T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ İLAÇ KEŞFİ VE GELİŞTİRİLMESİNDE KÖK HÜCRENİN YERİ. Hazırlayan Harun KARADUMAN

Transkript

1 1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ İLAÇ KEŞFİ VE GELİŞTİRİLMESİNDE KÖK HÜCRENİN YERİ Hazırlayan Harun KARADUMAN Danışman Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK Eczacılık Temel Bilimleri Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2012 KAYSERİ

2 2 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ İLAÇ KEŞFİ VE GELİŞTİRİLMESİNDE KÖK HÜCRENİN YERİ Hazırlayan Harun KARADUMAN Danışman Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK Eczacılık Temel Bilimleri Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2012 KAYSERİ

3 i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Harun KARADUMAN

4 ii Harun Karaduman tarafından Yrd. Doç. Dr. Haydar Çelik danışmanlığında hazırlanan İlaç Keşfi ve Geliştirilmesinde Kök Hücrenin Yeri konulu bitirme ödevi Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi tarafından kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Harun KARADUMAN Danışman Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK Eczacılık Temel Bilimleri Anabilim Dalı Başkanı Doç. Dr. Nalan İMAMOĞLU ONAY: Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın tarih ve... sayılı kararı ile onaylanmıştır..../.../... Prof. Dr. Müberra KOŞAR Fakülte Dekanı

5 iii TEŞEKKÜR Bu çalışmamda öncelikle bilgi ve birikimiyle bana her daim yol gösteren hocam Yrd. Doç. Dr. Haydar Çelik e, bu süreçte bana daima destek olan arkadaşlarım Mustafa Gökerik ve Mehmet Gezer e ve maddi ve manevi desteklerini hiç esirgemeyen sevgili babam Ayhan Karaduman ve annem Nimet Karaduman a teşekkür ediyorum.

6 iv İLAÇ KEŞFİ VE GELİŞTİRİLMESİNDE KÖK HÜCRENİN YERİ Harun KARADUMAN Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi, Mayıs 2012 Danışmanı: Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK ÖZET Kök hücreler kendi kendini yenileyebilme ve farklılaşma yeteneğine sahip özelleşmemiş hücrelerdir. Çeşitli faktörlerin etkisiyle farklılaşarak diğer hücre tiplerine dönüşebilirler. Kök hücreler totipotent, pluripotent ve multipotent olmak üzere 3 tipten oluşmaktadır. Çeşitli kaynaklardan elde edilmekle beraber bu kaynakları başlıca embriyonik ve embriyonik olmayan kök hücre kaynakları başlığı altında toplayabiliriz. Teknolojinin gelişmesiyle ve yapılan çalışmaların artmasıyla kök hücreler daha iyi anlaşılmaya başlanmıştır. Kök hücreler günümüzde rejeneratif tıp alanında yapılan çalışmalarda büyük öneme sahipken ilaç keşfi alanında da gittikçe önemli bir yere sahip olmaktadır. İlaç keşfi yüksek maliyetli ve çok uzun süre isteyen bir süreçtir. Kök hücreler kimyasal bileşiklerin taranması ve değerlendirilmesi, metabolizma çalışmaları, toksisite testleri ve hastalık mekanizmalarının açıklığa kavuşturulması gibi bir çok süreçte araştırmalar için büyük avantajlar sağlayabilir. Aynı zamanda zamandan tasarruf etmek ve maliyetleri düşürmek için de büyük bir potansiyele sahiptir. Çalışmamızda kök hücre hakkında genel bilgiler ve kök hücrelerin ilaç keşfinde kullanılması konusundaki son gelişmeler ele alınmıştır. Kök hücrelerin günümüzde kullanılan diğer hücresel modellere oranla daha büyük avantajlar sunuyor olması bu hücrelere olan ilgiyi arttırmıştır. Ancak çalışmalar henüz yeterli düzeyde değildir. Anahtar Kelimeler: Kök hücre, ilaç keşfi, kardiyomyosit, hepatosit, toksisite testi

7 v THE IMPORTANCE OF STEM CELLS IN DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT Harun KARADUMAN Erciyes University, Faculty of Pharmacy Graduation Project, May 2012 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK ABSTRACT Stem cells are the non-specialized cells which have the ability of self-renewal and differentiation. They can be converted into other cell types by differentiating with the help of various factors. The stem cells consist of three types that are totipotent, pluripotent and multipotent. Although they can be obtained from various sources, these sources can be grouped under two headings as embryonic and non-embryonic stem cells. As the technology has developed and the researches have increased, the stem cells are understood better. Stem cells are very important for the researches in regenerative medicine. They also become very important for the drug discovery field. Drug discovery is a process which needs high cost and long time. Stem cells may have the upper hand for the researches in the processes like screening and evaluating the chemical compounds, metabolism studies, toxicity tests and clarification of disease mechanisms. They also have a grand potential for saving time and for decreasing the cost. General information about stem cells and recent developments on using the stem cells for drug discovery and development have been discussed in our study. The attention has been directed to stem cells as they offer greater advantages than the other cellular models used currently. However, the studies aren t adequate yet. Key Words: Stem cell, drug discovery, cardiomyocytes, hepatocyte, toxicity testing

8 vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK...i KABUL ONAY...ii TEŞEKKÜR...iii ÖZET...iv ABSTRACT...v İÇİNDEKİLER...vi TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ...viii KISALTMALAR...ix 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİ KÖK HÜCRELER Kök Hücre Tipleri Kök Hücre Kaynakları Embriyonik Kök Hücreler Embriyonik Kök Hücrelerin Eldesi Embriyonik Kök Hücrelerin Hücre Yüzey Belirleyicileri Embriyonik Kök Hücrelerde Traskripsiyon Faktörleri Embriyonik Kök Hücre Kültürü Embriyonik Olmayan Kök Hücreler KANSER KÖK HÜCRELERİ İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELER İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin Oluşturulmasında Seçilen Hücre Tipleri ve Genler İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin Elde Edilmesi...17

9 vii 2.4. İLAÇ KEŞFİNDE BİR MODEL OLARAK KÖK HÜCRELER İLAÇ KEŞFİNDE KANSER KÖK HÜCRELERİ KÖK HÜCRELER KULLANILARAK HASTALIK MODELLERİNİN OLUŞTURULMASI GELİŞİMSEL TOKSİSİTEDE KÖK HÜCRELERİN ROLÜ İLAÇ KEŞFİNDE KÖK HÜCRELERDEN ELDE EDİLEN KARDİYOMYOSİTLERİN ROLÜ İLAÇ KEŞFİNDE KÖK HÜCRELERDEN ELDE EDİLEN HEPATOSİTLERİN ROLÜ KÖK HÜCRE ARAŞTIRMALARININ ETİK BOYUTU TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR...33 ÖZGEÇMİŞ...43

10 viii TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ Tablo 2.1. İnsan ve fare pluripotent kök hücrelerdeki hücre yüzey belirleyiciler... 8 Tablo 2.2. Kök hücre belirteçlerinin bazı kanser türleriyle ilişkisi Şekil 2.1. Kök Hücre Kaynakları... 5 Şekil 2.2. Kök hücrelerin çeşitli hücre tiplerine farklılaşması Şekil 2.3. İlaç araştırmalarında kök hücrelerin kullanımına ilişkin protokol Şekil 2.4. Kök hücre tabanlı yapılan araştırmalar Şekil 2.5. Kök hücrelerden elde edilen kardiyomyositler üzerinde uygulamalar... 26

