ÇAYDAN KATMA DEĞERİ YÜKSEK YENİ ÜRÜNLER GELİŞTİRİLMESİ

ÇAYDAN KATMA DEĞERİ YÜKSEK YENİ ÜRÜNLER GELİŞTİRİLMESİ MAM Gıda Enstitüsü Dr. Sena Saklar Ayyıldız 05.10.2016 Türkiye 12. Gıda Kongresi Edirne

Projenin Amacı Türkiye çay üreticisi ülke olmakla birlikte, çaya bağlı sanayi ürünleri Türkiye de üretilmemektedir. Gıda, ilaç ve kozmetik sektörü bu ürünleri ithal ederek kullanmaktadır. Projenin amacı Türk Çayından (mamul yeşil çay, siyah çay, yaş çay ve çay artıkları) katma değeri yüksek yeni ürünlerin geliştirilmesi, üretim yöntemlerinin pilot ölçekte belirlenmesi, çaya bağlı yeni bir sanayinin gelişmesidir: Kateşin ekstraktı Epigallokateşin gallat (EGCG) Kafein Kafeinsiz siyah ve yeşil çay Kafeini azaltılmış siyah ve yeşil çay

Proje 112G048 numaralı Çaydan Katma Değeri Yüksek Yeni Ürünler Geliştirilmesi isimli TARAL 1007 projesi tarafından desteklenmektedir. Müşteri kurum: Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, ÇAYKUR Paydaşlar : MAM Gıda Enstitüsü (kateşin ekstraktı, kafein, EGCG) Atatürk Çay ve Bahçe Kültürleri Araştırma Enst.(kafeinsiz ve kafeini azaltılmış siyah ve yeşil çay) Yeditepe Üniversitesi (sub kritik su ekstraksiyonu) Proje süresi: 2014-2016

Çay içerdiği biyoaktif bileşikler ve yüksek antioksidan özelliğiyle sağlıklı içecek olarak kabul edilmektedir. Yeşil çayın yapısında bulunan kateşinler, antioksidan özelliklere sahip olup insan sağlığına faydalı yönleriyle bilinmektedir. Özellikle kanseri, kalp hastalıklarını, obezite ve şeker hastalıklarını engelleyici özellikleri, bağışıklık sistemini güçlendirici etkileri bilinmektedir. Kateşinler gıda sanayinde fonksiyonel katkı maddesi, doğal antioksidan, ilaç sanayinde gıda takviyesi, kozmetik sanayinde çeşitli krem ve losyonlarda hücre yenilemesi ve antioksidan özellikleriyle kullanılmaktadır. Çay kateşinleri içinde bulunan EGCG, özellikle kansere karşı koruyucu özellikleriyle bilinen en önemli bileşiktir. Kafein ise kolalı ve enerji içeceklerinin önemli bileşeni, uyarıcı ilaçların önemli etken maddesidir.

Projenin Kapsamı Proje çalışmaları 2 bölümde tasarlanmıştır: 1. Bölüm: Çay ekstraksiyonu optimizasyonu: Klasik su ekstraksiyonu (lab. ölçekli, pilot ölçekli) Ultrasound yardımıyla ekstraksiyon Sub kritik su ekstraksiyonu Kateşin ekstraktı geliştirilmesi 2. Bölüm: Kateşinlerin, EGCG ve kafeinin: Laboratuvar ölçeğinde ayrılması ve saflaştırılması, lab ölçekli üretim Pilot ölçekte ayrılması ve saflaştırılması, pilot ölçekli üretim Raf ömrü çalışması

Çay ekstraksiyonu optimizasyonu Çay 5 lt. kapasitede erlen içinde, çalkalamalı su banyosu ile ekstrakte edilmiştir. Sıcaklık, süre ve su:çay oranı bağımsız değişkenler olarak seçilmiştir. Ekstraksiyon koşulları Yüzey Tepki Yöntemi (Response Surface Methodology, RSM) kullanılarak, 3 faktörlü, merkezi kompozit tasarım yapılarak optimize edilmiştir. Bağımsız işlem değişkenleri ve RSM seviyeleri Bağımsız değişkenler Semboller RSM seviyeleri -1.682-1 0 +1 +1.682 Sıcaklık, C T 72 75 80 85 88 Süre, dak. t 5 15 30 45 55 Su: çay oranı, ml/g S 12 15 20 25 28

