİSTESİ VI ŞEKİL LİSTESİ VII KISALTMALAR VIII ÖZET ve ANAHTAR SÖZCÜKLER IX ABSTRACT ve KEYWORDS X I. GİRİŞ ve AMAÇ 1 II. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Perinatal Asfiksi Ve Hipoksik İskemik Ensefalopati 3 2.1.1. Tanım 3 2.1.2. İnsidans 4 2.1.3. Asfiksi tipleri 4 2.1.3. 1. Kronik kısmi asfiksi 5 2.1.3.2. Akut tama yakın asfiksi 6 2.1.4. Patoloji 7 2.1.5. Prematür ve Matür Yenidoğanlarda Perinatal Hipoksik- 8 İskemik Beyin Hasarının Patogenezi 2. 1.5.1. Hipoksemi 11 2.1. 5. 2. Hipoksi-İskemi 11 2. 1.5.3. Beyin hasarında hücresel mekanizma 12 2.1.5.3.1..Enerji Dönüşümü 12 2.1.5.3.2. Serbest Radikal Oluşumu 14 2.1.5.3.3. Eksitatör aminoasitlerin salınması 14 2.1.5.3.4. İntrasellüler kalsiyum yüklenmesi 15 2.1.5.3.5. Nitrik Oksit Toksisitesi 16 2.1.5.3.6. İntrasellüler Asidoz 16 2.1.5.3.7. Apopitosis 17 IV
2.1.5.3.8. İnflamasyon 17 2.1.5.3.9. Sitokinler 18 2.1.6. Hipoksik İskemik Beyin Hasarının Önlenmesindeki 18 Mevcut Değerli Girişimler 2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması 19 2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu 19 2.1.6.3. Glutamat alınımındaki bozukluğun iyileştirilmesi 20 2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi 20 2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu 20 2.1.6.6. İntrasellüler Olayların Akışının Bloke Edilmesi 21 2.2. Kaspazlar; programlanmış hücre ölümlerinde anahtar oyuncular 24 2.2.1. Apoptoziste Kaspaz-3 ün Yeri ve Önemi 26 2.2.2. Kaspazların Aktivasyonu 27 2.2.3. Mitokondri/Sitokrom-C Aracılı Apoptozis Oluşturulması 28 2.2.4. Dış Sinyallerle Apoptozisin Tetiklenmesi 30 2.2.5. Endoplazmik Retikulum Aracılı Apoptozis Oluşturulması 31 2.3. Allopurinol 33 2.3.1. Özellikleri 33 2.3.2. Famakokinetik Ve Metabolizma 34 2.3.3. İlaç Etkileşimleri 35 2.3.4. Terapötik Kullanımlar 35 2.3.4. Toksik Etkiler 36 III. GEREÇ ve YÖNTEM 37 3.1. Kaspaz 3 ve Kaspaz 8 Ölçüm Yöntemleri 39 3.2. İstatistiksel analiz 39 IV. BULGULAR 40 V. TARTIŞMA 44 VI. SONUÇLAR 48 VII. KAYNAKLAR 49 VIII. ÖZGEÇMİŞ 55 V
TABLO LĠSTESĠ Sayfa No Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri 4 Tablo 2. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı 8 Tablo 3. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki değerli girişimler 23 Tablo 4. Belli başlı kaspazlar. 25 Tablo 5. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-3 aktiviteleri 41 Tablo 6. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-8 aktiviteleri 43 VI
ġekġl LĠSTESĠ Sayfa No ġekil 1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakış. 10 ġekil 2. Kaspazların aktivasyonu. 26 ġekil 3. Mitokondri/sitokrom-c aracılı apoptozisin tetiklenmesi. 29 ġekil 4. Apoptosom. 29 ġekil 5. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis oluşturulması. 30 ġekil 6. Dış sinyallerle apoptozisin tetiklenmesi. 31 ġekil 7. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-3 aktiviteleri 41 ġekil 8. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-8 aktiviteleri 43 VII
KISALTMALAR ADP AMP ATP CP ER FADH FPK GH GHR GP GSH H-I HK H 2 O 2 HİE IGF-1 IL1 Beta LDH NAD NADH NMDA NO O 2 PO 2 PCr PAF PK PV-İVK PUFA PVL QA SOR SOD TNF-alfa :Adenozin difosfat :Adenozin monofosfat :Adenozin trifosfat :Serebral palsi :Endoplazmik retikulum :İndirgenmiş flavin adenid dinükleotid :Fosfofruktokinaz :Büyüme hormonu :Growth hormon reseptörü :Glutatyon peroksidaz :Glutatyon :Hipoksik iskemi :Heksokinaz :Hidrojen peroksit :Hipoksik iskemik ensefalopati :İnsulin benzeri growth faktör :İnterlökin-1 beta :Laktik dehidrogenaz :Nikotinamid adenid dinükleotid :İndirgenmiş nikotinamid adenid dinükleotid :N. metil D.aspartat :Nitrik oksit :Oksijen :Parsiyel oksijen basıncı :Fosfokreatin :Platelet aktive edici faktör :Piruvat kinaz :Periventriküler- İntraventriküler kanama :Çoklu doymamış yağ asidleri :Periventriküler Lökomalazi :Quisqualik asit :Serbest oksijen radikalleri :Süperoksit dismutaz :Tümör nekrosis faktör-alfa VIII
ÖZET Hipoksik-Ġskemik Serebral Hasar OluĢturulan Yenidoğan Rat Modelinde Allopürinolün Kaspaz 3 Ve Kaspaz 8 Aktivitesi Ġle Nöroprotektif Etkisinin Değerlendirilmesi Amaç: Hipoksi-iskemi (H-İ) sonrası reperfüzyon-reoksijenasyon döneminde küçük damar endotel hücrelerinde serbest radikallerin üretimine neden olan siklooksijenaz ve ksantin oksidazın aktive olduğu iki önemli yol tetiklenir. Açığa çıkan serbest radikaller lökosit, platelet ve endotel hücrelerindeki adezyon moleküllerini aktive ederek lökositlerin adezyonu ve ekstravazasyonunu sağlar. Ksantin oksidaz inhibitörü olan allopürinolün hipoksik sikemik ensefalopatide (HİE) nöroprotektif olabileceği gösterilmiştir. Kaspaz 3 ve kaspaz 8 nöronal apoptozisde önemli bir role sahiptir. Biz hipoksik-iskemik ensefalopatili yenidoğan ratlarda farklı doz allopurinolün kaspaz-3 ve kaspaz-8 üzerine etkilerini araştırmayı amaçladık. Materyal ve Metod: Bu çalışmaya 10 günlük yenidoğan ratlar alındı. Çalışma modeli olarak Rice ın hpoksi-iskemi modeli kullanıldı. Ratların sol karotid arterleri bağlandı ve %8 oksijen ile %92 nitrojenli ortamda 2.5 saat bekletildi. Hİ sonrası allopurinol uygulanarak beyin dokusunda her iki hemisferde apopitozis öncül proteinleri olan kaspaz 3 ve 8 ölçümü yapıldı. Allopürinol AL48 tedavi grubuna, ratlar hipoksiye maruz kaldıktan 30 dakika ve 12 saat sonra, 24 mg/kg olmak üzere iki eşit dozda, AL72 tedavi grubuna ratlar hipoksiye maruz bırakıldıktan 30 dakika, 12 saat ve 24 saat sonra aynı dozlarda intraperitoneal olarak uygulandı. Son ilaç uygulanmasından 12 saat sonra ratlar dekapite edildi. Diğer gruplar sham ve Hİ grubuydu. Bulgular: Her bir grupta 10 rat vardı. Gruplar arasında cinsiyet ve ağırlık farkı yoktu (p>0.05). Hİ, AL48 ve AL72 gruplarında kaspaz 3 ve kaspaz 8 düzeyleri sham grubu ile karşılaştırıldığında belirgin yüksekti (her biri için p= 0,0001). Hİ ve AL48 grupları arasında kaspaz aktivitelerinde farklılık olmamasına rağmen (p>0.05) kaspaz -3 ve kaspaz-8 aktiviteteleri HI ve AL48 gruplarıyla kıyaslandığında AL72 grubunda daha düşüktü (her biri için p=0,001). Sonuç: Sonuçta AL72 grubunda kaspaz 3 ve kaspaz 8 aktivitelerinin azalması yüksek doz allopurinolün nöronal apopitozisin azalmasında etkili olabileciğini düşündürmektedir. Anahtar kelimeler: Hipoksik iskemi, yenidoğan ratlar, kaspaz 3, kaspaz 8, allopürinol IX
ABSTRACT Allopurınol s Effect On Caspase-3 And Caspase-8 In Hypoxıc-Ischemıc Newborn Rats Aim: During reperfusion period of hypoxia-ischemia, cyclooxygenase and xanthine oxidase pathways are induced. Free oxygen radicals activate adhesion molecules on leukocytes, platelets and endothelial cells and activate leucocytes adhesion and extravasation. A xanthine oxidase inhibitor, allopurinol has been shown to be neuroprotective in hypoxic- ischemic encephalopathy. Caspase-8 and caspase-3 have a key role in neuronal apoptosis. We aimed to investigate different dosages of allopurinol s effect on caspase-3 and caspase-8 activities in newborn rats with hypoxicischemic encephalopathy. Material and method: 10 days old newborn rats were enrolled to the study. Rice s hypoxia-ischemia model were used. Left carotid artery was ligated and rats were perfused with 8% oxygen and 92% nitrogen for two and half hours (HI group). Rats were treated with allopurinol and caspase- 3 and caspase- 8 activities were measured in both hemispheres. AL48 group was treated with 24 mg/kg intraperitoneal allopurinol 30 minutes and 12 hours after hypoxic- ischemic insult; while AL72 group was treated with same dose after 30 minutes, 12 hours and 24 hours. Twelve hours after last dose, rats were decapitated. The others groups were sham and non- treated hypoxic- ischemic (HI) group. Results: There were 10 rats in each group. There was no significance between gender and weights among groups (p>0.05). Caspase-3 and 8 activities were significantly higher in HI, AL48 and AL72 groups compared to sham group (p=0,0001, for all, respectively). Although caspase activities were not different in HI and AL48 groups (p>0.05), the activities were lower in AL72 group compared to HI and AL48 groups (p=0,0001, for each). Conclusion: Decreased activities of caspase- 3 and 8 in AL72 groups may suggest that high dose of allopurinol may be effective for reducing neuronal apoptosis. Keywords: Hypoxic-Ischemia, newborn rats, caspase-3, caspase-8, allopurinol X