11 ix KISALTMALAR LIF STAT3 OCT : Lösemi inhibitör faktörü : Transkripsiyonun sinyal dönüştürücü ve aktivatörü : Oktomer bağlayıcı transkripsiyon faktörü Sox2 : SRY(cinsiyet belirleyici bölge Y)-box 2 FoxD3 Fgf4 Utf1 Tdgf1 Tbn IL-3 IL-6 G-CSF GM-CSF M-CSF TGF-β BMP : Forkhead box D3 : Fibroblast büyüme faktörü : Farklılaşmamış embriyonik kök hücre transkripsiyon faktörü : Teratokarsinoma kaynaklı büyüme faktörü : Taube nuss : İnterlökin-3 : İnterlökin-6 : Granülosit koloni stimülasyon faktörü : Granülosit makrofaj koloni stimülasyon faktörü : Makrofaj koloni stimülasyon faktörü : Dönüşüm büyüme faktörü : Kemik morfogenetik protein BMI-1 : B lenfoma Mo-MLV yerleştirme bölgesi 1 LIF-R : Lösemi inhibitör faktörü reseptörü Klf-4 : Krueppel benzeri faktör 4 ALS SMA Nkx2.5 MEF-2C SERCA : Amyotropik lateral skleroz : Spinal müsküler atrofi : Kardiyak-spesifik homeobox : Myosit-spesifik geliştirici faktör 2C : Sarko-endoplazmik retikulum Ca²-ATPase

12 x NCX RyR FoxA2 HNF-1/4/6 HepG2 : Sodyum-kalsiyum değiştirici :Ryanodine reseptörü :Forkhead box protein A2 :Hepatosit nükleer faktör-1/4/6 :Hepatosellüler karsinoma

13 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Kök hücreler genlerin kontrolü altında aldıkları sinyale göre farklılaşarak bir çok hücre tipine dönüşebilen, kendi kendini yenileyebilen ve yüksek telomeraz enzim aktivitesi sonucu uzun süre çoğalabilen hücrelerdir. Totipotent, pluripotent ve multipotent olmak üzere 3 tipte kök hücre bulunmaktadır. Totipotent kök hücre tanımı embriyonun 5. gününe kadarki blastomerler için geçerlidir ve bu kök hücre tipi hemen hemen organizmadaki bütün hücreleri oluşturabilme özelliğine sahiptir. Pluripotent kök hücreler ise embriyonun 5. gününde oluşan blastosistin iç hücre kitlesinde bulunurlar ve yaklaşık 200 hücre tipine dönüşebilirler. Multipotent kök hücreler ise embriyonun gelişim sürecinin daha ileri evresinde görülürler ve tek bir yönde farklılaşmak üzere programlanmış hücrelerdir. Kök hücreler çeşitli kaynaklardan elde edilirler. Elde edildikleri kaynağa göre embriyonik ve embriyonik olmayan kök hücre kaynakları olmak üzere 2 grupta inceleyebiliriz. Embriyonik kök hücreler blatosist evresindeki embriyonun iç hücre kitlesinde elde edilirler. İç hücre kitlesini oluşturan hücreler pluripotent kök hücreler olup embriyoyu oluşturacak olan tüm dokuların esas kaynağıdır. Embriyonik kök hücreler esas olarak iki teknik kullanılarak elde edilirler. Bunlar immunocerrahi ile izolasyon ve mekanik izolasyon teknikleridir. Somatik hücrelerin pluripotent özellik kazandırılarak yeniden programlanmasıyla elde edilen hücrelere indüklenmiş pluripotent kök hücreler denilmektedir. Pluripotent özelliği sağlamak amacıyla c-myc, Sox-2, Oct ¾ ve Klf-4 genleri kullanılmaktadır. Bu genler somatik hücrelere aktarılarak pluripotent özellik kazanmış yeni hücreler elde edilmektedir. Etik sorunlar nedeniyle embriyonik kök hücrelerin kullanılamaması indüklenmiş pluripotent kök hücreleri hücresel tedaviler, ilaç araştırmaları ve hastalık modellerinin araştırılmasına olanak sağlayabilecek en uygun kaynak kılmaktadır. Kök hücrelerin ilaç keşfi alanında kullanımı çok önemli bir ihtiyaçtır. Kök hücreler kendilerini diğer hücre tiplerinden ayıran benzersiz özellikleri ile ilaç keşfi sürecinde bir

14 2 çok avantaj sağlayabilir. İlaç araştırmalarında hücresel modeller oluşturulurken genellikle birincil dokudan elde edilen hücreler ve ölümsüzleştirilmiş tümör hücreleri kullanımaktadır. Birincil dokudan elde edilen hücrelerin kültür ortamında hayatta kalmaları çok sınırlıdır. Bu nedenle bu hücrelerin kullanımı kısıtlı imkanlar sunmaktadır. Tümörlerden elde edilen ölümsüzleştirilmiş hücreler ise kültür ortamında süresiz olarak çoğaltılabilir ama bu hücrelerde genetik olarak anormal oldukları için elde edilen sonuçlar konusunda kısıtlı bilgiler sunmaktadır. Kök hücreler diğer tüm hücresel modeller ile karşılaştırıldığında önemli avantajlar sunmaktadır. Kök hücreler genetik olarak normal, üniform fizyolojik yanıt göstermekte ve uzun süreli kültürleri yapılabilmektedir. Kök hücreler kullanılarak oluşturulan hücresel modellerden bileşik değerlendirme, metabolizma ve güvenlik çalışmaları, ilaç etki çalışmaları için ikincil deneyler, kimyasal tarama, validasyon ve hedef belirlenmesi, hastalık modellerinin oluşturulması dahil bir çok süreçte faydalanılabilir. Kök hücreler hem in vitro testlerin sayısını azaltır hem de yeni terapötiklerin belirlenmesi için testlerin süresini kısaltabilir. Özellikle toksisite testlerinde kök hücre modellerinin kullanılması çok önemli bir yer tutmaktadır. Kök hücrelerin farklılaştırılarak kardiyomyosit ve hepatositlere dönüştürülmesi ve bu hücresel modeller üzerinde toksisite testleri yapılması günümüzde bu konuda yapılan çalışmaların temelini oluşturmaktadır. Kardiyomyositler üzerinde yapılan çalışmalar kardiyak ilaç keşfi ve yeni ilaç moleküllerinin kardiyak toksisite değerlendirmesi üzerinde yoğunlaşmıştır. Özellikle yeni ilaçların geliştirilmesinde önemli sorunlardan biri olan QT aralığı uzaması riskini saptamak çok önemlidir. Günümüzde bu konuda birçok in vitro model kullanılmakla beraber en uygun modeller ventriküler kardiyomyositlerdir. Bu nedenle ilaç gelişimi ve güvenliği konusunda kök hücrelerden elde edilen kardiyomyosit hücresel modellere büyük ihtiyaç vardır. Hepatositler de hepatotoksisite, toksikoloji analizleri, farmakokinetik testler ve ilaç metabolizması çalışmalarında in vitro modeller olarak büyük önem taşımaktadır. Özellikle ilaçların hepatotoksik etkilerinin ilaç keşfi sürecinin geç evrelerinde ortaya çıkması büyük bir sorundur. Bu konuda kullanılan mevcut modeller zayıf fenotipik özellik gösterir ve fonksiyonel uyumu sınırlıdır. Bu nedenle kök hücrelerden elde edilen hepatositlerin kullanımı çok önemlidir. İlaç öncül bileşiklerin bu hücresel modeller üzerinde test edilmesi ilaçların etkilerinin ve yan etkilerinin daha doğru değerlendirilmesini sağlayacaktır. İlaçların embriyotoksik etkilerini öngörmek

