RIDA QUICK Entamoeba Article no: N 1703 R-Biopharm AG, Landwehrstr. 54, D-64293 Darmstadt, Germany Tel: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Fax: +49 (0) 61 51 81 02-20
1. Kullanım amacı Laboratuvar içi kullanım içindir. RIDA QUICK Entamoeba, gaita örneklerindeki Entamoeba histolytica (sensu lato) nun kalitatif belirlenmesi için hızlı immünokromatografik bir testtir. 2. Özet ve testin açıklaması Dünyada toplam her yıl 500 milyon kadar insan Entamoeba histolytica sensu lato ile enfekte olmaktadır. Moleküler genetik araştırmaları protozoa yı göstermiştir, Entamoeba histolytica adı verilmiş olan ve klasik tanı metodlarının kullanımıyla belirlenen, morfolojik olarak seçilemeyen iki türden oluşmaktadır: patojenik türler, Entamoeba histolytica sensu stricto ve patolojik olmayan türler (şu anki bilgiye göre), Entamoeba dispar. Entamoeba enfeksiyonu olan insanların yaklaşık %90 ında E. dispar vardır. Yaklaşık olarak her yıl E. histolytica nın neden olduğu 40-50 milyon amibik kolit veya hepatik abse vakası 80,000 ölümle sonuçlanmaktadır. Entamoeba nın yaşam süreci nispeten bellidir. Dört çekirdekli kistlerin oral yolla alınımı enfeksiyona neden olmaktadır. Bunlar ince barsakta parazitin tek çekirdekli formunu oluşturmaktadır, kalınbarsakta ağırlıklı olarak çoğalan ve farklılaşan tropozoit (forma minuta) oluşturmaktadır. Muhtemelen kalınbarsağın alt bölgesindeki ortam ile kapsüllenme tetiklenmektedir. Ayrıca barsaklardan hızlandırılmış geçiş ile kistler, tropozoitler gaitada bulunur. Amoebiasis in semptomları, parazitin barsak lümeninden kolonun mukoz membranına akını ile tetiklenmektedir. Aynı zamanda ekseriyetle tropozoitler ile birlikte fagozitoza uğramış eritrositler de bulunmaktadır. Bu tropozoitler boyutlarından dolayı forma magna olarak bilinmektedir. Barsağın mukoz membranına akının semptomları diyare, dizanteri veya amebomlar. Yaygın dağılımdan sonra ortaya çıkabilecek komplikasyonlar hepatik apseler, pulmoner apseler veya çok nadir vakalarda eğer tedavi edilmezse genellikle ölümle sonuçlanan beyne ait apseler. Amoebiasis in akut barsak formunun klinik semptomları mide bulantısıyla beraber kramp benzeri karın ağrıları ve kanlı, sulu yapışkan gaitalı ağır diyare. Akut durum ara sıra meydana gelen diyare, kabızlık, karın ağrısı, mide bulantısı ve kusmayla kronik duruma dönüşebilir. Aynı zamanda tamamen semptomsuz kist eliminasyonu da tanımlanmıştır. Akut amibik dizanteri vakalarının yaklaşık olarak %10 u hepatik apse veya diğer organlara yayılması gibi ekstra-intestinal komplikasyonlar ile sonuçlanır. Ekstra-intestinal amoebiasis ile beraber serolojik olarak antikorların belirlenmesi gösterilmiştir. Intestinal amoebiasis gaitada kistlerin ve tropozoitlerin belirlenmesi için karmaşık mikroskobik prosedürlerin kullanımıyla teşhis edilebilir. Ancak parazit yoğunluğu çok küçük olabileceği için, tek gaita araştırması için bu metodun duyarlılığı deneyimli personel ile bile %75 farzedilebilir. Metod aynı zamanda Entamoeba nın barsak epitel hücreleriyle, granülositler, makrofajlar ve fungi ile karıştırılması riskini taşımaktadır. RIDA QUICK Entamoeba 08-05-09 2
