İçerik Tablosu Türkçe Kullanılan Semboller... 5 Kullanım Amacı... 6 Test Prensibi... 6 Reaktifler... 6 Tanımlama,kullanım için hazırlama ve saklama koşulları... 6 Kit içeriğinde olmayan gerekli materyaller... 9 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 9 Örnekler... 10 Beyanat ve Önlemler... 11 Test Prosedürü... 12 Yıkama Talimatı... 12 Sonuçlar... 13 Validasyon... 13 Test sonuçları... 13 Sınırlamalar... 14 Test performansı... 14 Kesinlik... 14 Klinik Sonuçlar... 15 Sorun Giderme... 15 Kullanılan Semboller Üretici In vitro diagnostik medikal gereç Lot numarası Katalog numarası İle kullanım Kullanım bilgileri Biyolojik risk Sıcaklık sınırlamaları < X > testi için yeterli miktarı içerir Pozitif Kontrol Plate Standard 200x (özel saklama sıcaklıklarından dolayı ayrı kutularda paketlenmiştir 80297) Örnek Diluent Yıkama Solusyonu 25x Konjugat Diluent 1 Konjugat 1 100x Konjugat Diluent 2 Konjugat 2 100x Substrat Buffer Substrat TMB 100x Stop Solusyonu
Kullanım Amacı INNOTEST PHOSPHO-TAU (181P) insan beyin-omurilik sıvısında (BOS) fosforillenmiş tau (PHOSPHO-TAU (181P) ) kantitatif belirlemesini yapan solid-faz enzim immunotesttir. Eğer bu test hasta yönetmek için kullanılıyorsa, herbir laboratuvar Test Performans bölümündeki cut-off değerini teyit etmelidir. Bu test ile elde edilen sonuçlar diğer klinik ve diagnostik bilgilerin kombinasyonları ile kullanılabilir. Test Prensibi INNOTEST PHOSPHO-TAU (181P) testi, ilk monoklonal antikor, HT7 kullanarak fosforile tau protein ve fragmanlarını yakalayan bir solid-faz immunotesttir. BOS örnekleri biotin işaretli antikor, AT270bio ile inkübe edilerek eklenir. Bu antijenantikor kompleksi bir peroxidase-işaretli streptavidin tarafından belirlenir. Substrat çalışma solusyonu eklenmesinden sonra pozitif örnekler bir renk gelişimine neden olurlar. Reaktifler Tanımlama,kullanım için hazırlama ve saklama koşulları - Tüm komponentler 2-8 C de saklanmalıdır, konsantre standartlar ise -15/-25 C ya da daha düşük ısılarda saklanmalıdır. Bu standartlar bu özel saklama koşulları nedeni ile ayrı olarak paketlenmişlerdir. - Eğer önerilen sıcaklıklarda saklanırsa tüm komponentler son kullanma tarihlerine kadar bozulmazlar. - Tüm test materyalleri kullanımdan yaklaşık 30 dakika önce oda sıcaklığına (18-30 C) getirilmiş olmalı ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına (2-8 C) kaldırılmalıdır. Kuyucuklarda su yoğunlaşmasından kaçının, alüminyum folyo oda ısısında bekletilirken sıkıca kapatılmış olmalıdır. 1. 1 kapalı paket bir strip-tutucu ile 12 x 8 kaplı test kuyucukları içerir. Içine kurutucu madde olarak silikajel torba eklenmiştir. Stripleri içeren alüminyum folyo poşet açıldıktan sonra, kullanılmayan herbir test kuyucuğu, silikajel torba ile birlikte kapalı plastic minigrip poşette 2-8 C de 8 hafta saklanabilir. 