Kateşin( -GA, -GC,-EGC, -C, -EC, -EGCG, -GCG, -ECG) miktarları ve kafein ISO 14502-2:2005 nolu "Content of catechins in green tea-method using high performance liquid chromatography" isimli standart analiz yöntemine göre belirlenmiştir. Kolon: Eclipse Plus Phenyl-Hexyl HPLC kolon Mobil faz A: %9 acetonitril, %2 asetik asit, 20 µg/ml EDTA Mobil faz B: %80 asetonitril, %2 asetik asit, 20 µg/ml EDTA Akış Hızı : 1 ml/dk. Detektör : UV Detektör. Dalga Boyu : 278 nm Sıcaklık : 35 O C± 0,5 C Enjekte edilen hacim : 10 l Toplam Analiz Süresi : 25 Dakika ve 10 dakika post time = 35 dakika 278 nm'de yeşil çay örneğinin kromatogramı

Design-Expert Software Factor Coding: Actual EGCG (g/100 g k.m) 3.76 2.48 X1 = A: sicaklik X2 = B: sure Actual Factor C: su:cay orani = 20 EGCG Değişimi E G C G ( g / 1 0 0 g k. m ) 4 3.5 3 2.5 2 55 45 35 B: sure (dak.) 25 15 Ekstraksiyon süresince her bir kateşin ve kafein sıcaklık ve süreye göre farklı bir kinetikle değişim göstermektedir. EGCG miktarı sıcaklık ve süreyle artmaktadır, yüksek sıcaklıkta süre uzadıkça EGCG epimerizasyon nedeniyle GCG ye dönüşmekte ve miktarı azalmaktadır. 5 88.00 84.80 81.60 78.40 75.20 A: sicaklik (C) 72.00 ANOVA for Response Surface Quadratic model Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III] Sum of Mean F p-value Source Squares df Square Value Prob > F Block 0.20 2 0.10 Model 1.50 9 0.17 10.43 0.0015 significant A-sicaklik 0.55 1 0.55 34.63 0.0004 B-sure 0.42 1 0.42 26.49 0.0009 C-su:cay orani 0.047 1 0.047 2.97 0.1233 AB 0.036 1 0.036 2.29 0.1691 AC 2.450E-003 1 2.450E-003 0.15 0.7054 BC 0.061 1 0.061 3.84 0.0857 A 2 4.107E-003 1 4.107E-003 0.26 0.6255 B 2 0.36 1 0.36 22.83 0.0014 C 2 3.569E-003 1 3.569E-003 0.22 0.6488 Residual 0.13 8 0.016 not Lack of Fit 0.11 5 0.023 5.27 0.1010 significant Pure Error 0.013 3 4.350E-003 Design-Expert Software Factor Coding: Actual GCG (g/100 g k.m.) 0.48 0.1 X1 = A: sicaklik X2 = B: sure Actual Factor C: su:cay orani = 20 G C G ( g / 1 0 0 g k. m. ) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 55 45 35 B: sure (dak.) 25 15 5 88.00 84.80 81.60 78.40 75.20 A: sicaklik (C) 72.00

Kafein Değişimi ANOVA for Response Surface Quadratic model Design-Expert Software Factor Coding: Actual CAF (g/100 g k.m.) 1.95 1.25 X1 = A: sicaklik X2 = B: sure Actual Factor C: su:cay orani = 20 C A F ( g / 1 0 0 g k. m. ) 2.2 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 55 45 35 B: sure (dak.) 25 15 5 88.00 84.80 81.60 78.40 75.20 A: sicaklik (C) 72.00 Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III] Sum of Mean F p-value Source Squares df Square Value Prob > F Block 1.772E-003 2 8.858E-004 Model 0.65 9 0.072 35.37 < 0.0001 significant A-sicaklik 0.39 1 0.39 190.57 < 0.0001 B-sure 0.11 1 0.11 52.67 < 0.0001 C-su:cay orani 7.515E-003 1 7.515E-003 3.69 0.0912 AB 2.112E-003 1 2.112E-003 1.04 0.3386 AC 1.125E-004 1 1.125E-004 0.055 0.8202 BC 1.125E-004 1 1.125E-004 0.055 0.8202 A 2 5.070E-003 1 5.070E-003 2.49 0.1535 B 2 0.14 1 0.14 69.20 < 0.0001 C 2 2.614E-004 1 2.614E-004 0.13 0.7296 Residual 0.016 8 2.039E-003 Lack of Fit 0.015 5 2.993E-003 6.65 0.0749 Pure Error 1.350E-003 3 4.500E-004 not significant Kafein miktarı sıcaklık ve süreyle artmaktadır, yüksek sıcaklıkta daha fazla miktarda kafein ekstrakte edilmektedir. Optimizasyon Design Expert v.9 programı kullanılarak numerik olarak yapılmıştır.