1- GĠRĠġ ve AMAÇ Neonatolojinin önemli sorunlarından biri olan perinatal asfiksi ve buna bağlı olarak gelişen hipoksik iskemik ensefalopati (HİE), doğuma yakın dönemde, doğum sırasında veya doğumdan sonra bebeğin hipoksi-iskemide (H-İ) kalmasına bağlı olarak gelişir. Hipoksik iskemik ensefalopati bazı bebeklerde hafif olmakla birlikte vakaların çoğunda ağır seyretmekte ve sekeller bırakabilmektedir. 1 Son yıllarda yapılan çalışmalarda hipoksi-iskemide olay ve hücre ölümü arasında geçen dönemin çok önemli olduğu görülmüş ve bu dönem terapötik pencere olarak isimlendirilmiştir. Bu dönemde hücre ölümüne neden olan moleküler olayların sonlandırılması çok önemlidir. Hipoksi-iskemide enerji metabolizmasının belirgin olarak etkilendiği; ilk dakikalardan itibaren adenozin trifosfat (ATP), total adenin ve fosfokreatin (PCr) düzeylerinin düştüğü, aerobik glikolizin anaerobik glikolize kaydığı ve oksidatif fosforilasyon ile 38 ATP üretilirken, anaerobik ortamda sadece 2 ATP üretildiği, glikolitik yolağın enzimlerinde artış gözlendiği bilinmektedir. 1 Değişik dokularda hipoksi ve iskemide heksokinaz (HK), piruvat kinaz (PK), laktik dehidrogenaz (LDH) ve glikolitik yola ait diğer enzimlerin koordine bir şekilde arttığı gösterilmiştir. 2-4 Aerobik ortamda, hücrede metabolizma sonucu serbest oksijen radikalleri (SOR) oluşmakta ve hücrenin antioksidan enzimleri savunma mekanizmalarını oluşturmaktadır; Enzimatik savunma mekanizmalarını glutatyon peroksidaz, katalaz ve superoksit dismutaz enzimleri olusturmaktadır. Serbest oksijen radikalleri fazla oluştuğunda oksidatif strese neden olurlar ve yüksek reaktivitelerinden dolayı proteinlerde yapısal ve fonksiyonel değişikliklere, genetik mutasyonlara ve lipit peroksidasyonuna yol açarlar. 5 Hücredeki antioksidan enzim sisteminin önemli enzimlerinden biri olan süperoksit dismutaz (SOD) süperoksit anyonunun hidrojen perokside dönüşümünü sağlar. 6 Hidrojen peroksit hücre membranından rahatça geçebileceği ve hidroksil radikaline dönüşebileceği için glutatyon peroksidaz (GP) ile indirgenmesi önemlidir. Bu reaksiyonda glutatyon (GSH) kullanılır. Yenidoğan beyninde H-İ sırasında hücre içine kalsiyum göçü sonucu SOR lerinin arttığı ve 1
reperfüzyon sonrası oksijenin yeniden ortamda olması nedeni ile oldukça fazla oranda sitotoksik olan oksidanların geliştiği bilinmektedir. 7 Ksantin oksidaz, serbest radikaller için önemli bir kaynak olabilir. Allopürinol, ksantin oksidaz enzimlerinin önemli inhibitörü olup hipoksantinden ksantinin sentezini engeller ve serbest radikal süper oksidinin oluşumundan korur. Apopitotik mekanizmaların özellikle immatür beyinde H-İ den sonra önemli olduğu görünmektedir. Serebral H-İ matür rat ile karşılaştırıldığında immatür rat beyninde daha az nöron nekrozuna neden olmaktadır. Bunun yerine elektron mikroskobisinde H-İ nin apopitosise ve nekroza yol açtığı ara grup hibrid hücrelerde apopitotik-nekrotik devamlılığın sürdüğü gösterilmiştir. En önemli apopitotik olay olan kaspaz-3 aktivasyonu olaydan sonraki 24 saat-7 gün içinde oluşur; bu durum apopitosisin neonatal serebral hasardaki uzamış rolünü göstermektedir. 8 Bu çalışmada serbest oksijen radikal sentez inhibitörü olarak ksantin oksidazı inhibe eden allopürinolün HİE de nöroprotektif etki sağlayabileceği hipotezi öne sürülmüş ve bu amaçla HİE oluşturulan 7-10 günlük rat modelinde kullanımının tedavideki etkinliğini değerlendirebilmek için beyin dokularından kaspaz-3 ve kaspaz-8 düzeyi çalışılmıştır. 2
2. GENEL BĠLGĠLER 2.1. Perinatal Asfiksi Ve Hipoksik Ġskemik Ensefalopati 2.1.1. Tanım Fetal ve neonatal hipoksi ve asfiksi özellikle az gelişmiş ülkelerde sık karşılaşılan bir sorundur. Perinatal hipoksi-iskemide kan ve dokulardaki oksijen konsantrasyonu, ph değişiklikleri ve glikoz gibi metabolize edilebilen substratların konsantrasyonlarındaki değişikliklere bağlı olarak gelişen bir takım olayların tanımına ihtiyaç vardır. Hipoksi (anoksi), bir veya birkaç organda oksijenin kısmi veya tam yokluğu, hipoksemi ise kanda oksijen konsantrasyonunun azalmasıdır. Asfiksi plasental veya pulmoner gaz değişiminin kesilmesi sonucu hipoksemi ve hiperkapninin birlikte olduğu durumdur. Perinatal asfiksi tanımı hemen her yerde farklı anlamlarda kullanılmaktadır. Asfıksinin kelime anlamı "nabızsızlık" olup; ancak çok ağır hipokside görülen kalp yetmezliğini tarifler. Ancak genel olarak perinatal asfiksi, dokuya sunulan oksijenin doku zedelenmesine yol açacak boyutta azalması (hipoksi-iskemi) sonucu hipoksemi ve hiperkapninin birlikte olmasıdır. İskemi ise bir organdaki kan akımının azalması veya kesilmesidir. Bu durumda sadece O 2 değil, diğer substratlar da dokuya erişemez. Fetus veya yenidoğandaki iskemi genellikle sistemik hipoksi-asidoz sonucunda meydana gelir. Ayrıca kardiyovasküler fonksiyonun deprese olduğu durumlarda veya okluzif vasküler hastalıklarda da iskemi oluşabilir. Perinatal hipoksiiskemiye maruz kalan yenidoğan bebeklerde santral sinir sisteminde belirgin olmak üzere bir veya birden fazla organ tutulumu olur. 1 Yenidoğanda H-İ, çoğunlukla HİE şeklinde bulgu verir ve yenidoğan bebeğin tüm hayatını etkileyebilen en önemli sorunlardan biridir. 3
2.1.2. Ġnsidans Sistemik asfiksi insidansı matür bebeklerde % 0,2-0,4 arasındadır. Asfiktik doğan bu bebeklerin % 20-50 si yenidoğan döneminde kaybedilmektedir. Yaşayanların % 25 inde mental retardasyonun da eşlik edebildiği serebral palsi (CP), öğrenme güçlüğü veya epilepsi gibi kalıcı nörolojik hasarlar olmaktadır. 1 2.1.3. Asfiksi Tipleri Perinatal asfiksi iki tablo halinde "kronik kısmi" veya "akut tam" asfıksi şeklinde ortaya çıkmaktadır. Bu iki durum birbirinden klinik ve patolojik özellikler ile ayırt edilebilir. 9 (Tablo 1). Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri Kronik Kısmi Riskli durumlar Ablasyo plasenta Plasental hipoperfüzyon Uterusta hipertonisite Akut - Tam Ablasyo plasenta Uterus rüptürü Kordun tam obstrüksiyonu Annenin kardiyo-respiratuvar arresti Asfiksi oluşması için geçen süre 1-3 saat > 10 dk Serebral kan akımında yeniden düzenleme Oluşmuş Yetersiz Klinik bulguların çıkışı için geçen sessiz dönem (6 48 saat) Var Yok Beyin ödemi Var Yok Konvülziyonlar Var Var/Yok Beyin sapı bulguları Yok Var 4