2. 1 şişe 20 ml Konjugat Diluent 1 (stabilize proteinler ile phosphate buffer ve koruyucu olarak 0.01% methylisothiazolone (MIT) / 0.1% chloroacetamide (CAA) mor renkli buffer solusyonu), Conjugate 1 dilusyonu için kullanılır. 3. 1 şişe 0.3 ml 100x konsantre Konjugat 1 (biotin işaretli anti-phospho-tau (181P) (AT270Bio), stabilize proteinler ve koruyucu olarak 0.01% MIT / 0.1% CAA ile phosphate buffer içinde) kullanmadan önce Konjugat Diluent 1 ile 100x seyreltiniz. Tablo 1: Konjugat çalışma solusyonu 1 hazırlanması Test sayısı 8 16 32 64 96 Konjugat 1 (µl) 10 10 15 20 40 Konjugat Diluent 1 (ml) 1 1 1.5 2 4 Konjugat çalışma solusyonu 1 taze olarak hazırlanmalıdır. 4. 3 şişe 0.3 ml 100000 pg/ml PHOSPHO-TAU (181P) Standard. Standard şişeleri kuru buz ile ayrılmış şekilde -15 C ya da altında saklanarak gönderilmelidir. PHOSPHO-TAU (181P) standard bençte erimesini sağlayın ve vorteks ile karıştırınız. Standartları seyreltmek i.çin polipropilen tüpler kullanın. 500 pg/ml yüksek standart, 100000 pg/ml 200x Örnek Diluent ile seyreltilmelidir. Bu standart ile (500 pg/ml) diğer standartlar Örnek Diluentte bir seri dilusyon ile hazırlanırlar: 250 pg/ml; 125 pg/ml; 62.5 pg/ml; 31.3 pg/ml ve 15.6 pg/ml. Tek standart stok solusyonu eritilmiş olmalıdır ve sonraki kullanımlar için saklanmamalıdır. Seyreltilmiş standartlar da kullanımdan sonra atılmalıdırlar. 5. 1 şişe 30 ml Örnek Diluent (stabilize proteinler ve koruyucu olarak 0.01% MIT / 0.1% CAA ile phosphate buffer), yüksek konsantrasyonda PHOSPHO-TAU (181P) ile örnek ve standartların seyreltilmesi için kullanılır. 6. 1 şişe 60 ml konsantre Yıkama Solusyonu (0.01% MIT / 0.09% CAA içeren phosphate buffer) kullanılmadan önce distile ya da deiyonize su ile 25x seyreltilmelidir. Herbir test kuyucuk stribi için en az 40 ml seyreltilmiş Yıkama Solusyonu kullanın. NOT: Yıkama Solusyonda 2-8 C de bekledikten sonra tuz kristalleri oluşabilir. Bu kristaller, seyreltme yapmadan önce 37 C de dağıtılmalıdırlar. Seyreltilmiş yıkama solusyonu 2-8 C de 4 hafta saklanabilir. 7. 1 şişe 20 ml Konjugat Diluent 2 (koruyucu olarak 0.05% Proclin 300 içeren phosphate buffer yeşil renkli buffer solusyonu),konjugat 2 seyreltilmesi için kullanılır. 8. 1 şişe 0.3 ml Konjugat 2 (koruyucu olarak 0.02% MIT ve 0.02% bromonitrodioxane içeren peroxidase konjugatlı streptavidin) kullanılmadan önce Konjugat Diluent 2 ile 100x seyreltilmelidir. Tablo 2: Konjugat çalışma solusyonu 2 nin hazırlanması Test sayısı 8 16 32 64 96 Konjugat 2 (µl) 20 30 40 80 120 Konjugat Diluent 2 (ml) 2 3 4 8 12 Konjugat çalışma solusyonu 2 taze olarak hazırlanmalıdır.
