1 TR TESTİN PRENSİBİ: SPEED-OLIGO MYCOBACTERIA Testin prensibi spesifik Mycobacteria gen fragmanlarının amplifikasyonuna dayanır ve Mycobacteria enfeksiyonlarının hızlı tanısına olanak sağlar. SP005: Mikobakteri cinsi ve 12 farklı mikobakteri türünün kalitatif belirlenmesi için oligokromatografik test: kültür örneklerinde M. tuberculosis kompleks (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum), M. avium-intracellulare-scrofulaceum kompleks, M. chelonaeabscessus kompleks, M. kansasii, M. fortuitum y M. gordonae. 40 test. GİRİŞ: Mikobakteriler bakteri grupları arasında en yüksek klinik öneme sahip, yüksek ölüm ve hastalık oranıyla çeşitli insan enfeksiyonlarına neden olan ajanlardır. Halen dünya çapında çok ciddi sağlık problemlerinden birini temsil etmektedirler. Yaklaşık olarak dünya popülasyonunun üçte biri tubercle bacillus ile enfekte olmuştur. Pratik bakış açısı olarak, Mikobakteri cinsi içinde 3 grup tanımlayabiliriz: 1) Tüberküloz a neden olan ve M. tuberculosis, M. bovis (BCG'yi kapsayan), M. africanum ve M. Microti türlerini içeren tubercular kompleks; 2) Leprae ye neden olan M. leprae; 3) Yukarıda bahsedilmemiş olan diğer mikobakteri gruplarından, patojenliği daha az olan tüberkülozlu olmayan semptomatolojiye neden olan ve çoğu kez fırsatçı veya saprofitik olan mycobacteriosis. M. tuberculosis kompleks Sığır normal olarak M. bovis için bir depo iken insanlar M. tuberculosis in doğal deposudur. Tüberküloz her ne kadar yayılmış veya lokalize olmuş olarak vücudun diğer kısımlarında da görülebilse de genellikle akciğerleri etkileyen kronik granulomlardan oluşmuş bir hastalıktır. M. avium-intracellulare kompleks Mikobakterilerin bu çeşidi doğada yaygındır. Başlıca immünosupresyonlu hastaları ve AIDS li hastaları etkilerler, odaklanmış veya yayılmış klinik durumlara neden olurlar (akciğerleri, mide-barsak kanalı veya lenf düğümlerini etkileyerek). M. scrofulaceum Çocuklardaki lymphadenitis vakasıyla bağlantılıdır. M. kansasii M. kansasii tüberküloza benzeyen kronik insan akciğer hastalığına neden olur. Yayılmış enfeksiyonlar taşıyıcı (immunocompromised) hastalarda bulunabilir. M. abscessus Kronik akciğer enfeksiyonlarına, cerrahi yaralardaki enfeksiyonlara, sondayla ilişkili enfeksiyonlara ve immünosupresyonlu hastalardaki enfeksiyonlara neden olabilir. M. chelonae Patojenin yüksek antimikrobiyal direnci vardır, ekseriyetle taşıyıcı (immunocompromised) hastalardan izole edilir. M. fortuitum Cerrahi yaralarda enfeksiyonlara, sondayla ilgili enfeksiyonlara, osteomiyelit ve cellulitis e neden olabilir. M. gordonae Her ne kadar taşıyıcı (immunocompromised) hastalarda bazen patoloji ürünü olabilse de genellikle kontaminant olarak mikrobiyoloji laboratuvarlarından izole edilir. SPEED-OLIGO MYCOBACTERIA belirleme kitinde PCR-tabanlı metot ile daldırma şeriti birleştirilmiştir, Mikobakteri cinsi ve 12 farklı mikobakteri türünün hızlı, yüksek duyarlılıkta ve spesifik olarak belirlenmesine olanak sağlar: kompleks M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum), kompleks M. avium-intracellularescrofulaceum, M. chelonae-abscessus, M. kansasii, M. fortuitum ve M. gordonae. Temin edilen PCR karışımı 16S-23S arasındaki ribozomal genleri kapsayan amplifikasyon için gerekli spesifik oligo çiftlerini içerir. Kit kolaylıkla kullanılacak şekilde tasarlanmıştır. PCR thermocycler kullanımına bağlı olarak amplifikasyon adımı 15 ila 75 dakika kadar bir zaman alır, oysa daldırma şeriti ile belirlemek için sadece 5-10 dakika gereklidir. PCR karışımının liyofilize sunumu kontaminasyonu önlemek için kullanım ve pipetleme prosedürlerini minimize eder. Test, örnekte amplifikasyon