T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI CAG A POZİTİF HELİKOBAKTERİ PİLORİ ENFEKSİYONUNDA NOD1 E266K POLİMORFİZMİ VE KLİNİK ÖNEMİ Dr. Banu KARA YAN DAL UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Hikmet AKKIZ PROJE NO: TF2008LTP16 ADANA 2008
TEŞEKKÜR Gastroenterolojiyi bana sevdiren ve tercih etmeme neden olan sevgili hocalarım Prof. Dr. Salih Çolakoğlu, Prof. Dr. Yılmaz Ergün, Prof. Dr. Macit Sandıkcı ve Prof. Dr. Hikmet Akkız a; endoskopi ünitesindeki eğitimimde yanımda olan Doç. Dr. Yüksel Gümürdülü ye; ELİSA çalışmasında bana her türlü kolaylığı sağlayan değerli hocam Prof. Dr. Eren Erken e; patolojik değerlendirmeleri sabırla yapan değerli hocam Prof. Dr. Figen Doran a tüm emekleri ve hoşgörüleri için teşekkür ederim. Tezin laboratuvar çalışması aşamasında emek veren Aynur Bekar, Süleyman Bayram, Ersin Akgöllü ve Suzan Dinkçi ye; hazırlık aşamasında benimle çalışan endoskopi ünitesi hemşirelerinden Melahat İyiyürek ve Nafiye Kılınç a, personellerinden Ahmet Keklikçi, Gökmen Bakıner, Veli Bal ve Adnan Sevgat a teşekkür ederim. Yoğun tempomuz içinde çalışmayı güzelleştiren diğer tüm ekip arkadaşlarıma, her daim bana beni şanslı hissettiren aileme ve çalışmamın her aşamasında desteğini hep hissettiğim Prof. Dr. Hikmet Akkız a tekrar teşekkür ederim. Banu Kara (Kozat) I
İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... I İÇİNDEKİLER... II TABLO LİSTESİ... III ŞEKİL LİSTESİ... IV KISALTMA LİSTESİ... V ÖZET VE ANAHTAR SÖZCÜKLER... VI ABSTRACT-KEYWORDS... VII 1. GİRİŞ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Helicobacter Pylori... 3 2.1.1. Bakteriyal Virulans Faktörleri... 5 2.1.2. CagPAI... 9 2.1.3. HP Enfeksiyonuna İmmün Yanıt... 13 2.2. Nod1 Proteini... 16 2.2.1. Nod1 Proteini Polimorfizmi ve Kronik Enflamatuvar Hastalıklarla İlişkisi... 20 3. GEREÇ VE YÖNTEM... 22 3.1. Hasta Seçimi... 22 3.2. Endoskopi ve Histolojik Değerlendirme... 22 3.3. Serolojik Değerlendirme... 24 3.3.1. Deneyin Yapılışı... 25 3.4. Nod1 E266K Polimorfizminin Belirlenmesi... 26 3.4.1. Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler... 26 3.4.2. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Malzemeler... 26 3.4.3. Çalışmada Kullanılan Stok Solusyonların Hazırlanması... 27 3.4.4. DNA İzolasyon Yöntemi... 29 3.4.5. Nod1 Genlerinin PCR ile Çoğaltılması... 29 3.4.5.1. Nod1 E266K Polimorfizminin Genetik Analizi... 29 3.4.5.2. Çoğaltılmış DNA ların Elektroforezde Değerlendirilmesi... 32 3.5. İstatiksel Analizler... 34 4. BULGULAR... 35 5. TARTIŞMA... 45 6. SONUÇ VE ÖNERİLER... 55 KAYNAKLAR... 56 ÖZGEÇMİŞ... 65 II
TABLO LİSTESİ Tablo No Sayfa No Tablo 1. HP nin Virulans Faktörleri... 5 Tablo 2. HP nin Salınımını Tetiklediği Enflamatuvar Faktörler ve Kanser Gelişimindeki Rolleri... 15 Tablo 3. Modifiye Sydney Sınıflamasına Göre Histolojik Özelliklerin ve HP Yoğunluğunun Değerlendirilmesi... 24 Tablo 4. Primer Çiftinin Özellikleri... 30 Tablo 5. NOD1 E266K Polimorfizminin Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildigi PCR Reaksiyonu Karışımı... 31 Tablo 6. E266K Polimorfizmi İçin PCR Sıcaklıkları... 31 Tablo 7. Hastaların HP Pozitifliğine Göre Demografik Özellikleri... 35 Tablo 8. HP(+) liğinin Mide Histolojik Parametreleri ile İlgilerinin Gösterilmesi: İstatiksel Anlamlılık (p), Risk Artışı (OR), %95 lik Güvenilirlik Aralığı (GA) Değerleri... 37 Tablo 9. Hastaların CagA Pozitifliğine Göre Demografik Özellikleri... 39 Tablo 10. CagA Pozitif Hastalarda Hastalıkların Dağılımı... 39 Tablo 11. CagA Pozitifliği ile Antrum ve Korpus Atrofi, İntestinal Metaplazi İlişkisi: İstatiksel Anlamlılık (p), Risk Artışı (OR) %95 güvenilirlilik aralığı (GA) değerleri... 40 Tablo 12. A Taşıyıcılığı ve Antrum Atrofisi ile İntestinal Metaplazisi Arasındaki Karşılaştırma Değerleri43 Tablo 13. AA Homozigot Aleli Varlığı ve Antrum Atrofisi, Antrum İntestinal Metaplazisi, Korpus İntestinal Metaplazi Arasındaki Karşılaştırma Değerleri... 43 III
ŞEKİL LİSTESİ Şekil No Sayfa No Şekil 1. HP enfeksiyonuna ikincil gelişen gastroduedonal hastalıkların, gastritin farklı yerleşim bölgelerinde olmasına göre oluşan farklılıkları... 4 Şekil 2. HP virulans faktörleri ve esas etkileri... 8 Şekil 3. T4SS üzerindeki cagl proteinleri ve konakçı hücre yüzeyindeki α5β1 integrini ile etkileşimi ve hücre içine bakteriyel yapıların geçişi... 10 Şekil 4. CagA uyarısıyla oluşan, birbirleriyle etkileşen uyarılar. A. Cag A nın injeksiyonu sonrası hücrede uzama ve sinekkuşu fenotipinin oluşması B. CagA nın fosforilasyondan bağımsız sıkı bağlantıları bozması ve hücre polarite kontrolünün bozulması C. CagA nın aktive ettiği transkripsiyon faktörleri ile hücre adherensi, proliferasyonu, apopitozisinde değişiklikler oluşması... 11 Şekil 5. HP peptidoglikanı ile Nod1 bağımlı NFκB aktivasyonu ve CagA translokasyonu (IκB: κb inhibitörü)... 12 Şekil 6. Nod1 in yapısı... 17 Şekil 7. Nod1 sinyal yolakları... 19 Şekil 8. Nod benzeri reseptörlerin inflamasyonu ve hücre ölümünü tetikleme yolları... 20 Şekil 9. NOD-1 E266K Polimorfizminin Tespiti için Yapılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu sonucunun %2 lik agaroz jeldeki görüntüsü... 32 Şekil 10. PCR Tabanlı RFLP yöntemi ile Eco881 (Fermentas Life Science, USA) Restriksiyon Enzimi Kullanılarak NOD-1 Geninin E266K Polimorfizmininin analizi... 33 Şekil 11. HP pozitifliğine göre hastalıkların dağılımı... 36 Şekil 12. HP pozitif hastalarda CagA görülme sıklığı... 38 Şekil 13. Hastalardaki NOD1 polimorfizm dağılımı... 41 Şekil 14. A taşıyıcılığı ile hastalık gruplarının dağılımının karşılaştırılması... 42 IV
KISALTMA LİSTESİ CagA : Sitotoksin ilgili gen A Cag PAI : Cag patojenite adası. E : Glutamik asit. HP : Helikobakter pilori. Hsp : Isı şpk proteini. HOP : Dış membran proteini. hbd2 : Human β defensin 2. IL : İnterlökin. INF : İnterferon. K : Lizin. MALT : Mukozaya eşlik eden lenfoid doku lenfoması. MMP : Metalloproteinaz. NF-κB : Nuclear factor κb. Oip A : Dış membran enflamatuvar proteini. ORF : Açık okuma kodonları. PAMPS : Patojene eşlik eden moleküler kalıplar. PRRs : Patojen tanıma reseptörleri. RICK : Recruit receptor-interacting serin/threonin kinase. SH2 : Src benzeri 2. T4SS : Tip 4 sekresyon sistemi. TNF : Tümör nekroz faktörü. TLR : Toll benzeri reseptörler. VacA : Vakuolize edici toksin. V