9. 1 şişe 30 ml Substrat Buffer (0.006% hydrogen peroxide içeren phosphate-citrate buffer), Substrat TMB seyreltilmesi için kullanılır. 10. 1 şişe 0.3 ml konsantre Substrat TMB (DMSO içinde çözülmüş tetramethylbenzidine), kullanımdan önce Substrat Buffer ile 100x seyreltilmelidir. Tablo 3: Substrat çalışma solusyonunun hazırlanması Test sayısı 8 16 32 64 96 Substrat TMB (µl) 20 30 40 80 120 Substrat Buffer (ml) 2 3 4 8 12 Substrat çalışma solusyonu taze olarak hazırlanmalıdır. NOTE: Kullanılmadan önce Konsantre Substrat TMB tamamen erimelidir. (erime noktası 18 C). 11. 1 şişe 30 ml Stop Solusyonu (0.9 N sulfuric acid). 12. 4 yapışkan plate kaplayıcı. 13. 1 plastik minigrip poşet, kullanılmamış striplerin konulması için. Kit içeriğinde bulunmayan gerekli materyaller - Distile ya da deiyonize su. - 10-1000 µl pipetler ve tek kullanımlık pipet uçları. Örnekler, Konjugat çalışma solusyonu, TMB Substrat çalışma solusyonu ve Stop Solusyonu eklenmesi için 25 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl multikanal pipetlerin kullanılması önerilir. - Vorteks mikser. - Örnek sulandırmak ve standart hazırlamak için polipropilen tüpler. - Microplate yıkayıcı (400 µl volümlü tekrar şırıngası ve aspirator kullanılarak alternatif olarak yıkama el ile yapılabilir). - Zamanlayıcı. - Emici dokular. - Fotometrik Okuyucu: 450 nm ve opsiyonel olarak 595 nm, 620 nm ya da 690 nm de okuma yapaliben ve 0-3.000 ya da daha yüksek aralıkta linear absorbansa sahip mikroplate okuyucu. - Çalışma solusyonlarını hazırlamak için tek kullanımlık şişeler. - Potansiyel kontaminasyonlu materyallere uygun biyotehlikeli atık konteyner. Güvenlik ve Çevre Koşulları R36/37/38 S23/24/26 Tahriş edici! (Xi) Gözler, solunum sistemi ve deri için tahriş edicidir. Buharını solumayınız. Deri ile temasından kaçınınız. Gözler ile temas etmesi halinde hemen bol su ile yıkayınız ve doktorunuza başvurunuz. DMSO içeren: Substrat TMB 100x. Tahriş edici! (Xi) Deri teması hassasiyete neden olur. R43 Deri ile temasından kaçınınız. Koruyucu eldiven kullanınız. S24-37 0.1% 2-chloracetamide içeren: PHOSPHO-TAU (181P) Standart 200x, Örnek Diluent, Konjugat Diluent 1, Konjugat 1 100x. Koroziv! (C) Yanmaya sebep olur. Deri ile temas etmesi halinde hemen R34 S28- bol su ve sabun ile yıkayınız. Koruyucu giysi, eldiven ve göz/yüz 36/37/39-45 giyiniz.bir kaza olduğunda ya da kendinizi kötü hissederseniz Doktorunuza başvurun.(etiketi gösterin) H 2 SO 4 içeren: STOP SOLUSYONU. - Lütfen Material Safety Data Sheet (MSDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz.. En son güncellenen MSDS versiyonu www.innogenetics.com websitesinde yer almaktadır. - Test metodu BOS örneklerinin enfeksiyon ajanlarını geçirmeyeceğine dair garanti vermemektedir. Bu nedenle, tüm BOS örnekleri ve biyolojik materyallerinin potansiyel enfeksiyon ajanı olduğu göz önüne alınarak kullanılmalıdır. Sadece yeterince tecrübesi olan personel bu testi çalışmalıdır. Tüm BOS örnekleri ve biyolojik materyaller güvenlik koşullarına uygun olarak atılmalıdır. 121 C de 15 dakika otklavlanmalıdır. Tek kullanımlık materyaller yakılmalıdır. Sodyum hipokloritli miks likit atıkların son konsantrasyonu ± 1% sodyum hipoklorit olmalıdır. Atmadan önce bir gece bekletiniz. ÖNLEM: asit içeren likitlere sodium hipoklorit eklemeden önce nötralize ediniz. - Bu kit Stop Solusyonu olarak 0,9N sülfirik asit içerir. - Konjugat 2 koruyucu olarak MIT/Bromonitrodioxane içerir. Konjugat Diluent 2 koruyucu olarak Proclin 300 içerir. - Tehlikeli ya da enfeksiyonlu ajanlar ile çalışılırken koruyucu giysiler; eldiven ve koruyucu gözlük kullanılması gereklidir. - Atıklar hastanelerin atılım talimatlarına göre yok edilmelidir. Kamusal ve çevresel düzenlemelere uyulmalıdır. Örnekler - İnsan beyin-omurilik sıvısı -20 C (-80 C tercihen) de saklanmalıdır, serbest hücreler polipropilen tüplerde toplanmalıdır. Hemolitik olmayan. - Bu test serum taraması veya hücre kültür süpernatantları için kullanılamaz. - Devamlı dondurup çözdürmekten kaçınmak için örnekleri alikuatlamanız önerilir. - OD 450 değeri en yüksek standardın üzerinde olan BOS örnekleri, doğru seviyelerde ölçebilmek için Örnek Diluent ile seyreltilmelidir.