2.1.3.1. Kronik Kısmi Asfiksi Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalarda maternal plasental hipoperfüzyon, uterus hipertonisitesi, ablasyo plasenta, umblikal kord obstrüksiyonu ve fetal hipoperfüzyon gibi nedenlerle oluşan plasental perfüzyon bozukluklarında, olay bir saat veya daha uzun sürmüşse fetusta progresif hipoksemi ve asidoz gelişmektedir. Bu durumu kompanse etmek için vücuttaki kan akımı yeniden düzenlenmekte; kan akımı vital olmayan organlardan (böbrekler, gastrointestinal sistem, karaciğer, kas ve deri), vital organlara (kalp, beyin ve adrenaller) yönlendirilmekte ve beyine giden kan akımı belirgin şekilde artmaktadır. Bu uyum sırasında serebral perfüzyon oldukça iyi korunmaktadır. Ancak fetal hipoksemi bir süre daha devam ederse, böyle bir kompansasyon ile sağlanan serebral perfüzyon yetersiz kalmakta ve santral sinir sistemine giden kan akımında yeni bir düzenleme ortaya çıkmaktadır. 9 Serebral hemisferlerde kan akımında azalma olurken, bazal metabolizmanın en fazla olduğu talamus, beyin sapı ve serebelluma daha fazla kan gönderilmeye çalışılır (intraserebral şant). Bu durumda serebral hemisferler, özellikle perfüzyonun en uç noktaları olan parasagittal korteks ve bunun altındaki beyaz cevher hipoksemiden etkilenmeye başlar, küçük infarktlar veya lokal konvülziyon odakları gelişir, olay daha da ilerlerse bütün serebral hemisferleri etkileyen infarkt alanları ortaya çıkar. 10 Yenidoğan bebeklerde ortaya çıkan klinik bulgular kan akımındaki bu değişikliklere bağlı olmakta, birçok organda hipoksik-iskemik zedelenme görülmektedir. Olguların üçte ikisinde beynin yanı sıra en az iki organ da etkilenmiştir. Kliniğimizde 1995-1999 yılları arasında izlenen 205 HİE li bebeğin % 40,5 inde böbrek, % 30,7 sinde karaciğer, % 20 sinde akciğer ve % 5 inde de kardiyovasküler sistemde etkilenme olduğu görülmüştür. 11 Nörolojik bulgular, hipoksik-iskemik zedelenmenin derecesine, süresine ve dağılımına bağlıdır. Bebek doğumdan hemen sonra beyin zedelenmesi ve metabolik asidoz nedeni ile depresedir. Hipotoni, letarji ve konvülziyonlar görülebilir. Hipotoni çok ağır olabilir. Ancak dakikalar veya saatler içinde bebeğin aktivitesi ve tonusunda artma olur, spontan ve uyarılarla tremorlar görülebilir. Konvülziyonlar genellikle 6-12 saat sonra ortaya çıkar, hemen her zaman hayatın ilk günü içinde görülür. 5
Konvülziyonların sıklığı giderek artar ve başlangıçta genellikle tedaviye dirençlidir. 2-5 gün sonra konvülziyonlar azalır veya tamamen ortadan kalkar ve ilaçla kontrol edilebilir duruma gelir. Ağır zedelenme olan vakalarda şiddetli beyin ödemi bulguları vardır. Kafa içi basınç artmasının bulguları (fontanelde bombeleşme, suturalarda açılma gibi) genellikle 24 saat sonra başlar, 48. saatte en şiddetli düzeydedir. Bu hastalarda yeniden hipotoni gelişir, bebeğin hareketleri azalır veya ortadan kalkar. Beyin sapı disfonksiyonu bulguları (sabit pupiller ve apne gibi) vardır. 9 Serebral hemisferlerdeki infarkt yaygınsa, özellikle beyin ödemi bulguları varsa, lateral ventriküller kompresedir, serebral beyaz cevher ekojenitesinde yaygın artış olur, serebral gri cevher (korteks ve bazal ganglionlar) ile beyaz cevher arasındaki görünüm farklılığı ortadan kalkar. Bir iki hafta sonra hemisferlerdeki nekroz alanları belirginleşir ve sonunda multikistik ensefalomalazi veya serebral hemisferlerin total obliterasyonu olur. Talamus, beyin sapı ve serebellum ise daha iyi korunmuştur. 9 2.1.3.2. Akut Tama Yakın Asfiksi Bu durumda olay akuttur, hipoksemi ani ve şiddetlidir. Olay hızlı geliştiğinden organlar arası ve beyin içindeki kan dolanımının yeniden düzenlenmesi yetersizdir. Buna bağlı olarak hipoksik-iskemik zedelenme bulguları, metabolik aktivitenin fazla, enerji depolarının az olduğu yerlerde daha fazla görülür. Talamus ve beyin sapı nükleusları belirgin derecede etkilenirken, serebral hemisferler daha iyi korunmuştur, beyin ödemi görülmez. Kısmi asfiksidekinin tersine nörolojik bulguların (konvülziyon ve beyin ödemi) ortaya çıkması için nisbeten sessiz geçen dönem görülmez. Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalarda, olay on dakikadan kısa sürerse, beyin zedelenmesi bulgularının tamamen düzeldiği gösterilmiştir. 10-25 dakika kadar sürdüğünde talamus ve beyin sapı nükleuslarında ağır zedelenme görülür. 25 dakikadan uzun süren durumlarda ise ağır kardiyak zedelenme de olduğu için geriye dönüşümsüz vasküler kollaps gelişir. 9 İnsanlarda tama yakın asfıksi çok seyrektir; ancak tam ablasyo plasenta, akut tam kord obstrüksiyonu, uterus rüptürü, maternal kardiyorespiratuvar arrest gibi durumlarda görülebilir. Bazı vakalarda ise hiç bir neden bulunamaz. Bununla birlikte bu vakaların 6
bir çoğunda daha önceden başlamış kısmi asfıksi bulguları da vardır. Ağır derecede etkilenmiş bebekler doğduklarında deprese ve bradikardiktir, resüsitasyon gerekir. Spontan solunumları uzun süre yoktur. Konvülziyonlar ve uzun süren stupor görülür. Beyin ödemine bağlı kafa içi basınç artışı bulguları yoktur. Beyin sapı disfonksiyonu bulguları 24 saat kadar sonra ortaya çıkar. Sabit pupiller, okulosefalik refleks yokluğu (orta-beyin, pons zedelenmesi), kornea refleksi yokluğu (pons zedelenmesi), öğürme refleksinin kaybı, dilde fasikülasyonlar (medulla spinalis zedelenmesi) görülebilir. Bu bulgular bebek uyanık iken biraz düzelme gösterse bile genellikle kalıcıdır. Öğürme refleksinin azalması nedeni ile beslenme ve yutma bozuklukları görülür, nasofarenkste biriken sekresyonlar sorun olur ve bu nedenle bebeğin entübe edilmesi gerekebilir. Beyin dışı organlardaki zedelenme bulguları daha hafiftir. 9 2.1.4. Patoloji Hipoksi-iskemi den sonra, beyinde tek tip patolojik lezyona rastlanmaz. Hücrelerin metabolik ihtiyacı zamanında karşılanamadığında hücre ölümü meydana gelir. Beyindeki hasarın şekli bazı faktörlere bağlıdır: 1. Asfiksiye yol açan olayın şiddeti (tam veya kısmi) 2. Etiyolojik faktörün zamanı ve süresi (akut veya kronik) 3. Beynin gelişimsel olgunluğu (prematüre veya matür) 4. Beyinde bölgesel duyarlı bölümler (vasküler faktörler ve N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörlerinin dağılımı). 12 Beyin zedelenmesinin ne zaman olduğu ile ilgili yapılmış çalışmalar az olmakla birlikte histolojik incelemelerle lezyonun yaşı konusunda bilgi edinilebilir. 9 (Tablo 2). Hipoksik iskemik ensefalopati de gelişebilen başlıca serebral lezyonlar: 1) Selektif nöronal nekroz 2) Bazal ganglion ve talamusta status marmoratus şeklinde lezyon 3) Parasagital serebral hasar 4) Periventriküler lökomalazi (PVL) 5) Periventriküler- İntraventriküler kanama (PV-İVK) 6) Fokal ve multifokal iskemik beyin hasarıdır (10) 7
Tablo 2. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı Bulgu Gün Reaktif astrositozis 0,5 4 Mikroglial proliferasyon 0,3-3 Nöronal karyoreksis 0,5-2 Makrofaj infiltrasyonu 4-6 Kapiller endotelyal reduplikasyon 5 Fibriller gliosis 6 Kist oluşumu 10-42 Matür bebekte görülen hipoksik-iskemik beyin hasarında selektif nöron nekrozu, parasagittal zedelenme ve fokal iskemik beyin nekrozu görülür. Bunların arasında esas olan selektif nöron nekrozudur. Prematür bebekte görülen oligodendroglial/beyaz cevher hasarı matür bebekte de görülmekle birlikte nöron hasarı daha baskındır. Hipoksik iskemik ensefalopati esas olarak matür bebeklerde geliştiği için burada daha çok nöron nekrozuna neden olan patolojik biyokimyasal olaylardan bahsedilecektir. 2.1.5. Prematür ve Matür Yenidoğanlarda Perinatal Hipoksik-Ġskemik Beyin Hasarının Patogenezi Hipoksi-iskemi prematür ve matür bebeklerde değişik nöropatolojik olaylara yol açar. Matür bebeklerde esas olay nöron hasarı iken prematür bebeklerde oligodendroglial/beyaz cevher hasarı daha hakimdir. Hipoksik-iskemik hasardan sonra ortaya çıkan, hücre yıkımına yol açan biyokimyasal olayları anlamak bu hasarın önlenmesi için önemlidir. Hipoksik-iskemik olaylardaki nöron hasarına yol açan olayların patogenezi Şekil 1 de gösterilmiştir. İlk oluşan olay glikoz ve oksijenin azalmasıdır. Hücre ölümüne neden olan olaylar hipoksik-iskemik olayın sonlanmasından sonra ve reperfüzyon sırasında enerjide çok da fazla düşüş olmasını beklemeden olur ve bunu glutamat 8