ÖZET CagA Pozitif Helikobakteri Pilori Enfeksiyonunda NOD1 E266K Polimorfizmi ve Klinik Önemi Amaç: Helikobakter piloriye ikincil gelişen hastalıkların şiddeti enfekte bireyler arasında değişkenlik gösterir ve hem konakçıya hem de bakteriye ait faktörlerden etkilenir. Bu çalışmada NOD1 G796A polimorfizminin varlığının helikobakter pilorinin klinik presentasyonları üzerine etkisini incelemeyi amaçladık. Gereç ve Yöntemler: Üst gastrointestinal sistem endoskopisi yapılan 500 hastada HP varlığı histoloji ve hızlı üreaz testi ile araştırıldı. Helikobakter pilori pozitif hastaların serum örneklerinde CagA genine ait IgG antikorları ELİSA ile bakıldı. Sadece helikobakter pilori ve CagA pozitif olan hastalarda NOD1 mutasyonu çalışıldı. NOD1 G796A polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism yöntemi ile çalışıldı. Gastritin aktivite ve kronisitesi, intestinal metaplazi, atrofi varlığı ve bakterinin yoğunluğu korpus ve antrum biyopsilerinde çalışıldı. Ayrıca tedavi sonrası Helikobakter pilori varlığını test etmeye yönelik kontrolleri yapıldı. Bu parametrelerin aralarındaki korelasyona yönelik istatiksel analiz SPSS 15 paket programı ile yapıldı. Bulgular: 266 hasta helikobakter pilori pozitifdi (%53,2). 140 hastada CagA pozitifdi. (% 52,6) NOD1 796A allelini taşıyıcılığı antral atrofi (OR=13,5, % 95 GA=5,2-34,2), ve antral intestinal metaplazi (OR=2,71, % 95 GA=1,26-5,80) riskini arttırmaktaydı. NOD1 G796A tek nükleotid polimorfizm taşıyıcılığının, helikobakter pilori tedavisindeki yanıtsızlıkta önemli bir risk faktörü olduğu gösterildi (OR=4,62, % 95 GA=1,67-12,79). Sonuçlar: NOD1 G796A mutasyonu taşıyıcılığı mide epitel hücrelerinde CagA pozitif Helikobakter pilori suşlarıyla enfekte olunduğunda intestinal metaplazi ve atrofi riskini arttırmaktadır. Ek olarak, eradikasyonda başarısızlık oranını arttırmaktadır. Anahtar Sözcükler: Atrofi, CagA, Helikobakter pilori, intestinal metaplazi, NOD1 E266K polimorfizmi. VI
ABSTRACT Influence of E266K Polymorphism in The NOD1 Gene on The Clinical Outcome of Helicobacter Pylori Infection Objective: The severity of Helicobacter pylori related disease varies greatly among infected individuals and seems to be influenced by both host and bacterial factors. The aim of this study is to investigate whether the presence of the NOD1 G796A polymorphism had any influence in the clinical outcomes of helicobacter pylori. Material and Method: The presence of Helicobacter pylori was investigated using the rapid urease test and histology in 500 patients who underwent upper gastrointestinal endoscopy. Serum samples from Helicobacter pylori positive patients were tested by ELISA for IgG antibodies against CagA gene. Only Helicobacter pylori positive and CagA positive patients were considered eligible for the study. In these selected group, NOD1 G796A was detected by using polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism. Activity and severity of gastritis, atrophy, intestinal metaplasia and Helicobacter pylori density were assessed in body and antral biopsies. Also post-therapy controls for predicting the Helicobacter pylori persistance were done. The correlations of these parameters were determined by SPSS 15 packet program for statictical analysis. Results: 266 patients were Helicobacter pylori positive (% 53,2). CagA was positive in 140 patients (% 52,6). NOD1 796A allele carriers had higher risk for antral atrophy (OR=13,35, 95% CI=5,12-34,82) and antral intestinal metaplasia (OR=2,71, 95% CI=1,26-5,80). Carriage of the single nucleotide polymorphism of NOD1 G796A proved to be a significant risk factor for the Helicobacter pylori therapy failure (OR=4,62, 95% CI=1,67-12,79). Conclusions: Our results suggest that carriage of the NOD1 G796A mutation increases the susceptibility of gastric epithelial cells for intestinal metaplasia and atrophy when infected by CagA positive Helicobacter pylori strains. Additionally, increases the ratio of eradication failure. Key Words: Atrophy, CagA, Helicobacter pylori, intestinal metaplasia, NOD1 E266K polymorphism. VII
1. GİRİŞ Helicobacter Pylori (HP) enfeksiyonlarına dünyanın her yerinde rastlanmakta ve enfeksiyon persistan bir özellik göstermektedir. 1 Dünya nüfusunun yaklaşık yarısının midesinde mevcuttur. HP ile enfekte tüm bireylerde kronik gastrit gelişirken, yaklaşık %15-20 de midenin daha ciddi hastalıkları; peptik ülser, mukozaya eşlik eden lenfoid doku lenfoması ve karsinoma gelişmektedir. 2 Uemura ve arkadaşlarının 7.8 yıllık bir takip sırasında HP ile enfekte hastaların %3 de mide kanseri geliştiğini bildirmişlerdir. 3 HP e bağlı oluşan esas hasar gastritdir. Artık gastritin yaygınlığı ve dağılımının farklı klinik tablolar oluşumunda etkili olduğu bilinmektedir. Üç tip klinik presentasyon tanımlanmıştır: Basit veya benign gastirit (Mide asit sekresyonunda minimal azalma mevcut olup, hastalar genellikle semptomsuzdurlar ve ciddi bir gastrointestinal hastalık gelişmez.); Duedonal ülser fenotipi ( Enfekte kişilerin %15 de gelişir. Gastrit antrumda belirgin olup, korpus mukozasında asit yapımı devam etmektedir. Bu hastalarda yüksek asit yapımı ve gastrin seviyesi mevcuttur. Bu hastalarda peptik ülser gözlenmektedir.) ve en ciddi tip olarak mide kanseri fenotipi (Midede korpusta gastrit belirgindir. Hipo veya aklorhidri mevcuttur.). 1 Enfekte bireylerdeki hastalığın ciddiyetinin, hem konakçıya ait hem de bakteriye ait faktörlere bağlı olduğu gösterilmiştir. 4 HP e ait virulans faktörlerinden; özellikle sitotoksin ilgili gen A (CagA) nın daha ciddi doku hasarına neden olduğu, artmış duedonal ülser ve mide kanser riski oluşturduğu epidemiyolojik çalışmalar ile gösterilmiştir. 5-7 CagA nın hücrelerde değişiklik yapabilmesi için bakteriden translokasyonu gerekmektedir. Burada da devreye Cag patojenite adası (Cag PaI) olarak adlandırılan 30 kadar genden oluşan yapı devreye girmektedir. Cag PaI tarfından kodlanan tip 4 sekresyon sistemi ile CagA epitel hücresi içine enjekte edilmektedir. 8 Fischer ve arkadaşlarının yaptığı çalışma ile, sadece Cag PaI içeren HP suşlarının hücre iskelet değişiklikleri ve nuclear factor- κb (NFκB) bağımlı inflamasyonu mide epitel hücrelerinde yapabildiği gösterilmiştir. Bu çalışmada CagA yokluğunda da IL-8 ve NFκB aktivasyonun olabildiği gösterilmiştir. 9 Viala ve arkadaşlarının sonrasında yaptıkları çalışmada da Cag PaI pozitif suşların sahip oldukları tip 4 sekresyon sistemi (T4SS) ile hücre içine peptidoglikan geçişi olduğu ve bununla da Nod1 üzerinden NFκB aktivasyonunu başlattığı gösterilmiştir. 10 1