Entamoeba nın antijenlerine karşı spesifik antikorları olan bu hızlı test gibi hassas immünolojik test prosedürleri büyük avantajlara sahiptir. Teşhis metodu subjektif değerlendirmeye bağımlı değildir ve artık morfolojileriyle tanımlanabilen aynı zamanda belirlemede kullanılan bileşenler için çok duyarlıdır. Entamoeba nın sadece yayılma gösteren formu antikor oluşumuna neden olmaktadır. Çünkü antikor titreleri genellikle klinik semptomların başlangıcında saptanabilir, spesifik antikor belirlemesi E. Histolytica nın teşhisi için kullanılabilir. Aynı zamanda tedavi seçiminde karar vermek için çok önemli olan intestinal ve ekstra-intestinal amoebiasis titrelerinin büyüklüğü arasındaki farklılıkların olasılığını verir. 3. Testin prensibi Hızlı test tek adımlıdır, belirli bir biçimde Entamoeba ya karşı yönelen kırmızı lateks partiküllere bağlanan antikorların immünokromatografik yana doğru akış testidir. Patojene karşı diğer spesifik antikorlar membrana sıkıca bağlanır. Gaita örneği önce ekstraksiyon tamponunda asılıdır ve sonra çökelir. Örneğin berrak süpernatantından alınan kısım test alanına konulur. Bu esnada, örnek renkli lateks partikülleri içine alır, eğer varsa antijen kendisi bağlanır, test pozitif ise membrandan geçer ve spesifik yakalama şeritine bağlanır. 4. Temin edilen reaktifler 20 belirleme için yeterli reaktif pakettedir. Kaset 20 Bel. Kasette tek tek paketlenmiş 20 test Diluent 26 ml Ekstraksiyon tamponu, kullanıma hazır; % 0.1 sodyum azit içerir. Pipet 25 adet Torba 25 tek kullanımlık pipet içerir. 5. Saklama talimatları Paket 2-30 C de saklanabilir ve yazılan son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Son kullanma tarihinden sonra, kalite garantisi geçerli değildir. Aynı şekilde, kasetin dış ambalajı hasar görmüş ise kasetlerin kullanılabilirliği garanti edilemez. RIDA QUICK Entamoeba 08-05-09 3
6. Gerekli materyal (temin edilmemiştir) - Gaita süspansiyonu için test tüpleri - Vorteks (opsiyonel) - Mikropipet (200 μl - 1000 μl) - % 0.5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren atık kabı 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece laboratuvar içi kullanım içindir. Test sadece eğitimli laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilmelidir. Tıbbi laboratuvarlarda çalışma yönergesi takip edilmeli ve testin uygulama talimatlarına kesinlikle bağlı kalınmalıdır. Örnek dilüsyon tamponu koruyucu olarak sodyum azit içermektedir. Bu maddelerin deri veya mukoz membran ile temasına izin verilmemelidir. Örnekler veya reaktifler ağız ile pipetlenmemelidir ve yaralı deri veya mukoz membranlar ile teması önlenmelidir. Örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler kullanın ve test tamamlandığında ellerinizi yıkayın. Örneklerin kullanıldığı alanlarda sigara kullanmayın, birşey yiyip içmeyin. Bulaşıcı olabilecek örnekler ile temas eden tüm reaktif ve malzemeler uygun dezenfektan (örneğin sodyum hipoklorit) ile örneklerin kendileri gibi aynı yöntemle tamamen işlemden geçirilmelidir veya en az bir saat 121 C de otoklavda tutulmalıdır. 