reseptörlerinin aktivasyonu izler. Nöron ölümüne neden olan diğer olaylar sitozolik kalsiyumun artması ve kalsiyuma bağlı süperoksit anyon, hidroksi radikaller gibi serbest radikallerin ve nikrik oksit derivelerinin oluşması gibi çeşitli zararlı olayların aktive olmasıdır. Nöron ölümüne neden olan olaylar kaskadı hipoksik-iskemik hasarın sonlanmasından birkaç saat sonra oluşur. Bu nedenle bu dönemde beyin hasarını azaltabilecek veya daha kötü olmasını engelleyebilecek önemli girişimler yapılabilir. 13 9
ADENOZĠN ATP Ca HĠPOKSANTĠN NĠTRĠK OKSĠT SENTAZ LĠPA Z PROTEAZ MĠKROTÜBÜL AYRIMI NÜKLEAZ ATP BAĞIMLI CA KANALLARI SĠSTEMĠ VE OKSĠDATĠF FOSFORĠLASYON KSANTĠN OKSĠDAZ KSANTĠN SERBEST RADĠKALLER ARAġĠDONAT EKAZANOĠDLER MĠKROFLAMENT AYRIġMASI ĠSKELET AYRIġMAS I MEMBRAN HASARLANMASI HÜCRE ÖLÜMÜ ġekil-1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakış 10
2.1.5.1. Hipoksemi Intrauterin dönemde fetus, parsiyel oksijen basıncının (PO 2 ) 22-28 mmhg arasında olduğu fizyolojik hipoksemik bir ortamda yaşar. PO 2 15 mmhg e kadar düştüğü değerlerde normal kardiyovasküler fonksiyonun bir kaç saat devam edebildiği, kalp hızının ve sistemik kan basıncının düşmesi ile birlikte ilerleyici laktik asideminin oluştuğu gösterilmiştir. Dokuda yüksek enerjili fosfat rezervleri (özellikle ATP), hipoksemi esnasında oldukça iyi korunur. Ancak sistemik hipotansiyona hipoksemi eşlik ediyorsa ve serebral iskemi oluşmuşsa beyin hasarı olma şansı yüksektir. 1 2.1.5.2. Hipoksi-Ġskemi Hipoksinin meydana getirdiği beyin zararlanmasında doku O 2 nin azalmasına ek olarak bir veya daha fazla faktörün rol oynadığı düşünülmektedir. Hayvanlardaki ilk çalışmalar Myers ve ark. 14,15 tarafından yapılmıştır. Annelerinin abdominal aortası sıkıştırılarak asfiksi yaratılan miadındaki maymun fetüslerde iyileşmeyi takiben esas olarak serebral hemisferlerde zararlanma olduğu gösterilmiştir. Kortikal gri cevherde atrofi, beyaz cevherde skleroz ve bazal gangliyonlarda status marmoratus şeklinde hasarlanma gözlenmiştir. Benzer lezyonlar perinatal periyotta serebral H-İ gelişen yaşayan bebeklerde de saptanmıştır. Bu çalışmalara ek olarak Brann ve Myers, gaz anestetik ve haloten ile annelerinde hipotansiyon yaratarak parsiyel intrauterin asfiksiye maruz bıraktıkları miadındaki maymun fetüslerinde ağır hipoksemi ile birlikte kombine metabolik ve respiratuvar asidoz olduğunu tespit etmişlerdir. Doğumu ve resüsitasyonu izleyerek maymunların mekanik ventilasyona gereksinim duydukları, konvülziyon geçirdikleri ve 96 saatten önce stabilize olmadıkları görülmüştür. Yapılan nöropatolojik analizlerde yaygın beyin ödemi ve soluklukla birlikte, hemorajik nekrozun özellikle serebral korteks ve subkortikal beyaz cevherde oluştuğu gösterilmiştir. Sistemik kan basıncı daha düşük olan maymunlarda asfiksinin daha ağır beyin zararlamasına yol açtığı görülmüştür. 16 Hipoksik kardiyovasküler depresyon sonucu sistemik hipotansiyon oluşması için O 2 basıncının veya içeriğinin % 40 veya altında olması gerekmektedir. Hipoksemi esnasında kan basıncı daha düşük olduğunda serebral iskemi daha da artmakta ve beyin hasarı daha ağır olmaktadır. 1 11
Beyinde hasarının oluşabilmesi için serebral H-İ nin en az ne kadar sürmesi gerektiği sorusu en önemli sorudur. Bu sorunun yanıtı serebral H-İ nin ağırlığına, olayın olduğu zamanki beynin anatomik ve fonksiyonel maturasyonuna bağlıdır. Hipoksi-iskemi esnasında daha matür hayvanlarda beyin hasarı daha kısa total asfiksi süresinde meydana gelmektedir. Kısmi serebral H-İ de bu süre daha uzun olmaktadır. Hayvanlarda yapılan deneylerde bu süre muhtemelen üç saatten daha fazla değildir. Üç saatten daha az H-İ ye maruz kalan hayvanların başarılı bir şekilde canlandırıldığı görülmüştür. 1 Sistemik hipoksemiye bağlı serebral iskeminin meydana getirdiği beyin hasarı deneysel verilere ek olarak klinikte de radyografik bulgular, prognoz ve postmortem sonuçlar ile değerlendirilmiştir. Yapılan çalışmalarda hipoksemi ile birlikte sistemik hipotansiyonun özellikle prematür bebeklerde subkortikal veya PVL ye neden olduğu tespit edilmiştir. Miall-Allen ve arkadaşları 17, 31 haftanın altındaki 33 yenidoğan bebekte ortalama arteriyel kan basıncının bir saatten daha fazla 30 mmhg nın altında seyretmesi durumunda periventriküler beyaz cevherde ağır hemorajik infarkt veya iskemi geliştiğini göstermiştir. Ortalama arteriyel kan basıncı 30 mmhg üzerinde olan bebeklerde ise daha az lezyon gelişmiştir. 2.1.5.3. Beyin Hasarının Patogenezinde Hücresel Mekanizma 2.1.5.3.1. Enerji DönüĢümü Serebral hipoksi-iskemisi olan hayvan ve insan yenidoğanlarında H-İ sırasında serebral enerji yetmezliği bifaziktir. Hipoksi-iskemi sırasında primer enerji yetmezliğinin ardından gelişen ve enerjinin kısmen geri kazanıldığı bir reperfüzyon devresi vardır. Ancak yaklaşık 24 saatlik bir latent süre sonunda yeterli serebral perfüzyon ve oksijenizasyon olmasına rağmen ikinci bir enerji yetmezliğinin olduğu dönem gelişir. Latent faz döneminde gecikmiş hücre hasarı oluşur. Bu dönem çalışmaların yoğun olarak yapıldığı ilgi çeken bir dönemdir. 13 ATP tüm hücrelerde olduğu gibi nöronlarda da primer enerji kaynağıdır. İki yüksek enerjili fosfat bağı biyokimyasal reaksiyonlar ve fizyolojik olaylarla yakından ilişkilidir. ATP enerji tüketen reaksiyonlarda ve iyon pompalanması gibi fizyolojik işlemlerde 12
önemli rol oynar. Böylece hücresel serbest enerji ile nöronal canlılık ve spesifik fonksiyonlar sağlanır. Fizyolojik şartlar altında hücresel ATP stabil halde bulunur. ATP tüketim hızı ATP üretim hızı ile tam bir denge halindedir. Hücrenin ATP içeriğini devam ettirme yeteneği enerji ihtiyacının arttığı durumlarda bile biyokimyasal işlemlerle ATP üretimine imkan verir. ATP üretimi en fazla nikotinamid adenid dinükleotid in (NAD) oksidatif fosforilasyonu ile oluşur. Bu olay mitokondrilerin içinde gerçekleşir. Ayrıca substrat fosforilasyonu ile mitokondri ve sitozol içinde de küçük miktarlarda ATP oluşur. Hücresel ATP yi sabit tutan diğer iki mekanizma, birbirleri arasında basit enerji transferinin olduğu kreatinin fosfokinaz ve adenilat kinaz eşitliğidir. 1 Doku O 2 basıncı kritik bir değer altına indiğinde (<0.1 mmhg) mitokondrinin sitokrom sistemleri ansatüre hale gelir. Redükte ajanlar (NADH, flavin adenin dinükleotid) birikmeye başlar. Oksidatif fosforilasyonla oluşan ATP üretimi durur. Hücresel adenozin difosfat (ADP) ve adenozin monofosfat (AMP) seviyeleri artar. ADP ve AMP nin yükselmesi, anahtar regülatuvar enzim olan fosfofruktokinazı (FPK) aktive ederek glikolizi stimüle eder. Oksidatif fosforilasyonda bir glikozun yıkımı ile 36 mol ATP üretilirken, subtrat fosforilasyonu ile 2 mol ATP üretilir. ATP üretimi 18 kat azalmış olur. Glikoliz maksimum olarak stimüle olduğunda, kapasite en çok 4-5 kat artar, bu sırada biriken NADH tan ortaya çıkan H + iyon birikimi PFK aktivitesini inhibe eder. 1 Böylece glikoliz, parsiyel oksijen yokluğunda oksidatif fosforilasyonu stimüle edebilmesine karşın, hiçbir zaman mitokondriyal oksidasyonun yerini dolduramaz. İrreversibl doku hasarı sonucu oluşan serebral H-İ de beynin enerji durumunda genellikle belirgin değişiklikler söz konusudur. Değişiklikler sadece adenin nükleotidlerde oluşmaz, ayrıca fosfokreatininde de meydana gelir. Böylece ATP, ADP ve AMP de de değişiklikler oluşur. Hipoksi-iskemi esnasında erken dönemde doku yüksek enerjili fosfat rezervlerinin konsantrasyonunda değişiklikler meydana gelir ve iyileşme periyoduna kadar sürer. ATP ve total adenilat bileşiklerinin konsantrasyonları resüsitasyondan sonra tamamen normal seviyeye gelmez. Doku hasarına bağlı olarak kısmi eksiklik devam eder. 1 Hipoksi-iskemi esnasında hücrede ATP nin azalması enerji gerektiren diğer metabolik olayları da etkiler. ATP ye bağımlı Na pompası ve değişimi, Na un hücre içinde birikimine neden olarak sitotoksik ödeme yol açar. 1 13