inhibitörlerinin taşınmadığı durumların kontrolü için iç amplifikasyon kontrolü içermektedir ve doğru amplifikasyon oluşmaktadır. Kontrol, DNA fragmanı ve onun amplifikasyonu için spesifik oligo çiftinden oluşmaktadır. Teknik üç ana adıma bölünmüştür: DNA ekstraksiyonu, spesifik oligo çiftiyle amplifikasyonu ve çoğaltılmış ürünlerin belirlenmesi. Belirleme daldırma şeriti ile gerçekleştirilir. İki defa amplifikasyon yapıldığında, amplifikasyon kontrol ve spesifik test amplicon denatüre olur ve stripte ilerlemesine olanak sağlar. PCR fragmanları, altın partiküllerinin kolloidal süspansiyonu ile birleştirilmiş spesifik oligonükleotidler ile reaksiyon verir. Sonra PCR ürünleri ve kolloidal altın kompleksi spesifik problara (test çizgisi ve PCR amplifikasyon kontrol çizgisi) ulaşana kadar membrandan yukarı doğru ilerler, ikinci hibridizasyonun meydana geldiği yer. Altın probun tamamlayıcı oligonükleotidler ile hibridizasyonundan artan kısmın membran tarafından absorbe edilmesinden dolayı ürün kontrol çizgisi ortaya çıkar. Altın reaksiyonunun olduğu konumda kırmızı çizgiler görünür hale gelir. Bu teknik geleneksel PCR dan daha duyarlı ve daha spesifiktir. Çift hibridizasyon spesifik ve spesifik olmayan amplifikasyon fragmanları arasındaki ayırımı sağlar. KİT ÖZELLİKLERİ: Kit DNA amplifikasyonu ve hibridizasyon prensiplerine dayanmaktadır. Kontaminasyon riskinden dolayı Tavsiyeler ve önlemler bölümünün dikkatle okunması önemlidir. PCR karışımı liyofilizedir. Kullanımdan önce kullanıma hazır forma getirilmeleri gerekmektedir (Reaktiflerin ön hazırlığına bakın). Geri kalan reaktifler kullanıma hazırdır. KİT İÇERİĞİ: 1 VIRCELL MYC PCR MIX: Liyofilize PCR tamponu, Cl 2 Mg, mycobacteria için spesifik primerler, dntp ler, Taq polimeraz ve amplifikasyonu için spesifik primerler ile birlikte PCR amplifikasyon kontrolü için DNA fragmanları içeren 5 şişe. 4 VIRCELL MYC STRIPS: Spesifik DNA belirlenmesi için 40 strip. 5 VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION: Triton X-100 içeren, PCR karışımını kullanıma hazırlamak için 1 ml sulu çözelti 1 şişe. 7 VIRCELL MYC RUNNING SOLUTION: Proklin içeren hibridizasyon çözeltisinin 1 ml'sini içeren 2 şişe. 2-8ºC de saklayın ve son kullanma tarihini kontrol edin. Gerekli materyal, temin edilmemiştir: Biyolojik güvenlik bölümü Isıtıcı blok veya sabit ısı banyosu 95ºC±2ºC
2 Thermocycler Mineral yağ (ısıtılmış kapağı olmayan thermocycler için) Hassas mikropipet (10-200 µl) Aerosol bariyerli steril uçlar Tek kullanımlık eldivenler 55ºC±2ºC ısıtıcı blok 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri Mikrosantrifüj PCR odası (tavsiye edilen) Vorteks SAKLAMA KOŞULLARI: 2-8ºC de saklayın. Kit reaktiflerini son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Bu reaktifler kapalı ve 2-8ºC de saklandığında geçerlidir. VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandığında, -20ºC nin altında saklanmalıdır ve tekrarlayan dondurup çözme işleminden kaçınılmalıdır. AÇILDIĞI ZAMAN REAKTİFLERİN KARARLILIĞI: REAKTİF Kullanıma hazırlanmış VIRCELL PCR MIX Diğer bileşenler KARARLILIK -20ºC nin altında saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın 2-8ºC de saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın. KARARLILIK VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: Kit 2-8ºC de son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. VIRCELL PCR MIX kullanıma hazırlandıktan sonra, -20ºC'nin altındaki sıcaklıkta son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. Mikrobiyal kontaminasyondan kaçınmak için reaktifleri aseptik koşullarda kullanın. Reaktifleri sadece test için gereken miktarda kullanın. Artan çözeltiyi şişeye geri koymayın. VIRCELL, S.L. kit içeriğindeki reaktiflerin hatalı kullanımına dair sorumluluk kabul etmemektedir. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece laboratuvar içi kullanım içindir. Sadece profesyonel kullanım içindir. 2. Sadece kit bileşenlerini kullanın. VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION farklı VIRCELL SPEED-OLIGO kitleriyle kullanılabilir. VIRCELL PCR MIX, VIRCELL STRIPS ve VIRCELL RUNNING SOLUTION lotlar ve kitler arasında değişim yapmayın. 3. Aerosol bariyerli steril uçlar DNA ekstraksiyonu esnasında kontaminasyonu engellemek ve PCR performansı için zorunludur. 4. Numuneler bulaşıcı örneklerdeki gibi laboratuvar güvenlik prosedürleri uygulanarak kullanılmalıdır. Tüm çalışma alanlarını taze olarak hazırlanmış deiyonize veya distile suda %0.5 lik sodyum hipoklorit çözeltisi ile tamamen temizleyin ve dezenfekte edin. 5. Tüm örneklerin alındıktan sonraki en kısa aralıkta test edilmesi en doğru test sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olacaktır. Numunenin yollanması sırasında saklama süresindeki değişimler değerlendirilmemiştir. 6. Numuneleri kullanırken koruyucu tek kullanımlık eldivenler, laboratuvar kıyafetleri ve göz koruyucu kullanın. Örnekler ile çalıştıktan sonra ellerinizi tamamen yıkayın. 7. Reaktif tüplerinden numune alırken reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçının. 8. Testi gerçekleştirirken üç farklı alan olması zorunludur: Amplifikasyon öncesi, Amplifikasyon ve Amplifikasyon sonrası veya Belirleme alanı. Laboratuvardaki iş akışı Amplifikasyon öncesi başlangıcından ve Amplifikasyon sonrası alana doğru hareket ederek tek yönlü biçimde ilerlemelidir. Herbir alanda eldiven giyilmeli ve herbir alandan ayrılırken eldiven atılmalıdır. A) Amplifikasyon öncesi alan: Sadece örneğin toplanması ve DNA ekstraksiyonu içindir. Yalnızca amplifikasyon öncesi faaliyetler için spesifik ekipmanlar belirlenmelidir (eldivenler, steril tüpler, bariyer uçlar, mikropipetler, mikrosantrifüj veya diğer gerekli ekipman) ve diğer prosedürler için kullanılmamalıdır veya diğer alanlara taşınmamalıdır. B) Amplifikasyon alanı: Bu alanda PCR gerçekleştirilir ve sadece PCR reaktifleri kullanılmalıdır. Amplifikasyon faaliyetleri için spesifik ekipmanlar belirlenmelidir (eldivenler, steril tüpler, bariyer uçlar, mikropipetler, mikrosantrifüj, thermocycler, katmanlı hava akış dolabı veya diğer gerekli ekipman) ve diğer prosedürler için kullanılmamalıdır veya diğer alanlara taşınmamalıdır. Amplifikasyon tamamlandıktan sonra, PCR tüpleri asla bu alanda açılmamalıdır. C) Amplifikasyon sonrası veya belirleme alanı: Belirleme bu alanda gerçekleştirilir. Isıtıcı blok, 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri mikropipet gereklidir. Amplifikasyon sonrası materyeller ve teçhizat her zaman amplifikasyon sonrası alanda durmalıdır. 9. Testin yüksek analitik duyarlılığından dolayı, kit reaktifleri veya amplifikasyon karışımlarının saflığını korumak için aşırı özen gösterilmelidir. Tüm reaktiflerin saflığı yakından takip edilmelidir. Şüpheli reaktifleri atın. 10. Bu ürün PCR testlerinin tekniklerinde eğitilmiş personel ile sınırlandırılmalıdır. 11. Kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. 12. Kullanılmamış reaktifleri ve atığı uygulanabilir yönetmeliklere göre atın. 13. Bu kitin reaktifleri genetik materyal veya hayvan ve/veya insan orjinli maddeler içerebilir. Her ne kadar bu materyal bulaşıcı olmasa da potansiyel olarak bulaşıcı gibi kullanılmalıdır. Tüm materyal potansiyel olarak bulaşıcı gibi kullanılmalı ve atılmalıdır. Klinik atıkların yok edilmesi için yerel yönetmeliklere uyun. 14. Edinilen stripler PCR kontaminasyon riskinden kaçınmak için amplifikasyon öncesi alandan uzak bir yerde saklanmalıdır. Daha iyi bir koruma için edinilen striplerin kenarlarının kesilmesi tavsiye edilir. REAKTİFLERİN İLK HAZIRLIĞI VIRCELL PCR MIX hariç tüm reaktifler kullanıma hazır temin edilmiştir. 