15 3 konusunda da kök hücrelerin kullanımı çok önemlidir. Çünkü ilaçların bu etkilerini saptamak için embriyo üzerinde çalışmalar yapmak etik olarak uygun değildir. Bu nedenle embriyonik kök hücrelerin bu testlerde kullanılması ilaçların embriyotoksik etkilerini saptamamıza yardımcı olabilir. Kanser ilaç keşfi programlarında kanser kök hücrelerin kullanımı kanser tedavilerinde büyük bir öneme sahiptir. Son zamanlarda tümörlerde bulunan tümör indükleyici hücreler veya kanser kök hücreler üzerinde yapılan çalışmalar artmakta ve bu hücrelerin varlığı daha iyi anlaşılmaktadır. Kanser kök hücreler kök hücre benzeri karaktere, kendi kendini yenileyebilme yeteneğine, standart kimyasal/radyasyon tedavisine karşı dirence ve tümör hücreleri haline dönüşme eğilimine sahip hücrelerdir. Bu hücreler tekrar çoğalarak tümör kitlesinin yeniden ortaya çıkmasına veya büyümesine neden olmaktadır. Kanser kök hücrelerin yer aldığı kanser ilaç keşfi programları yüksek terapötik verimliliği ile ilaç keşfi sürecinde önemli bir platform sunabilir. Teknolojinin gelişmesiyle ve yapılan deneysel çalışmaların artmasıyla kök hücreler ilaç keşfi sürecinde daha etkin bir şekilde kullanılacak ve büyük yararlar sağlayacaktır. Bu çalışmadaki amacımız kök hücre hakkında genel bilgi vererek bu hücrelerin ilaç keşfi sürecindeki rolünü incelemektir.

16 4 2. GENEL BİLGİ 2.1. KÖK HÜCRELER Kök hücreler farklılaşmamış hücreler olup kendi kendini yenileyebilen ve farklılaşarak diğer doku hücrelerine dönüşebilen hücrelerdir (1). Kök hücreleri diğer hücrelerden ayıran iki temel özellik vardır: 1. Uzun süre çoğalabilme(proliferasyon) ve kendi kendini yenileyebilme(rejenerasyon) 2. Farklılaşabilme Genlerin kontrolü altında aldıkları sinyale göre birçok dokuya kaynaklık edebilirler, fakat özelleşmiş bir hücrenin işlevini yerini getiremezler (2). Kök hücreler uzun süre bölünebilme ve kendi kendini yenileyebilme yeteneğine sahiptirler (3). Bu sınırsız bölünme yetenekleri telomeraz enzim aktivitesi sonucu oluşmaktadır. Bu enzim doğrusal kromozomların ucunda bulunan ve tekrarlanan TTAGGG DNA dizileri olan telomerlerin kısalmasını önlemektedir. Telomerler ne kadar uzun olursa hücrelerin bölünme kapasiteside o kadar fazla olur. Kök hücrelerde de çok aktif telomeraz enzim aktivitesi ve buna bağlı uzun telomer zinciri vardır (4) Kök Hücre Tipleri Kök hücreler totipotent, pluripotent ve multipotent olmak üzere 3 grup altında tanımlanmaktadır. Totipotent Kök Hücre: Hemen hemen organizmadaki bütün hücreleri oluşturabilme özelliğine sahip kök hücrelerdir. Bu hücreler embriyo, embriyo sonrası tüm doku ve organlar ile embriyo dışı membranların ve organların kaynağını oluşturan kök hücreler olarak tanımlanır. Bu terim embriyonun 5. gününe kadarki tüm blastomerler için geçerlidir (5).

17 5 Pluripotent Kök Hücre: Organizmada birçok dokuya kaynak oluşturan kök hücrelerdir (5). Fertilizasyondan sonra pre-implantasyon döneminde 5. günde oluşan blastosist evresindeki embriyoda bulunurlar. Blatosist; trofoblastik hücreler, balastosöl ve iç hücre kitlesi olmak üzere üç yapıdan oluşur. Embriyonik kök hücrelere kaynaklık eden iç hücre kitlesinden elde edilen hücreler pluripotent kök hücreler olup gerekli ortam sağlandığında yaklaşık 200 hücre tipine dönüşebilecek potansiyele sahiptirler; ancak işlev gören bir organizmayı oluşturamazlar (6). Multipotent Kök Hücre: Multipotent kök hücreler embriyonik gelişmenin daha ileri evresine ait hücreler olup, özelleşmiş hücre tiplerine farklılaşabilirler ve erişkin kök hücrelerine dönüşürler. Erişkin kök hücreler bulundukları dokunun hücre tipine dönüşürler. Bu hücreler tek bir yönde farklılaşmak üzere programlanmış hücrelerdir. Multipotent kök hücreler doğumla birlikte kordon kanında ve erişkin vücudunda dokularda bulunurlar (7) Kök Hücre Kaynakları Kök hücre kaynakları embriyonik ve embriyonik olmayan kök hücreler olmak üzere iki grupta ele alınırlar (Şekil 2.1) (7). Şekil 2.1. Kök hücre kaynakları

18 Embriyonik Kök Hücreler Blastosist evresindeki embriyonun iç hücre kitlesinden elde edilen pluripotent hücrelerdir. Embriyonun ilk hücresel farklılaşması morulayı oluşturan hücrelerin blastokist hücrelerine farklılaşmasıdır. Morulanın dış tarafında bulunan hücreler sıvı transportunu sağlayan ve blastoselin oluşmasında rol oynayan trofoblast epitel hücrelerine farklanır. İçte bulunan morula hücreleri ise blastokistin iç hücre kitlesini oluşturur. İç hücre kitlesini oluşturan hücreler pluripotent kök hücreler olup embriyoyu oluşturacak olan tüm dokuların esas kaynağıdır. Embriyonik kök hücreden elde edilen hücre kümeleri embriyoid cisimcikler olarak adlandırılmaktadır. Uygun kültür ortamı sağlandığında bu hücreler farklılaşmadan çoğaldıkları gibi, ortamın değiştirilmesi ile bu hücrelerin farklılaşmasıda sağlanabilir. Bunlar plasenta dışında ektoderm, mezoderm ve endoderm tabakalarından köken alan çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilirler (8) Embriyonik Kök Hücrelerin Eldesi Embriyonik kök hücrelerin eldesinde genel olarak iki teknik kullanılır: İmmunocerrahi ile izolasyon ve mekanik izolasyon. İmmunocerrahi İle İzolasyon: Bu yöntem iç hücre kitlesini blastokistten ayıran seçici bir yöntemdir. Öncelikle blastokist zona pellucida pronaz enzimi ile uzaklaştırılır. Ardından embriyo anti-insan veya anti-fare serumu ile (blastokistin orijini ne ise ona uygun serum seçilmelidir) inkübe edilir. Daha sonra blastokist direkt olarak uygun ortama alınarak trofoblastlar ortamdan uzaklaştırılıncaya kadar beklenir ve geride kalan iç hücre kitlesi mitozu durdurulmuş embriyonik fibroblast tabakası üzerine alınarak kültüre edilir (9,10). Mekanik İzolasyon: Embriyonik kök hücre, direkt olarak zona pellucidası uzaklaştırılmış blastokistte trofoblastlararın iğne ucu ile mekanik olarak diseksiyonu veya zona pellucidası uzaklaştırılmış blastokistin direkt olarak mitozu inhibe edilmiş fibroblast tabakası üzerine konulması ile elde edilir. Eğer trofoblast hücreleri tamamen uzaklaştırılmamış veya bir kısmı uzaklaştırılmış ise, blastokist feeder tabakasına tutunur ve yassı hale gelir. Böylelikle iç hücre kitlesinin büyümesine izin veren etrafta yerleşmiş tek tabakalı trofoblast hücreleri gözlenir. İç hücre kitlesini oluşturan hücreler çoğaldığında oluşan koloni alttaki trofoblast hücrelerinden kolaylıkla ayrılabilir ve