Beyin hücrelerinin gecikmiş hasarında mitokondrilerin disfonksiyonu önemli rol alır. Serebral H-İ den hemen sonra mitokondriyal solunum hızı deprese olur ve ancak olaydan 8 saat kadar sonra, kısmen düzelir. Enerji yetmezliğinin başlangıcında nöron markırı olan mikrotübül-ilişkili protein de (microtubule-associated protein) orta derecede bir azalma fakat kaspaz-3 aktivasyonunda minimal bir artış vardır. Mitokondriyal solunum hızındaki gecikmiş düşüş olaydan 24 saat sonra en alt düzeye iner ve belirgin kaspaz-3 aktivasyonuna ve nöronal zedelenmeye yol açar. Kaspaz-3 ün aktivasyonu ile mitokondriyal disfonksiyon ve apopitosis arasında önemli bir ilişki olduğu gösterilmiştir. 18 2.1.5.3.2. Serbest Radikal OluĢumu Beyin, özellikle çoklu doymamış yağ asidleri (PUFA) açısından zengin olup serbest radikal atıklarına karşı oldukça duyarlıdır. Serbest demir ve nitrik oksit (NO) önemli oksidatif maddeler olup daha toksik serbest radikal üretimine yol açabilirler. Bu reaksiyonlar sonucu oluşan ürünlerin eliminasyonu hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), superoksit veya katalist reaksiyonu ile sağlanır. 1 Serbest oksijen radikalleri (SOR) hipoksi-iskemi esnasında bir kaç yolla meydana gelir. Kısmi H-İ esnasında dokuda düşük konsantrasyondaki O 2 sitokrom oksidaz ile elektron alışverişine girerken proksimal basamaklarda serbest radikal oluşturur. Oluşan bu O 2 serbest radikalleri, mitokondri ve sitoplazma tarafından tüketilemez. Yenidoğanların özellikle prematüre bebeklerin superoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz gibi antioksidanları beyinde rölatif olarak eksiktir. Beyin bu nedenle serbest radikal hasarından daha fazla etkilenir. Prematüre bebeklerde ayrıca glutatyon seviyeleri düşüktür ve demiri sekestre edecek yeterli transferrin yoktur. 1 2.1.5.3.3. Eksitatör Nörotransmitterlerin Nörotoksisitesi Son zamanlarda yapılan in-vitro ve in-vivo çalışmalarda hipoksik-iskemik hasarın oluşumundaki major faktörlerden birinin glutamat toksisitesi olduğu gösterilmiştir. Bu özellikle glutaminerjik nöronlar ile inerve edilen sinir hücrelerinde belirgindir. 1 14
İmmatür ve erişkin beyninin belirli bölgelerinde glutamata yanıt veren özel reseptörlerin bulunduğu yerler tanımlanmıştır. Bu bölgeler: serebral korteksin orta tabakaları, striatum ve özellikle hipokampusun CA1 bölgeleridir. Glutamat tarafından aktive edilebilen en az üç membran reseptörü vardır. Bunlar kainik asit, quisqualik asit (QA) ve NMDA dır. Son zamanlarda bulunan bir diğer reseptör QA reseptörünün bir benzeri veya subtipi olan alfa amino 3-OH 5-metil 4 isoksazol propronat reseptörüdür. Bu reseptör ve bunların subünitleri plazma membranı boyunca elektrokimyasal gradientten bağımlı veya bağımsız olarak iyon geçişine izin vererek kanalların çalışmasını sağlar. Eksitatör aminoasitlerin toksik etkisi kısmen nöronal plazma membranı boyunca iyon geçişini değiştirmesinden kaynaklanmaktadır. 1 2.1.5.3.4. Ġntrasellüler Kalsiyum Yüklenmesi Kalsiyum, bir çok yerde bulunduğu için intrasellüler ikinci bir messenger olarak düşünülür. Bu iki değerlikli katyon, çeşitli hücresel reaksiyonlarda kofaktör olarak rol alır. İntrasellüler Ca +2 dengesinin bozulmasının, nöronal metabolizma ve fonksiyon üzerine belirgin etkisi vardır. Hücre içinde kalsiyum konsantrasyonu sıkı bir şekilde regüle edilir. Kalsiyumun % 100 e yakını subsellüler organellere bağlıdır. Normalde serbest Ca +2 çok düşük düzeylerdedir. Kalsiyumun fizyolojik ekstrasellüler seviyeleri plazma membranı boyunca serbest kalsiyumun hücreye giriş çıkışına imkan verir. Primer olarak intrasellüler Ca +2 un bağlandığı yerler mitokondri ve endoplazmik retikulum, daha az miktarda nöronun plazma membranı ve nükleusudur. Bağlanma enerjiye (ATP) bağımlı ve intrasellüler ph dan etkilenen bağımsız olaylar ile oluşur. Ayrıca sitozol içinde Ca +2 bağlayan spesifik proteinler de bulunur ve bunlar serbest Ca +2 konsantrasyonlarının düşük olmasını sağlar. 1 Hipoksi-iskemi de serbest Ca +2 un sitozolde konsantrasyonu artar. Bu yükselmenin iki kaynağı olduğu sanılmaktadır: 1. Kalsiyumun intrasellüler depolardan serbest hale geçmesi 2. Plazma membranı boyunca geçişinin artması Bu nedenlerle sitozolik serbest Ca +2 toksik seviyelere erişir. Kalsiyum dengesindeki değişikliklerde meydana gelen bu mekanizmalar Ca +2 ile ilgili biyokimyasal 15
reaksiyonlarda bozukluklara neden olur ve nöronun canlılığının devamı etkilenir. Bu reaksiyonlar arasında çeşitli lipaz, proteaz ve endonükleaz reaksiyonlarının etkilenmesi sayılabilir. Ayrıca fosfolipaz C nin aktivasyonu oldukça önemlidir. Kalsiyum, ksantin ve prostoglandin oluşumu ile serbest O 2 radikallerinin oluşumuna da yardım eder. Nihayet intrasellüler serbest Ca +2 un yüksek konsantrasyonları mitokondride oksidatif fosforilasyonun kesintiye uğramasına neden olur. Fazla miktarda Ca +2 birikiminin toksik etkileri nöron ölümü ve membran bütünlüğünün bozulması için bir nedendir. 1 2.1.5.3.5. Nitrik Oksit Toksisitesi Yeni deneysel çalışmalar NO gibi serbest radikal gazların, hipoksik-iskemik beyin hasarının oluşmasına neden olan veya yol açan metabolik olayların gidişini etkilediğini düşündürmektedir. Nitrik oksit, katalitik sitozolik bir enzim olan NO sentetaz ile L- arginin in sitrulin e dönüşümü esnasında oluşur. Beynin seçilmiş nöronlarında üretilir. Nitrik oksit üretimi glutamatın NMDA reseptörleri gibi, eksitatör amino asit yüzey reseptörlerinin aktivasyonu ile ilişkilidir. Bunların aktivasyonu Ca +2 un hücre içine girişine neden olarak kalmoduline bağlanmasını sağlar. Nitrik oksit çeşitli metabolik olayları, primer olarak da siklik guanozin monofosfat ın oluşumu ile guanilat siklaz gibi ikincil messenger enzimin aktivasyonunu bozarak etkiler. Nitrik oksit yüksek konsantrasyonlarda nörotoksik bir ajan gibi rol alır ve beyinde amino asit eksitotoksitesi için son yolu oluşturur. Nitrik oksit glikolitik enzimlerden gliseraldehid 3 fosfat dehidrogenazı inaktive eder. Glikolitik yoldaki kesinti ATP nin sitozolik üretimini azaltır, daha sonra mitokondride enerji üretimi için kullanılacak olan substrat üretimi de azalmış olur. Nitrik oksit ayrıca mitokondriyal elektron transport zincirini ve Krebs siklusu enzimi olan akonitazı inhibe ederek oksidatif metabolizmayı bozar. 1 2.1.5.3.6. Ġntrasellüler Asidoz Beyinde hasar oluşturacak kadar yeterli H-İ, hemen daima doku asidozu ile birliktedir. Bunun nedeni laktik asid birikimidir. İntrasellüler laktik asidoz, glikozun oksidatif metabolizmasının kısmi veya total anaerobik glikolize dönüşümü sonucu oluşur. 16