8. Örnek toplama ve saklama Gaita örnekleri herhangi bir katkı maddesi içermeyen temiz kaplarda toplanmalıdır ve teste başlamadan önce 2-8 C de saklanmalıdır. Eğer 3 günden fazla saklanırsa örnek -20 C de dondurulmalıdır. Bu durumda örnek tamamen çözünmelidir ve teste başlamadan önce oda sıcaklığında bırakılmalıdır. Örneği tekrar dondurup çözme işleminden kaçının. Eğer rektal çubuk kullanılması gerekiyorsa, testi uygulamak için yeterli gaita materyali (yaklaşık olarak 50 mg) toplandığından emin olun. 9. Testin prosedürü 9.1. Genel bilgi Örnekler, ekstraksiyon tamponu ve test stripleri kullanımdan önce oda sıcaklığında (20-25 C) bırakılmalıdır. Test kasetleri sadece kullanımdan önce dış ambalajından çıkarılmalıdır. Kullanılan kaset tekrar kullanılmamalıdır. Test direk güneş ışığında gerçekleştirilmemelidir. Reaktifleri şişelerin içine tekrar dökmeyin çünkü bu reaktif kontaminasyonuna neden olabilir. RIDA QUICK Entamoeba 08-05-09 4
9.2. Örneklerin hazırlanması 1 ml Extraction Buffer Diluent i etiketlenmiş test tübüne koyun. Sıvı gaita örneğiyle, 100 μl lik pipet ile (ikinci koyuluğun tam üstüne kadar) örnekten pipetleyin ve önceden tübe konulmuş olan tamponda süspanse edin. Katı gaita örneğiyle, tamponda 50 mg (küçük bezelye büyüklüğünde) süspanse edin. Örnek daha sonra iyi bir şekilde homojenize olmalıdır. Bu tek kullanımlık pipet kullanarak süspansiyona tekrarlayan emme ve boşaltma yapılarak veya alternatif olarak vorteks ile karıştırarak elde edilebilir. Bundan sonra homojenize süspansiyonu berrak süpernatant oluşana kadar en az 3 dakika bekletin. 9.3. Örneğin test edilmesi Dış ambalajından çıkarıldığında, test kasetini önce altlık seviyesinde yatırın. Sonra gaite süspansiyonunun berrak süpernatantından 200 μl (mikropipet) veya 4 damla (tek kullanımlık pipet) pipetleyerek test kasetinin dairesel açıklığından içine aktarın. Sıvı akışının membran boyunca engellenmediğinden emin olun. Aynı anda herhangi bir partikülün pipetlenmesi bir engele neden olabilir ve önceden uzaklaştırılmalıdır. Test sonucu 5 dakika sonra okunabilir. 10. Kalite kontrol reaktif süresinin dolduğunun belirtileri Eğer test kaseti örnek süspansiyonu pipetlenmeden önce sağlam ise ve renk değişimi yoksa veya membrandaki çizgiler görünür ise test değerlendirilebilir. Ayrıca, test inkübasyonundan sonra en azından mavi kontrol çizgisi görülmelidir. Eğer görülmezse, test tekrarlanmadan önce aşağıdakiler kontrol edilmelidir: - Test kasetlerinin ve kullanılan ekstraksiyon tamponunun son kullanma tarihi - Doğru test prosedürü - Ekstraksiyon tamponunun kontaminasyonu Eğer yeni test kasetiyle test tekrarlandıktan sonra kontrol çizgisi hala görünmüyorsa, lütfen imalatçı veya yerel R-Biopharm dağıtıcınız ile temasa geçin. 11. Değerlendirme ve yorum Örnek absorbsiyon bölgesinde izleyen sırada maksimum iki çizgi görülmelidir: bir kırmızı test çizgisi ve bir mavi kontrol çizgisi. Eğer mavi kontrol çizgisi eksikse, test geçersizdir ve değerlendirilemez! RIDA QUICK Entamoeba 08-05-09 5
Aşağıdaki yorumlar mümkündür: - Entamoeba pozitif: kırmızı ve mavi çizgi görünür. - Entamoeba negatif: sadece mavi çizgi görünür. - Geçersiz: görünür çizgi yok veya üstte tanımlanandan başka bir birleşim veya çizgi renginde diğer değişiklikler. Benzer şekilde, 5 dakika sonra veya daha sonrasında ortaya çıkan çizgi rengindeki değişikliklerin herhangi bir tanı değeri yoktur ve değerlendirme için kullanılamaz. 