0318 EN 1 G/M1017: İndirek immunoenzim testi, insan serumunda, Chlamydophila trachomatis karşı oluşan IgG ve /veya IgM antikorlarını test etmek için kullanılır. 96 test. GİRİŞ C. trachomatis cinsel yoldan geçen bir mikro organizmadır.erkeklerde urethritis ve cervicitis kadınlarda salpingitis sebeb olur.annelerde bebeklere geçtiğinde, konjutivit veya pneumonia sebep olur. C. trachomatis enfeksiyon teşhisi serolojik tenikler veya hücre kültürü ile konur. En yaygın teknik indirek mikro-immunoflörasans tekniğidir.ama, ELISA tekniğide uygulaması en kolay olandır.teste kullanılan COMP (Complexes of Outer Membrane Proteins) C. trachomatis, LPS olmadan diğer Chlamydia türleri ile çapraz reaksiyon verir. TEST PRENSİBİ: ELISA metodu numunelerdeki antikorla polstiren kuyucuklara kaplana antijenin reaksiyonuna dayanır.bağlanmayan immunglobulinler yıkanıp atılır.enzim bağlı etiketli anti insan globulin, ikinci basamakta kompleks oluşturur. Yeni bir yıkama adımından sonra konjugat bağlanır, substratın (TMB) yardımıyla mavi renk oluşturur.stop solüsyonu ile sarı renge dönüşür. Renkli ürün CHLAMYDIA TRACHOMATIS ELISA IgG/IgM Anti-C. trachomatis human IgG/IgM 3M VIRCELL IgM POZİTİF KONTROL: 500 µl pozitif kontrol serum IgM için, Prokilin içerir. 4G VIRCELL IgG CUT OFF KONTROL: 500 µl cut off kontrol serum serum IgG için, Prokilin içerir. 4M VIRCELL IgM CUT OFF KONTROL: 500 µl cut off kontrol serum IgM için, Prokilin içerir. 5G VIRCELL IgG NEGATİF KONTROL: 500 µl negatif kontrol serum IgG, Proklin içerir. 5M VIRCELL IgM NEGATİF KONTROL: 500 µl negatif kontrol serum IgM için, Proklin içerir. 6G VIRCELL IgG KONJUGAT: 15 ml anti-insan IgG peroksidaz konjugat dilüsyonu, kırmızı renkte, Proklin içerir, kullanıma hazırdır. 6M VIRCELL IgM KONJUGAT: 15 ml anti-insan IgM peroksidaz konjugat dilüsyonu, kırmızı renkte,proklin içerir, kullanıma hazırdır. 7 VIRCELL TMB SUBSTRAT SOLÜSYONU : 15 ml substrat solüsyonu tetramethylbenzidine (TMB). Kullanıma hazırdır. 8 VIRCELL STOP REKTİF: 15 ml stop solüsyon: 0.5 M sülfirik asit. 9 VIRCELL YIKAMA BUFER: 50 ml 0x yıkama solüsyonu :fosfar buffer Tween R -0 ve Prokilin. -8ºC saklayınız ve miadını kontrol ediniz. Gerekli materyaller ama sağlanmayanlar: Presizyonlu mikro pipet 5 ve 100 µl. 8 kanallı 100 µl mikro pipet. ELİZA pleyt yıkayıcı. Termostatlı inkübatör/su banyosu. ELISA pleyt okuyucu spektrofotometre, 450 nm ve 60 nm filtreli. Alternatif olarak, ELISA otomatik analizörü. Distile su. IgM testi için, insan IgG sorbent (ref. Vircell S001). SAKLAMA GEREKLİLİKLERİ: -8ºC de saklayınız. Miadı geçmiş kitleri kullanmayınız.bu kit -8ºC de ağzı kapalı olarak saklanırsa geçerli kalır. Renksiz substrat AÇILAN REAKTİFLERİN SAKLANMASI: REAKTİF 1x yıkama solüsyonu Diğer reaktifler STABİLİTE VE SAKLAMA 4 ay -8ºC Paket insertünde yazan miad kadardır. ( -8ºC) KİT ÖZELLİKLERİ: Yıkama solüsyonu hariç tüm reaktifler kullanıma hazırdır. Serum dilüsyon solüsyonu ve konjugat solüsyonu tekniğe yardım etmek için renklendirilmiştir. Numune ön dilüsyonu gerekli değildir. Kırılabilir kuyucuk sağlanır.test sayısı kadar kuyucuk ayrılır. KİT İÇERİKLERİ 1 VIRCELL CHLAMYDIA TRACHOMATIS PLEYT: 1 96-kuyucuklu pleyt COMP (Dış protein membranın kompleksi) C. trachomatis kaplı, strain 434 LGV tip II (ATCC VR-90B). VIRCELL SERUM DİLUENT: 5 ml serum dilüsyon buffer solüsyonu: mavi renkli fosfat buffer, stabilizör ve proklin içerir. Kullanıma hazırdır. 