Bu olay esnasında doku O 2 i çok düşük seviyelere iner. Bunun yanında bazı araştırıcılar beyindeki laktik asidozun hipoksik-iskemik hasarın major nedeni olduğunu, irreversibl hasarın oluşması için beyin dokusunun her kilogramı başına minimum 15-20 mmol laktat oluşması gerektiğini öne sürmüşlerdir. Ancak yapılan bazı araştırmalarda immatür hayvanlarda serebral laktik asidozun beyin hasarı oluşmasında kritik rolününün bulunmadığı yönünde bulgular da elde edilmiştir. 1 Hipoksi-iskemide laktik aside ek olarak H + iyon kaynakları da hücresel asidoza neden olmaktadır. İndirgenmiş ekivalanların major kaynağını, ATP nin asit hidroliz ürünleri ve hücresel enerji kaybı ile biriken NADH ve H + oluşturmaktadır. 1 Hipoksi-iskemi esnasındaki hücresel asidoza bağlı nöronal nekrozdan değişik mekanizmalar da sorumlu olabilir. Bunlar arasında mitokondriyal fonksiyonun inhibisyonu, iyon dengesinin bozulması, Ca +2 birikimi ve ödem oluşumunun artışı sayılabilir. 1 2.1.5.3.7. Apopitosis İmmatür kemiricilerde son yıllarda yapılan çalışmalarda gecikmiş hücresel hasar çalışılmıştır. 19 Nekrotik ve apopitotik mekanizmalar arasındaki ayrım tam olarak yapılamamıştır, olayın daha önce sanılandan çok daha karmaşık olduğu görülmüştür. 2.1.5.3.8. Ġnflamasyon Hipoksik-iskemik olay beyaz cevher hasarında iyi tanımlanmış bir neden olmasına rağmen son yıllarda özellikle prematürelerde yapılan epidemiyolojik ve deneysel çalışmalardan inflamasyon ile PVL ve serebral palsi arasında yakın ilişki olduğu görülmüştür. Hipoksi-iskemide de olduğu gibi sitokinlerden en fazla zarar görenler immatür oligodendrositlerdir. 20 17
2.1.5.3.9. Sitokinler Proinflamatuvar sitokinler birkaç değişik mekanizma ile beyin hasarına neden olurlar. İnflamatuvar sitokinler direk serebral sitotoksik etki göstererek oligodendrosit öncüllerinin farklılaşmasını önlerler, oligodendrosit apopitosisini stimüle ederler ve vakuoler myelin dejenerasyonuna neden olurlar. Sitokinlerin uzun süren vazomotor ve vazooklusif etkileri olabilir. 20 Dolaşımdaki sitokinler maternal, fetal ve neonatal enfeksiyon ve iskemi sonucunda oluşabilirler. Son çalışmalar sitokin toksisitesinin glutamat transportundaki bozukluklar nedeni ile olabileceğini göstermiştir. 21 Astrositler glutamatı 1000 kat konsantre etme yeteneğine sahip oldukları için ekstrasellüler glutamat regülasyonunda önemlidir. Glial kültürlerde proinflamatuvar sitokinlerden interlökin- 1β (IL-1β) ve Tümör Nekrozis Faktör- α nın (TNF-α) glutamat transportörünün fonksiyonunu bozdukları ve glutamat aracılıklı oksidatif stresi arttırdıkları gösterilmiştir. 21 Buna karşın bu etkiyi, anti-inflamatuvar olan IL-4 ve IL-10 pro-inflamatuvar sitokinlerin üretimini engelleyerek indirek yoldan inhibe eder. Astrositlerin glutamatı temizleme kapasitesindeki bozukluk antioksidanlar, vitamin-e ve glutatyonlar ile düzeltilebilir. Bu durum, astrositik glutamat transportörlerinin serbest radikaller ile kısmen de olsa hasarlandığını göstermektedir. 20 2.1.6. Hipoksik Ġskemik Beyin Hasarının Önlenmesindeki Mevcut Değerli GiriĢimler Son çalışmalarda H-İ de olay ile hücre ölümü arasında geçen sürenin çok kritik olduğu görülmüş ve bu dönem terapötik pencere olarak adlandırılmıştır. Bu dönemde oluşan hücre ölümüne neden olan moleküler olaylar kaskadının sonlandırılması klinikte çok yararlıdır. Fetüste ve yenidoğan bebekte olayın başlangıç zamanını ve ağırlığını bilmek zordur. Miadındaki yenidoğanda H-İ e neden olan intrauterin asfiksinin ne zaman beyin hasarına yol açtığını belirleyen bir metot henüz yoktur. Benzer şekilde beyin hasarlarının daha çok postnatal dönemde olduğu prematürelerdeki beyin hasarı genellikle bulgu vermez veya sessizdir. Bu nedenle hem prematürelerde hem de term bebeklerde beyin hasarının geç tespit edilmesi terapötik pencere döneminin kaçırılmasına neden olur. 13 18
Tablo 3 de hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesinde değerli olan mevcut girişimler gösterilmiştir. 13 2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması Enerji kaybı çok ciddi olmasa dahi iskemiden sonra nöron ölümüne yol açan kaskadı başlatan olaydır. Bu nedenle glikozun fizyolojik düzeylerde tutulmasının önemi büyüktür. Ancak yüksek düzeyde glikoz seviyelerinin de zararlı olduğu gösterilmiştir. Glikoz düzeyleri normal değerlerin çok üstüne çıktığında serebral laktat düzeyleri yükselmektedir. Yüksek doz barbitüratın serebral metabolik hızı azalttığı ve böylece enerjinin korunmasını arttırdığı bilinmektedir. 22 Hafif hiperkapninin de hayvan modellerinde enerji kaybının azaltılmasında koruyucu etkisinin olduğu gösterilmiştir. 23 Enerji tüketiminin azaltılmasında en umut verici girişim hafif hipotermi gibi görünmektedir. Hafif hipoterminin H-İ deki yararlı etkisi bir çok çalışmada gösterilmiştir. 13 Hemen hemen tüm çalışmalarda hipotermi H-İ sırasında veya reperfüzyondan hemen sonra veya her iki dönemde birden uygulanmıştır. Hafif hipoterminin reperfüzyondan saatler sonra gelişen ikincil enerji yetersizliğini de azalttığı gösterilmiştir. 24 2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu Glutamatın ekstrasellüler birikimi hem nöronal hem de oligodendroglial hücre ölümünde önemli olduğu için artmış glutamat salınımı H-İ de önemlidir. Glutamat salınımı presinaptik sinir uçlarından kalsiyum aracılığı ile olur ve magnezyum bu olayı bloke eder. Kalsiyum kanal blokörleri veya magnezyum bu basamakta yararlı olabilir. 13 Kültüre edilmiş nöronlarda ve yenidoğan domuzlarda yapılmış çalışmalarda hafif hipoterminin nöroprotektif etkisinin bir kısmından sinaptik sinir uçlarından glutamat salınımının inhibe edilmesi sorumlu bulunmuştur ancak başka çalışmalarda böyle olduğu gösterilememiştir. 13 Serbest radikal tutucularının nöroprotektif etkisi, kısmen glutamat salınım düzeyinde etki göstermesine bağlıdır. Çünkü bazı modellerde serbest radikallerin nöronal glutamat salınımını arttırdığı görülmüştür. 13 Ayrıca fenitoin ve lamotrijinin de 19
H-İ de yararlı etkisinin görülmesi bu antikonvülzanların glutamat salınımını inhibe etmesinden kaynaklanmaktadır. 25,26 2.1.6.3. Glutamat alınımındaki bozukluğun iyileģtirilmesi Hipoksi-iskemi de ekstrasellüler glutamat artışının nedeni sadece artmış salınım değil aynı zamanda astrosit ve presinaptik sinir uçlarından alımın bozulmasıdır. Hipotermi, iskemi nedeni ile astrositlerde enerji bağımlı glutamat alımındaki bozukluğu azaltarak bir miktar nöroprotektif etki gösterebilir. 13 2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi NMDA reseptör antagonistlerinden özellikle MK-801, magnezyum; ketamin ve destrofan ın iskemik nöron hasarının değişik modellerinde hem kültür hem de in-vivo şartlarda nöroprotektif etkisi olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde bazı modellerde non- NMDA (AMPA/kainate) antagonistlerinin (örn.nbqx, CNQX) kullanımı ile ek yararlı etki gösterilmiştir. Bu ajanlar hasardan birkaç saat sonra veya hasarın sonlanmasından hemen sonra uygulandığında nöroprotektif özellikleri belirgindir. 13 Non-NMDA reseptörlerin inhibisyonu sadece nöronal zedelenmeyi değil aynı zamanda oligodendroglial zedelenmeyi de inhibe eder. Son çalışmalar AMPA/kainate reseptörlerinin aktivasyonunun kültüre oligodendrositlerin ve in-vivo çalışmalarda oligodendrogliaların ölümüne neden olduklarını göstermiştir. Bu bulguların hepsi birden değerlendirildiğinde glutamatın hem reseptör hem de non-reseptör aracılıklı mekanizmalar ile immatür oligodendroglialara toksik etki gösterdiği görülmektedir. 13 2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu Lökosit adherasyonu, mikroglial aktivasyon ve sitokin etkisi hipoksik-iskemik beyin hasarında önemli görünmesine rağmen perinatal modellerde bu düzeyde nöroproteksiyon ile ilgili çalışmalar azdır. İn-vivo perinatal hipoksik iskemik hasarda, H-İ öncesi yaratılan nötropeninin yararlı etkisi olduğu gösterilmiştir. İskemi/reperfüzyon 20