Nod1 hücre içi patojen tanıma moleküllerinden olup, bakteriyel peptidoglikan yapıları tarafından uyarılmaktadır. 11 Nod1 hücre içinde patojeni tanıdıktan sonra, NFκB aktivasyonunu uyarmakta ve sonrasında inflamasyon öncüsü sitokinlerin salınımı artmaktadır. 12 Viala ve arkadaşlarının daha önce de belirtilen çalışmalarında, Nod1 eksikliği olan farelerde, olmayanlara göre HP enfeksiyonuna yatkınlığın arttığı gösterilmiştir. 10 Ayrıca Fritz ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada da, Nod1 in peptidoglikan ile uyarılmasının, IL-12 salınımı ve T helper immün cevaplarını başlatması ve dolayısıyla edinsel immün yanıtı oluşturabilmesi için gerekli olduğu gösterilmiştir. 13 HP e karşı konakçının yanıtında doğal bağışıklık sisteminin önemi aşikardır. Konakçının genetik yatkınlığı ile ilgili yapılan çalışmalarda; IL-1, IL8 ve metalloproteinazlar gibi inflamasyonun başlamasından sonra devreye giren sitokinler çalışılmış ve bunlar ile hastalığın şiddeti arasında ilgi kurulmuştur. 14 Ama bağışıklık sisteminin ilk etkileşim noktası olan patojenin tanındığı ve epitel hücre değişikliklerinin başladığı kısım ile ilgili bilgiler henüz net değildir. Cag PaI içeren suşların daha patojen oldukları artık kabul edilen bir bilgi olduğuna göre, bu suşlar ile konakçı etkileşiminde, diğer suşların sahip olmadığı Cag PaI ile kodlanan T4SS ve dolayısıyla hücre içine aktarılan peptidoglikanın tetiklediği Nod1 yolağının önemi ortaya çıkmaktadır. Nod1 geni kromozom 7p14 üzerinde olup, mutasyonları ile enflamatuvar barsak hastalıkları, astım, atopik egzama, sarkoidoz arasında ilgi bulunmaya yönelik çalışmalar yapılmıştır. 15 Nod1 geninin E266K mutasyonu ile proteinin nukleotid bağlayan parçasında aminoasit değişikliğinin olduğu gösterilmiş ve bu polimorfizm ile enflamatuvar barsak hastalıkları arasındaki ilgi araştırılmış 16. HP enfeksiyonu yöremizde % 93,4 gibi yüksek bir sıklıkta görülmektedir. 17 Ayrıca Adana bölgesini içeren başka bir çalışmada da CagA, HP ile enfekte hastalarda % 97,7 gibi yüksek bir oranda saptanılmıştır. 18 Tüm bu bilgilerin ışığında, çalışmamızda bölgemizde yüksek prevelansda görülen CagA pozitif HP suşları ile enfekte olan hastalardaki hastalığın şiddeti ile bu kişilerde bakılacak olan Nod1 E266K mutasyonu arasında olası bir ilgi varlığını saptamayı amaçladık. 2
2. GENEL BİLGİLER 2.1. Helicobacter Pylori Helicobacter pylori (HP), kıvrık spiral veya çomağımsı şekilli, yuvarlak uçlu gram negatif bir bakteridir. Yapılan çalışmalarla, HP nin yalnızca gastrik tip epitele yerleştiği belirlenmiştir. HP nin yalnızca mikroaerofil koşullarda üreyebilmesi ve bunun yalnız gastrik epitelde olması bu seçiciliğin belkide en temel nedenidir. 19 HP enfeksiyonlarına dünyanın her yerinde rastlanmakta ve enfeksiyon persistan bir özellik göstermektedir. Gelişmiş ülkelerde prevelans, 60 ve daha yukarı yaşlarda %50 kadardır. İnsidans yaşa paralel olarak artmaktadır. Gelişmekte olan ülkelerde 30 yaşına kadar olanların % 70-90 ı seropozitif bulunmuştur. 20 Türkiye de farklı çalışmalarda HP % 34,4-93,4 arasında değişen oranlarda izole edilmiştir. 20-23 Tüm enfekte bireylerde semptomatik olmayan histolojik kronik gastrit gelişirken, sadece % 15-20 vakada daha ciddi klinik tablolar; peptik ülserasyonlar, mide kardiya dışında lokalize adenokarsinoması ve mukozaya eşlik eden lenfoid doku lenfoması (MALT) gelişmektedir. 1,24,25 HP konağın midesindeki yerleşim lokalizasyonuna göre farklı klinik tablolara neden olmaktadır. Bazı hastalarda antrumda belirgin mukozal enflamasyona yol açmakta ve artmış asit sekresyonu ile duedonal ülser gelişimine neden olmaktadır. Antroduedonal geçiş bölgesindeki ph ın 2.5 in altına düşmesi ile bu bölgede oluşan mide metaplazisi şeklindeki histolojik değişikliklerde duedonal ülser gelişimine yardımcı olmaktadır. Diğer bir hasta grubunda da pangastrit veya korpusta belirgin gastrit yapmaktadır. Bu vakalarda da değişik derecelerde mukozal atrofiyi takiben asit sekresyonunda azalma ve gastrik ülser veya metaplazi ve displaziyi takiben kanser gelişimine neden olmaktadır. En sık görülen klinik tutulumu olan semptom vermeyen hafif gastrit tablosu ile de karşımıza çıkmaktadır (Şekil 1). 1,14 HP ile enfekte bireylerde gelişen farklı klinik tablolar konakçı ve bakteriye ait faktörlerle ilgilidir. HP genomu oldukça dinamik olup; farklı çeşitlilikte, her biri farklı genom diziliminde, birbirinden farklı suşlar oluşturmaktadır. Hatta tek bir suş bile çok sayıda varyant oluşturup, konakçının ortamına uzun dönem kolonizasyon için uyum sağlayacak şekilde davranmaktadır. Bu genomik plastisiteye bağlı olarak HP farklı derecelerde patojenite yapmaktadır. 26-28 Mide içi asiditesinde azalma HP nin mide proksimaline doğru migrasyonunu sağlamaktadır. 29 Proton pompa inhibitörü alan 3
hastalarda ve peptik ülser hastalığı nedeniyle asit azaltmak amaçlı cerrahi vagotomiye giden hastalarda gastritin proksimale doğru kaydığı gösterilmiş. 18 Daha önce bahsedildiği gibi HP mide mukozasında kronik enflamasyonu başlatarak hasar yapmaktadır. Bu enflamasyon, enflamasyon öncüsü ve karşıtı sitokinler tarafından yönlendirilmektedir. Genetik polimorfizmler direk olarak bireyler arası sitokin cevabının değişkenliğini etkilemekte ve bu da bireylerde farklı kliniklere neden olmaktadır. 1 HP enfeksiyonunda en önemli genlerin doğal ve bağışık yanıttaki immün cevabı başlatanlar olduğu aşikardır. 30 Ama bu genlerin fazlalığı nedeniyle öncelikle midede oluşan patolojilerin mide asidi ile ilişkisinden dolayı hem pro-enflamatuvar etkisi olan, hem de mide asidini inhibe eden faktörler incelenilmiş. İnterleukin-1β, TNFα, metalloproteinazlar (MMP-7 ve MMP-9 özellikle) ile yapılan mutasyon 14, 31-33 çalışmalarında mide adenokanseri ve mide ülseri arasında ilişki saptanılmış. Ayrıca anti-enflamatuvar bir sitokin olan IL-10 ile nötrofil ve lenfositlerin enflamasyon bölgesine gelmesini sağlayan IL-8 polimorfizmlerinin de enflamasyon şiddetini direk etkiledikleri gösterilmiş. 7,28 HP enfeksiyonu Antrumda belirgin gastrit Klinik hastalık yok Korpusta belirgin gastrit Hipergastrinemi Asit salınımında azalma Asit salınımında artma Mukozal inflamasyon ve Atrofi Duedonal ülser Gastrik ülser ve kanser Şekil 1. HP enfeksiyonuna ikincil gelişen gastroduedonal hastalıkların, gastritin farklı yerleşim bölgelerinde olmasına göre oluşan farklılıkları. 4