- Test yapılmadan önce örneklerin çözülmemiş kısımları 2000 g de 10 dakika santrfüj ile ortadan kaldırılmalıdır. Beyanat ve Önlemler - Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayınız. - Kit içeriğindeki reaktifleri birbirine karıştırmayınız, farklı lot numarasındaki komponentleri kullanmayınız. - Tüm kanallar Konjugat Çalışma Solusyonu ve Substrat Solusyonu hazırlanmasından sonra distile su ile iyice temizlenmelidir. - Kontaminasyonu önlemek için plate kenarlarına dokunmayınız. - Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçınınız. - Kullanmadan önce örnekler ve kontrollerin homojen olduğundan emin olun. - Herbir örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Örneklerin kuyucuklara eklendiğinden emin olun. Örnek eklenmesi (standart ve blank değil) renk değişiminin gözlenmesi ile teyit edilmelidir (mor renk maviye döner). - Kontaminasyonu önlemek için örnek ya da konjugat yüklerken kuyucukların kenarlarına pipet ucu ile değmeyiniz. - Hava baloncuklarını pleyte hafifçe vurarak yok ediniz. - İnkübasyon ya da saklama sırasında Substrat Solusyonunu güçlü ışık altında açıkta bırakmayın. Substrat ile inkübasyon sırasında plate karanlıkta bekletilmelidir. Substrat Solusyonu kullanılırken renksiz olmalıdır. Eğer solusyon maviye dönerse değiştirilmelidir. - Stop Solusyonu, Substrat Buffer solusyonu, Konjugat çalışma solusyonu 1 ya da Konjugat çalışma solusyonu 2 istenmeyen renk değişimlerini önlemek için metal veya metal iyonları ile temas etmemelidir. - Yıkama sonrasında eğer kuyucuklar hemen konjugat ya da substrat ile doldurulmamış ise, emici doku üzerine ters çevrilmeli, 15 dakikadan uzun olmayacak şekilde Yıkama Solusyonu ile ıslatılmalıdır. - Reaktif çalışma solusyonlarını hazırlarken kan toplama tüplerini kullanmayınız. Test Prosedürü Lütfen teste başlamadan önce Beyanat ve Önlemler kısmını okuyunuz. Tüm test materyallerinin kullanmadan önce oda sıcaklığına (18 to 30 C) getirilmiş olduğundan emin olunuz. 1. Gerekli sayıda stribin üzerindeki koruyucuları alın, herbir test çalışması için 6 standart ve bir blank kuyucuğu içermelidir. Standartlar ve blank iki kopya çalışılmalıdır. Tercihen örnekler de iki kopya çalışılabilir. 2. Herbir test kuyucuğuna 25 µl Konjugat çalışma solusyonu 1 ekleyiniz. Uygun kuyucuklara 75 µl örnek ya da standart ekleyiniz. BOS örnekleri kullanılmadan önce vortekslenmelidir. Blank hariç herbir kuyucuğa 75 µl Örnek Diluent ekleyiniz. Miks, dikkatlice pleyt sallanarak ya da plate shaker (1000 rpm) kullanılarak karıştırılmalıdır. Stripleri yapışkan kaplayıcı ile kapatın ve 2-8 C de bütün gece 14-18 saat inkübe ediniz. 3. Herbir kuyucuğu 5 kez yıkayınız (Yıkama Talimatlarına bakınız). 4. Herbir kuyucuğa 100 µl Konjugat çalışma solusyonu 2 ekleyiniz. Stripleri yeni yapışkan kaplayıcı ile kapatınız ve oda ısısında (18-30 C) 60 ± 5 dakika inkübe ediniz. 5. Herbir kuyucuğu 5 kez yıkayınız (Yıkama Talimatlarına bakınız). 6. Herbir kuyucuğa 100 µl Substrat çalışma solusyonu ekleyiniz ve oda ısısında ve karanlıkta (18-30 C) 30 ± 3 dakika inkübe ediniz. 