Maksimum miktarda EGCG ve CAF ekstrakte edilmesi için %100 yaklaşımla hedefe ulaşan 100 adet farklı çözüm bulunmuştur. Örnek: 88 C de, 31 dak., 26 ml/g su:çay oranı kullanılarak yapılan ekstraksiyonda EGCG miktarı 3.86 g/100 g, CAF 1.97 g/100 g olarak belirlenmiştir. 72.00 88.00 75.00 85.00 5 55 15 45 A:sicaklik = 87.65 B:sure = 30.9189 12 28 15 25 2.48 3.76 C:su:cay orani = 26.5111 EGCG = 3.86898 Desirability = 1.000 1.25 1.95 CAF = 1.97249

Ultrasound yardımıyla ekstraksiyon Ultrasound probu (Hielscher, 20 khz) yardımıyla 75 amplitude (genlik) su kullanılarak ekstraksiyon yapılmıştır. Ultrasound ekstraksiyon, merkezi kompozit tasarım (su:çay oranı 25) Bağımsız değişkenler Semboller RSM seviyeleri -1.414-1 0 +1 +1.414 Sıcaklık, C T 66 70 80 90 94 Süre, dak. t 18 30 60 90 102

ANOVA for Response Surface Quadratic model Design-Expert Software Factor Coding: Actual EGCG (g/100 g km.) 4.95 4.13 X1 = A: Sicaklik X2 = B: Sure E G C G ( g / 1 0 0 g k m. ) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4 3.8 3.6 102 88 74 60 B: Sure (dak.) 46 32 18 66 73 94 87 80 A: Sicaklik (C) Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III] Sum of Mean F p-value Source Squares df Square Value Prob > F Block 4.114E-003 1 4.114E-003 Model 0.81 5 0.16 12.39 0.0023 significant A-Sicaklik 3.680E-007 1 3.680E-007 2.823E-005 0.9959 B-Sure 0.094 1 0.094 7.22 0.0312 AB 0.011 1 0.011 0.85 0.3883 A 2 0.39 1 0.39 29.97 0.0009 B 2 0.37 1 0.37 28.05 0.0011 Residual 0.091 7 0.013 Lack of Fit 0.073 3 0.024 5.45 0.0675 not significant Pure Error 0.018 4 4.483E-003 ANOVA for Response Surface Quadratic model Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III] Sum of Mean F p-value Design-Expert Software Factor Coding: Actual CAF (g/100 g km.) 2.5 1.95 X1 = A: Sicaklik X2 = B: Sure C A F ( g / 1 0 0 g k m. ) 2.8 2.6 2.4 2.2 2 1.8 Source Squares df Square Value Prob > F Block 6.429E-005 1 6.429E-005 Model 0.30 5 0.060 38.58 < 0.0001 significant A-Sicaklik 0.25 1 0.25 160.17 < 0.0001 B-Sure 0.021 1 0.021 13.29 0.0082 AB 4.225E-003 1 4.225E-003 2.73 0.1424 A 2 0.026 1 0.026 16.60 0.0047 B 2 5.926E-004 1 5.926E-004 0.38 0.5555 Residual 0.011 7 1.547E-003 102 88 74 60 B: Sure (dak.) 46 32 18 66 73 94 87 80 A: Sicaklik (C) Lack of Fit 3.894E-003 3 1.298E-003 0.75 0.5771 not significant Pure Error 6.933E-003 4 1.733E-003