2.1.1. Bakteriyal Virulans Faktörleri HP nin virulans faktörleri kolonizasyonu sağlayıcı faktörler ve doku hasarından sorumlu faktörler olarak iki gruba ayrılır (Tablo 1). 34 Mide asidi ve peristaltizmi normalde insan midesine bakteriyal kolonizasyonu inhibe eder. HP nin unipolar 5 veya 6 flagellası ph ın düşük olduğu mide lümeninden, büyümesine olanak sağlayacak ph ın nötrale yakın olduğu mukus tabakasına doğru hızlı hareketini sağlar. 34 HP çok miktarda sitoplazmik ve hücre yüzeyine eşlik eden üreaz sentezler. Üreaz üreyi amonyak ve karbondiokside çevirerek, bakteriyi mide asidinden korur. 1 Ama üreaz negatif HP nin duedonal ülserli hastalardan kültüre edilmesi ve HP nin üre içermeyen asidik ortamlarda da yaşayabilmesi üreaz dışında da asidik ortamlara adaptasyonunu sağlayacak başka mekanizmalarının da olduğunu göstermektedir. 35 Tablo 1. HP nin Virulans Faktörleri Kolonizasyon sağlayıcı faktörler: Flagella Üreaz Adezyon faktörleri Doku hasarından sorumlu faktörler: Lipopolisakkaritler Lökosit aktive edici faktörler Vakuolize edici sitotoksin (VacA) Sitotoksin ilişkili antijen (CagA) Dış membran enflamatuvar proteini (OipA) Isı şok proteinleri (HspA, HspB) Fagositoz, bakterilere karşı en önemli savunmalardan biri olmasına rağmen HP fagositoz ile öldürülmekten kaçabilmektedir. Çok sayıda bakteri bir fagozom içinde hatta bunlarında birleşmesiyle bir megazom içinde yaşamakta ve korunma kalkanı altında nişte enfeksiyonun devamlılığını sağlamaktadırlar. Üreaz bu megazom formasyonuna katılmaktadır. HP ayrıca NADPH oksidaz aktivitesini bozarak, fagosit 5
haynaklı ölümden kurtulmaktadır. NADP oksidaz moleküler oksijeni superoksid anyonlara katalizlemekte ve hücre dışı zararlı serbest oksijen radikalleri salınımına neden olmaktadır. HP katalaz aktivitesi ile bunlardan da korunmaktadır. 36 HP nin mide epiteline adezyonu hastalığın oluşabilmesi için gereklidir. HP e ait çok sayıda Hop (Dış membran proteinleri) proteini adezyon faktörleri olarak tanımlanmıştır. Bunlar arasında; BabA, SabA, OipA, AlpA ve AlpB bulunmaktadır. Fakat HP patojenitesindeki gerçek rolleri kesin bilinmemektedir. 27 Mahdavi ve arkadaşları sialyl-dimeric-lewis(x)(le(x)) glycosphingolipid i HP için reseptör olarak göstermişler ve insan ile maymun mide mukozasında sialyl-le(x) antijenlerinin ekspresyonu ile bakteriyel kolonizasyonun arttığını göstermişlerdir. Bu antijenlere de bağlanmak için gerekli olan adezin, SabA olarak belirlenmiştir. BabA mide epitel hücresinde varolan kan grubu antijeni Lewis-b e bağlanmaktadır. OipA, dupa, BabA, RNA polimeraz alt ünitesi enflamasyonu tetikleyen sitokinlerin salınımı ile etki etmektedirler. 35 Mide enflamasyonunun şiddeti, HP nin hem lokal enflamasyon öncülü etkileri hem de oluşturduğu lokal ve sistemik immün cevaplardan etkilenir. HP nin en önemli ve enflamasyonu uyarmadaki rolü en iyi bilinen virulans faktörü sitotoksin ilişkili gen patojenite adası (Cag PaI) ve ürünlerinden CagA dır. Cag PaI pozitif olan HP suşlarının hepsinde CagA eksprese edilmektedir. CagA ekspresyonu yapan suşlar daha ciddi doku hasarı yapmakta, peptik ülser, mide adenokarsinoması, midede MALT lenfoma riskini arttırmaktadırlar. 37,38 Epidemiyolojik çalışmalar HP enfeksiyonunun intestinal ve diffüz histolojik tipteki mide kanserini sırayla 3 ve 6 kat arttırdığını göstermektedir. CagA pozitif suşların negatif olanlara göre daha belirgin mide mukozası enflamasyonu yaptıkları ve daha fazla atrofik gastrite yol açtıkları gösterilmiştir. 7,39,40 Şekil 2 de gösterildiği üzere, Cag PaI tip 4 sekresyon sistemini (T4SS) kodlamakta ve T4SS den transloke olan CagA, konakçıya ait protoonkogen özelliği olan tirozin kinaz grubuna ait src kinazları ile fosforlandıktan sonra bir tirozin fosfataz olan, SHP-2 ile etkileşmekte ve mitojen aktive edici kinaz sinyalini uyararak mide epitelyal hücrelerinde anormal proliferasyon ve harekete neden olmaktadır. Ayrıca fosforile olan CagA Crk proteinlerine bağlanarak epitelyal bağlantıları bozmakta ve doku hasarına neden olmaktadır. 41 6
Murata Kamiya ve arkadaşları CagA nın fosforilasyondan bağımsız olarak E- cadherin ile bağlantı kurabileceğini ve bu bağlantının E-cadherin ile β-catenin arasındaki yapıyı bozarak β-catenin in çekirdekte birikmesine neden olacağını bildirmişlerdir. Uygunsuz β-catenin birikimi de intestinal metaplazide rol alan CDX1 transkripsiyon faktör gibi faktörleri kodlayan genleri aktive edeceğini belirtmişlerdir. 42 Mimura ve arkadaşları da CagA nın sadece tirozin fosforilasyonu üzerinden hücre üzerinde etki yapmadıklarını, growth faktör reseptör bağlayıcı 2 (Grb2) e bağlanarak Ras/MEK (mitojen aktive edici kinaz kinazı)/hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz (ERK) yolaklarını aktive ettiklerini ve sonuç olarak hücresel ayrılma ve proliferasyona yol açtığını göstermişlerdir. 43 Ayrıca CagA nın N ucu epitelyal hücrelerin birleşim yerlerindeki proteinler; ZO-1, JAM, E-Cadherin gibi, ile kompleksler oluşturup, epitel hücreleri arası adezyonu bozar. Hücreler arasındaki polaritenin bozulması ile transforme karsinoma hücrelerinde olduğu gibi epitelyal hücreler arası adezyon kontrolü bozulur. 1 HP vaca geni tarafından sentezlenen vaca proteini de patojenitesinde rol alan diğer bir ürünüdür. VacA epitelyal hücrelerde enflamasyon öncüsü sitokin salınımından daha ziyade hücre hasarı yapmaktadır. VacA PTP zeta/beta reseptörlerine bağlanarak, mide epitelinde anormal sinyal oluşumu ve ayrılmaya yol açmaktadır. Hücreler arası geçirgenliğin artışı ile organizmanın ihtiyaçlarına daha rahat ulaşabilmesine neden olmaktadır. 35,44 7
Sekrete edilen toksin Delik oluşumu Diğer transloke olan bakteriyal birleşenler Hücre bağlantılarına etkiler Hücre iskeletinde değişiklikler Epitel hücresi Proliferasyon İnflamasyon öncüsü sitokin salınımı İNFLAMASYON Şekil 2. HP virulans faktörleri ve esas etkileri VacA nın en iyi bilinen etkisi endozomal olgunlaşma üzerinedir. VacA geç endozomal veziküllerin membranlarına yapışır, klor kanal aktivitesi olan porlar oluşturarak ozmotik şişmeye neden olur. Ve sonuç olarak anormal sinyal sonucu mide ülserasyonu gelişir. 27 Vac A geni tüm HP suşlarında bulunmakla beraber sitotoksin oluşturma yeteneği hepsinde bulunmamaktadır. 42 OipA ve dupa fonksiyonları net bilinmemekle beraber, sitokin salınımını ve enflamasyonu uyarmaktadırlar. 40 8
