Dönem Adı: 2 Dilim Adı: Kan-Lenfoid Dersin Adı: Kök hücre teknolojisi ve yeni açılımlar Sorumlu Öğretim Üyesi: Prof.Dr. Işıl Albeniz Sorumlu Öğretim Üyesi ABD: Biyofizik Anabilim Dalı Amacı: Günümüzde hızla gelişen, tedavi ve teşhiste kullanılmak üzere geliştirilen kök hücre tekniklerini öğretmek. Kök hücrelerin saflaştırmasında tercih edilen yöntemler hakkında bilgi kazandırmak. Öğrenim hedefleri: Bu dersin sonunda öğrenci; - Kök hücreleri farklı saflaştırma yöntemleri kullanılarak elde etme yöntemlerini anlayabilmeli, -Kök hücre izolasyonunda ALDH ( Aldehid dehidrogenaz) etkinliğinin önemini kavrayabilmeli, -İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler ( IPS ) ve UygulamalarıKökhakkında bilgi sahibi olmalı, - Çeşitli teknikler kullanılarak elde edilen kök hücrelerin kliniğe uygulamalarındaki sorunları bilmeli, - Kök hücrenin tedavi amaçlı kullanımı ve somatik hücre çekirdek transferi (Somatic cell nuclear transfer SCNT) tekniğini açıklayabilmeli. Kök hücre teknolojisi ve yeni açılımlar Tüm tarih boyunca insanoğlunun en büyük hedeflerinden birisi sağlıklı ve uzun yaşamak olmuştur. Her geçen gün ilerleyen teknoloji ile birlikte hastalık sayısıda artmıştır. Teknoloji geliştikçe mi hastalıklar arttı, yoksa hastalıklar arttığı için mi teknoloji gelişmek zorunda kaldı? Bu soru günümüzde tartışılırken, insanlığın en güçlü arzularından biri olan ölümsüzlük bilim adamlarının çalışmalarına yön vermektedir. Ölümsüzlüğü temel alan ve hastalıklara da çare bulma arayışında olan bilim adamları bu yolda kök hücre ile bilimsel çalışmalara hız vermişlerdir. Kök hücre basitçe düşünüldüğünde yaşamın kaynağıdır. Dr. Rudolph Virchow un dediği gibi Her hücre bir hücreden meydana gelir - Omnis cellula e cellula. Bu zincirin en başında da döllenmiş hücre (zigot) bulunur. Yani döllenme sonrası oluşan hücre (zigot) tek başına tüm organizmayı meydana getirebilecek genetik bilgiye ve güce sahiptir. Vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilecek potansiyele sahip olan bu ilk embriyonel hücreye "totipotent" herşeyi yapabilen anlamında hücre denilmektedir. Döllenmeden 6-7 gün sonra meydana gelen hücrelerden herhangi biri alınıp rahime yerleştirilirse bu hücre artık bir insan oluşturamaz. Yani beşinci günden sonra oluşan hücreler her hücre türüne dönüşebilecek güce sahiptir ve gerekli ortam sağlandığında bu hücreler bilinen yaklaşık 200 hücre türüne dönüşebilirler. Ancak bu hücreler artık tek başlarına tüm organizmayı oluşturamazlar. Bu nedenle bu hücrelere "pluripotent" hücre denilir(şekil 1). Şekil 1 Bir hücrenin kök hücre tanımına uyabilmesi için üç temel kriteri yerine getirmesi gerekir.-kendini yeniliyebilme.-farklı hücrelere dönüşebilme.-in vivo şartlarda uygulandığı dokuyu fonksiyonel olarak destekliyebilme. Bu özelliklere göre, kök hücreler, bölünerek kendini yenileyen ( self-renewal ) sayılarını devamlı sabit tutan kan, karaciğer ve kas gibi özelleşmiş, görev yapan organları oluşturabilen ve farklılaşma yeteneğinde olan primitif nitelikte olan hücrelerdir. Vücudumuzdaki kas, cilt, karaciğer hücrelerin belli bir hedefi vardır. Bölündüklerinde yine kendileri gibi bir hücre oluştururlar. Bundan farklı olarak, kök hücrelerin bu şekilde belirlenmiş bir görevi yoktur. Aldıkları sinyale göre farklı hücre türlerine dönüşürler. Bunu kontrol eden unsurlarsa genlerdir. Bir kök 1