1 VIRCELL PCR MIX. Herbir PCR mix 8 PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için yeterli reaktifi içerir. Kullanıma hazırlamak için sonraki adımları takip edin: - Herbir tübe 150 µl VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION ekleyin. - 10 saniye vorteksleyerek karıştırın. PCR karışımının tamamen homojenize olduğundan emin olmalısınız. - Kullanıma hazırlamanın tamamlanması için oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Kullanıma hazırlanan VIRCELL PCR MIX daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir. TEST PROSEDÜRÜ: 1.-DNA ekstraksiyonu: (Amplifikasyon öncesi alanda gerçekleştirilir). DNA izolasyonu bakterinin yetiştirildiği katı veya sıvı ortamdan gerçekleştirilebilir. Çalışma alanında amplifiye DNA olmaması ve kullanılan materyalin DNAsa-sız olması zorunludur. DNA izolasyonu için, her ne kadar bizim deneyimlerimizle tanımladığımız metod amlifiye DNA ın izolasyonu için hızlı ve yararlı olsada herhangi bir ticari metod veya kit kullanılabilir. Bu protokolün ilk adımı, Mycobacteria nın büyüme ortamının katı veya sıvı olmasına bağlı olarak değişmektedir. Protokolün geri kalanı her iki durumdada aynıdır. Sıvı ortam: 1 ml tübe pipetleyin. Bakterileri yoğunlaştırmak için 12000 g de 15 dakika satrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 300 µl VIRCELL SAMPLE SOLUTION ile bakterileri tekrar süspanse hale getirin. Katı ortam: Bakteriyel büyümeyi bir aşılama döngüsüyle toplayın ve 300 µl ve VIRCELL SAMPLE SOLUTION ile tekrar süspanse hale getirin. Bakterileri sabit ısı banyosunda veya ısıtıcı blokta 95ºC de 1 saat inkübe edin, kullanılan tüplerin uygun olduğundan emin olun. Bakterilerin
3 aşılamasını gerçekleştirmek amacıyla, ısıdan dolayı kazayla tüplerin açılması ve Mycobacterium aerosolü oluşumundan kaçınmak için vidalı tüplerin kullanılmasını tavsiye ediyoruz. Bu prosedürün biyolojik güvenlik bölümünde gerçekleştirilmesi tavsiye edilir. -12000g de 5 dakika santrifüjleyin ve PCR için hemen 10µl süpernatant kullanın. Santrifüjleme PCR inhibitör bileşenlerinin tekrar süspanse hale gelmesini engellemek için PCR dan hemen önce gerçekleştirilmelidir. Eğer PCR derhal gerçekleştirilemeyecek ise, süpernatant yeni bir tübe aktarılabilir, peletin aktarılmadığından emin olun ve -20ºC nin altındaki sıcaklıkta saklayın. - - Hemen stribi doğru yönelimde (oklar örneğe doğru göstermektedir: plana bakın) yerleştirin ve 55ºC de 5 dakika inkübe edin. 2.-PCR (Amplifikasyon alanında gerçekleştirilir): PCR karışımı 1 liyofilizedir. Herbir şişe 8 reaksiyon için gerekli bileşenleri içerir. Analizlenecek örnek sayısına bağlı olarak bir veya daha fazla PCR karışımı tüpleri kullanıma hazırlanmalıdır ( reaktiflerin ön hazırlığı"na bakın). rack ta gerekli tüp sayısını ayırın: her örnek için bir tüp. Artan PCR karışımı daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir. - Her tübe kullanıma hazırlanan PCR karışımının 15 µl sini pipetleyin. - Herbir tübe örnek veya kontrolün 10 µl sini ekleyin. - Thermocycler a PCR tüplerini yerleştirin ve aşağıdaki programı uygulayın*. 1 döngü 92ºC 1 dakika 92ºC 20 saniye 40 döngü 55ºC 30 saniye 72ºC 30 saniye 1 döngü 72ºC 1 dakika 1 döngü 95ºC 1 dakika *(thermocycler üreticisi tarafından verilen talimatları izleyin). PCR ürünlerinin belirlenmesi daldırma çubuğuyla yapılır. Eğer hibridizasyon hemen gerçekleştirilmezse PCR tüpleri -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir. Daha sonra hibridizasyonu oluşturmak için PCR son denatürasyon adımının bir daha gerçekleştirilmesi gereklidir. Adım 1 95ºC 1 dakika 3.