2.1.2. Cag PaI Cag PaI HP kromozomunda bulunan yaklaşık 40 kb büyüklüğünde 30 kadar gen grubundan oluşmuştur. HP suşlarının %50-70 de Cag PaI mevcuttur. 38 Cag PaI HP nin esas virulans faktörlerinden birisidir. Cag PaI üzerinde yer alan CagA geni tarafından 120-145 kda büyüklüğünde CagA antijeni sentezlenmektedir. 45 CagA proteini ile peptik ülser hastalığı, mide kanseri ve MALT lenfoması arasında pozitif bir ilişki vardır. Cag PaI + olan suşlarda bu hastalıklara yakalanma riski artmaktadır. 46-49 Cag PaI + suşlarda in vivo daha belirgin fenotipik değişiklikler, örneğin IL-8 sekresyonunda artma olmaktadır. 50 IL-8 deki uyarılma dışında in vitro olarak Cag PaI + olan HP suşları mide epiteline yerleştirildiğinde başka cevaplarda gözlenmiş: (i) Rho GTPaz lardan Rac1/Cdc42 aktivasyonu ve hücre motilitesinin uyarılması; (ii) NF-κB ve AP-1 transkripsiyon faktörlerinin uyarılması; (iii) Epidermal growth faktör reseptörü ve c-met gibi bazı reseptörlerin fosforlanarak aktive edilmesi; (iv) Protoonkogenlerden c-fos ve c-jun aktivasyonu; (v) Konakçı hücresinde aktin hücre iskeletinin tekrar organizasyonu ile sinekkuşu fenotipinde hücrelerin oluşması. Sonuç olarak Cag PaI + HP, mide epitel hücrelerinin çoğalma ve apopitozisini etkiler. 51,52 Cag PaI, Cag1 ve Cag2 olarak iki bölgeye ayrılır. Cag1 ve Cag2 de en az 14-16 kadar açık okuma kodonları (ORFs) bulunmaktadır. Cag PaI içindeki bazı ORF lerin, gerekli proteinleri kodlayarak Bordetella pertussis toxin sekresyon sistemine benzer tip 4 sekresyon sistemini (T4SS) oluşturduğu saptanılmıştır. 46 T4SS bakteri yüzeyinde bir pili yapısı gibi görünmektedir. İçerisinde membranla korunan bir sekresyon kanalı ve moleküler şırınga görevi gören hücre dışı bir pili bulunmaktadır. 53 HP T4SS aparatı VirB/D ve benzerlerini içeren 32 protein ve CagL gibi fonksiyonları henüz bilinmeyen proteinler içermektedir. Konakçı ile karşılaşılmadığında CagL bakteri yüzeyine hatta T4SS pilisi yüzeyine yayılmaktadır. İnfeksiyon sırasında HP konakçı hücresine yaklaşmakta ve yüzeyde yerleşmiş olan CagL transmembran reseptör olan integrin α5β1 e bağlanmaktadır. 54 Bu, bağlantı pilini uzamasını bilinmeyen bir mekanizmayla uyarmaktadır. Ve buradan konakçı hücre içine bakteriyal patojen proteinler geçmektedir (Şekil 3). 55 Cag PaI daha önce de belirtildiği gibi bakteriyel ürünlerin konakçı hücrelerine geçişini sağlayan tip 4 sekresyon sistemini (T4SS) kodlamaktadır. CagA bu bakteriyel 9
ürünlerden biri olup, hücre içine girince, Src ailesi kinazlar ile fosforilasyona uğramaktadır. 56 Helikobakter pilori Konak hücre stoplazması Şekil 3. T4SS üzerindeki cagl proteinleri ve konakçı hücre yüzeyindeki α5β1 integrini ile etkileşimi ve hücre içine bakteriyel yapıların geçişi. 10
CagA fosforilasyonu sonrası epitel hücre sitoplazmasında ökaryotik fosfataz olan ve sitoplazmik Src-benzeri 2(SH2) domain içeren tirozin fosfataz ı aktive etmektedir. 57 Böylece konakçı hücre proteinlerinde defosforilasyona ve hücresel morfolojik değişikliklere yol açmaktadır (Şekil 4). 55 Daha önce belirtildiği üzere de tirozin fosforilasyonundan bağımsız olarak da hücre değişiklikleri ve proliferasyonuna neden olmaktadır. 42-43 A. Büzüşme B. Hücre sıkı bağlantılarında bozulma C. Transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu Artmış hücre motilitesi Hücre polaritesinde kaybolma Proliferatif, proinflamatuvar, pro-apopitotik gen ekspresyonu. Şekil 4. CagA uyarısıyla oluşan, birbirleriyle etkileşen uyarılar. A. Cag A nın injeksiyonu sonrası hücrede uzama ve sinekkuşu fenotipinin oluşması B. CagA nın fosforilasyondan bağımsız sıkı bağlantıları bozması ve hücre polarite kontrolünün bozulması C. CagA nın aktive ettiği transkripsiyon faktörleri ile hücre adherensi, proliferasyonu, apopitozisinde değişiklikler oluşması. T4SS den bakteriyel yapıların geçişi, epitelyal hücrelerde enflamasyon öncüsü sitokin salınımı ve mide enflamasyonunun uyarımında esas başlatıcı etkendir. 48 11
Cag PAI içeren suşların yoğun IL-8 ekspresyonuna neden oldukları gösterilmiştir. 9 CagA β-katenin aktivasyonunu uyarmakta ve IL-8 sekresyonunu uyarmaktadır. 58 In vitro çalışmalarda sadece fonksiyonel Cag PaI içeren suşların mide epitelyal hücrelerinde hücre iskeletinde değişiklikler yaptığı ve transkripsiyon faktörü NFκB bağımlı inflamasyon öncüsü cevapları uyardığı gösterilmiştir. 52 Her ne kadar HP nin hücre etkileşiminde CagA nın T4SS yolu ile hücreye girmesi ve fosforilasyonu gerekmekte ise de, CagA fosforilasyonundan bağımsız olarak NFκB aktivasyonu ve IL- 8 gibi inflamasyon öncüsü sitokinlerin sentezinin arttığı gösterilmiştir. Bu sonuçta bakteriye ait başka yapıların NFκB aktivasyonunda rolleri olabileceği sonucuna getirmiştir. 52,59 Konakçı hücrelerine Tip4 sekresyon sistemi ile giren diğer bir bakteriyel yapı da hücre içi tanıma reseptörü Nod1 ile tanınan ve NFκB aktivasyonuna neden olan peptidoglikandır (Şekil 5). 58 Şekil 5. HP peptidoglikanı ile Nod1 bağımlı NFκB aktivasyonu ve CagA translokasyonu (IκB: κb inhibitörü) 12
Viala ve arkadaşları Cag PaI tarafından kodlanan tip 4 sekresyon sistemi ile hücre içine geçen peptidoglikanın hücre içi tanıma reseptörü olan Nod1 ile tanındığını göstermişlerdir. Ayrıca mide epitel hücreleri tarafından IL-8 yapım uyarısının Nod1 yoluna bağlı olduğu gösterilmiştir. 10 Bu çalışmada Nod1 eksikliği olan farelerde Cag PAI pozitif olan HP suşlarının enfeksiyonunun Nod1 eksikliği olmayan gruba göre daha ciddi enflamasyon ve bakterinin daha fazla kolonizasyonuna neden olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlardan yola çıkılarak yapılan diğer çalışmalarda da Cag PAI pozitif olan HP suşlarına konakçının yanıtında peptidoglikanın (PGN) Nod1 ile tanınmasının önemini göstermektedir. 10,59,60 2.1.3. HP Enfeksiyonuna İmmün Yanıt HP ile enfekte konakçıda oluşan güçlü lokal immün yanıtlara karşın, bakteri yıllarca süren enfeksiyonları oluşturma kapasitesindedir. 14 Bu immün yanıtlar bakteriyi yerleştiği nişten ortadan kaldırmak yerine enfekte bireylerde görülen midedeki mukozal lezyonlara neden olmaktadırlar. HP, klasik bir gastrointestinal patojenin davranışından farklı olarak, mide epitelyal hücrelerine invaze olmaz, ama hücrelerin dış yüzeylerine adezyon gösterir. 30,61 Çeşitli çalışmalarda HP e özgül antikorların korunmada kritik rol oynamadığı gösterilmiştir. 26 HP e ikincil gastrit de Th1 tip immun cevabın dominant olduğu gözlenilmiş ve T hücrelerince üretilen sitokinlerin nötrofil ve mononükleer hücre infiltrasyonunda esas rol oynadığı öngörülmüştür. 62 HP nin mide mukozasına kolonizasyonu ile konakçının doğal savunma sistemi aktive olmakta ve sonrasında enflamasyon öncüsü ve antibakteriyel faktörlerin salınımı artmaktadır. Bunlardan; TNFα, IL-6 gibi sitokinler NFκB ve STAT3 aktivasyonunu uyarırlar ve hücre proliferasyonunu uyarıcı, apopitozisi inhibe edici etkilerini ortaya çıkarırlar. Mide epitelyal apopitozisi mukozada programlı bir fizyolojik olaydır ve hücre proliferasyonu ile bir denge içerisinde hücre döngüsünü regüle eder. Apopitozisde azalma veya hücre proliferasyonundaki artma gibi nedenlerle bu dengenin bozulması mide karsinogenezisinde önemli bir rol oynar. 41 STAT3 aktivasyonu çekirdek içi β-katenin birikimini hızlandırır. Th1 tip sitotoksik hücrelerin uyarılması ile de sitotoksik sitokin olan INF-γ yapımı uyarılır ve epitelyal hücre döngüsünün artması ile mide karsinogenezisine zemin oluşur. 7 Sitokin genlerinden salınan ürünler (IL-1β, TNF-α,IL- 13