19 7 uygun büyüklüğe ulaştığında koloniyi oluşturan hücreler alınıp uygun ortama taşınabilirler. Farklı embriyonik dönemlerden ve farklı strainlerden elde edilen embriyonik kök hücrelerin özellikleride farklıdır, yani embriyonik kök hücreler heterojenite gösterirler. O nedenle, embriyonik kök hücrelerin hangi dönemden ve hangi strainden elde edildiği önemlidir (11) Embriyonik Kök Hücrelerin Hücre Yüzey Belirleyicileri SSEA (Stage-Specific Embriyonic Antigen): Hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinde tanımlanan bu antijenin bilinen üç formu vardır; SSEA-1, SSEA-3 ve SSEA-4. İnsan embriyonik kök hücresinde pluripotent dönemde SSEA-3 ve SSEA- 4 pozitif ken, farklılaşmaya başladığı dönemde SSEA-1 antijenini de salgılamaya başlar. SSEA-1 antijeninin varlığı trofoblast farklılaşmasının bir göstergesidir. İnsan blastokistinde SSEA-3 ve SSEA-4 pozitiftir, trofoblast hücreleri ise zayıf olarak SSEA- 1 salgılanması gösterir. Pre- mplantasyon dönemindeki fare embriyosunda sadece SSEA -1 pozitiftir. Fakat farklılaşma ile birlikte SSEA-1 antijen pozitifliği kaybolur. Fare iç hücre kitlesinde SSEA-1 pozitif iken, fertilize olmamış oosit ve erken yarıklanma dönemindeki fare embriyosunda SSEA-3 ve SSEA-4 pozitiftir. Fakat insan embriyosuna zıt olarak blastokist aşamasında SSEA-3 ve SSEA-4 negatiftir (12). TRA-1-60, TRA-1-81 (Tumor rejection antigen) ve GCTM-2 (germ cell tumor monoclonal-2): Bu üç antijen perisellüler matriks keratan sülfat/kondrotin sülfat proteoglikan ile ilişkili olup, farklılaşmamış insan embriyonik kök hücrelerinde pozitiftir (12). CD9: Plazma membranında lokalize tip III membran proteinidir. Hem insan hem de fare embriyonik kök hücresindeki CD9 salgılanması LIF/STAT3 yolağında önemlidir. CD9 a özel antikorun uygulanması hücre farklılaşmasını ve hücre füzyonunu inhibe ettiği için CD9 antijeninin hücre adezyonu, göçü, proliferasyonu ve füzyonunda rolü olduğu düşünülmektedir (13). İnsan ve fare pluripotent kök hücrelerdeki hücre yüzey belirleyiciler Tablo 2.1 de özetlenmiştir (Tablo 2.1) (13).

20 8 Tablo 2.1. İnsan ve fare pluripotent kök hücrelerdeki hücre yüzey belirleyiciler Embriyonik Kök Hücrelerde Traskripsiyon Faktörleri Embriyonik kök hücrelerin farklılaşmadan kendini yenileyebilmesi için birçok faktörün dengede olması gerekmektedir (8,14). Sox-2, Oct-4 ve Nanog pluripotent embriyonik kök hücre fenotipinin devamlılığının sağlanmasında önemli transkripsiyon faktörleridir (14). Oct4 (Oct3/4, Oct3): Embriyonik kök hücrenin en önemli transkripsiyon faktörüdür. İnsan ve farede iç hücre kitlesinden salınır. Oct4 embriyonik kök hücrelerin farklılaşmasını inhibe eder. Oct4 ün salınımının azalması ile birlikte farklılaşma başlar. Ayrıca Oct4 salınımı ile birlikte erken embriyonik dönemde Sox2, Fgf4, Rex1, hcg ve Utf1 gibi birçok transkripsiyon faktörününde salınımı başlamış olur. Anneden gelen

21 9 Oct4 proteini fertilize olmamış oositte, 2 hücreliden 8 hücreli döneme kadar pozitiftir. Farklılaşmanın başlaması ile birlikte Oct4 sentezide azalır. STAT3 e ters olarak Oct4 ve NANOG farklılaşmanın inhibisyonu sırasında gözlenir. Yani Oct4, embriyonik kök hücrelerin kendilerini yenileyebilmeleri için gereklidir (13). Sox2: Sox2 iç hücre kitlesinde eksprese edilir ve Oct4 ün kofaktörüdür. Maternal Sox2; preovulatuar oosit, iç hücre kitlesi ve trofoblastta pozitiftir. Zigotta ilk olarak morula döneminde salınır ve daha sonra iç hücre kitlesi, epiblast ve ekstraembriyonik hücrelerde, nöral tabaka, geç dönemde de sinir sistemi, barsak ve germ hücreleri gibi kök hücrelerde sınırlı dağılım gösterir (16). Salınımı insan ve fare embriyolarında preimplantasyon döneminde başlar ve fonksiyonu Oct4 ile aynıdır. Gelişimin daha sonraki dönemlerinde Sox2, Oct4 ile birlikte göç eden primordial hücrelerde gözlenir. Oct4, Sox2 ve osteopontin erken embriyonik dönemdeki aynı hücrede aynı anda salınırlar. Farklılaşma sırasındaki osteopontinin salınımındaki artış ve azalma, Oct4 ve Sox2 ile aynı anda gerçekleşir. Oct4 ve Sox 2 reporter gen olarak birlikte görev alırlar (13). Nanog: Nanog iç hücre kitlesi ve epiblast hücrelerinde pozitif iken, daha sonra gastrulasyonun başlaması ile mezoderm ve endoderm hücrelerinde negatif, ektoderm hücrelerinde pozitiftir. Embriyonik kök hücrelerde de pozitif olan Nanog salınımı LIF den bağımsızdır. Hem embriyonik kök hücrelerin yenilenmesinde hem de farklılaşmanın inhibisyonunda görev alır. LIF yokluğunda fare embriyonik kök hücrelerinin pluripotensi için gereklidir. Morula ve blastokist döneminde salınımı en fazla iken, implantasyondan hemen önce azalır. Nanog salınımı fare ve insan embriyonik kök hücre ve embriyonik germinal hücrelerde gözlenmiştir. Oct4 ve Nanog birlikte hücrelerin farklılaşmamış düzeyde kalmalarını sağlarlar. Oct4 ün esas fonksiyonu embriyonik kök hücrelerinin trofoektoderme farklılaşmasını önlemek iken, Nanog bağımsız olarak ekstramebriyonik endoderme farklılaşmayı önler ve temel olarak pluripotensiyel özelliğin korunmasını sağlar (13). FoxD3: Primitif embriyonik hücrelerde salınır. Fertilize olmamış oosit ve fertilize olmuş bir hücreli embriyoda negatiftir. Blastokist döneminde kuvvetli pozitif iken, farklılaşmanın başlaması ile birlikte salınımı azalır. FoxD3, farede pluripotent hücre popülasyonun gelişimi için önemlidir. Bunla beraber insan embriyonik kök