-Strip belirlemesi: (Amplifikasyon sonrası alanda gerçekleştirilir). Strip hibridizasyonu gerçekleştirmeden önce ısıtıcı bloğun 55ºC de ön ısıtması gereklidir. - 1.5 ml lik tübe* 40 µl VIRCELL RUNNING SOLUTION ekleyin ve 55ºC de 2 dakika inkübe edin. - Örneği 95ºC de 1 dakika denatüre edin ve hemen buza veya 4ºC ye soğutulmuş rack'a koyun. 95ºC lik denatürasyon adımından sonra örnekleri oda sıcaklığındaki rack ta bırakmayın. Soğutulmuş rack veya buzunuzun olmaması durumunda, 95 ºC de denatürasyon adımından sonra örneği soğutmadan pipetleyebilir ve hemen stribi yerleştirebilirsiniz. - 4ºC ye soğutulmuş denatüre PCR ürününün 5 μl sini ekleyin. Örnekler 1.5 ml lik tübe eklenmeden, 4ºC de 1 dakikadan fazla kalamaz. Eğer PCR programının son denatürasyon adımından sonra PCR ürünü 1.5 ml lik tübe hemen eklenmezse, 4ºC de buza veya eş soğuklukta rack a koymak için bu adımın (95ºC de 1 dakika) bir daha tekrarlanması gerekecektir. Eş zamanlı olarak birçok örneğin analizi durumunda, denatürasyon adımı ile strip belirlemesi arasında 1 dakikadan fazla zaman geçmemesine dikkat edin, 3 ila 5 örneklik gruplar için tavsiye edilir. Bu şekilde yanlış negatifin ortaya çıkmasından kaçınıyoruz. - Stribi çıkarın ve sonucu okuyun. *1.5 ml lik tüp ısıtıcı bloğu dolduracak şekilde uymalıdır. Sonuçların yorumu strip çıkarıldıktan sonra gerçekleştirilmelidir. Kurutma işaret yoğunluğundaki değişimlere neden olabilir ve negatif örneklerde bazı zeminler görülebilir. Edinilen stripler PCR kontaminasyon riskinden kaçınmak için amplifikasyon öncesi alandan uzak bir yerde saklanmalıdır. İÇ KALİTE KONTROL: İç kalite kontrol testine tabi olan herbir parti piyasaya çıkmadan önce, yüksek derecede kesin tanımlamalara uymaktadır. Herbir özel lot için son kalite kontrol sonuçları mevcuttur. KULLANICILAR İÇİN SONUÇLARIN YORUMU VE GEÇERLİLİK PROTOKOLÜ: Sonucu okumak için okuma kartında S ile gösterilen pozisyona stribi yerleştirin. Test 9 okuma alanı içerir: ürün kontrol çizgisi, PCR amplifikasyon kontrol çizgisi, bilinen tüm mikobakter cinsleri için bir çizgi ve farklı mikobakter veya mikobakter komplekslerinin belirlenmesi için 6 çizgi. Sonuç yorumu için 4 farklı durum bulunabilir: 1.-Geçersiz Test (Figür ): 1.1.-Çizgiler yok: Bu durumda VIRCELL RUNNING SOLUTION ile örnek stip boyunca uygun bir şekilde akmamıştır. 1.2.-Sadece ürün kontrol çizgisi görünür: Örnekte inhibitör bileşenlerinin bulunduğunu gösterir böylece örnekteki DNA amplifikasyonundan kaçınılır, amplifikasyon kontrolünü kapsayarak. Eğer inhibisyon gözlenirse, örneğin 12000 g de 5 dakika birkez daha santrifüjlenmesi tavsiye edilir ( Test Prosedürü: DNA ekstraksiyonu na bakın) ve sonra PCR için 10 µl süpernatant alın. Eğer inhibisyon devam ederse, orjinal kültürden yeni bir ekstraksiyon şiddetle önerilir. 2.-Negatif Test (Figür ): Ürün kontrol çizgisi ve PCR amplifikasyon kontrol çizgisi görünür. Test doğru olarak gerçekleştirilmiştir ve örnekte inhibitör bileşenler yoktur. Mikobakter cinsinden farklı diğer mikroorganizmaların bulunma olasılı varken, test negatif olarak dikkate alınır çünkü mikobakteri DNA'sı örnekte belirlenememiştir. 3.-Mikobakteri cinsi için pozitif test (Figür ): PCR amplifikasyon kontrol çizgisi olsa da olmasa da (TL7) cinsiyle ilgili olarak spesifik çizgi görünür. Bu durum örnekte mikobakteri bulunduğunu gösterir. 4.-Test bazı Mikobakteri kompleksleri veya Mikobakteriler için pozitif testi kapsamaktadır (Figür ): Testin içerdiği mikobakteriler