3G VIRCELL IgG POZİTİF KONTROL : 500 µl pozitif kontrol serum IgG için, Prokilin içerir. C. trachomatis antijen STABİLİTE VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: Reaktifleri aseptik durumlarda, mikrobiyolojik kontaminasyondan uzak bir şekilde saklayınız. Yıkama ve reaktif ekleme arasında pleyti kuru bırakmayınız. Substrat solüsyonu ışığa hassastır. Işıktan sakınarak koruyunuz, mavi renk oluşursa atınız.substrat solüsyonu oksitleyicilerle örneğin çamaşır suyu ya da metallerle temas etmemelidir. Gerektiği kadar yıkama, serum dilüent solüsyonu, konjugat ve TMB solüsyonu kullanın geri kalan solüsyonları reaktif şişelerine geri koymayınız. VIRCELL, S.L.yanlış kullanımdan olan hataların sorumluluğunu kabul etmez. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir.sadece profesyonel kullanım içindir.. Sadece kitin içindekileri kullanın.diğer üreticilerin kitleri ile karıştırmayınız.sadece serum Diluent, yıkama, stop ve substrat solüsyonları diğer VIRCELL ELISA kitlerinden kullanılabilir. 3. Her test basamağında pipet uçlarını temizleyiniz.sadece temiz, tercihen tek kullanımlık materyal kullanınız. 4. Hasar görmüş paketleri kullanmayınız. FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE
5. Asla ağız ile pipetlemeyiniz. 6. Serum dilüenti, pleyt, konjugat ve kontroller hayvan kaynaklıdır. Kontroller insan kaynaklıdır. Bu kitin kontrolleri Hepatit B yüzey antijeni (HBsAg), Hepatit C antikorları ve HIV antikorlarına karşı test edilip negatif bulunmasına rağmen enfeksiyon kapma riski varmış gibi davranılmalıdır. Hiçbir mevcut metot bu konularda kesin sonuç vermez. Kuyucuklar, inaktive edilmiş C. trachomatis antijen ile kaplıdır.yine de kullanılan tüm malzemeler potansiyel risk faktörü gibi davranılmalıdır. Atıklar konusunda da bölgesel kanunlara göre davranılmalıdır 7. Substrat solüsyonu deriyi ve mukus tabakayı irrite edebilir.bu solüsyon ile temas edilirse bol su ile yıkanıp medikal bir yardım alınmalıdır. Daha fazla bilgi, Material Safety Data Sheet mevcuttur. 8. Bu ürünü otomatik analizörde çalışmadan önce, öncelikle kitin performansını değerlendirmenizi öneririz. Bu amaç için VIRCELL de numune seti mevcuttur, manuel teknikle paralel olarak çalışmak için kullanılır.bu numune seti talep üzerine sağlanır. 9. İnkübasyon süresi boyunca, kuyucukları üzerini uygun bir bant ile kapatınız.kitin buharlaşmasını önleyip daha garanti bir sonuç verir. 10. IgM test için, bu ürün VIRCELL insan IgG sorbent (Vircell ref. S001 ile birlikte tek kullanım için üretilmiştir) NUMUNE TOPLAMA VE SAKLAMA : Kan mikrobiyolojik kontaminasyon dikkate alınarak eğitimli bir personel tarafından, venipunktür tekniği ile eğitimli bir personel tarafından alınmalıdır. Steril ve aseptik teknik kullanımı numunenin yapısını da koruyacaktır. Serum numuneleri (-8ºC) buzdolabında ya da 7 gün içinde çalışılmayacaksa (-0ºC) de saklanır.numuneler tekrar tekrar dondurulup çözülmemeli.hiperlipemik, hemolizli ya da kontamine olmuş numune kullanmayınız. Partikül içeren numuneler, santrifüj edilerek berrak hale getirilmelidir. Plazma kullanmayınız. 11.-Bantı çıkarınız, sıvıyı tüm kuyucuklardan çekiniz ve 5 defa 0.3 ml yıkama solüsyonu 9 ile yıkayınız. Kalan tüm sıvıyı dışarı atınız. 1-Hemen 100 µl substrat solüsyonunu 7 her kuyucuğa ekleyiniz. 13.-Işıktan korunarak 0 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. 14.-Her kuyucuğa,50 µl stop solüsyonu 8 ekleyiniz. 15.