12. Metoda dair sınırlamalar RIDA QUICK Entamoeba gaita örneklerinde Entamoeba histolytica sensu lato antijenlerini belirler. Test spesifik görünür çizginin yoğunluğu ve klinik semptomların meydana gelmesi veya şiddeti arasında bir ilişki türetmek için kullanılamaz. Elde edilen sonuçlar her zaman klinik düşünceyle birleştirilerek yorumlanmalıdır. Pozitif sonuç başka bir bulaşıcı patojen varlığında bertaraf edilemez. Negatif sonuç muhakkak Entamoeba histolytica enfeksiyonu yok anlamına gelmez. Patojenin aralıklarla olan boşaltımından dolayı veya örnekteki antijen miktarının çok az olmasından dolayı bu olabilir. Eğer hasta anemili veya patojenle enfekte olduğundan şüphe ediliyorsa, dört hafta sonra başka bir gaita örneği test edilmelidir. Gaita örneğinin fazlası kahverengimsi şeritlerin, belirli bir biçimde renklendirilmiş şeritlerin yerine görünmesine neden olabilir. Bu kahverengimsi şeritler herhangi bir tanı değerine sahip değildir. Böyle durumlarda, örnekte olan ve çok fazla gaita matriksiyle maskelenmiş olan patojenin aranmasını açıklığa kavuşturmak için daha az gaita miktarıyla veya hazırlanmış olan süspansiyonu (sedimentasyondan sonraki berrak süpernatant) daha fazla dilüe ederek testin tekrarlanması gerekli olacaktır. 13. Performans karakteristikleri 13.1. Klinik karşılaştırma çalışması 13.2. Çapraz reaktivite Aşağıda belirtilen barsak parazitlerinin hiçbiri RIDA QUICK Entamoeba da çapraz reaksiyona yol açmaz: RIDA QUICK Entamoeba 08-05-09 6
Entamoeba coli Blastocystis hominis Chilomastix mesnili Endolimax nana Entamoeba nana Entamoeba hartmannii Hymenolepsis nana Isospora belli Isospora felis Jodamoeba buetschlii RIDA QUICK Entamoeba 08-05-09 7
Kaynakça 1. Bracha, R. et al.: Differentiation of clinical isolates of Entamoeba histolytica by using specific DNA probes. Clin. Microbiol. 28 (No. 4), 680-684 (1990). 2. Citronberg, R. J., Semel, J. D.: Severe vaginal infection with Entamoeba histolytica in a woman who recently returned from Mexico: Case report and review. Clin. Infect. Dis. 20, 700-702 (1995). 3. Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A.: Entamoeba histolytica: Mechanism of surface receptor capping. Exp. Parasitol. 79, 424-435 (1994). 4. Katzwinkel-Wladarsch, S. et al.: Direct amplification and differentiation of pathogenic and nonpathogenic Entamoeba histolytica DNA from stool specimen. Am. J. Trop. Med.-Hyg. 51 (1), 115-118 (1994). 5. Kean, B. H. et al.: Epidemic of amoebiasis and giardiasis in a biased population. Brit. J. Ven. Dis. 55, 375-378 (1979). 6. Mannweiler, E.: Immundiagnostik der Amöbiasis. Der Mikrobiologe 5. Jg., Heft 6, 194-200 (1995). 7. Ohnishi, K. et al.: Brain abscess due to infection with Entamoeba histolytica. Am. J. Trop. Med. Hyg. 51 (2), 180-182 (1994). 8. Petter, R. et al.: Characterization of two distinct gene transcripts for ribosomal protein L 21 from pathogenic and nonpathogenic strains of Entamoeba histolytica. Gene 150, 181-186 (1994). 9. Reed, Sh. L.: New Concepts regarding the pathogenesis of amebiasis. Clin. Infect. Dis. 21 (Suppl. 2), 182-185 (1995). 10. Strachan, W. D. et al.: Immunological differentiation of pathogenic and non-pathogenic isolates of Entamoeba histolytica. Lancet 12, 561-563 (1988). 11. van Lunzen, J., Tannich, E., Burchard, G.-D.: Amöbenruhr und Amöbenleberabszeß. Deutsches Ärzteblatt 93, Heft 2, 2659-2665 (1996). 12. Schunk, M. et al.: Detection of Giardia lamblia and Entamoeba histolytica in stool samples by two enzyme immunoassays. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20, 389 391 (2001) RIDA QUICK Entamoeba 08-05-09 8