hücresinin hangi hücreye dönüşeceğini hücre çekirdeğindeki genler belirler. Diğer hücreler ölünce veya hasar görünce, kök hücreler hangi hücre türüne ihtiyaç varsa o hücreye dönüşler. Bu işlem sırasında bazı genler daha aktif hale gelirken, bazıları da baskılanır. Kendisini yenileme gücüne sahip olan kök hücreler, bir bakıma diğer hücre türleri için tükenmez bir kaynak görevi üstlenirler. İlk olarak 1998 yılında insan embriyosundan kök hücre elde edilip kültürlerde çoğaltılmasından sonra kök hücre araştırmaları hız kazanmıştır. Değişik hücre türlerine dönüşebilme potansiyeli olan kök hücreleri, kontrol edilebildikleri taktirde laboratuar ortamında istenilen hücre türüne dönüştürülebilirler. Vücutta eskiyen, hastalanan veya ölen hücrelerin veya organların yerini doldurmak üzere laboratuarda kök hücrelerinden yeni hücreler, hatta yeni bir organ elde edilebilir. Ancak bunu başarabilmek için hücrenin genetik şifresini ve kontrol mekanizmalarını çok iyi bilmek gerekir. Kök hücrelerde çok aktif telomeraz faaliyeti ve buna bağlı uzun telomer zinciri vardır. Bu nedenle kök hücreler çok uzun sürelerle bölünerek kendilerini kopyalayabilirler. Anne karnındaki embriyonun daha sonraki gelişim aşamalarında hücreler biraz daha özel görevlere sahip olurlar ve erişkin kök hücrelerine dönüşürler. Bu erişkin kök hücreleri de belirli hücre türlerini meydana getirir. Örneğin kan kök hücresi kemik iliğinde bulunur ve gerektiğinde beyaz kan hücreleri, kırmızı kan hücreleri ve kanın pıhtılaşmasında görev alan trombositlere dönüşürler. Aynı şekilde deri kök hücreleri de değişik deri hücrelerine dönüşebilirler. Biraz daha özelleşmiş olan bu kök hücrelere "multipotent" (çok yetili) hücre denir. İnsan vücudunda ancak belirli birkaç hücre türüne dönüşebilen yetişkin kök hücreleri, laboratuar koşullarında gerekli ortam ve sinyaller sağlandığında çok daha fazla hücre türüne dönüşebilirler. Kök Hücrelerinin Araştırmada Kullanımı: *Totipotent/pluripotent özellikleri nedeniyle;-embriyonal gelişme mekanizmalarının incelenmesinde, -Hastalıkların ("knock-out deney hayvanlarının örneğinde olduğu gibi) modellenmesinde, -İlaç geliştirme, toksisite deneylerinin gerçekleştirilmesinde - Gen kontrol ve gelişmesi ile ilgili deneylerde.* Çok yönlü farklılaşabilme, aktarıldıkları dokuların hücrelerine dönüşebilme yetkinlikleri nedeniyle;-haraplanmış doku ve organların onarımında; Örneğin; farklılaşmış hücrelerin, dokuların kaybıyla gelişen (dejeneratif) hastalıklarda (parkinson, Alzheimer ya da diyabet gibi)- Travma ya da iskeminin yol açtığı doku tahribatının onarımında; enfaktüs sonrası miyokard kaybı ve yetmezliğinin ya da felcin tedavisinde.