- 450/60 nm de 1 saat içinde okuyunuz İNTERNAL KALİTE KONTROL: Her üretim lotu pazara sürülmeden önce internal (Q.C.) testi yapılır.bu validasyon prosedüründen daha önemlidir. Lotlara göre,son QC testleri mevcuttur. QC materyalleri referans numune panellerine karşı valide olmuş, ispat edilmiştir. KULLANICILAR İÇİN VALİDASYON PROTOKOLÜ: Pozitif, negatif ve cut off kontroller her teste çalışılmalıdır.bu kitin ve testin validasyonunu sağlar. (O.D.) aşağıdaki aralıklarda olmalıdır.değilse, test geçersiz olup tekrar edilmelidir. KONTROL O.D. POZİTİF KONTROL >0.9 NEGATİF KONTROL <0.55 <0.7 x(o.d. POZİTİF CONTROL) CUT OFF KONTROL >1.5 x(o.d. NEGATİF CONTROL) SONUÇLARIN YORUMLANMASI: Cut off un ortalama O.D. sini hesaplayın. Antikor indeks=(numune O.D./ cut off serum ortalama O.D.) x 10 REAKTİFLERİN ÖN HAZIRLIĞI: Sadece yıkama solüsyonu hazırlanmalıdır. 50 ml 0x yıkama solüsyonu 1 litre distile su ile karıştırılır.eğer yıkama solüsyonu saklama sırasında kristalleşebilir, hazırlanmadan önce 37ºC ye getirilmelidir.dilüe edilen solüsyonlar -8ºC de saklanmalıdır TEST PROSEDÜRÜ: 1.-İnkübatörü veya su banyosunu 37±1ºC ye getiriniz..-tüm reaktifleri çalışmaya başlamadan 1 saat önce dolaptan çıkarınız.pleyti paketinden çıkarmayınız. 3.-Tüm reaktifleri karıştırınız. 4.-Pleyti 1 paketten çıkarın.kaç kuyucuk kullanacağınızı tespit ediniz: : 4 tane kontrol için ayırınız. cut off serum, 1 pozitif kontrol ve 1 negatif kontrol içindir.: Gerekli olmayan kuyucuklar paketin içine konup ağzı kapatılmalıdır. 5.-.IgG testi için, tüm kuyucuklara 100 µl serum diluent ekleyiniz.5 µl serum, 5 µl pozitif kontrol 3G, 5 µl cut off kontrol 4G (çift olarak) ve 5 µl negatif kontrol 5G ilgili kuyucuklara pipetlenir. Eğer test manuel yapılıyorsa, homojenizasyonu sağlamak için, dk elle çalkalanır. Bazı sebeplerden dolayı doğru karıştırmak mümkün değilse, iki kat hacimlerde bir tüpte karışım yapınız.homojen bir şekilde karıştırıp, her kuyucuklara 105 µl dilüe edilmiş numuneden koyulur. 1 6.-IgM testi için, 5 µl VIRCELL IgG sorbent (ref. S001) tüm kuyucuklara ekleyiniz, kontrol kuyucukları hariç. 5 µl Numune ve 75 µl serum diluent eklenir.her kuyucuğa 100 µl serum diluent ekleyin ve sonra 5 µl pozitif kontrol 3M, 5 µl cut off kontrol 4M (çift çalışma) ve 5 µl negatif kontrol 5M ilgili kuyucuğa eklenir. Eğer test manuel yapılıyorsa, homojenizasyonu sağlamak için, dk elle çalkalanır. Bazı sebeplerden dolayı doğru karıştırmak mümkün değilse, iki kat hacimlerde bir tüpte karışım yapınız.homojen bir şekilde karıştırıp, her kuyucuklara 105 µl dilüe edilmiş numuneden koyulur. 1 7.-.- Üzerini kapatıp 37±1ºC de 45 dk inkübasyona bırakınız. 8.- Üzerinden yapışkanı alıp tüm kuyucuklardan sıvıyı çekiniz ve 0.3 ml yıkama solüsyonu 9 ile her kuyucuğu 5 defa yıkayınız.kuyucuklardan tüm solüsyonu çekiniz. 9.- Hemen, her kuyucuğa,100 µl IgG konjugat solüsyonu 6 ekleyiniz ya da IgM konjugat 6M solüsyonu ekleyiniz. 10.- Bir bant ile yüzeyini kapatınız ve 37±1ºC de 30 dk inkübe ediniz. INDEKS YORUM < 9 Negatif 9-11 Şüpheli >11 Pozitif Şüpheli serumlar mutlaka yeniden test edilmeli ve/veya yeni numune alınarak çalışılmalı. 9 dan küçük indeks sonucu, C. trachomatis karşı IgG ya da IgM antikoru oluşmadığını gösterir. 11 den büyük indeks sonucu, C. trachomatis IgG ya da IgM antikoru oluşturduğunu gösterir. LİMİTLER: 1.-Bu kit sadece insan serumunda kullanmak içindir..