10, IL-8) HP enfeksiyonuna karşı mide içinde kronik inflamasyona ve asiditenin azalmasına neden olmaktadırlar. (Tablo 2) 41 Bu ortam diğer tür bakterilerinde bu ortamda yaşayabilmelerine ve oksidatif/genotoksik stres oluşturmalarına neden olmaktadır. Bu da mide karsinogenezisindeki daha ileri basamaklarda, HP nin neden gerekmediğini açıklamaktadır. 63 Doğal yanıt, konakçının mikroorganizmalar üzerindeki, kendisine yabancı patojene eşlik eden moleküler kalıpları (PAMPs) tanıması ile başlar. Bakteri duvar kompenentleri, flagellalar, nükleik asit yapıları PAMPs lar arasında sayılabilir. PAMPs lar patojen tanıma reseptörleri (PRRs) tarafından tanınırlar. 64 Toll benzeri reseptörler (TLR) ve Nod benzeri proteinler PRRs i oluştururlar. TLR ler transmembran proteinler olup, Nod benzeri proteinler hücre içindedirler. 65 Cag PaI pozitif HP suşları tarafından TTS4 yolu ile epitel hücresi içine injekte edilen peptidoglikan, Nod1 tarafından tanınır ve Nod1 in tetiklediği enflamasyon süreci başlar. Nod1 in aktivasyonu ile NFκB aktive olur ve sonrasında JNK yolağının da devreye girmesiyle, Nod1 uyarılması sonrası apopitozis tetiklenir. 64 Nod1 in HP enfeksiyonundaki savunmadaki rolünün önemi, Nod1 eksikliği olan farelerde HP nin oral kontaminasyonu sonrası, diğer eksikliğin olmadığı farelere göre enfeksiyona yatkınlıklarının arttığının gösterilmesiyle anlaşılmıştır. Ek olarak, eksikliğin olduğu farelerde enfeksiyonun gelişmesinden bir ay sonra midede 100 kat fazla bakteri saptanılmıştır. 10 Ayrıca Nod1 eksikliği olan farelerde HP e karşı antijen özgül Th1 cevap verme kapasitelerinin de bozulduğu ve dolayısıyla enfeksiyonu ortadan kaldıramadıkları da başka bir çalışmada gösterilmiştir. 13 14
Tablo 2. HP nin Salınımını Tetiklediği Enflamatuvar Faktörler ve Kanser Gelişimindeki Rolleri Faktör Enflamasyondaki rolü Karsinogenezisdeki rolü IL-8 Lenfosit ve nötrofilleri tanıma. Gastrin salınımını uyararak epitelyal hücrelerde proliferasyona neden olur. NF-κB aktivasyonu ve COX-2 ekspresyonu, pro-angiogenic aktivite. IL-1β Makrofaj ve polimorfonükleer lökositlerin aktivasyonu. IL-6 salınımını uyarma, COX- 2 ekspresyonu Hipergastrinemi ve epitelyal hücre proliferasyonunu uyarır. Pro angiogenic aktivite. Matrix metalloproteinaz sekresyonunu uyarır ve aktive eder. IL-6 Makrofaj aktivasyonu ve farklılaşması. Nötrofil fagositik aktivitesinde artış. VEGF ekspresyonu ile angiogenezis de artma Endotelyal hücrelerde ICAM-I ekspresyonunda artma, B hücre farklılaşması TNFα Makrofaj aktivasyonu ve farklılaşması. Epitelyal hücrelerde apopitozis ve epitelyal bariyerde bozulma. Mikrovasküler epitelyal hücre proliferasyonu ve yara iyileşme Hipergastrinemi ve epitelyal hücrelerde proliferasyon. NF-κB aktivasyonu ve COX-2 ekspresyonu. inhibisyonu COX-2 Damar geçirgenliğini arttıran prostaglandinlerin yapımını katalize eder. İnflame olan dokuya hücre migrasyonunu Anti-apopitotik aktivite. İmmunite ve tümör immunolojik savunmasını IL-10 ile yapar sağlar.yara iyileşmesi. Reaktif oksijen ürünleri DNA hasarı ve bakterinin öldürülmesi DNA hasarı. Mutasyon. Konakçı sinyal yollarının aktivasyonu ve angiogenezis. Nitrik oksid DNA hasarı ve bakterinin öldürülmesi Doku DNA hasarı, mutasyon, DNA tamir mekanizmalarının inhibisyonu, apopitozis inhibisyonu, Angiogenik aktivite. 15
Farklı çalışmalarda TLR2, TLR4, TLR5ve TLR9 HP enfeksiyonlarına bağlı enflamasyon öncüsü gen ekspresyonlarında çalışılmış, ama rolleri konusunda henüz netliğe ulaşılamamıştır. 66-70 Achyut ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada TLR-4 ün Thr399lleu varyasyonunda bakteri lipopolisakkaritlerine karşı doğal bağışık yanıtın azaldığı ve dolayısıyla bakterinin mide ortamında daha uzun süre kaldığı gösterilmiş. Bu çalışmaya göre, süregen enfeksiyon IL-8 gibi kemoatraktan proteinlerin artmış ekspresyonuna ve epitel hücre hasarı ile mide epitelinde serbest radikallerin artışına neden olmakta, mide kanser öncüsü lezyonlarına özellikle de kronik gastritden, atrofik gastrit ve metaplaziye geçişte zemin hazırlamaktadır. 66 Defensinler de HP e karşı oluşan immun yanıtın içindedirler. Human-β defensin 2 (hbd2), nötrofil kaynaklı alfa defensinler 1,2 ve 3 HP ile enfekte kişilerin mide sıvısında artmış düzeydedirler. 41 Boughan ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada da hbd2 nin mide epitelyal hücrelerinde ekspresyonunun Nod1 ve CagPaI bağımlı olduğu gösterilmiştir. 71 HP mide epiteline yapışınca, epitel hücresinden salınan sitokin ve kemokinler granülositlerin, monositlerin ve lenfositlerin enflame mukozaya gelmesine neden olurlar. İnfiltre eden hücrelerin yoğunluğu arttıkça da daha ciddi enflamatuvar patolojiler oluşur. 72 HP de mevcut olan farklı bileşenler de nötrofil ve diğer enflamatuvar hücreleri uyarırlar. Örnek verecek olursak; HP ısı-şok proteini monositlerden TLR-2 yoluyla IL-8 salınımını uyarır. 69 HP nötrofil aktive edici protein endotel hücrelerine nötrofil adezyonunu sağlar, reaktif oksijen radikallerinin yapımını, doku faktörü ve plasminojen aktivatör inhibitörü salınımını uyarır. 73 2.2. NOD1 Proteini Doğal bağışıklık sistemi mikroplarda bulunan belirli molekülleri tanımakta ve patojenlere karşı konakçının savunma sistemini uyarmaktadır. Bu patojen tanıyıcı reseptörler: membrana bağlı TLRs, sitozolde bulunan Nod benzeri reseptörler ve RIG-1 aile proteinleridir. Bu üç reseptör grubu doğal ve edinsel bağışıklık cevaplarını hücre içi sinyal yolaklarını uyararak, p38, c-jun NH2-terminal kinaz, hücre dışı sinyal regüle edici kinazlar, caspase-1 ve NFκB ve/veya IRFs aktivasyonuna yol açıp kontrol ederler. 74 16