22 10 hücrelerinde de tanımlanmıştır. FoxD3 hücre yüzeyi veya salgılanan sinyal moleküllerinin düzenlenmesinde görev alır. Bununla beraber hücre-hücre etkileşimde de önemli fonksiyonu olabileceği üzerinde durulmaktadır (13). Fbx15: Salınımı Oct4 ile benzerdir. Embriyonik kök hücre, erken fare embriyosunda ve testisde pozitiftir. Fonksiyonu henüz kesin olarak bilinmemektedir (13). Fgf4: İnsan ve fare embriyonik kök hücrelerinde Oct4 ve Sox2 ile birlikte aynı dönemlerde salgılanır. Blastokist dönemindeki embriyoda iç hücre kitlesini oluşturan hücrelerde ilk defa gözlenir. Farklılaşma ile birlikte Fgf4 salınımı azalır ve miyotom gibi farklılaşmış bazı bölgelerde sınırlı olarak bulunur (13). Utf1 (Farklılaşmamış embriyonik hücre transkripsiyon faktörü): Fare ve insan embriyonik kök hücrelerinde ve germ hücresi içeren dokularda pozitiftir. Farklılaşma ile birlikte salgılanması hızla azalır. Oct4 ve Sox2,Utf1 in salgılanmasını düzenler. Farklılaşma sürecinde Utf1 in salgılanmasındaki azalma Oct4 ve Sox2 den önce olur (13). Rex-1: Farklılaşmamış fare embriyonik kök hücrelerinden salgılanan Rex-1, trofoblast ve spermatogenetik hücrelerin gelişiminde önemli rol oynar. Polar trofoblast hücrelerinde pozitif olan Rex-1, insanda faredeki ile aynı özellikte dağılım gösterir. Kısaca Rex-1, pluripotent hücreler için belirteçtir (13). Tdgf-1 (teratocarsinoma-derived growth factor-1)/cripto-1: En erken 4 günlük fare embriyosunda pozitiftir. 10.günden itibaren Tdgf-1 e rastlanmaz (13). Tbn (Taube nuss): İç hücre kitlesinde pozitif olan Tbn, insan embriyonik kök hücrelerinde de pozitiftir. İç hücre kitlesi hücrelerinin canlı kalması için gerekli olan Tbn nin yokluğunda bu hücrelerin apoptozis ile öldüğü görülmüştür. Bununla beraber, Tbn yokluğunda trofoblast hücreleri ölmez, canlılığına devam eder. Tbn, Oct4 ve Fgf4 salgılanmalarına ihtiyaç duymaz. Özet olarak Tbn pluripotent hücrelerin canlı kalması için gerekli bir proteindir (12). Ehox: Bir homeobox ailesi üyesi olan Ehox emriyonik kök hücre farklılaşmasında ve erken embriyonik gelişimde önemlidir (13).

23 Embriyonik Kök Hücre Kültürü İnsan ve fare embriyonik kök hücrelerinin morfolojisi ve büyüme özellikleri birbirinden farklıdır. Fare embriyonik kök hücreleri birbirleri ile bir koloni şeklinde büyür ve alttaki fibroblast tabaka hücrelerinden ayrı hücre kolonileri şeklinde ayırt edilirler. Hem fare hem de insan embriyonik kök hücreleri büyümeleri için altta bir hücre tabakasına ihtiyaç duyarlar. Genellikle hem fare hem de insan embriyonik kök hücreleri için fare fibroblast hücreleri kullanılmaktadır, fakat bu hücreler konfluent olduktan sonra farklılaşmalarının durdurulmuş olması gerekmektedir. Fibroblast tabakalarından oluşabilecek olumsuz etkiler göz önüne alınarak embriyonik kök hücre kültürüne olanak sağlayacak kimyasal ürünlerde kullanılmaktadır (17). Bunlara örnek olarak içerisinde esas olarak laminin ve kollajen içeren matrijel verilebilir. Bir ekstrasellüler yapı olarak görev alan matrijel üzerinde yapılan embriyonik kök hücre kültürleri ile fibroblast tabakaları üzerinde yapılan kültürler arasında farklılık gözlenmemiştir (18) Embriyonik Olmayan Kök Hücreler Erişkin Kök Hücreler: Bu hücreler, erişkin dokularda bulunan tam farklılaşmamış hücrelerdir. Embriyonik kök hücrelere göre gelişmenin daha sonraki basamaklarında görülen bu hücreler daha sınırlı olmakla birlikte kendilerini yenileyebilme özelliğini korurlar. Erişkin dokulardaki öncü ve özelleşmiş hücrelere farklılaşma yeteneğine sahiptirler. Daha çok elde edildikleri dokuya dönüşme potansiyelleri vardır ve multipotent kök hücrelerdir. Bu hücrelerin, vücut dışında embriyonik kök hücreler kadar uzun süre özelliklerini koruyarak çoğalma yetenekleri yoktur. Kişinin immün sistemine uyum gösterirler, ancak tüm hücre tiplerine dönüşemedikleri için kullanımları sınırlıdır ve teratokarsinoma oluşturmazlar. Organizmada ancak belirli birkaç hücre türüne dönüşebilen erişkin kök hücreler, laboratuvar koşullarında gerekli ortam ve sinyaller sağlandığında birçok farklı hücre türüne dönüştürülebilirler (7). En iyi tanımlanan erişkin kök hücreler hematopoetik kök hücreler olmakla birlikte, erişkin kök hücrelerin beyin, barsak, kas, deri/kıl folikülü, kalp, akciğer ve son zamanlarda meme bezi gibi çeşitli doku ve organlarda da varlığı gösterilmiştir (19). Hematopoetik Kök Hücre: Kendi kendine yenileyebilme ve bütün matür kan hücrelerine farklılaşabilme özellikleri vardır. Kemik iliği, periferik kan, kordon kanı ve fetal karaciğerden elde edilebilirler. Yüzey belirteçleri başlıca; CD34, CD14, CD45 ve

24 12 CD133 dür. İntrensek ve ekstrensek sinyaller ile farklılaşmaları düzenlenmektedir. Son yapılan çalışmalar ile Wnt, Notch, kemik morfogenetik protein (BMP), sonic hedgehog ve fibroblast büyüme faktörü nün hematopoetik kök hücre farklılaşmasını kontrol ettiği gösterilmiştir (19,20). Osteoblastik ve damarsal mikroçevre, hematopoetik kök hücrelerin çoğalma, farklılaşma, mobilizasyon ve homing gibi davranışlarının düzenlenmesinde önemli rol oynamaktadır. Kök hücre faktörü kemik iliğinde stromal hücreler tarafından salınır ve hematopoetik kök hücre üzerindeki c-kit antijenine bağlanır. Kök hücre faktörünün, interlökin-1(il-1), IL-3 veya IL-6 ile kombinasyonları hematopoetik kök hücrelerin eritroid ve myeloid yönde çoğalmalarını sağlar. Sessiz fazdan çoğalma fazına geçmesi için uyarılar gereklidir. Kültür ortamına eritropoetin, G-CSF, GM-CSF veya M-CSF eklenmesi hematopoetik kök hücrelerin myeloid öncü hücrelere farklanmasını sağlar. Normal fizyolojik durumda hematopoetik kök hücre ve erişkin kök hücreler, sessiz dönemde uzun süre kalabilirler. Sessiz dönemlerinden ayrıldıklarında, kök hücreler intrensek ve ekstrensek uyarıcı sinyallerin etkisine bağlı olarak kendini yeniler ya da progenitör hücreye farklılaşırlar. Wnt sinyal yolağı, kök hücrenin kendini yenilemesinde anahtar faktördür. Notch ve hedgehog sinyal yolakları da hematopoetik kök hücrelerin kendini yenilemesi için düzenleyici rol oynamaktadır. Diğer sinyaller olan BMP ve TGF-β yolakları kök hücre proliferasyonunun negatif düzenleyicisidirler. BMP ve Wnt sinyali arasındaki karşılıklı etkileşim çok önemlidir. Pozitif ve negatif regülatorler arasındaki çok hassas dengenin bozulması kök hücrenin kendi kendini yenileme ve farklılaşmasında in vivo olarak problemlere yol açabilir (21). Örneğin; Wnt sinyalinin kök hücre ya da progenitörler de genetik değişikliğe uğraması, lösemi ve diğer kanserlerin gelişmesine yol açmaktadır (19,20). Mezenkimal Kök Hücre: Kemik iliğinin stroması içinde yer alan fibroblast benzeri multipotent kök hücrelerdir. CD73, CD54 (ICAM-1), CD105, CD39 ve CD49e (α5- integrin) gibi belirteçleri eksprese ederler. Uygun koşullarda osteojenik, kondrojenik, adipojenik yönde farklılaşabilmektedirler (22,23). Aynı zamanda fibroblast, iskelet kası hücreleri gibi mezodermal hücreler ile, mezodermal kökenli olmayan endotel, nöroektoderm de dahil olmak üzere çok çeşitli hücrelere farklılaştıkları gösterilmiştir (24). Mezenkimal kök hücrelerin, elde edildikleri dokularda çok az sayıda olmaları nedeniyle in vitro hücre kültür ortamında çoğaltılmalarının gerekmesi, bu kök