- Kitin kullanıcısına, kitin içeriğini iyice okuyarak, anlayıp çalışması önerilir. Güvenilir sonuç elde etmek için, protokole tamamen uymak gerekir. Özellikle, doğru numune ve doğru reaktif pipetleme ve inkübasyon zamanı adımlarına tamamen uymak gereklidir. 3.- Numunelerin sonuçları klinik değerlendirme ve diğer teşhislerle birlikte yorumlanmalıdır. Kesin teşhis ayırma tekniği ile konulmalıdır. 4.- Bu test enfeksiyonun yerini belirtmeyecektir. Ayırım yapma amacı ile kullanılmaz. 5.- Antikor seviyesinin eksikliğinin tespiti enfeksiyon olasılığını içermemesi söz konusu değildir 6.-Erken alınan numunlerde IgG seviyesi tespit edilmeyebilir.bu durumlarda IgM testi yapılmalıdır.ikinci serum 14-1 gün sonra alınmalıdır, serokonversiyonun tespiti için ilk alınan numuneyle paralel çalışılmalıdır. 7.-Neonatallarda IgG tespiti değerlendirilmesi dikkale yorumlanmalıdır, çünkü IgG anneden pasif bir şekilde doğumdan önce tfansfer edilir.igm testi 6 ayın altındaki çocuklarda bakmak daha faydalı olur. 8.-Tek bir numuneye antikor bakmak teşhis koymakta tek başına yardımcı olmak için kullanılmamalıdır.çift numune(akut ya da nekahat zamanı numunesi) alınmalı, serokonversiyon için test edilmeli yada yükselen antikor seviyesi izlenmelidir. 9.-IgM test çalışması için, insan IgG sorbent kullanılmalı. Yoksa, RF nin varlığından dolayı yanlış pozitiflik ya da IgG antikor fazlalığından dolayı yanlış negatiflik görülür. 10.- Chlamydophila psittaci pozitif olna numunelerin az bulunurluğundan dolayı çapraz reaksiyon olup olmadığı test edilememiştir. 11.-Testin performansi takipli terapide değerlendirilmedi.
3 1.-ELISA testleri, IFA tarafından titrasyonlu çalışma da lineer ilişki göstermez. 13.- C. trachomatis tarafından olna hastalıkta serojik yanıtlar düşüktür. 14.-Kronik hastalıkta, bebekler için testin performansı değerlendirilmedi. 15.-Testin performansı,(lgv) ve pelvik hastalıkta değerlendirlmedi. PERFORMANS HASSASİYET VE ÖZGÜLLÜK: 79 serum numuneleri CHLAMYDOPHILA TRACHOMATIS ELISA IgG/IgM testi, IFA KIT ile IgG için karşılıklı çalışılmıştır. 60 serum numuneleri CHLAMYDIA TRACHOMATIS ELISA IgG/IgM testi IFA KIT ile IgM için karşılıklı çalışılmıştır. Sonuçlar aşağıdadır: NUMUNE NR HASSASİYET ÖZGÜLLÜK IgG 79 96% 100% IgM 60 90% 100% Bulunamayan değerler son hesaplamadan çıkarıldı. INTRA-TEST PRESİZYONU: IgG TESTİ İÇİN 3 serum 10 defa aynı operatör tarafından aynı koşullarda çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: ÇAPRAZ REAKSİYONLAR VE ETKİLEŞİMLER: Sendromik gruplardan pozitif (herpes simplex tip )ve Chlamydophila pneumoniae pozitif 10 numune IgG için test edildi. Sendromik gruplardan pozitif (herpes simplex tip )ve Chlamydophila pneumoniae pozitif 6 numune IgM için test edildi. RF pozitif olduğu bilinen 3 numune IgM için test edildi. Çapraz bir reaksiyon veya etkileşim görülmedi. DİĞER TESTLER İLE ETKİLEŞİMLER: Daha önce ANA pozitif olan1 numune ve RF pozitif olan 4 numune IgG ve IgM için 4 farklı ELISA kiti kullanılarak test edildi.