EK-8 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU İDRARDA İKİ BOYUTLU SIVI KROMATOGRAFİ AYRIM TEKNİĞİ KULLANILARAK AMİLOİD PROETİNİN TESBİTİ Prof.Dr. Nejat AKAR 20060809033 01.01.2007 01.01.2008 29.06.2007 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - 2007
I. İDRARDA İKİ BOYUTLU SIVI KROMOTOGRAFİ AYRIM TEKNİĞİ KULLANILARAK AMİLOİD PROETİNİN TESBİTİ Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA: Familial Mediterranean Fever: FMF), otozomal resesif olarak kalıtılan genetik bir hastalıktır. Daha çok Akdeniz kökenli Sefardik Yahudiler, Ermeniler, Türkler ve Araplarda görülmektedir (1). Bu toplumlarda taşıyıcılık oranı oldukça yüksektir. Ermeniler ve Sefardik Yahudilerinde taşıyıcı sıklığı sırasıyla 1/7 ile 1/5 olarak hesaplanmıştır (2). FMF den sorumlu gen genomda 16p13.3 bölgesinde yer almaktadır. Bu gen üzerinde yapılan çalışmalarda temel üç farklı yanlış anlamlı, amino asit değişikliği yaratan mutasyon (M694V, V726A ve M680I) tanımlanmıştır (3). Toplumumuzda M694V mutasyonu %51, M680I mutasyonu %14, V726A mutasyonu ise %9 oranında görülmektedir (4). FMF; periton, sinoviya veya plevrayı tutarak ateşli serözal inflamasyon yapan ve tekrarlayan ataklarla seyreden, şiddetli karın, göğüs veya eklem ağrılarıyla kendisini gösteren bir hastalıktır. Birbirinden bağımsız iki ayrı klinik tablosu vardır. Birincisi, ani başlayan ve kısa süreli karın, göğüs veya eklemlerde ağrı ile birlikte amiloidoz görülmesi, diğeri ise genç yaşta bile böbrek yetmezliğine neden olabilen böbrek amiloidozu görülmesidir (5). Türk FMF li hastalarda görülen klinik bulguların oranı, ateş (%92.5), peritonit (%93.7), plörezi (%31.2) ve artrit (%47.4) olarak belirtilmiştir (6). Yukarıda belirtilen birbirinden bağımsız iki klinik tabloda dikkat edilmesi gereken ortak nokta amiloidozun görülmesidir. M694V mutasyonun amiloidoz gelişiminde rol oynadığı düşünülse de, Türk FMF hastalarında sadece bu mutasyon değil, diğer mutasyonların da amiloidoz oluşumunda rolü olduğu belirtilmiştir (7). FMF in en önemli komplikasyonu amiloidozdur. Fibriler yapıdaki Amiloid A (AA) nın çeşitli organ ve dokularda ekstraselüler olarak birikimi ile ortaya çıkar. AA, amiloidozun sekonder formunu oluşturur (8). Serum Amiloid A (SAA), karaciğer başta olmak üzere hepatosit, monosit ve fibrositlerden sentezlenen bir akut faz proteinidir (9). SAA nın akut faz izotipleri SAA1, SAA2 ve SAA3 olmak üzere üç farklı gen tarafından kodlanmaktadır. Amiloid fibrilogenezinde esas rolü SAA1 in oynadığı düşünülmektedir (10). FMF amiloidozu daha çok
böbrekleri etkilemektedir. Nefrotik sendrom gelişimi sonucunda böbrek yetmezliği ortaya çıkar. Böbrekler dışında; karaciğer, dalak, mide-bağırsak ileri evrelerde ise kalp, akciğer, tiroid ve testislerde amiloid birikimi görülmektedir (11). Klinik belirtiler erken yaşlarda ortaya çıkar. Amiloidozdan meydana gelen ölümler 40 yaşın altındaki vakalarda %90, 10 yaşın altındaki vakalarda ise %6 oranındadır (8). Hemodiyaliz ve renal transplantasyon, amiloidli hastaların yaşam sürelerini uzatmaktadır (12). Kolşisin, amiloid gelişiminde doğrudan etkilidir. Amiloid fiberlerinin organizasyonuna ve değişik dokularda birikimlerine engel olabilir. Amiloidozun erken evrelerinde ise amiloid gelişimini durdurduğu gösterilmiştir (13). FMF tanısı alan bireylerde amiloid tespitinin yapılması hastalığın ilerlemesi ve tedavi açısından önemlidir. FMF ataklarını gösteren fakat amiloid tespiti yapılamayan kişilerde klinik ve tedavi yönünden sıkıntı çekilmektedir. Bu kişilerde amiloid proteininin gerçekten var olup olmadığı veya eser miktarda bulunuyorsa bugün için kullanılan biyokimyasal metodlarla tespit edilemediği durumlarda yeni geliştirilmiş proteomiks yöntemleri ile tespit edilebilir mi sorularına cevap vermenin klinik açıdan hastalığın tedavisine yön verecek önemde olduğunu düşünmekteyiz. ANAHTAR SÖZCÜKLER Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA: Familial Mediterranean Fever: FMF), akut faz proteinleri, amiloidoz, amiloid proteini
I. AMYLOID PROTEIN BY USING TWO DIMENSIONAL LIQUID CHROMOTOGRAPHY in UREA Familial Mediterranean Fever (FMF) is an autosomal recessive genetic diseases that prevalent mainly non-ashkenazi Jews, Armenians, Turks, Arabs. The frequency of the FMF carriers in non-ashkenazi Jews and Armenians; was thus as high as 1:5-1:7. The gene encoded FMF is located on chromosome 16p13.3. Researchs on this gene showed that three missense mutations (M694V, V726A, and M6801) cause this disease. In our society, the mutation frequency is 51% for M694V, 14% for M6801 and 9% for V726A. The salient features of this disease include recurrent episodes of peritonitis, pleuritis, and arthritis, which are usually associated with fever. In addition to these symptoms, recurrent abdominal attacks and acute chest pain can be seen. Two different clinical features independently