* Kök hücresi kaynakları- IVF uygulamalarından arta kalan embriyolar- Fetusun tahliyesiyle elde edilen dokular - Kordon kanı hücreleri - Erişkinlerde elde edilen pluripotent hücreler (örneğin kemik iliği hücreleri) Doku uyuşmazlığı sorunları:*doku aktarım şekilleri -Otograft (Donöre geri ekleme) -İsograft (Aynı genetik yapıya sahip singenik bireylerarası aktarım)-allograft (=Homograft; aynı türden, ancak farklı genetik yapıda alogenik bireyler arası aktarım) - Ksenograft (=Heterograft; farklı türden bireyler arası aktarım.)yaşam ne zaman başlar? Sorusunun yanıtlanması gereği.doku uyuşmazlığı sorunu için önerilen çözüm,tedavi amaçlı klonlama ile insan klonlama nın (reproductive cloning) aynı metodolojiye dayanması. Tedavi amaçlı klonlamada amaç, kişiye özel kök hücreleri üretmektedir. Kök hücreleri yetişkin canlıda bulunan farklılaşmış hücre tiplerinden herhangi birine dönüşerek bozulmuş ya da hastalıklı dokuları yenileme özelliği sergiler. Eğer kök hücresi kişinin kendi genetik materyalini taşımıyorsa bu uyumsuzluk hücrelerin hasta tarafından reddedilmesine yol açar. Önerilen çözüm, Alıcı bireyin somatik hücre çekirdeğinin donör niteliğindeki yumurta hücresine yada totipotent hücreye aktarımı. Yani çekirdeğinden yoksun yumurta hücresine bir somatik hücre çekirdeğinin aktarılması ve böylece oluşturulan diploit hücrenin kültürde çoğaltılmasıyla elde edilen kök hücrelerinin yitirilmiş doku yenilenmesinde kullanımı. (Somatic cell nuclear transfer SCNT Tedavi amaçlı klonlama ( therapeutic cloning)) (Şekil 2). Kök hücre türleri: Embriyonel kök hücreler: Blastosit evresindeki embriyolardan köken alan ve herhangi bir hücreye farklılaşma kapasitesine sahip (pluripotent) olan kök hücreler. 2
Erişkin kök hücreler: Farklı dokularda bulunan ve genelde bulundukları dokuya özgü hücrelere farklılaşma kapasitesine sahip postnatal dönemdeki kök hücreler. Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts. Science 308(5729):1777-1783, 2005. Şekil 2. Somatik hücre çekirdek transferi (Somatic cell nuclear transfer SCNT) Uyarılabilir İndüklenmiş Pluripotent Kök hücreler (ips Hücreleri): Bu hücreler tanım olarak pluripotent özellik kazanmış somatik hücrelere denir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre, pluripotent olmayan bir hücreden, bazı genleri üretmesi sağlanarak veya dışarıdan faktörler verilerek, farklılaşmanın tersine çevrilmesi sonucu elde edilen hücrelerdir. Yani, somatik hücreler Oct4, Sox2, cmyc ve Klf4 gibi birtakım transkripsiyon faktörlerinin kombinasyonunun ilave edilmesi ile yeniden programlanırlar. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler birçok yönüyle doğal pluripotent kök hücrelere (örn. Embriyonik kök hücrelere) benzer. Farklılaşabilirler, blastosiste enjekte edildiğinde yeni oluşan bireyin vücut hücrelerine katkıda bulunabilirler ve yetişkin bir canlıda teratom oluşturabilirler. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler ilk olarak Shinya Yamanaka nın çalışma grubu tarafından 2006 yılında Kyoto Üniversitesi nde üretildi. Araştırmada, embriyonik kök hücrelerde önemli olduğu saptanan transkripsiyon faktörlerinden 24 tanesi seçildi. 1. Takahashi, K; Yamanaka, S (2006). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors". Cell 126 (4): 663 76. PMID: 16904174 Fare fibroblastlarına retroviral transfeksiyon yöntemiyle önce bunların tamamı akratılarak pluripotent hücreler elde edildi, daha sonra tek tek çıkarılarak en önemli 10 tanesi ve bunların içinden 4 tanesi seçildi. Fibroblastlara yalnızca bu 4 genin (Oct4,Sox2,cMyc ve Klf4) aktarılmasının onları pluripotent hale getirildiği saptandı. Cell dergisinde yayımladıkları makale ile yetişkin bir fareden alınmış farklılaşmış fibroblast hücrelerinin özel koşullarda yeniden programlanması ile kök hücre özelliği kazanabilecekleri gösterilmiştir. İnsan derisi, saç gibi her insandan kolayca alınan örneklerle elde 3
edilebilen ips hücreleri, laboratuvar ortamında gençleştirildikten sonra hastanın zarar görmüş organlarına veya vücudundaki çeşitli bölgelere adapte edilerek onarım işlevi görebilmektedirler. Bu hücreler hastanın kendisi ile aynı genetik yapıya sahip olduklarından vücut tarafından reddedilmezler. Bu önemli özellik ips hücre araştırmalarında son 3 yılda meydana gelen artışın en önemli sebebini oluşturur. Bu hücreler şu ana kadar embriyonik hücrelerin yaptığı herşeyi yapabilirler. Yetişkin kök hücre farklılaşmış doku yada organ hücreleri arasında bulunan kendini yenileyebilen dokunun yada organın özel hücre tiplerini elde etmek için farklılaşmamış bir hücredir.hematopoetik kök hücreler(hkh);myeloid seri ve lenfoid seriden tüm kan hücre tiplerine dönüşebilen multipotent kök hücrelerdir.hematopoetik kök hücre nakli (transplantasyonu) (HKHN) için kök hücreler sıklıkla kemik iliği periferik kan dan elde edilirken kordon kanı üçüncü bir kök hücre kaynağını oluşturmaktadır. Hematopoetik kök hücrelerin en önemli özellikleri kendi kopyalarını yaparak yine bir kök hücre olarak yollarına devam etme veya diferansiye olup bir progenitör hücre dizisine dönüşerek bir çok matür hücre oluşturabilmeleridir. Kök hücre teknolojisi ve açılımları: Akım sitometride analiz (Facs Yöntemi) MACS yöntemi Floresan İşaretleme Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Yeşil Floresans Protein Yöntemi (GFP) Floresansla etkinleştirilmiş hücre ayrımı, milyonlarca hücrenin arasındaki birkaç kök hücreyi tespit etmek için bu teknik kullanılır. İşaretli süspansiyon örnekler basınçlı olarak çok dar bir geçiş noktasına yönlendirilir. Buradan geçen hücreler, teker teker bir ışık kaynağının önünden ve hemen ardından da elektrik yüklü bir sahadan geçirilir. Floresanlı hücreler negatif ve floresanssız hücreler pozitif elektrikle yüklenir. Yük farkı, kök hücrelerin diğer hücrelerden ayrılmasını sağlar. Bu işlem sonrasında, aynı belirteç özelliklerine sahip bir hücre topluluğu elde edilmiş olur. Bu yöntemde floresan boya ile işaretli monoklonal antikorlarla tanınabilen hücre yüzey proteinlerinden yararlanılır. Bunun için kök hücrelerin üzerinde bulunan bazı belirteçler kullanılır. İnsan HKH si için tanınmış belirteçlerden bazıları; Lin,CD34,Cd38,CD43,CD45RO,CD45RA,CD59,CD109,CD117,CD133,CD166,HLA-DR şeklindedir. Klinik çalışmalarda insan HKH leri için temel olarak CD34 belirteci kullanılır.cd34 pozitif hücre topluluğu, HKH açısından oldukça zengin olmasına karşın diğer hücre tiplerini de içermektedir. İnsan kök hücreleri genel olarak CD34 gibi yüzey belirteçlerinin anlatımı ile karakterizedir. Fakat