7. Reaksiyonu durdurmak için, Substrat Solusyonu ile aynı sekansta ve aynı zaman aralığında herbir kuyucuğa 50 µl Stop Solusyonu ekleyiniz. Strip tutacağını miksin tam üzerini kapattığından emin olacak şekilde dikkatlice kapatınız. 8. 7. adımdan sonra 15 dakika içinde kuyucuklardaki solusyonların absorbanslarını 450 nmde mikroplate okuyucu da okutunuz. Yıkama Talimatı En etkili otomayıkama performası: Columbus M8/2ch Tecan. Protokol talep üzerine verilir. Diğer yıkayıcı ve protokoller için aşağıdaki otomatik yıkama önerilerine dikkat ediniz: - Seyreltilmiş yıkama solusyonu ile yıkayıcıya önyıkama yaptırınız. - 5 yıkama siklüsüne ayarlanmalıdır: 400 µl/kuyucuk miktarında yükleyin. Doldurma yüksekliğini kuyucuğun tamamı olarak ayarlayınız. Bir aspirasyon/yıkama/ıslanma siklüsü yaklaşık 30 saniye sürmelidir. Aşağıda manual yıkama adımları bulunmaktadır: - Tüm kuyucuklardaki sıvıyı tamamen aspire edin, aspiratörün ucu ile kuyucukların dibinde kalanları da çekin. - Kuyucuk yüzeyine zarar vermemeye dikkat edin. - Herbir aspirasyondan sonra pleyti ters çevirin ve emici dokular üzerinde sertçe vurun. - Kuyucukları 400 µl seyreltilmiş Yıkama Solusyonu ile doldurun. - En az 30 saniye ıslanması için bekleyin ve sıvıyı aspire edin. - Bu adımları 5 kez tekrarlayın. - Yıkama tamamlandıktan sonra pleyti ters çevirin ve emici dokular üzerinde sertçe vurun. Tamamlanmamış yıkama, sonuçları olumsuz etkileyecektir. Yıkama solusyonunun ve yıkayıcının kontamine olması kapsamlı problemlere neden olabilir.
Bir problem oluştuğunda, yıkama şişesi ve yıkayıcıyı uygun dezenfeksiyon solusyonu ile gece boyu dezenfekte ediniz. Sonuçlar Validasyon - BOS örnekleri Konjugat çalışma solusyonu 1e eklendiğinde mordan mavi renge değişim olduğundan emin olunuz. - Kişisel blankin (Örnek Diluent) 450 nm de absorbansı 0.100 den düşük olmalıdır. NOT: - Test sonuçlarını etkilemeyecek şekilde çiftl dalgaboylarının (450 nm, 595 nm, 620 nm ve 690 nm) absorbans değerleri, tek dalgaboyu değerlerinden yaklaşık 50 mod fazla olmalıdır. OD değeri en az 2.3 OD olmalıdır. Bununla beraber, bu değer OD-okuyucu kullanımına bağlıdır ve gerçek validasyon kriteri olarak kullanılamaz. Test sonuçları Standart solusyonların ve bilinmeyen örneklerin ortalama absorbanslarını ölçünüz. OD değerleri 20% den fazla farklı ise testi tekrar ediniz. Standart solusyonların her biri dikey (Y) aksiste ve ilişkili konsantrasyonların yatay (X) aksiste olduğu ortalama absorbans değerleri grafiğinden standart eğriyi işaretleyiniz. Bu noktalardan en iyi uygun eğriyi çiziniz. NOT: - Uygun bir sigmoidal eğri gerekmektedir (çeşitli eğimler, dört parametreli lojistik denklem ya da Logit-Log ile sigmoidal doz-cevap). Herbir bilinmeyen BOS örneğinin ortalama absorbans değerini kullanarak pg/ml olarak PHOSPHO-TAU (181P) ilişkili konsantrasyonunu belirleyiniz. Sadece absorbanslar standart eğri limitleri içinde ise örnek konsantrasyonları belirlenebilir.en yüksek noktaya uzanan ya da en düşük noktaya inen uygun değerler ile anormal olarak ölçülen konsantrasyonları düzenleyebilirsiniz. Sınırlamalar INNOTEST PHOSPHO-TAU (181P) insan beyin-omurilik sıvısında PHOSPHO-TAU (181P) kantitasyonu için dizayn edilmiştir. Diğer vucüt sıvıları ile test performansı hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu