attomol lactose intolerance -13910C>T quicktype İnsan laktase-genine karşı -13910C>T geçiş tespitine yönelik mutasyon testi Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir! 20 tespit sipariş numarası: 1045 1.Giriş Sütün işlemi ve diğer laktoz-içeren yiyecekler, bazı erişkinlerde sindirim sorunlarına neden olur. Erişkinlerde görülen kalıtsal laktoz intolerans (LIT) sendromuyla genellikle bu tür semptomlar ayrılmıştır. Sindirim bozukluğu, meteorizm (Tympanites), şişme ve ishal laktoz intoleransında en sık görülen semptomlardır (Obermayer-Pietsch, 2004, Journal für Mineralstoffwechsel, 11(3):20-23). Laktoz intoleransı kromozom 2 laktase geninin(lactase phlorizin hydrolase gen, LPH gene) yanında MCM6 geninde(minichromosome maintenance gene) aktif hale gelen bir mutasyon nedeniyle olabilir. Mutasyon laktase geninde 13910 a karşı nucleotit konumunda C'den T'e bir baz değişimidir ve mutasyon bu test kullanarak tespit edilmiş olabilir. Mutasyonun homozigot taşıyıcıları bütün bir laktoz toleransına sahiptir. Heterozigot taşıyıcıları laktoz intoleransını kısmen telafi edilebilir(obermayer-pietsch, 2004, Journal für Mineralstoffwechsel, 11(3):20-23; Sibley, 2004, Am J Pharmacogenomics, 4(4):239-245). Wild tip taşıyıcıları laktoz intoleransını ilerleyen yaş emzirmelerden sonra bir lactase eksikliğini geliştirmiştir. Lactase eksikliğinin sonucu olarak, laktozun yukarıda bahsedilen semptomlarına sebep olan verimli monosakkaridler, glikozu ve galactoseyi etkili olarak ayıramaz(srinivasan und Minocha, 1998, Postgraduate Medicine, 104(3):109-111, 115-116, 122-123). Sadece monosakkaridler, sindirim esnasında tekrar absorbe olur. Laktoz intolerans belirtileri, dünyada farklı etnik gruplar arasında değişir. Avrupa nüfusunda çok yaygın olarak görülmeyen laktoz intoleransı % 30 lardadır.(sahi, 1994, Scand J Gastroenterol, 202(29):7-20). Avusturya'da örneğin, insanların % 20-25 inde ilk yetişkin laktoz intoleransı görülür. (Obermayer-Pietsch, 2004, Journal für Mineralstoffwechsel, 11(3):20-23). 2. Genel Açıklamalar Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalıdır. Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat ediniz. Test uygulamasının tüm adımlarında eldiven giyiniz.
Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara göre hareket edilmelidir.. PCR* a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın.. 3. Dahil olan malzemeler Sipariş numarası Reaktif Hacim Saklama Isısı 38 deiyonize PCR-H 2 O 0.2 ml -20 C 83 PCR-buffer I 0.5 ml -20 C 156 Primer LIT- 13910C>T (pembe renkli tüpler) Liyofilize primerler içeren 2 tüp, tüp başına 225 μl PCRbuffer I (#83) ile çözündürme -20 C Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır. 4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler Hastaların DNA numuneleri ( genomik DNA kullanın, konsantrasyonu yaklaşık 20 ng/μl, distile suyla veya TE-buffer çözündürme) Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz Kontrol template(-13910c>t heterozigot DNA) Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml) Mikropipetler (hacim aralığı 0.5-1000 μl) ve steril filtre uçları Thermocycler Agoroz jel elektroforez ve sarf malzemeleri için ekipman (agoroz veya % 3 prekastlanmış agoroz jelleri, elektrot buffer, örnek buffer, DNA-boya, UV-transilluminator) 5. Test Prensibi Quicktype genotipleme işlemi sırasında belirli bir genin her iki allelleri özellikle amplifiye edilmiş olur. Amplifikasyon ürünlerinin denemesi agoroz jel elektroforezle yapılabilir. Her iki allel de Wild tip dizisi taşırsa (homozigot wild tip), agoroz jeli yalnızca 290 bp te specifik bir bant içerir. Eğer bir allel Wild tip dizisi ve diğeri mutasyon dizisi(heterozigot) taşırsa, sırasıyla 290 bp ve 330 bp te iki bant olacaktır. DNA numunesi homozigot olarak mutasyona uğramışsa jelde 330 bp te sadece tek bir bant gözükür. Jeldeki bantların kalibrasyonunda sonuçları daha iyi doğrulamak için referans olarak bir heterozigot DNA numunesi kullanmalısınız (Fig. 1'i gör).
Tek başına bir diagnostik metodun sonuçlarından klinik tanıya gidilmemelidir. Doktor mevcut tüm laboratuar ve klinik sonuçları dikkate almalıdır. 6. Manuel Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki kontrolleri eklemeniz önerilir: 1. Negatif kontrol (PCR-blank) 2. Pozitif kontrol (bir heterozigot kontrol template kullanın [genotiplendirilmiş, genomik DNA]) Kontrol template ayrı olarak üreticisinden de sipariş edilebilir(sipariş numaranızı 160). Doğru şekilde genotiplendirilmiş olan hasta numuneleri kullanıcı tarafından kontrol template olarak da kullanılabilir. Protokol: Standart prosedürlere göre hasta kanından DNA-hazırlama Tüp başına 225 μl PCR-buffer I kullanarak (sipariş numarası 83) primerleri çözündürün, PCR Premix içinde pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dk. İnkübe edin. Dikkat: 225 μl den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı -20 C de saklayabilirsiniz. PCR premix e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama: Bir reaksiyon için kullanılıcak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (20 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim eklenmelidir (8 reaksiyon için örnek: 8 x 20 μl + 10 μl fazladan hacim = 170 μl PCR premix). Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 170 μl PCR premix + 1,7 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi, PCR mix iyice karıştırılmalıdır. PCR mixi 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma: Negatif kontrol: Pozitif Kontrol: Hasta numuneleri: 20 μl PCR mix 20 μl PCR mix 20 μl PCR mix + 5 μl PCR-H 2 O + 5 μl kontrol template + 5 μl DNA (ca. 20 ng/μl) (ca. 20 ng/μl) PCR thermocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır: İlk denatürasyon: 15 dak. 95 C
5 döngü: 1 dak. 94 C 1 dak. 63 C 1 dak.72 C 30 döngü: 30 s 94 C 30 s 63 C 30 s 72 C Final sentezi: 2 dak. 72 C Durdurma: 4 C zaman sınırı yok PCR ürünlerinin analizleri uygun laboratuvar şartlarında bir agoroz jel üzerine (2,5 % 3) 10 μl PCR ürünü ilavesi ve sonra elektroforez ile gerçekleştirilir.. Hasta numunelerinin genotiplemesi kontroller ile numunelerin bant modeli kıyaslanarak yapılır (Fig. 1'i gör). Genotipler: WT= homozigot Wild Tipi= Lactose intolerant HZ=Heterozigot MU=homozigot Mutasyon= Lactose tolerant Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta tereddüt etmeyin. EK 1 Kit etiketlerinde kullanılan sembollere genel bakış Sembollerin açıklaması Üretici Lot numarası Son kullanma tarihi 2 C ve 6 C arasında saklayın
Max. -20 C de saklayın Katalog numarası In vitro diagnostik medikal ürünler <n> determinations için yeterli içerik Kullanım talimatına bakınız