Nod benzeri reseptör protein ailesinde 20 den fazla üye, örneğin; Nod1, Nod2, cryopyrin, Ipaf, NAIP, NALP1 vardır. 74 Nod1, caspase-recruitment domain 4 geni (CARD4) tarafından kodlanmaktadır. Nod1 proteini bir N-terminal caspase-recruitment domain (CARD), santral yerleşimli bir nukleotid bağlayıcı oligomerizasyon kısmı (NOD) ve çok sayıda c-terminal lösinden zengin tekrar bölgeleri (LRR) içerir. NOD kısmı ATPaz aktivitesine de sahiptir (Şekil 6). 75 CARD NOD LRR-KISIM Şekil 6. Nod1 in yapısı. Nod1 antijen sunucu hücreler ve epitel hücreleri tarafından eksprese edilir. Peptidoglikan kaynaklı muropeptidleri tanır. Peptidoglikan, gram pozitif bakterilerin hücre duvarının esas yapıtaşlarından biriyken, gram negatif bakterilerin periplazmik bölgesinde ince bir tabaka halinde bulunur. Nod1 in bakteriyal peptidoglikanı tanıyabilmesi için bir çok gram negatif bakterinin ve bazı gram pozitif; Listeria monocytogenesis, Bacillus gibi bakterilerin aminoasit karekteristiği olan, mesodiaminopimelic acid (meso-dap) varlığı gerekir. 76 GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glumeso-DAP ve GlcNAc-MurNAc-Lala-D-Glu-meso-DAP-D-Ala muropeptidleri insan ve fare Nod1 leri tarafından tanınan ürünler olarak gösterilmiştir. Nod1 in tanıdığı en küçük yapı D-Glu-meso-DAP tır. 77 Sitozolde yerleşmesine rağmen, ekstraselüler yerleşimli Pseudomonas aeroginosa ve HP gibi bakterileri tanıdığı da gösterilmiştir. HP nin peptidoglikan ağını Cag PaI tarafından kodlanan bir muramidaz olan litik transglycosylases (HP0523) parçalar. Ortaya çıkan peptidoglikan parçaları tip 4 sekresyon sistemi ile hücre içine injekte edilince Nod1 tarafından tanınır hale gelmektedir. 77,78 Peptidoglikan parçaları sitozole girdikten sonra, Nod1 in LRR kısmı tarafından tanınırlar. Daha sonra recruit receptor-interacting serin/threonine kinase (RICK) ile CARD etkileşimi başlar. Kobayashi ve arkadaşları RICK eksikliği olan fare embriyo 17
fibroblastlarında Nod1 bağımlı NFκB aktivasyonunun bozulduğunu göstermişlerdir. Ortama RICK verildikten sonra da bozulan döngünün devam ettiğini göstermişlerdir. Bu da RICK in Nod1 yolağındaki önemini göstermektedir. 78 Sonrasında IKKγ (NFκB kinaz kompleks inhibitörü) nın RICK ile iletişimi net değildir. IKKγ, IKKα ve IKKβ içerir. IKKβ nın fosforilasyonu sonrasında NFκB serbestleşir ve çekirdeğe transloke olur. CARD6, RICK ile bağlanmada yarışarak NOD1 aktivasyonunu ve dolayısıyla NFκB aktivasyonunu engelleyebilmektedir. Ayrıca Nod 1 sinyali mitogen-activated protein kinaz (MAPKs) ları örneğin; JUN amino-terminal kinaz (JNK), ekstraselüler sinyal regüle edici kinazı (ERK) aktive eder (Şekil 7). 79 Nod1 in pro-kaspaz-1 e CARD etkileşimleri ile bağlanması, pro-kaspaz-1 oligomerazasyonunu uyarmakta ve IL-1β salınımına neden olmaktadır (Şekil 8). 80 Ek olarak, yeni tanınan bir enflamasyon öncüsü sitokin olan IL-32 in Nod1 ile etkileşime girerek IL-1β salınımını uyardığı gösterilmiştir. Nod yolağı uyarıldığında insan epitelyal hücre kültürlerinde enflamasyon öncüsü sitokinlerin (TNF-α, IL-6), kemokinlerin (CXCL8/IL8, MIP2, CCL2/MCP-1, CXCL5/ENA78) ve beta defensinin yapımının arttığı görülmüştür. Bu faktörler hücrelerin tanınması için gerekli olup, doğal immun yanıtı sağlamaktadırlar. 80,81 18
Plazma membranı Gr(-) bakteriden PGN Gr(+) bakteriden PGN Gr(-) bakteriden PGN RICK aktivasyonu Proteozom yıkımı MAPK aktivasyonu AP1 bağlayıcı bölge NFκB bağlanması İnflamatuvar gen transkripsiyonu Sitozol Şekil 7. Nod1 sinyal yolakları. 19
İNFLAMASYON HÜCRE ÖLÜMÜ Şekil 8. Nod benzeri reseptörlerin inflamasyonu ve hücre ölümünü tetikleme yolları 2.2.1 Nod 1 Proteini Polimorfizmi ve Kronik Enflamatuvar Hastalıklarla İlişkisi Nod1 in doğal bağışıklık sistemindeki önemi anlaşıldıktan sonra bu proteinin fonksiyonlarını etkileyecek olan mutasyonlar ve hastalıklarla ilişkisi araştırılmaya başlanılmıştır. Nod1 geni 7p14-p17 kromozom bantları üzerinde haritalanmıştır. (UniGene Cluster HS 19405) Bu bölgenin atopiye yatkınlık bölgesine yakınlığı 20
nedeniyle yapılan çalışmalarda; atopik ekzema ve astım ile Nod1 polimorfizmleri arasında ilgi bulunmuştur. 82,83 Bu vakalarda Nod1 in intron 9 da bir insersiyon-delesyon polimorfizmi (ND1+32656) ile hastalıklara yatkınlık arasında ilişki saptanılmıştır. Nod1 ile Nod2 arasındaki yapısal benzerlik nedeniyle, Nod2 de saptanılan mutasyonların Crohn hastalığına eşlik etmesinden yola çıkılarak, Nod1 mutasyonları ile enflamatuvar barsak hastalıkları arasında ilgi kurulmaya çalışılmıştır. Bu konudaki çalışmaların bir kısmında ilgi kurulamamıştır. 84,85 Ama Zouali ve arkadaşları enflamatuvar barsak hastalıkları ile ilgi kuramasalarda, NOD1 de E266K mutasyonunu tanımlamışlardır. Burada ki G796A polimorfizmi ile farklı bir protein kodlamakta, lysin yerine glutamik asid gelmektedir. 84 McGovern ve arkadaşları Nod1 +32656 polimorfizmi ile enflamatuvar barsak hastalıklarına yatkınlık arasında ilişki bulmuşlardır. 85 Molnar ve arkadaşları da Nod1 de E266K polimorfizmi ile Crohn arasında ilişki saptamışlardır. 86 Nod1 polimorfizmleri ile enflamatuvar barsak hastalıkları arasında ilgi araştırılırken saptanılan mutasyonlar kullanılarak, HP e bağlı farklı klinik tablolardaki etkilerine de bakılmıştır. Bu çalışmalar oldukça az sayıda olup, Hofner ve arkadaşları G796A(E266K) Nod1 polimorfizminin HP ile enfekte hastalada peptik ülser riskini arttırdığını göstermişlerdir. 87 Ama Rosenstiel ve arkadaşları gastrit şiddeti ve peptik ülser ile Nod 1 mutasyonları arasında bir ilgi gösterememişlerdir. 88 21