hematopoetik kök hücrelerin tümünde CD34 anlatımı görülmeyebilir. Bu nedenle insan kök hücrelerini tamamen fenotipik hücre yüzey moleküllerine dayanmadan etkin olarak saptayan metodlara ihtiyaç vardır. Bu metodlardan retinoid metabolizması ve HKH lerin siklofosfamid gibi alkilleyici ajanlara direcinde rol oynayan sitozolik Aldehid dehidrogenaz etkinliği (ALDH) dir. İnsan hücrelerine toksik olmayan Aldefluor substratı; insan hücrelerinin çoğalma fonksiyonunu değiştirmez. Deoksiribonükleik asit (DNA) arasına girmez. Sonuç olarak ALDH aktivitesine bağlı izolasyon DNA ya bağlanan boyalarla seçime kıyasla relatif olarak daha güvenli olarak gözükmektedir. Değişken hücre yüzey molekülleri kullanmadan kök hücreleri diğer dokulardan ayırmada standart bir yöntem sağlayabilir. MACS (magnetik alanla aktive edilmiş hücre ayrımı):bu teknik pozitif seleksiyon ve negatif seleksiyon sağlama kapasitesine sahiptir. Nanogram ağırlığında manyetik bilyeler ile birleştirilen antikorlar, zenginleştirilmek istenen hücrelere yöneltilir. 4
Şekil 3 İstenen hücre tipine bağlanması beklenen bilyeler solüsyondaki hücrelerin geçişi esnasında manyetik bir alanda alıkonulur (Şekil 3). Antijenden yoksun olan hücreler ise, bilyelere bağlanamaz ve manyetik alanda tutulamaz ve engelsiz geçip atılır. Nanogram ağırlığında manyetik bilyeler ile birleştirilen antikorlar, zenginleştirilmek istenen hücrelere yöneltilir. İstenen hücre tipine bağlanması beklenen bilyeler solüsyondaki hücrelerin geçişi esnasında manyetik bir alanda alıkonulur (Şekil 3). Antijenden yoksun olan hücreler ise, bilyelere bağlanamaz ve manyetik alanda tutulamaz ve engelsiz geçip atılır. Bilimsel çalışmalarda, akım sitometresi (Facs) yerine, mikroskop kullanımı da tercih edilir. Floresan etiket ile işaretli sinyal molekülleri kök hücre belirteçlerine bağlanır. İşaretlenen bu belirteçler, daha sonra ya özel bir ışık kaynağıyla veya kimyasal bir tepkimeyle etkinleştirilir. Bu işlemler sonrasında kök hücreler mikroskop altında rahatça görülebilen bir floresans ışıma verir. Kök hücrelerle tedavi edilebilen hastalıkların bazıları, Kalp rahatsızlıkları Sinir sisteminde meydana gelen bozukluklar, otoimmün rahatsızlıklar, diabet, Parkinson, Alzheimer, eklem romatizması gibi. Kaynaklar 1-Orkin,S.H.,Zon, L.I.(2008)Hematopoiesis: An Evolving Paradigm for Stem Cell Biology. Cell 1 2: 44. 2-Lagasse E,Cannors H,Al-Dhalimy M,Reitsma M,Dohse M,Osborne L,Wang X,Finegold M, Weismann IL, Grompe M. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 2000; 6: 1229-1234. 3-Clarke DL, Johansson CB, Wilbertz J, Veress B, Nilsson E, Karlstrom H, Lendahl U, Frisen J. Generalized potential of adult neural stem cells. Science. 2000; 288(5471): 1660-1663. 4-Wurmser AE, Gage FH. Stem cells: cell fusion causes confusion. Nature. 2002; 416(6880): 485-487. 5-Herzog EL, Chai L, Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 2003; Nov 15; 102(10): 3483-3493. 10-TÜBA. Kök Hücre Biyolojisi ve Klinik Uygulamalar. 11-http://stemcells.nih.gov/info/2001report/2001report 12- Temel Kök Hücre Teknikleri ve Moleküler Biyoloji Uygulamaları Kurs Kitabı.Kocaeli Üniversitesi 5