4 için bazı spesifik şeritler (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5, TL6) görünür. Bu şeritler cins çizgiyle ve/veya PCR amplifikasyon kontrol çizgisiyle birlikte görünebilir de görünmeyebilir de. Bazen 2 veya daha fazla mikobakteri tarafından birbirine eşlik eden enfeksiyonlar meydana gelebilir, o durumda mikobakteriler için teste dahil edilen 2 veya daha fazla spesifik çizgi (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5, TL6) gözlenebilir. Test sadece bir PCR tübünde birçok PCR uygulamasını gerçekleştirir. PCR karışımı türlerin (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5, TL6) çizgilerinin amplifikasyonu biraz cins çizgisi (TL7) veya PCR kontrol çizgisi (PCRCL) lehine ayarlanmıştır. Bundan başka, Mikobakteri cinsi (TL7) nin amplifikasyonu PCR kontrol (PCRCL) den daha verimlidir. Bu tekniğin karakteristikleri gösterir ki olguda Mikobakteri cinsi için (Figür ) pozitif örnekte PCR amplifikasyon kontrol çizgisi görünür olmayabilir veya herhangi bir mikobakteri türü için pozitif örneklerde PCR amplifikasyon kontrol çizgisi veya cins çizgisi (Figür ) görünür olmayabilir. Bu müstesna durum geçersiz test sonucu değildir. Örnekte bulunan mikobakteriye bağlı olarak aşağıdaki çizgilerde işaret gözlenecektir. Mikroorganizma Spesifik çizgi/ler M. chelonae/m. abscessus complex TL1 Mycobacterium gordonae TL2 M. kansasii TL3 M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. TL4 + TL3 africanum) M. avium/intracellulare/scrofulaceum complex TL5 Mycobacterium fortuitum TL6 Mycobacterium genus TL7 2.-Kit kullanıcısına paket insert ünü dikkatle okuması ve anlaması tavsiye edilmiştir. Güvenilir test sonuçları elde etmek için protokole katı bir şekilde bağlı kalınması gereklidir. Özellikle doğru örnek ve reaktif pipetleme, dikkatli kullanımla birlikte inkübasyon adımlarının zamanlama ve sıcaklıkları doğru sonuçlar için zorunludur. Bu özellikle test protokolünde tanımlanan atanmış alanlarda herbir test adımını gerçekleştirmek için önemlidir. 3.-Mikroorganizmanın belirlenmesi kültürde bulunan organizma sayısına bağlıdır. 4.-Herhangi bir tanı testinde, sonuçlar tüm klinik ve laboratuvar bulgular göz önüne alınarak yorumlanmalıdır. Kit sonuçları klinik değerlendirme ve diğer tanı prosedürleri ile birlikte kullanılabilir. 5.-Bu ürünün kullanımı sadece PCR tekniklerinde eğitilmiş personel ile sınırlandırılmalıdır. 6.-Test kalitatif sonuçlar sağlar. Pozitif sonuç büyüklüğü ve örnekteki mikroorganizma sayısı arasında bir korelasyon oluşturulamaz. 7.-Test katı ortamda (Lowenstein-Jensen, Middlebrook) ve sıvı ortamda (Middlebrook) manuel ve otomatik sistemlerde (Bactec, BacT/ALERT) doğrulanmıştır. Bu test diğer ortam tipleriyle doğrulanmamıştır. 8.-Performans özellikleri tüm genotipler için belirlenmemiştir. 9.-Test sadece seçilen probun genomik bölgelerinin limitleri içerisinde çalışır. Bakteriyel genomların yüksek değişkenliğinden dolayı bazı alt tiplerin belirlenememesi olasıdır. PCR oligolarında veya mikroorganizma DNA dizi problarındaki değişiklikler yanlış negatif sonuçlara neden olabilir. 10.-Negatif test sonucu hedef organizma düzeyinin testin belirleme limitinin altında olduğu durumda dışlanamaz. 11.-Testin içerdiği iç kontrol tüm yanlış negatif test sonuçlarını ortadan kaldırmayacaktır. 12.-DNA amplifikasyon işleminden önce bakteriyel kültürden uygun metod kullanılarak ekstrakte edilmelidir. 13.