25 13 hücrelerin temel bilim araştırmalarında ve klinik kullanımdaki en önemli dezavantajıdır (25). Fetüs Kök Hücreleri: Amniyon sıvısındaki kök hücreler, plasenta kaynaklı kök hücreler, göbek kordonu stroması kaynaklı kök hücreler bu grupta sayılabilir. Bu hücrelerin diğer bir ortak özelliği de fetusa zarar vermeden gebelik süresince veya doğum esnasında kolaylıkla ve etik problemlere yol açmadan elde edilebilir olmalarıdır. Bu hücreler yüzey işaretleyicileri açısından hem embriyonik, hem de yetişkin kök hücre özelliği barındırırlar (26) KANSER KÖK HÜCRELERİ Kök hücrelerin kanser hücreleriyle olan benzerlikleri, kanser hücrelerinin kök hücrelerden köken aldığını düşündürmektedir. Kök hücrelerin kendi kendini yenileme ve asimetrik olarak bölünme özellikleri kanser hücrelerinin telomeraz enzimi aktivitesindeki artışla birleşince sonsuza kadar bölünebilme durumu ortaya çıkar. Hücrelerin malign fenotip kazanmasıyla birlikte göç etmeleri (metastaz), apoptozisi engellemeleri, hücre zarındaki taşıyıcı mekanizmaları değiştirmeleri ve tutunmadan büyüyebilmeleri gibi nitelikler kanserdeki tümör hücrelerinin tipik özelliğidir (26). Araştırmalar, çeşitli kanser hücresi tiplerinde kök hücrelerde de bulunan yüzey belirteçlerinin varlığını ortaya koymuştur (Tablo 2.2). Tablo 2.2. Kök hücre belirteçlerinin bazı kanser türleriyle ilişkisi ( Svendsen CN, Ebert AD, 2008 ve Bapat S, 2009 dan derlenmiştir) (27).

26 14 Bazı solid kanser türlerinde hücre kitlesi içinde kök hücre özelliklerini barındıran belli sayıda kanser kök hücresi bulunmaktadır. Bunlar kendi kendini yenileme ve sınırsız çoğalabilme özellikleri sayesinde kimyasal ve fiziksel ajanlara daha dirençli oldukları için ortadan kaldırılmaları çok daha zordur. Bu hücreler tekrar çoğalarak tümör kitlesinin yeniden ortaya çıkmasına veya büyümesine neden olmaktadır (26). Kanser kök hücreleriyle normal kök hücreler arasındaki benzerlikler: Asimetrik hücre bölünmesi, Kendini yenileme için kullanılan ortak sinyal yolakları (Wnt, Sonic Hedgehog) ve epigenetik düzeyde ifade bulan ortak Polycomb genlerine (BMI-1 ve EZH2) sahip olmak, Oct4, Nanog ve Sox2 gibi transkripsiyon faktörlerinin ifade edilmesi, Uzun telomer boyu ve yüksek telomeraz aktivitesi sayesinde uzun süre çoğalabilme yeteneği, ABC taşıyıcılarının ifade bulması sonucu büyümeyi engelleyen ilaçlara karşı direnç geliştirilmesi, Büyüme faktörlerinden bağımsız hale gelmek, Anjiyojenik fartörler salgılayarak anjiyogenezi uyarmak, Metastaz ve belli bir bölgeye yerleşme (homing) ile ilgili ortak yüzey reseptörlerine sahip olmak, örneğin; CXC4, CD1, integrin, c-kit, c-met, LIF-R (27) İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELER Pluripotent özellik kazanmış somatik hücrelere indüklenmiş pluripotent kök hücre denir (32). Pluripotent özellik, organizmanın bütün dokularındaki hücreleri oluşturabilme özelliğidir ve sadece embriyonik kök hücreler bu özelliğe sahiptir. İlk olarak 2006 yılında Takahashi ve Yamanaka isimli araştırmacıların çalışmaları ile somatik bir hücreye gen aktarılması sonucu pluripotent özellikte hücreler elde edilmiştir ve bu hücrelere indüklenmiş pluripotent kök hücre adı verilmiştir. İndüklenmiş pluripotent

27 15 kök hücreler oluşturulurken pluripotent özelliği sağlamak amacıyla c-myc, Sox-2, Oct ¾ ve Klf-4 genleri transfeksiyonla somatik hücrelere aktarılmaktadır. Gen aktarımı işlemi sonucunda aktif genleri içeren hücre kolonileri seçilerek indüklenmiş pluripotent kök hücreler elde edilmektedir (28). Embriyonik kök hücreler, bilimsel çalışmalar için istenilen hücre tipinin elde edilmesi ve geri dönüşümsüz hücresel hasarların oluştuğu hastalıklarda hücresel tedavi için kaynak olarak kullanılmaları açısından oldukça önemlidir (29). Ancak embriyonik kök hücreler elde edilirken blastosiste müdahale edilmesi, insan kaynaklı çalışmaların yapılmasında etik sorunları ortaya çıkarmıştır. Geçerli olan etik kurallar dahilinde kök hücre transplantasyonu ile ilgili hematopoietik kök hücrelerin otolog olarak tedaviye yönelik kullanımı olmasına rağmen embriyonik kök hücreler ile yapılan çalışmalar etik sorunlar nedeniyle yapılamamaktadır. Ülkemizde 2006 yılı itibari ile Sağlık Bakanlığı tarafından alınan kararla embriyonik kök hücreler ile yapılacak çalışmalar durdurulmuştur (30,31). Bu nedenle indüklenmiş pluripotent kök hücreler hücresel tedaviler, ilaç araştırmaları ve hastalık modellerinin araştırılmasına olanak sağlayabilecek en uygun kaynaktır (28) İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin Oluşturulmasında Seçilen Hücre Tipleri ve Genler İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin eldesinde somatik hücreler yeniden programlanarak pluripotent özellikte hücrelere dönüşmektedir (32,33,34). Hücrelerin yeniden programlanması için çeşitli yollar bulunmaktadır. Bunlar; hücre füzyonu, somatik hücre çekirdek aktarımı ve gen aktarımıdır. Somatik hücre kaynağı olarak seçilen hücreler genellikle fibroblast kökenli hücreler olmaktadır. Fare hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler elde edilirken kaynak olarak çeşitli hücreler kullanılmaktadır. Bunlar; dermal fibroblastlar, dermal papilla hücreleri, pankreas β hücreleri, ince barsak epitelyum hücreleri, nöral kök hücreler, kemik iliği kök hücreleri, B lenfositler ve mononükleer hücrelerdir (32,35). İnsan hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarda ise dermal fibroblastlar, amniyotik sıvıdan elde edilen hücreler, embriyo kökenli fibroblastlar, hematopoietik oldukları tespit edilmiş CD34 pozitif kan hücreleri, mezenkimal kök hücreler, yağ doku kök hücreleri ve oral mukoza hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretilmektedir (36-43).