ile artan, platelet aktive edici faktör (PAF) lökosit adezyonunda ve daha sonra gelişen inflamatuvar kaskatta önemlidir. İmmatür ratta PAF antagonistinin hem tedavi öncesi hem de tedavi sonrası örn. reperfüzyondan sonra uygulanmasının infarkt sahasını azalttığı gösterilmiştir. Erişkin hayvanlarda yapılan çalışmalarda lökosit adezyon moleküller veya değişik sitokinler üzerine etki eden antikor veya ilaçların önemli nöroprotektif etkisi olduğu görülmüştür. 13 Mikroglia/makrofajların önemli bir ürünü IL- 1β dır. IL-1β, TNF-α yı da içeren diğer proinflamatuvar sitokinlerin salınımını sağlar. Yenidoğan ratta H-İ de IL-1β reseptör antagonistinin olaydan önce ve reperfüzyon sırasında kullanılmasının yararlı etkileri olduğu gösterilmiştir. 27 Benzer şekilde, bir fosfodiesteraz inhibitörü olan, H-İ den sonra beyinde arttığı bilinen ve TNF-α üretimini inhibe eden pentoksifilin in H-İ den hemen önce uygulandığında hipoksik-iskemik hasarı azalttığı görülmüştür. 28 2.1.6.6. Ġntrasellüler Olayların AkıĢının Bloke Edilmesi Hücre ölümüne neden olan intrasellüler biyokimyasal olaylar kalsiyumun artması, serbest oksijen radikallerinin oluşumu, nitrik oksit sentezi ve apopitotik ve nekrotik hücre ölümüdür. Hipotermi bu kaskatta bir çok düzeyde etki eder ancak bu etkiler arasında en belirgin olanları serbest radikal oluşumu ve nitrik oksit sentezindeki azalmadır. Değişik H-İ modellerinde nöroprotektif olduğu gösterilen serbest radikal inhibitörleri; ksantin oksidazı inhibe eden allopürinol, siklooksijenazı inhibe eden indometazin, Fenton reaksiyonu ile hidroksil radikallerin üretimini azaltan demir şelatörleri ve lipit peroksidasyonunu inhibe eden magnezyum dur. Serbest radikal tutucularının (vitamin E, 21-aminosteroidler, idebenon) nöroprotektif etkilerinin olduğu gösterilmiştir. 9 Büyüme faktörleri ve diğer nörotrofik maddelerin somatotropik aksın nöral gelişim, nöral hasar ve hastalıklarında çok önemli olduğu artık bilinmektedir. Growth hormonun (GH) normal beyine girişi her ne kadar sınırlı ise de beyinde GH reseptörleri yaygın olarak bulunmaktadır. 29 Growth hormonun etkisi primer olarak insulin benzeri growth faktör (İGF-1) aracılığı ile olur. Growth hormon reseptörünün (GHR) beyinde yaygın olarak bulunması nöral GH aksisinin varlığını doğrulamaktadır. Son çalışmalarda 21
beyin hasarının iyileşme döneminde beyinde nöral GH ve reseptörlerinin arttığı ve nöral GH sisteminin aktive olmasının nöroprotektif olduğu görülmüştür. Endojen sistem beyinde spesifik nöronlar ve reaktif mikroglialar üzerine etkilidir. Makrofaj benzeri olan bu reaktif mikroglialar beyindeki İGF-1 in hasardan sonraki ana kaynağıdır. Growth hormon hipokampus ve talamusta; İGF-1 reseptörü az olan bölgelerde ve İGF-1 tedavisine cevapsız bölgelerde nöroprotektif etki gösterebilir. 29 Growth hormon ve growth faktörler genellikle apopitotik hücre ölümünü engellerler. Bunlar arasında İGF-1, sinir growth faktör, beyin kaynaklı nörotrofik faktör ve GH vardır. 13 Özet olarak nöral somatotropik aks hem MSS gelişimi hem de nöral hasarlanma sonrası belirgin olarak olaya iştirak etmektedir. 22
Tablo 3. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki değerli girişimler 1. Enerji kaybının azaltılması Glikoz Hipotermi Barbitürat Hiperkapni (hafif) 2. Glutamat salınımının inhibisyonu Kalsiyum kanal blokörleri Magnezyum Adenozin/adenozin agonistleri Hipotermi Serbest radikal tutucuları Lamotrijin Fenitoin 3. Glutamat alım yetersizliğinin düzeltilmesi Hipotermi 4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi NMDA reseptör antagonistlerinin (MK-801, magnezyum, ketamin, dekstrofan) verilmesi Non-NMDA reseptör antagonistlerinin (NBQX, CNQX) verilmesi 5. Lökosit/ mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu Nötropeni PAF IL-1 reseptör antagonistleri Anti-ICAM-1 antikoru Antisitokin antikorları/ilaçları 6. İntrasellüler olayların akışının bloke edilmesi Hipotermi Serbest radikal sentez inhibitörleri (allopürinol, indometazin, demir şelatörleri, magnezyum) Serbest radikal tutucuları (vitamin E, 21-aminosteroidler) NOS inhibitörleri/tutucuları (nitroarjinin deriveleri) Büyüme faktörleri, İGF-1, beyin kaynaklı nörotrofik faktör, GH, sinir growth faktörü içeren anti- apopitotik ajanlar Monosialogangliosidler (GM-1) 23
2.2 Kaspazlar; programlanmıģ hücre ölümlerinde anahtar oyuncular Apoptosisle ilgili araştırmalar, kaspazların temel rollerini ortaya çıkarmıştır. Son günlerde kaspaz 1, kaspaz 3 ile birlikte kaspaz 8 e yönelik biyokimyasal çalışmalar; bu enzimlerin yapısını, fonksiyonunu ve spesifisitesini anlamamızı sağlamıştır. Bu çalışmalar, kaspazların biyolojik rolünün gelecekteki araştırmalarına temel sağlayacaktır ve kaspaz ile ilişkili hastalıkları tedavi etmek için öncülük edecektir. Apoptosis, çok hücreli organizmaların homeostazisi ve gelişimi boyunca istenmeyen hücreleri yok etmek için gerekli bir mekanizmadır. Oldukça karmaşık olan bu süreç, DNA fragmantasyonunu, hücresel membranlardaki değişik reaksiyonları içerir. Bu hücreler fagositozla elimine edilirler. Düzensiz hücre ölümleri, klinik hataların arttığının belirtisidir. Kanser ve otoimmün hastalıklar gibi durumlara yetersiz apoptosis neden olurken, kontrolsüz apoptosis iskemik hasarlara ve nörodejeneratif bozukluklara neden olabilir. Bu kontrol altına alınmış hücre ölüm yolları hala tamamen belirlenememesine rağmen, biyokimyasal ve genetik yaklaşımların, sistein proteazlar olan kaspazların apoptotik sürecin çeşitli evrelerinde önemli rol oynadığı fikri yerleşmiştir. Son zamanlarda, kaspazın yer aldığı iki önemli yol olduğu belirtilmektedir. İlki hücre yüzeyinin uyarılmasına dayanmakta ve ekstrinsik yol olarak bilinmektedir. Ölüm sinyalleri, tümör nekrosis faktör (TNF) gibi aynı köklü reseptörleri ve TNF reseptörüne bağlı hücresel ölüm ligandına doğru gönderilir. Ekstrinsik yolun apikal proteazları kaspaz 8 ve 10 olup, hücre içerisine doğru sinyal gönderirler. İnstrinsik yol, hücresel hasar sonucu olarak ortaya çıkar ve mitokondrindeki sitokrom c tarafından başlatılır. Bu durumda, kaspaz 9 aktive edilir. Tüm bu yollar, sırasıyla kendi spesifik hücresel proteinleri ile inaktif ya da aktif durumunda olan ölümcül kaspazların aktivasyonuna neden olur. Son yıllarda yapılan araştırmalarda kaspazların fonksiyonları ve yapısı üzerinde durulmuştur. Kaspazların substrat bölünmesi, spesifitesi, inhibisyonu, biyolojik rolü ve hastalıklardaki potansiyel rolleri ile ilgili bilgiler araştırılmaktadır. Apoptozisin tam mekanizması anlaşılamamasına rağmen apoptozis ile bağlantı kurulan en önemli olay kaspazların aktivasyonudur. Kaspazlar, (cysteine dependent 24
aspartate spesific proteases) kalsiyumdan bağımsız hücreiçi sistein proteaz sınıfının en önemli bölümünü oluştururlar. Bu endoproteazlar inaktif olarak hücre sitoplazmasında bulunurlar ve bir çoğu proapoptotiktir. Kaspaz-9, bcl-2 ailesi tarafından stimüle veya inhibe edilir. Kaspaz-2 ve kaspaz-8, TNF α gibi sitokinler tarafından aktive edilir.günümüzde kadar 14 memeli kaspazı tespit edilmiş olup, hayvanlarda bulunan kaspaz-11 ve kaspaz-12'nin insandaki karşılığı hala gösterilememiştir (Tablo 4). Kaspazlar apoptozisi aktive eden sinyaller tarafından tetiklenip, apoptozisin her üç yolunda da aktif olarak görev alırlar Tablo 4. Belli başlı kaspazlar Kaspazlar 3 subunit içeren prokaspazlar (30-50 kd) olarak sentezlenir: Bunlar NH2 terminal subunit, geniş subunit, (~ 20 kd veya p20) ve küçük bir subunittir (~ 10 kd veya p 1O). Kaspazlar biyolojik fonksiyonlarına göre 3 grupta incelenmektedir. a- Sitokin aktivasyonu yapanlar: Kaspaz -1, -4, -5, -11, -12, -13 ve -14'ü içermektedir. Sitokin sekresyonu ve inflamasyondan sorumludurlar. Ayrıca kaspaz -1, - 4, -5 tetrapeptid olup kendi kendilerine aktive olabilmektedir. b- Apoptozisi başlatanlar: Kaspaz-2, -8, -9 ve -10'u içermektedir. c- Apoptozisi yürütenler (efektör grup): Kaspaz-3, -6, -7'yi içeren efektör grup. Kaspaz 14'ün dışında tüm inflamatuar ve başlangıç kaspazları uzun bir subunite sahiptir. Uzun subunit Death Effector Domain (DED) veya Kaspaz Recruitmend Domain (CARD) kapsar. Bu alanlar prokaspazlar arasında protein-protein aracılı etkileşime neden olur ve prokaspazların aktivasyonunda önemli rol oynar. Aktif 25