3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Hasta Seçimi Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Kliniği ne 2008 Şubat ile 2008 Haziran tarihleri arasında dispeptik yakınmalar ile başvuran ve endoskopi yapılarak tanı konulan 500 hasta (259 erkek, 241 kadın; ortalama yaş 48.27±9,17) çalışmaya alındı. Çalışmaya alınmadan önceki 3 ay içerisinde anti-sekretuvar, bizmut içeren bileşik ve/veya non-steroidal anti-enflamatuvar ilaç tedavisi alan; herhangi bir nedenle son 6 ay içerisinde antibiyotik tedavisi alan; son 1 yıl içerisinde HP eradikasyon tedavisi alan; 30 yaş altındaki ve 60 yaş üzerindeki hastalar; kronik organ yetmezliği olan ( Kronik böbrek, akciğer veya karaciğer hastalığı); kronik alkol ve sigara kullanımı olan; mide ameliyatı geçirmiş olan; mide dışı malignensisi bulunan hastalar çalışmaya alınmadı. Hastaların HP e yönelik tedavi alıp almadıkları ve tedaviye uyumları sorgulandı. Çalışma için Çukurova Üniversitesi Etik Kurul onayı alındı. Araştırılacak hastalar çalışma konusunda bilgilendirilerek, onayları ile birlikte rıza formları alındı. Endoskopi yapılan günün sabahı hastalardan aç karnına ELİSA ve DNA analizleri için 10cc venöz kan örnekleri alındı. 3.2. Endoskopi ve Histopatolojik Değerlendirme Üst gastrointestinal sistem endoskopisi 2.5 mg midazolam, 0.25 mg atropin intramusküler injeksiyonu ile premedikasyon ve %10 luk lidokain sprey ile lokal farinks ve hipofarinks anestezisini takiben Pentax tipi videoendoskop (Model EPK- 1000, Pentax, Tokyo, Japonya) ile yapıldı. Her hastadan küçük kurvatür ve büyük kurvatür tarafından 2 antrum ve 2 korpus biyopsileri alındı. Şüpheli malign görünümü olan lezyonlardan ek biyopsi örnekleri de alındı. Bu biyopsi örnekleri %10 luk formol çözeltisi içerisinde patolojik incelemeye gönderildi. Ayrıca incisura angularis üzerinden hızlı üreaz testi (hp fast, Grandview Avenue, USA) için beşinci örnek alındı. Testin duyarlılığı %90, özgüllüğü %98 olarak bildirilmekteydi. Alınan biyopsi örneği biyopsi forsepsi ile jele batırıldı. Oda sıcaklığında 24 saat bekletildikten sonra jel rengine bakıldı. Jel renginde değişiklik oldu (sarıdan yeşile döndü ise) ise test pozitif kabul 22
edildi. Hem patolojik olarak hem de üreaz testi ile HP varlığını gösteremediğimiz hastalar negatif olarak kabul edildiler. Hastaların mevcut hastalık durumları için; endoskopide saptanılan ülser ve kanser, histolojik olarak saptanılan gastrit sınıflamaya alındı. HP (+) olan tüm gastrit ve ülser hastalarına tetrasiklin 4x500mg, bizmut subsitrat 4x300mg, metranidazol 3x500mg, proton-pompa inhibitörü 2x1 14 gün kullanılmak üzere tedavi başlanıldı. Ülser grubunda proton pompa inhibitörü kontrol endoskopiden 2 hafta önceye kadar devam edildi. HP (+) 200 hastaya kontrol endoskopileri, tedavi bitiminden 2 ay sonra yapıldı. Diğer 66 hastanın 8 inde mide adenokanseri olduğu için kontrol yapılmadı. Geri kalan 58 hasta ise ikinci endoskopiyi yaptırmayı kabul etmediler. Kontrol endoskopide antrum ve korpustan alınan iki biyopsi örneği hızlı üreaz testi jeline batırılarak HP açısından daha önce anlatıldığı gibi değerlendirildiler. Tedaviye yanıt açısından yapılan değerlendirilmede; HP pozitifliği devam eden grup tedaviye yanıt vermeyen, diğer grup ise tedaviye yanıt veren grup olarak sınıflandırıldı. Histopatolojik değerlendirme için patoloji bölümüne yollanılan örnekler parafin bloklar haline getirilerek, 5µ kalınlığında kesitlere bölündü. Örnekler hematoksileneozin ve giemsa ile boyanılarak HP varlığı ve gastritin Modifiye Sydney Sınıflamasına göre değerlendirilmesi yapıldı (Tablo 3). 89 Bu sınıflamaya göre örneklerde HP yoğunluğu, kronisite, aktivite, intestinal metaplazi ve atrofi : 0= Normal, 1= Hafif, 2= Orta, 3= Ciddi olarak skorlandı. İstatiksel anlamlılığı arttırmak amaçlı intestinal metaplazi ve atrofi skorları var ve yok olanlar olarak değerlendirildi. Aktivite ve kronisite istatiksel anlamlılığı sağlamak için düşük skorlu (0 ve 1 i içeren) ve yüksek skorlu (2 ve 3 ü içeren) olarak sınıflandırıldı. Ayrıca Hp yoğunluğu da aynı şekilde, evre 1 (skor 1 i içeren grup) ve evre 2 (skor 2 ve 3 ü içeren grup) olarak sınıflandırıldı. Patolojik değerlendirme konuda uzman olan tek patolog tarafından yapıldı. 23
Tablo 3. Modifiye Sydney Sınıflamasına Göre Histolojik Özelliklerin ve HP Yoğunluğunun Değerlendirilmesi Özellik Tanımlama Derecelendirme Klavuzu Kronik İnflamasyon Aktivite Atrofi İntestinal metaplazi Lamina propriyada lenfosit ve plazma hücrelerinin artışı Lamina propria, yüzey epitelinde nötrofil infiltrasyonu Antrum veya korpusda özelleşmiş bezlerin kaybı Epitelde intestinal metaplazi varlığı Yoğunluğa göre hafif, orta ve ciddi. Yüzeyin 1/3 den azı infiltre ise hafif; 1/3 ile 2/3 arası infiltre ise orta; 2/3 den fazlası infiltre ise ciddi. Hafif, orta veya ciddi kayıp. Mukozanın1/3 den azı tutuldu ise hafif, 1/3 ile 2/3 arası tutulum orta; 2/3 den fazla tutulum ciddi. HP HP yoğunluğu Yüzeyin 1/3 den azını kaplıyorsa hafif, yüzeyin 2/3 nden fazlasını kaplıyorsa yoğun, her ikisi arasında ise orta derecede kolonizasyon. 3.3. Serolojik Değerlendirme Endoskopi yapıldığı gün hastalardan serum örnekleri alınarak, -20 0 C de inceleme yapılacak güne kadar saklandılar. HP pozitif olan hastalarda CagA proteinine özgül antikor varlığını saptamak için mikroelisa kiti (CagA IgG, DIA.PRO, Milano, İtalya) kullanıldı. Kitin bildirilen duyarlılığı >%98, özgüllüğü >%98. 24
3.3.1. Deneyin Yapılışı Çalışmaya başlamadan önce serumlar oda sıcaklığına alınarak erimeleri sağlanıldı. Kit buzdolabından çıkarıldı ve oda ısısına gelmesi için 30 dakika beklenildi. 1- Yıkama solusyonu konsantresi 20X oranında distile su ile dilue edilerek hazırlandı. 2- Serum örnekleri 1:101 oranında (1000µl örnek dilue edici ve 10 µl örnek karıştırılarak) dilue edildi. Kalibrasyon örnekleri hazır durumda oldukları için dilue edilmediler. 3- Elisa plağının ilk kuyucuğu (blank) hariç tüm kuyucuklara sırasıyla her birinden 100µl kalibratörler, kontrol serum ve dilue edilmiş örnekler konuldu. Toplam test sayısı 96 olup, kullanılan kalibratör, kontrol serum ve blank testleri sonrası 88 örnek çalışıldı. 4- Plak oda ısısında 37 o C de 1 saat bekletildi. 5-1 saatin sonunda, semiotomatik elisa yıkayıcısında, bütün kuyucuklar en az 400µl yıkama solusyonu ile 4 kez yıkandı. Son yıkamadan sonra plak ters çevrilip, kurutma kağıdı üzerinde çırpılarak kuyucuklardaki sıvı tamamen uzaklaştırıldı. 6- Blank kuyucuğu hariç tüm kuyucuklara 100µl enzim konjugat eklendi. Üzerleri kapatılarak, oda sıcaklığında 1 saat bekletildi. 7- Beşinci kademede anlatıldığı gibi tekrar yıkanıldı. 8- Tüm kuyucuklara 100 µl kromojen/substrat karışımı konuldu. Plak 18-24 o C de, karanlıkta 20 dakika bekletildi. 9- Tüm kuyucuklara 100 µl sülfirik asit eklendi. Asidin eklenmesi ile pozitif kalibratörler, kontrol serumu ve pozitif olan örnekler maviden sarıya doğru renk değiştirdiler. 10- Her kuyucuktaki solusyonun renk yoğunluğu 450 nm de mikroeliza cihazında (Bio-Tek Instruments INC, Winooski, VT, USA) otomatik olarak okunan optik densite değerleri ile çizilen grafikten örneklerin serum CagA düzeyleri arbu/ml cinsinden hesaplandı. 5 arbu/ml in üzerinde olan değerler pozitif olarak kabul edildi. 5 arbu/ml in altında olan değerlerdeki örnekler ise Cag-Ag IgG antikoru negatif kabul edildiler. 25