28 16 Seçilen somatik hücrelerin programlanması amacıyla Takahashi ve Yamanaka tarafından yapılan çalışmada, öncelikle pluripotent özelliği sağlayan 24 adet gen tanımlamış ve bu genler içinde 4 adet genin pluripotent özelliklerin sağlanmasında yeterli olduğu gösterilmiştir. Bu genler Oct¾, Sox2, c-myc ve Klf4 genleridir. Takahashi ve Yamanaka nın çalışmasından bir yıl sonra ise Yu ve arkadaşları Oct ¾, Sox2, Nanog ve Lin28 genlerini indüklenmiş pluripotent kök hücre eldesinde kullanmışlardır (44). Oct¾; DNA da ATTTGCAT oktomerini tanıma özelliği olan oktomer bağlanma transkripsiyon faktörüdür. İlk olarak döllenmemiş yumurtada bulunan bir protein olarak tanımlanmıştır (45). Embriyonik kök hücrelerin gelişiminde bu faktörün seviyesinin 3 önemli etkisi gözlemlenmektedir. Düşük seviyede ifade edildiğinde hücreler pluripotent özellikte kalmakta ve farklılaşma olmamaktadır. İfadesindeki 2 kat artış hücrelerin primitif endoderm ve mezoderm yönünde farklılaşmasına; ifadesinin baskılanması durumunda ise hücrelerin pluripotent özelliğini kaybedip tropoektoderm yönünde farklılaşmasına neden olmaktadır (34,46). Sox2; DNA da küçük oluğa bağlanan transkripsiyon faktörleri ailesindendir. Embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenileme özelliği için gereklidir. Erken embriyoda, germ hücrelerinde ve epiblastta ifade edilir. İfadesinin baskılanması durumunda epiblast oluşumunda sorun oluştuğundan embriyo yok olur. Sox2 nin en önemli görevlerinden birisi de Oct ¾ ifadesini düzenlemesidir (47). c-myc; tümör hücrelerinde yüksek aktivasyona sahip bir onkogendir. Histon asetilasyonunda rol adığı için kromatin yapısının düzenlenmesinde etkilidir (48). Hücre döngüsü, apoptozis, sinyal iletimi, transkripsiyonel ve posttranskripsiyonel düzenleme mekanizmaları, kök hücre biyolojisi ve kanser moleküler biyolojisinde önemli olan faktörlerdendir (49,50). Klf4; birçok dokuda bulunan bir transkripsiyon faktörüdür. Etkilediği gen ve ürünlerin durumuna göre transkripsiyonu aktive edebilir ya da baskılayabilir. Ayrıca yüksek seviyede ifade edildiğinde hücre bölünmesini baskılar ve hücrenin G1-S fazında kalmasını sağlar (51). Embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenileme özelliği için gerekli bir faktördür (28).

29 17 Nanog; indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin programlanmasında kullanılan transkripsiyon faktörüdür. Nanog embriyonik kök hücrelerin farklılaşmadan kalma özelliğini ve pluripotent özelliğini etkileyen önemli bir faktördür. Yapılan çalışmalar Nanog geni hasarlı embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenileme özelliğini kaybettiğini ve ekstraembriyonik doku hücrelerine farklılaştığını göstermiştir (52). Lin-28; indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin programlanmasında kullanılan transkripsiyon faktörüdür. Erken embriyonik dönemde ifade edilen bir proteindir ve embriyonik kök hücrelerin işaretleyicisi olarak da kullanılmaktadır(28). Fibroblast gibi somatik bir hücrenin bu genleri ifade etmesi hücrenin pluripotent yönde programlandığını göstermektedir (53) İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin Elde Edilmesi Hücrelere gen aktarımı amacıyla retrovirüsler ve adenovirüsler gibi vektör sistemleri kullanılmaktadır (32,54). Virüsler kullanılarak yapılan gen aktarımında viral vektörün genetik materyaline aktarılmak istenen gen bölgesi yerleştirilir. Gen aktarımı işlemi gerçekleştiğinde viral genetik materyal hücrenin DNA sına entegre olur ve devam eden hücre bölünmeleri süresince hücre DNA sı ile bölünür ve genetik olarak istenilen özellikteki hücreler elde edilir. Vektör sistemlerinin yanı sıra proteinlerin hücrelerin içine hedeflenmesi yöntemi yani protein transdüksiyonu ile hücrelerin yeniden programlanması için de çalışmalar devam etmektedir (55). Gen aktarımı ile elde edilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin, pluripotent hücre özelliklerine sahip olduğunu analiz etmek için çeşitli testler uygulanmaktadır. Bu analizlerde hedeflenen amaç indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin pluripotent özellikteki hücreler olan embriyonik kök hücrelere benzerliğinin gösterilmesidir. Analizlerde indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin hücre kültür sistemlerinde embriyonik kök hücrelere benzer gelişim göstermesi, embriyonik kök hücrelerde olan aktif gen profiline sahip olması, hücre kültüründe embriyoid cisimcikleri oluşturabilmesi, hücre kültüründe üç germ tabakasına ait hücreleri oluşturabilmesi, in vivo deneylerde teratom oluşturabilmesi ve son olarak da gelişmekte olan embriyoya aktarıldıklarında kimerik canlılar oluşturabilmeleri araştırılmıştır. Araştırmalarda indüklenmiş pluripotent kök hücreler, hücre kültüründe embriyonik kök hücreler ile paralel olarak takip edilmiş ve hücrelerin büyüme eğrilerinin benzer oldukları

30 18 görülmüştür. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelere eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real-Time PCR) analizi yapılarak embriyonik kök hücrelere özgü genleri ifade ettikleri gösterilmiştir. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin immün sistemi baskılanmış hayvanlara implantasyonu sonucu oluşan teratomlar histolojik olarak incelenmiş ve üç germ tabakasına ait hücreler histolojik boyamalarla gösterilmiştir. Histolojik yönteme ek olarak indüklenmiş pluripotent kök hücreler, immunofloresan yöntemlerle de analiz edilmiştir. Ayrıca indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin epigenetik olarak da embriyonik kök hücrelere olan benzerlikleri araştırılmıştır. Bu amaçla telomeraz enzim aktiviteleri, DNA metilasyon modelleri ve histon asetilasyon analizleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar ile indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin bütün bu testlerde embriyonik kök hücrelere benzer sonuçlar verdiği görülmüş ve böylece bu hücrelerin pluripotent özellikte olduğu gösterilmiştir (32,33,56) İLAÇ KEŞFİNDE BİR MODEL OLARAK KÖK HÜCRELER İlaç keşfinde yaklaşık 250 ilaç tanımlanır ve bu tanımlama karışım incelendikten sonra yapılır (phrma Endüstri profili 2006). Bu 250 aday molekülün sadece 5 tanesi insan testlerinde gelişme gösterir ve bu 5 molekül arasından bir tanesi pazarlama için düzenleyici otoriteler tarafından onaylanır yılında onaylanan yeni ilaçlar sadece 20 iken 2004 yılında 36 yeni ilaç ABD Gıda ve İlaç Dairesi(FDA) tarfından kabul edilmiştir (57). İlaçların pazarlama süreçleri, son derece pahalı ve çok uzun süren bir aşamadır. Yeni bir ilacın keşfinden eczacının rafına ulaşması yaklaşık yıl gibi bir zaman almakta ve maddi olarak 900 milyon dolarlık bir maliyete ulaşmaktadır (58). Kök hücreler ilaç keşfi ve gelişiminin etkinliğini arttırmak, maliyeti düşürmek ve zamandan tasarruf etmek adına büyük bir potansiyele sahiptir. Teknolojinin gelişmesiyle ve deneysel çalışmaların artmasıyla dokulardaki kök hücrelerin varlığı daha iyi anlaşılmaya başlanmıştır (59). Rejeneratif tıp alanındaki uygulamalara ek olarak yüksek içerikli ilaç taramaları, toksisite ve tesir çalışmaları kök hücrelerin farmasötik araştırma ve ilaç keşfi alanında değerli bir kaynak haline gelmesini sağlamıştır (60,61). Hastalığa özgü hücre tiplerinin deneysel çalışmalarda ve testlerde kullanılması ilaç keşfi sürecinde başarılı bir uygulama için çok önemlidir, çünkü tedaviler genellikle patolojik hücre hedeflerine yöneliktir. İlaç araştırmaları için hücreler genellikle birincil dokudan,