kaspazların 3 boyutlu yapısı tespit edilmiş olup 2 heterodimer, 2 geniş subunit tarafından çevrelenmiş 2 komşu küçük subunitle karşı yönde bir tetramer oluşturur. Her bir heterodimer substratın bağlanması ve katalizisi için gerekli küçük ve geniş subunitler içerir (Şekil 2). ġekil 2. Kaspazların aktivasyonu 2.2.1. Apoptoziste Kaspaz-3 ün Yeri ve Önemi Kaspazlar iskemi sonrasında ve genetik kontrolle aktive olurlar. Geçici iskeminin in-vivo modellerinde kaspazları inhibe eden ajanlar yaralanmayı azaltmada oldukça etkilidir. Kaspaz-1 ve kaspaz-3 iskemide başlayan hücre ölüm ile ilgili kaskadın en önemli mediatörleridir. Chen ve ark.kaspaz-3 ün gecikmiş nöronal ölüme aracılık ettiğini rapor etmişler ve kaspaz-3 inhibitörlerinin hücre ölümü üzerine etkilerinin kaspaz-1 inhibitörlerine göre daha etkili olduğunu bildirmişlerdir. 30 Diğer kaspazlar gibi kaspaz-3 te prokaspaz olarak sentez edilir. Nöronlarda apoptotik hücre ölümü kaskadında aktif forma dönerler. Kaspaz- 3, kaspaz-6, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10 26
birlikte aktive edilir. Kaspaz-3 te kaspaz-6 ve -7 yi aktive eder. Apoptozisin efektör fazında önemli rol oynayan kaspaz-3 ün nöronal gelişim ve yaralanmada oldukça önemli olduğu gösterilmiştir. Bu proteazın bozulması nörolojik defektlere yol açar. Deneysel iskemi ve travmatik beyin hasarlanması sonucunda nöronal hücre ölümüne kaspaz-3 aktivitesi katkıda bulunur. Bu iki yaralanmada da kaspaz inhibitörleri apoptozisi azaltmakla kalmayıp ayrıca hayvanlarda fonksiyonel iyileşme ile sonuçlanmıştır. 31 DNA fragmantasyonunda, DNAase aktivasyonuna sebep olan kaspaz-3 ün direk rolü olduğu düşünülmektedir. Kaspaz-3 geni yeteri kadar açığa çıkmamış olmakla beraber kromozom 8 üzerinde lokalize olduğu bilinmektedir. Bu gen embriyonik 4. günden itibaren gelişimden sorumludur. Kaspaz-3 teki eksiklik ciddi nörolojik gelişim problemlerine hatta 3 haftalık embriyoda ölüme neden olabilmektedir. 31,32 2.2.2. Kaspazların Aktivasyonu Kaspazların en az 3 yolla aktive olduğu gösterilmiştir: Otoaktivasyon, ransaktivasyon ve non-kaspaz proteazlar ile proteoliz. Prokaspazlar düşük fakat saptanabilir bir proteolitik aktiviteye ve belli koşullar altında otoaktivasyon potansiyeline sahiptir. Prokaspazların oligomerizasyonu otoaktivasyon için gereklidir. Başlangıç kaspazları bir kez aktive olduğunda diğer prokaspazları aktive eder. Kaspaz aktivasyonu için diğer bir mekanizmada non-kaspaz proteazlar ile direk proteolizdir. Örnek olarak sitotoksik T hücre proteinazı, garanzim-b, prokaspaz-3 ve -7'nin etkin bir aktivatörüdür. Garanzim-B ayrıca prokaspaz-8, -9 ve -10 un aktivasyonunda da görev alır. Başlatıcı kaspazlar apoptotik uyarıyla başlayan ölüm sinyallerini efektör kaspazlara naklederler. Efektör kaspazlar ise ilgili proteinleri (örneğin, hücre iskeleti proteinleri aktin veya fodrin, nükleer membran proteini lamin A, DNA tamirinde rol alan poli ADP-riboz polimeraz) parçalayarak apoptotik hücre morfolojisinin meydana gelmesine neden olur. İnaktif (zimojen) formdaki kaspazlar kırılarak aktifteşir ve dimerize olurlar. Kaspaz aktivasyonu (dimerizasyonu), ya hücre yüzey ölüm reseptörlerinin aktivasyonu, ya da kaspaz-9 bağlayıcı protein olan Apaf-1'in oligomerize olmak üzere indüklenmesi ile gerçekleşir. Kaspaz ailesinin ve kaspaz inhibitörlerinin keşfi apoptotik hastalıklara 27
terapötik yaklaşımda bizleri cesaretlendirmektedir. Zira farklı kaspazlara spesifik farklı sentetik inhibitörierin yanısıra kaspaz aktivasyonunu yada kaspaz aktivitesini önleyen doğal kaspaz inhibitörleri de bulunmuştur. 33,34 Memelilerde apoptozun farklı formlarındaki ana kontrol noktası mitokondridir. Bu yüzden mitokondrinin aktivasyonu (Sitokromc'nin mitokondriden sitoplazmaya salıverilmesi) apoptotik süreçte irreversbl noktayı gösterir. Mitokondrinin aktivasyonuna yol açan en önemli faktör bcl-2 ailesidir. Hem pro-apoptotik hem de antiapoptotik üyeleri olan bu ailenin üyelerinin mitokondri üzerindeki etkileriyle, ya sitokrom-c'nin sitoplazmaya salıverilmesi gerçekleşir (apoptozisin başlaması) veya sitokromc'nin sitoplazmaya salıverilmesi baskılanır (apoptozisin inhibisyonu). Kaspaz aktivasyonunun başlaması için mitokondrinin devreye girmesi gereklidir. Apaf-1 latent sitozolik bir protein olup mitokondri tarafından salınan sitokrom-c ile bağlanarak kompleks oluşturur. Bu da inaktif prekürsör haldeki kaspaz- 9'u aktive eder. 32 (Şekil 2). 2.2.3. Mitokondri/Sitokrom-C Aracılı Apoptozis OluĢturulması Mitokondri normal şartlar altında ATP oluşturmak üzere sitokrom-c ihtiva eder. mitokondrial stres durumlarında serbest bırakılan sitokrom-c apoptotik hücre ölümünde kaspaz-3 aktivasyonu için önemli rol teşkil eder. Bu yolda mitokondri tarafından kontrol edilen apoptotik proteaz aktive edici faktör (Apaf-1) ve kaspaz-9 bulunmaktadır. Kofaktör nükleotid trifosfat (d-atp ve ATP) ile aktive edilen sitokrom-c ve apaf-1 birleşerek prokaspaz-9 u aktive eder. Aktive kaspaz-9 da kaspaz-3 ü aktive ederek diğer kaspaz kaskadının tetiklenmesini sağlar. 33 (Şekil 3). 28
ġekil 3. Mitokondri/sitokrom-c aracılı apoptozisin tetiklenmesi Sağlıklı bir hücre mitokondrisinin dış membranında Bcl-2 proteini yer alır. Bcl- 2, Apaf-1 proteininin bir molekülünü bağlar. Bcl-2 neden olduğu internal hasarla mitokondride çatlaklar oluşturarak Apaf-1 ve Sitokrom-C salınımına yol açar. Bu iki protein kaspaz-9 moleküllerine bağlanır. 33 (Şekil 4,5). ġekil 4. Apoptosom 29
Bu proteolitik aktivite kaskadı kan pıhtılaşması ve kompleman aktivasyonuna benzer. Terminal uç kaspaz-3'dür. Bu proteolitik aktivite ile sitoplazmada yapısal poteinlerin sindirimi, kromozomal DNA'nın degradasyonu ve hücrenin fagositozu sağlanır. 32-34 ġekil 5. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis oluşturulması 2.2.4. DıĢ Sinyallerle Apoptozisin Tetiklenmesi Birbirini tamamlayan ölüm aktivatörlerinin (Fas-L ve TNF) hücre yüzeyindeki Fas ve TNF reseptörlerine bağlanmasıyla sitoplazmaya kaspaz-8'i aktive eden sinyaller yayılır (Şekil 6). Kaspaz-8, kaspaz-9 gibi diğer kaspazları uyarır ve hücrenin fagositozuna yol açar. 30
ġekil 6. Dış sinyallerle apoptozisin tetiklenmesi 2.2.5. Endoplazmik Retikulum Aracılı Apoptozis OluĢturulması Son zamanlarda amiloid β nörotoksisitesine katkıda bulunan kaspaz-12 ye bağımlı endoplazmik retikulum aracılı apoptotik bir yol tarif edilmiştir. Bu yol mitokondrial/sitokrom-c ve ölüm reseptör aracılı apoptozisten farklı bir yoldur. ER, hücre içi kalsiyum dengesi ve membran proteinlerinin katlanmasını içeren bir çok süreçte kritik öneme sahiptir. Kaspaz-12, ER membranında lokalize olan ve ER aracılı apoptozis için esas teşkil eden bir kaspazdır. Kalsiyum seviyesinin ve kalpainin endoplazmik retikulumu etkilemesi ile prokaspaz-12 aktiflenir. Ayrıca kaspaz-7 salınımı ile de prokaspaz-12 salınımı arasında bir bağlantı bulunur. Aktiflenmiş kaspaz-12 sitoplazmaya yönelir. Kaspaz-9 ile karşılıklı olarak etkileşerek sitozolik kaspaz kaskadını aktive eder. Son çalışmalar, invivo ve in vitro olarak kaspaz-12 nin kaspaz- 9 u aktive ettiğini göstermiştir. 30-34 31