Optimizasyon Maksimum miktarda EGCG ekstrakte edilmesi için 1 adet çözüm bulunmuştur. Sıcaklık 80 C, süre, 52 dk., EGCG miktarı 4.85 g/100 g. Maksimum CAF ekstrakte edilmesi için 11 adet çözüm bulunmuştur. Sıcaklık 90 C, süre, 90 dk., CAF miktarı 2.43 g/100 g. 70 90 A:Sicaklik = 79.7108 70 90 A:Sicaklik = 90 30 90 30 90 B:Sure = 52.5699 B:Sure = 90 4.13 4.95 EGCG = 4.85341 Desirability = 0.882 1.95 2.5 CAF = 2.43042 Desirability = 0.873

Ultrasound probu (Hielscher, 20 khz) yardımıyla 75 amplitude (genlik) etil alkol:su karışımıyla ekstraksiyon yapılmıştır. Ultrasound ekstraksiyon, merkezi kompozit tasarım (su:çay oranı 25, çözücü: etil alkol-su karışımı) Bağımsız değişkenler Semboller RSM seviyeleri -1.682-1 0 +1 +1.682 Sıcaklık, C T 20 30 45 60 70 Süre, dak. t 10 30 60 90 110 Etil alkol: su, % EtoH:su 6 20 40 60 74 Design-Expert Software Factor Coding: Actual EGCG (g/100 g km) 7.45 4.4 X1 = A: Sicaklik X2 = C: % Actual Factor B: Sure = 60 E G C G ( g / 1 0 0 g k m ) 8 7 6 5 4 3 7.57677 Design-Expert Software Factor Coding: Actual CAF (g/100 g km) 2.31 1.94 X1 = A: Sicaklik X2 = C: % Actual Factor B: Sure = 60 C A F ( g / 1 0 0 g k m ) 2.4 2.2 2 1.8 1.6 2.27646 74 57 40 C: % (Etil alkol orani) 23 6 20 30 40 70 60 50 A: Sicaklik ( C) 74 57 40 C: % (Etil alkol orani) 23 6 20 30 40 70 60 50 A: Sicaklik ( C) EGCG miktarı etil alkol kullanılarak yapılan ekstraksiyonda %7 civarına çıkmıştır, suyla yapılan ekstraksiyonlara göre verim yaklaşık %90-95 artmıştır.

Optimizasyon Maksimum miktarda EGCG ve CAF ekstrakte edilmesi için %97 yaklaşımla hedefe ulaşan 1 adet çözüm bulunmuştur. Örnek: 57 C de, 79 dak., %50 EtOh: su oranı kullanılarak yapılan ekstraksiyonda EGCG miktarı 7.67 g/100 g, CAF 2.29 g/100 g olarak belirlenmiştir. 30 60 30 90 A:Sicaklik = 56.7084 B:Sure = 79.149 20 60 1.94 2.31 C:% = 50.3407 CAF = 2.29064 Desirability = 0.973 4.4 7.45 EGCG = 7.66919

Pilot Ölçek Ekstraksiyon Lab ölçekli su ekstraksiyonu sonuçları pilot ölçeğe aktarılmış, ekstraksiyon 100 lt. su kullanılarak yapılmıştır. EGCG, kafein ve diğer kateşinler için çok benzer sonuçlar elde edilmiştir. g/100 g GA 0,09 GC 0,3 EGC 2,4905 C 0,054 CAF 1,8225 EC 0,432 EGCG 4,0105 GCG 0,2395 ECG 0,629

Kateşin Ekstraktı Seramik membranlı filtrasyon Sıvı-sıvı ekstraksiyon

Rotary evaporator Püskürtmeli kurutucu

Kateşin ve kafein ekstraktları Yeşil çay kateşin ekstr. (4 kg çay/ 103 g ekstrakt) Artık yeşil çay kateşin ekstr. (4 kg çay/ 80 g ekstrakt) Siyah çay kafein ekstr. (4 kg çay/ 15 g ekstrakt) Artık Siyah çay kafein ekstr. (4 kg çay/ 10 g ekstrakt) Yaş çay ekstr. (4 kg çay/ 20 g ekstrakt) GA (g/100 g) 0,024 0,089 3,983 9,103 0,05 GC 6,988 7,333 1,668 0,624 5,896 EGC 8,301 8,954 6,099 1,89 7,125 C 0,960 3,018 1,407 0,812 1,885 CAF 6,763 6,896 33,170 36,27 10,98 EC 3,549 4,302 0,000 1,123 3,661 EGCG 35,757 30,871 3,536 2,497 30,102 GCG 8,070 14,434 0,736 0,576 12,45 ECG 8,445 8,889 0,770 0,92 9,875