31 19 ölümsüzleştirilmiş tümör hücreleri veya genetik olarak değiştirilmiş hücrelerden elde edilir. Birincil memeli hücreleri genetik olarak normal ama kültürde hayatta kalmaları oldukça sınırlıdır, buda tarama teknolojilerinde birincil eksplantların (vücuttan türetilen suni ortamda yaşatılan doku) kullanılabilirliğini etkiler. Ayrıca doğal donör varyasyonuda ilaç keşfinde birincil hücrelerin kullanımını kısıtlamaktadır. Tümörlerden elde edilen ölümsüzleştirilmiş hücreler veya onkojenik transformasyon sonucu oluşan hücreler hücre tabanlı modellerin daha uygun kaynaklarını sunmaktadır. Ölümsüzleştirilmiş hücreler süresiz olarak çoğaltılabilir, ancak bu hücreler genetik olarak anormaldir ve gen fonksiyonu temelli sonuçları sınırlandırabilir. Kök hücreler birincil veya ölümsüzleştirilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında önemli avantajlar sunmaktadır. Bu hücreler genetik olarak normal, üniform fizyolojik yanıt göstermekte ve uzun süreli kültürleri yapılabilmektedir. Tüm bunlar tarama sürecinde kök hücrelerin kullanılabilirliğini arttırmakta ve tarama sonuçlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlamaktadır. Değişik kaynak ve türlerden elde edilen kök hücreler açısından gelişmeler ilaç keşfi açısından çok önemlidir (62,63). İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri, yetişkin doku spesifik kök hücreleri ve embriyonik kök hücreleri izole etmek için kullanılan metadolojilerin gelişmesi ve daha kolay hale gelmesi ile yüksek verimli ve kombinasyonel tarama teknolojilerinin gelişmesi sağlanacak ve böylece ilaç keşfinde kök hücre modellerinin rolü daha çok artacaktır (64,65,66,67). Kök hücreler in vitro testlerin sayısını azaltır ve yeni terapötiklerin belirlenmesi için testlerin süresini kısaltabilir ve daha üstün yöntemler sunabilir. Ayrıca bu hücresel sistemler klinik olarak biyomarkerların belirlenmesi ve insan genetik varyantları için bileşik değerlendirme, metabolizma ve güvenlik çalışmaları, ilaç etki çalışmaları için ikincil deneyler, kimyasal tarama, validasyon ve hedef belirlenmesi dahil bir çok süreçte önemli fırsatlar sunabilir. Toksisite ve hastalık mekanizmalarının açıklığa kavuşturulmasında kök hücre uygulamaları önemli bir yer tutmaktadır. Nöronal, hepatik ve kardiyak toksisiste testleri için öncül bileşiklerin test edilmesi ilaçların etkilerinin ve yan etkilerinin daha doğru değerlendirilmesini sağlar (61). Hastalarda ve normal bireylerde embriyonik veya doku spesifik kök hücreler toksisiste testleri için kardiyomyosit, hepatosit yada nöronlara farklılaştırılırlar (68). Şekil 2.2 de kök hücrelerin çeşitli hücre tiplerine farklılaşma aşamaları görülmektedir (Şekil 2.2) (57).

32 20 Şekil 2.2. Kök hücrelerin çeşitli hücre tiplerine farklılaşması İlaç testlerinde in vitro modellerin kullanılması sadece potansiyel terapötik bileşiklerin belirlenmesinde değil ADME özelliklerini anlamamızda da büyük yarar sağlamaktadır (69). Çeşitli in vitro ADME modellerinin gelişimi hızlanan ilaç keşfi ve doğru yolağın

33 21 bulunmasında önemli etkiler yapacaktır (70). Tümör kaynaklı ve insan veya hayvan kaynaklı ölümsüzleştirilmiş hücreler in vitro modeller olarak farmasötik endüstride ve biyoteknolojide yaygın olarak kullanılmaktadır (71,72). Tarama sürecinde avantaj sağlayan bu hücreler ilaçların fizyolojik yanıtı, anormal genotip ve büyümede büyük değişkenlik gösterirler. Ölümsüzleştirilmiş hücreler ile ilgili bu anormallikler ilaç gelişimi için öncül moleküllerin sayısını ve güven değerini kısıtlayabilir. Keratinositler, insan umblikal endotel hücreleri ve hapatositler gibi primer kültür modelleri kısıtlı genişleyebilmeleri nedeniyle sınırlı bir kullanım sunmaktadır (73,74). Kök hücrelerin ilaç keşfi çalışmalarına yönlendirilmesi büyüme şekli, normal genotip ve tek tip fizyolojik yanıt için bir ihtiyaçtır (75). Kök hücrelerin kullanımı ile ilaç keşfi maliyetlerini düşecek, zamandan tasarruf sağlanacak ve aynı zamanda hastalık süreci ile ilgili yolağı veya bir hedefi belirleme şansıda artacaktır. Kök hücreler büyük bir potansiyel sunuyor olsada ilaç keşfi alanında uygulanabilirliği çeşitli faktörlere bağlı olarak sınırlıdır. Örneğin; farklı dokuların kök hücreleri aynı değildir ve kök hücrelerin in vitro kültür büyüme faktörleri in vivo olarak bulunduğu çevreden farklıdır. Kök hücreler invivo progenitör hücrelerden daha yavaş hücre döngüsüne sahiptir. Bu nedenle invitro elde edilen sonuçların hassasiyet derecesi invivo olarak aynı olmayabilir (76,77). Hücre tabanlı invitro analizler yüksek içerikli taramalar yapmak için bir platform sağlar, fakat kompleks invivo senaryoyu yansıtmamaktadır. Hücre tabanlı taramalarda invivo olarak görülen yan etkileri ve genel metabolizmayı göz önüne alamayız. Bu nedenle invitro testler değişik hayvan modellerinde çeşitli invivo testler ile tamamlanmalıdır (78,79). Kök hücrelerin ilaç keşfi araştırmalarında kullanımı ile ilgili protokol şekil 2.3 de kısaca özetlenmiştir (Şekil 2.3).

34 22 Şekil 2.3. İlaç araştırmalarında kök hücrelerin kullanımına ilişkin protokol (Rubin ve Haston, 2011 den alınmıştır) (110) İlk olarak hastadan hastalıklı hücrelerin farklılaşması sağlanır. Daha sonra bulunan doğru hastalık fenotipi üzerinde kimyasal ve farmakolojik taramalar yapılır ve ilaç öncül molekülleri belirlenir. Bu ilaç öncül molekülleri ile birden çok hastada hastalıklı hücreler üzerinde etkinlik testi yapılır ve yine birden çok hastada kardiyomyosit ve hepatositler üzerinde güvenlik testleri yapılır. Son olarak ilaç adayları ve duyarlı hastalar belirlenir. Kök hücrelerin ilaç keşfinde daha etkin kullanılabilmesi için metodların kolaylaştırılması ve geliştirilmesi gerekmektedir. Özellikle stabil genişleme kabiliyetinin, embriyonik kök hücrelerin farklılaşmadan çoğalmasının ve hücre tabanlı taramalar için gerekli boyutta embriyonik kök hücre kaynaklı hücrelerin üretiminin sağlanması gerekmektedir (80). Biyoreaktör kültür yöntemleri ile fare embriyonik kök hücrelerden elde edilen embriyoid organlar önemli ölçüde arttırılabilir. Bu embriyoid organlara kriyoprezervasyon(hücrelerin sıfırın altındaki sıcaklıklarda dondurularak muhafaza edilmesi) yapılabilir ve daha sonra farklılaşmış hücre tipleri elde etmek için