nedenle, bu örneklerin çalışılması önerilmez. Test Performansı Kesinlik Kesinlik 3 ardışık topluluğun internal değerleri ve bir topluluğun eksternal gelişimine dayanarak belirlenmiştir. Kesinlik, ± 25 pg/ml (LLOQ, kantitasyonun düşük sınırı) den 250 pg/ml (ULOQ, kantitasyonun yüksek sınırı) ye kadar olan bölgede %10 dan düşük olarak bulunanve normal çalışma bölgelerinde [25-150 pg/ml] tipik olarak %5 ten düşük bulunan konsantrasyonda kesin olmayan %CV değerleri tarafından ifade edilir. Belirleme limiti (LOD) en düşük standarda yakın olarak 15.6 pg/ml. %CV tekrar edilebilirliği %5 den düşük olarak bulunmuştur. Interlot (R) değişkenliği 10% dan düşüktür. Laboratuvarlar-arası deneme değişkenliği (5 lab; normal çalışma bölgelerinde farklı konsantrasyon seviyelerinde 3 örnek), üç farklı konsantrasyon seviyesinde laboratuvar-içi değişkenlik için %CV < 5% olduğunu ve laboratuvarlar-arası değişkenlik için %CV ortalamada %10 olduğunu göstermiştir. Klinik Sonuçlar Eksternal validasyon çok merkezli bir çalışma, 76 Alzheimer hastasında (AD), 53 kontrol deneğinde (CS) ve 52 Lewy cismi ile bunama vakasında(dlb) PHOSPHO-TAU (181P) konsantrasyonlarını belirlemek için yapılmıştır. PHOSPHO-TAU (181P) konsantrasyonları diğer gruplar ile karşılaştırıldığında AD-grubunda önemli bir artış olmuştur. 61 pg/ml cut-off da aşağıdaki sonuçlar alınmıştır: AD-CS: Özgünlük = 87% Duyarlılık = 80% AD-DLB: Özgünlük = 79% Duyarlılık = 80% Bu sonuçlar, Alzheimer hastalığını Lewy cismi ile bunamadan ayırt etmek için kullanılan markır olarak ilk interval gelişmede bulunan ayırt edici değeri teyit etmektedir (In: Alzheimer's Disease: Advances in Etiology, Pathogenesis and Therapeutics. Edited by K Iqbal, SS Sisodia and B. Winblad, John Wiley and Sons, Ltd., Chichester, 2001: 285-291). Sorun Giderme Çok düşük OD değerleri Olası nedenler Çözüm CSF örneklerinin yanlış saklanması.
Uzun süreli saklamalar için CSF -20 C ya da düşük ısıda saklayın. CSF toplamak ve saklamak için polipropilen tüpler kullanın. Farklı lotlardaki komponentlerin karıştırılması. Aynı lottaki komponentleri kullanarak testi tekrar ediniz. Pipetlerin ya da otomasyonlarının iyi olmaması. Sadece kalibrasyonlu pipetler kullanınız. Örnekler ve blankler için çok yüksek OD değerleri Olası nedenler Çözüm Konjugat çalışma solusyonu 2 ve Substratın kontaminasyonu. Konjugat çalışma solusyonu 2 ve Substrat hazırlarken temiz konteyner kullanın. Düşük üretim Olası nedenler Çözüm Kontamine olmuş pipet uçları. Herbir örnek için temiz uç kullanın. Plate üzerinde örnek konteynerinin açılması ile mikrotiter plate kontaminasyonu. Örnek konteynerini mikrotiter plate üzerinde açmayınız. Yapışkan kaplayıcıyı çıkarırken bir kuyucuktan diğerine kontaminasyon. Plate kaplayıcıyı dikkatlice çıkarın ve herbir inkübasyon aşaması için yeni bir tane kullanın. Yıkayıcının kontaminasyonu. Yıkama solusyonu kabını ve yıkayıcıyı uygun dezenfektan ile dezenfekte edin ve su ile yıkayın. Örnekler ve kontrollerin Örnek diluent ile yeterli miktarda karışmaması. Örnekler ve kontroller Örnek diluent ile 1000 rpm de mikrotiter plate shaker ile yada pleyti nazikçe sallayarak tamamen karıştırılır.