(3 viral ve 1 bakterial)igm için numuneler IgG sorbenti ile kullanıldı. Sonuçlar gösterdi ki Ana pozitif olan numunelerin % 96 sında, RF pozitif olna numunelri %100ünde düşük etkileşim görüldü. IgM için, önerilen sorbent test edildi ve IgG antikorların fazlalığından kaynaklanan yanlış negatifliğin engellendiği görüldü. ETİKETTE KULANILAN SEMBOLLER: ºC 8ºC In vitro diyagnostik medikal alet Miadı kadar kullanın (miadı) -8ºC de saklayınız SERUM N %C.V. PC 10.5 NC 10 7.50 CO 10 3.58 IgM TESTİ İÇİN 3 serum 10 defa aynı operatör tarafından aynı koşullarda çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: x Yeteri kadar r <X> test içerir. Lot Katalog No Inserte bakınız SERUM N %C.V. PC 10 1.81 NC 10 6.63 CO 10 3.49 <X>kuyucuklar INTER-TEST PRESİZYONU: IgG TESTi İÇİN 3 serum 5 günde farklı operatör tarafından çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: SERUM N % C.V. PC 10 5.7 NC 10 8.75 CO 10 8.15 IgM TESTİ İÇİN 3 serum 5 günde farklı operatör tarafından çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: SERUM N % C.V. PC 10 3.43 NC 10 11.8 CO 10 5.33
4 TEST PROSEDÜRÜNÜN ÖZETİ IgG İÇİN DİLÜSYON 100 μl serum diluent 5 μl serum ve kontroller 3G 4G 5G Yıkama 5x (yıkama solüsyonu) 9 6G 100 μl konjugat 6M Yıkama 5x (yıkama solüsyonu) 9 100 μl substrat 7 50 μl stop solüsyonu 8 IgM İÇİN DİLÜSYON 5 μl sorbent 5 μl serum 75 μl serum diluent KONTROLLER 100 μl serum diluent 5 μl kontroller 3M 4M 5M 45 dk 37ºC 30 dk 37ºC 0 dk oda sıcaklığı Okuma 450/60 nm LİTERATÜR: 1. Bas, S., P. Muzzin, B. Ninet, J. E. Bornand, C. Scieux, and T. L. Vischer. 001. Chlamydial serology: comparative diagnostic value of immunoblotting, microimmunofluorescence test, and immunoassays using different recombinant proteins as antigens. J Clin Microbiol 39:1368-77.. Finn, M. P., A. Ohlin, and J. Schachter. 1983. Enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulin G and M antibodies to Chlamydia trachomatis in human sera. J Clin Microbiol 17:848-5. 3. Forsey, T., K. Stainsby, P. H. Hoger, G. L. Ridgway, S. Darougar, and U. Fischer-Brugge. 1986. Comparison of two immunofluorescence tests for detecting antibodies to C. trachomatis. Eur J Epidemiol :163-4. 4. Gonen, R., Y. Shemer-Avni, P. A. Csango, B. Sarov, and M. G. Friedman. 1993. Serum reactivity to Chlamydia trachomatis and C. pneumoniae antigens in patients with documented infection and in healthy children by microimmunofluorescence and immunoblotting techniques. APMIS 101:719-6. 5. Jones, R. B., S. C. Bruins, and W. J. Newhall 5th. 1983. Comparison of reticulate and elementary body antigens in detection of antibodies against Chlamydia trachomatis by an enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 17:466-71. 6. Mahony, J. B., J. Schachter, and M. A. Chernesky. 1983. Detection of antichlamydial immunoglobulin G and M antibodies by enzyme- linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 18:70-5. 7. Ossewaarde, J. M., A. de Vries, J. A. van den Hoek, and A. M. van Loon. 1994. Enzyme immunoassay with enhanced specificity for detection of antibodies to Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 3:1419-6. 8. Piura, B., I. Sarov, B. Sarov, D. Kleinman, W. Chaim, and V. Insler. 1985. Serum IgG and IgA antibodies specific for Chlamydia trachomatis in salpingitis patients as determined by the immunoperoxidase assay. Eur J Epidemiol 1:110-6. 9. Raymond, J., P. Duc-Goiran, S. Joundy, J. Orfila, and J. Acar. 1985. Enzyme-linked immunosorbent assay using three different antigen preparations for detection of antibodies to Chlamydia trachomatis. Eur J Clin Microbiol 4:468-7. 10. Yong, E. C., J. S. Chinn, H. D. Caldwell, and C. C. Kuo. 1979. Reticulate bodies as single antigen in Chlamydia trachomatis serology with microimmunofluorescence. J Clin Microbiol 10:351-6. Sorularınız için lütfen aşağıdaki adres ile temasa geçiniz: technicalservice@vircell.com REVİZE EDİLEN TARİH: October-06
5