-Testin yararı klinik numunede direkt olarak gösterilmemiştir. PERFORMANS DUYARLILIK VE SPESİFİKLİK: Analitik Duyarlılık: Mikobakteri saflaştırılmış DNA (gerçek zamanlı PCR ile miktarı belirlenmiştir) seri dilüsyonları negatif örneklerde yapılmıştır. İşleme tabi olmuş ve analizlenmişlerdir. Kit her reaksiyonda DNA nın 20 kopyasına kadar belirleyebilmiştir. Spesifiklik: Sağlıklı donörlerden alınan 50 örnek işleme tabi tutulmuş ve test edilmiştir. Pozitif reaksiyon belirlenmemiştir. TEST İÇİ KESİNLİK: 2 örnek (belirleme limitine yakın bir pozitif ve bir negatif) aynı operatör ile değiştirilmemiş koşullarda tekli testte 5 kez çoğaltılması gerçekleştirilmiştir. Tüm testlerde aynı sonuçlar gözlenmiştir. TESTLER ARASI KESİNLİK: İki örnek (belirleme limitine yakın bir pozitif ve bir negatif) 2 farklı operatör tarafından ardışık 3 günde ayrı ayrı çoğaltılmıştır. Tüm testlerde aynı sonuçlar gözlenmiştir. ÇAPRAZ REAKTİVİTE VE GİRİŞİMLER: Test aşağıdaki mikroorganizmaların ani artış gösteren örnekleriyle kontrol edilmiştir (Streptomyces ambofaciens, Streptomyces gardneri, Streptomyces sampsonii, Nocardia farcinica, Nocardia cyriacigeorgica, Nocardia nova, Nocardia brasiliensis, Propionibacterium acnes, Nocardia terpenica, Rhodococcus equi, Corynebacterium glutamicum, Aspergillusfumigatus, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Brucella SINIRLAMALAR: abortus, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, Haemophilus 1.-Kit kültürden insan örneğiyle kullanılmak için tasarlanmıştır. influenzae, Haemophilus ducreyi, HSV1, HSV2, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis serogroups A, B and C,
5 Rickettsia conorii, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Toxoplasma gondii). Yanlış pozitif sonuç gözlenmemiştir. ETİKETLERDE KULLANILAN SEMBOLLER: 8ºC 2ºC x Laboratuvar içi tanı medikal aygıt Son kullanım tarihi 2-8ºC de saklayın. <X> teste yeterli içerik Parti kodu Katalog numarası Kullanım talimatlarına başvurun <X> µl de kullanıma hazırlayın 7 test çizgisi için okuma kartı 7 test çizgisi için yorumlama kartı Ürün Kontrol Çizgisi PCR Amplifikasyon Kontrol Çizgisi Test Çizgisi 1 Test Çizgisi 2 Test Çizgisi 3 Test Çizgisi 4 Test Çizgisi 5 Test Çizgisi 6 Test Çizgisi 7 Test Çizgisi Örnek Negatif Örnek Pozitif Örnek TL7 için pozitif örnek TL1, TL2, TL3, TL4, TL5, TL6 ve/veya TL7 için pozitif örnek Geçersiz Test KAYNAKÇA: 1. Alcaide Fernández de Vega, F., Esteban Moreno, J., González Martín, J., Palacios Gutiérrez, J. 2005. Mycobacterias. Procedimientos en Microbiología Clínica. 9ª. 2. Blackwood, K. S., C. He, J. Gunton, C. Y. Turenne, J. Wolfe, and A. M. Kabani. 2000. Evaluation of reca sequences for identification of Mycobacterium species. J. Clin. Microbiol. 38:2846-2852 3. Kim, B. J., S. K. Hong, K. H. Lee, Y. J. Yun, E. C. Kim, Y. G. Park, G. H. Bai, and Y. H. Kook. 2004. Differential identification of Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria by duplex PCR assay using the RNA polymerase gene (rpob). J. Clin. Microbiol. 42:1308-1312. 4. Kirschner, P., and E. C. Bottger. 1998. Species identification of mycobacteria using rdna sequencing. Methods Mol. Biol. 101:349-361 5. Kox, L. F., H. M. Jansen, S. Kuijper, and A. H. Kolk. 1997. Multiplex PCR assay for immediate identification of the infecting species in patients with mycobacterial disease. J. Clin. Microbiol. 35:1492-1498 6. Lebrun, L., F. X. Weill, L. Lafendi, F. Houriez, F. Casanova, M. C. Gutierrez, D. Ingrand, P. Lagrange, V. Vincent, and J. L. Herrmann. 2005. Use of the INNO-LiPA-MYCOBACTERIA assay (version 2) for identification of Mycobacterium avium-mycobacterium intracellulare- Mycobacterium scrofulaceum complex isolates. J. Clin. Microbiol. 43:2567-2574. 7. Mäkinen J, Marjamäki M, Marttila H, Soini H. 2006. Evaluation of a novel strip test, GenoType Mycobacterium CM/AS, for species identification of mycobacterial cultures. Clin Microbiol Infect. 