Kateşinlerin ve kafeinin laboratuvar ölçeğinde ayrılması, saflaştırılması Kolon kromatografi tekniğiyle kafein ve kateşinler birbirinden ayrılmıştır. Biyoaktif maddelerin ayrılmasında sıklıkla kullanılır. Güvenli, sürdürülebilir ve çevre dostu bir yöntemdir. Büyük kapasitelerde kullanılabilmesi endüstriyel ölçekte kullanımını sağlamaktadır. Kolon, kateşinleri seçici adsorblayan bir maddeyle (polyamid) doldurulur. Kateşin ekstraktının sulu çözeltisi kolona yüklenir. Kolondan hareketli faz (mobil faz) geçirilir, adsorbe edilmeyen bileşikler kolondan önce çıkar, adsorbe edilenler ise daha geç çıkar.

Kateşinlerin ve kafeinin laboratuvar ölçeğinde ayrılması, saflaştırılması Kateşinlerin ayırma çalışmaları Biorad NGC Quest 10 kolon kromatografi cihazı kullanılarak yapılmıştır.

Cihaz, örnek yükleme, pompa, UV detektör, kolon, fraksiyon toplayıcı ve yazılımın bulunduğu bilgisayardan oluşmaktadır. Çalışma prensibi: Yürütücü faz pompa yardımıyla kolona gitmekte, seçilen akış hızında kolondan geçerek, ayrılan bileşikler detektöre farklı zamanlarda ulaşmakta ve fraksiyon toplayıcı tarafından yürütücü fazla birlikte toplanmaktadır. Ayrılan bileşikler detektörde farklı adsorbans verdiği için ayrı pikler halinde görülmektedir. Toplanan örneklerin HPLC'yle analizleri yapılarak, bileşiklerin ayrılıp ayrılmadığı ve ne kadar miktarda elde edildikleri belirlenmektedir. Kateşin ve kafeinin ayrılması için mobil faz olarak su ve etil alkol kullanılmıştır.

Tablo 2.1. Tüplerde toplanan ürünlerin analiz sonuçları (mg/1000 ml) Mobil faz Mobil faz Akış-hızı Numune su Etil Alkol-su 2ml/dak %5 kateşin ekstraktı Etil alkol oranı(%) 0 80 80 Tüp sayıları 2-3-4-5 12-17 18-38 1.Pik 2.pik 3. pik GA 0,000 0,000 0,000 GC 0,000 537,822 0,000 EGC 0,000 1988,593 0,000 C 0,000 145,893 0,000 CAF 5281,253 0,000 0,000 EC 0,000 582,342 0,000 EGCG 0,000 0,000 7375,63 GCG 0,000 11,733 793,207 ECG 0,000 57,457 1102,413 Toplam 5281 3323,83 9271,25 %EGCG 79,55 Sonuç: Kafein kateşinlerden %100 oranında ayrılmış, kafeinsiz %100 saflıkta kateşin ekstraktı elde edilmiştir. EGCG %79,55 saflıkta elde edilmiştir.

Toplanan etil alkol döner vakum evaporatorde uçurularak, suda çözünmüş EGCG elde edilir. Püskürtmeli kurutucuda kurutularak toz formda EGCG elde edilir. Suda çözünmüş formda elde edilen kafein püskürtmeli kurutucuda kurutularak toz formuna getirilir.

Pilot ölçek kolon kromatografi sistemi

Proje Ekibi Dr. Sena Saklar Ayyıldız (proje yöneticisi) Dr. Bülent Karadeniz Dr. Nihat Özcan Dr. Hayrettin Özer Dr. Banu Bahar Doç. Dr. Canan Doğan Doç. Dr. Cesarettin Alaşalvar Nihan Sağcan (Bursiyer) Ahmet Abdullah Us (Bursiyer)

TEŞEKKÜRLER sena.saklar@tubitak.gov.tr