12:481-3. 8. Padilla, E., V. Gonzalez, J. M. Manterola, A. Perez, M. D. Quesada, S. Gordillo, C. Vilaplana, M. A. Pallares, S. Molinos, M. D. Sanchez, and V. Ausina. 2004. Comparative evaluation of the new version of the INNO- LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42:3083-3088. 9. Pérez-Martínez I, Ponce-De-León A, Bobadilla M, Villegas-Sepúlveda N, Pérez-García M, Sifuentes-Osornio J, González-y-Merchand JA, Estrada- García T. 2008. A novel identification scheme for genus Mycobacterium, M. tuberculosis complex,and seven mycobacteria species of human clinical impact. Eur J Clin Microbiol Infect Dis;27:451-9. 10. Richter E, Rüsch-Gerdes S, Hillemann D. 2006. Evaluation of the GenoType Mycobacterium Assay for identification of mycobacterial species from cultures. J Clin Microbiol.44:1769-75. 11. Richter, E., M. Weizenegger, A. M. Fahr, and S. Rusch-Gerdes. 2004. Usefulness of the GenoType MTBC assay for differentiating species of the Mycobacterium tuberculosis complex in cultures obtained from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 42:4303-4306. 12. Roth, A., M. Fischer, M. E. Hamid, S. Michalke, W. Ludwig, and H. Mauch. 1998. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rrna gene internal transcribed spacer sequences. J. Clin. Microbiol. 36:139-147. 13. Sanguinetti, M., B. Posteraro, F. Ardito, S. Zanetti, A. Cingolani, L. Sechi, A. De Luca, L. Ortona, and G. Fadda. 1998. Routine use of PCRreverse cross-blot hybridization assay for rapid identification of Mycobacterium species growing in liquid media. J. Clin. Microbiol. 36:1530-1533 14. Springer, B., L. Stockman, K. Teschner, G. D. Roberts, and E. C. Bottger. 1996. Two-laboratory collaborative study on identification of mycobacteria: molecular versus phenotypic methods. J. Clin. Microbiol. 34:296-303. 15. Suffys, P. N., R. A. da Silva, M. de Oliveira, C. E. Campos, A. M. Barreto, F. Portaels, L. Rigouts, G. Wouters, G. Jannes, G. van Reybroeck, W. Mijs, and B. Vanderborght. 2001. Rapid identification of mycobacteria to the species level using INNO-LiPA Mycobacteria, a reverse hybridization assay. J. Clin. Microbiol. 39:4477-4482. 16. Takewaki, S., K. Okuzumi, I. Manabe, M. Tanimura, K. Miyamura, K. Nakahara, Y. Yazaki, A. Ohkubo, and R. Nagai. 1994. Nucleotide sequence comparison of the mycobacterial dnaj gene and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacterial species. Int. J. Syst. Bacteriol. 44:159-166. 17. Tevere, V.T., Hewitt, P.L., Dare, A., Hocknell, P, Keen, A., Spadoro, J.P. and Young, K.K.Y. 1996. Detection of mycobacterium tuberculosis by
6 PCR amplification with pan-mycobacterium primers and hybridization to an M. tuberculosis-specific probe. J. Clin. Microbiol. 34:918-923. 18. Tortoli, E., A. Mariottini, and G. Mazzarelli. 2003. Evaluation of INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2: improved reverse hybridization multiple DNA probe assay for mycobacterial identification. J. Clin. Microbiol. 41:4418-4420. 19. Wu, X., Ahang, J., Liang, J., Yang, Lu, Y., Li, H., Li, C., Yue, J., Zhang, L., and Liu, Z. 2007. Comparison of three methods for rapid identification of mycobacterial clinical isolates to the species level. J. Clin. Microbiol 56: 1898-1903. 20. Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J. and Gilbert, G.L. 2006. Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rrna gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 Mycobacterium species. J. Clin. Microbiol. 44:3544-3550. Sorularınız için lütfen temasa geçin: customerservice@vircell.com REVİZYON TARİHİ: Ocak-09