act on FMF. It can be a sudden and short term abdominal and chest attacks or end up with renal amyloidosis that can cause the renal failure although the patient is young. The most common manifestation of Turkish patient is fever (92.5), peritonitis (93.7%), arthritis (47.4%) and pleurisy (31.2%). Although it be thought that M694V cause the amyloidosis, in Turkish FMF patient not only this mutation cause this disease but also other mutations can be leaded to this disease. The most important manifestation of FMF is amyloidosis. Amyloid A (AA), structure is fibril is accumulated in the different organs and tissues which caused the FMF diseases. Serum amyloid A (SAA), acute phase protein is synthesized by mostly from liver, hepatocytes, monocytes, and fibrosis. There are there isoforms of SAA acute phase; SAA1, SAA2, SAA3 which are coded three different genes. It is known that SAA play the most important role in the Amyloid fibrilogenesis. FMF amyloidosis affects mostly on kidney. Nephritic syndrome results as kidney failure. Not only kidney but also liver, spleen, chest- abdominal accumulate amyloid also can be seen. In the late stage amyloid accumulation occur in heart, lung, thyroid and testis. Clinical symptoms appear in the early ages. The mortality rate is 90% below the 40 years, 6% below the 10 years. Hemodialysis and renal transplantation makes the amyloid s patients survival rate much more higher. Colchicine directly affects on amyloid development. It can prevent amyloid fiber organization and accumulation in
the different organs. In early stages of the amyloidosis, it can cease the amyloid development. In FMF patient, amyloid diagnosis is important for the improvement of the disease and treatment. The purpose of this study was to apply a recently introduced proteomic based approach to identify the diagnostic biomarkers that couldn t detected by other biochemical methods with the high proteome sensitivity. We concluded that Proteomic analysis can be suggested as a useful promising novel tool for diagnosis of some diseases such as FMF along with routine biochemical tests. KEY WORDS FMF; Familial Mediterranean Fever, acute phase reactants, amyloidosis, amyloid protein
II. Amaç ve Kapsam : FMF tanısı almış ve FMF atakları geçiren hastalarda, iki boyutlu sıvı kromotoğrafisi ve onu takiben kütle spektrometresi proteomiks yöntemleri ile geleneksel biyokimyasal yöntemler ile tespit edilememiş amiloid proteinin idrarda tespiti ve tanımlanması. Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA: Familial Mediterranean Fever: FMF), otozomal resesif olarak kalıtılan genetik bir hastalıktır. Toplumumuzda FMF hastalarıyla yapılan epidemiyolojik çalışmalar, FMF prevelansını 1/1075, taşıyıcılık oranını ise 1/5 olarak göstermektedir (14). Hastalığın biyokimyasal bozukluğu tam olarak bilinmemekle beraber birçok hipotez önerilmektedir. Nötrofiller, akut inflamasyonla yakından ilişkili önemli hücre topluluklarıdır. FMF de meydana gelen mutasyonlar, ortamda kemotaktik inhibitörlerin eksikliğine yol açarak, nötrofilleri o bölgede toplamak için kemotatik faktörlerin daha uzun süre kalmasına neden olur. Böylece inflamasyon devam eder (11). İnflamasyon sırasında SAA (serum amiloid A) plazma seviyesinin yükselmesiyle, AA (amiloid A) proteinin ortaya çıkarak dokularda birikim meydana gelir (15). Serum Amiloid A (SAA), karaciğer başta olmak üzere hepatosit, monosit ve fibrositlerden sentezlenen bir akut faz proteinidir (9). SAA nın akut faz izotipleri SAA1, SAA2 ve SAA3 olmak üzere üç farklı gen tarafından kodlanmaktadır. Amiloid fibrilogenezinde esas rolü SAA1 in oynadığı düşünülmektedir (10). FMF amiloidozu daha çok böbrekleri etkilemektedir. Nefrotik sendrom gelişimi sonucunda böbrek yetmezliği ortaya çıkar. Böbrekler dışında; karaciğer, dalak, mide-bağırsak ileri evrelerde ise kalp, akciğer, tiroid ve testislerde amiloid birikimi görülmektedir (11). Klinik belirtiler erken yaşlarda ortaya çıkar.amiloidozdan meydana gelen ölümler 40 yaşın altındaki vakalarda %90, 10 yaşın altındaki vakalarda ise %6 oranındadır (8). Amiloidozdan meydana gelen ölüm yaşına ve oranlarına bakıldığında bu oranların toplumumuz içinde ne kadar önemli olabileceği ortaya çıkmaktadır. Hastalığın yayılışına bakıldığında diğer bölgelere oranla Akdeniz ülkelerinde görülme sıklığı fazladır. Ülkemizin bulunduğu konum nedeniyle bu hastalıkla ilgili yapılacak çalışmalar hem klinik hem de tedavi açısından çok önemlidir. Toplumumuzda M694V mutasyonu %51, M680I mutasyonu %14, V726A mutasyonu ise %9 oranında görülmektedir (4). FMF in en önemli komplikasyonu olan amiloidoz gelişiminin bu mutasyonlarla ilişkili olduğu düşünülmektedir. FMF tanısı alan hastalarda yapılan incelemelerde belirli oranlarda amiloid proteinine rastlanmıştır. İdrarla atılabilen amiloid proteini biyokimyasal metotlarla tespit edilebilmektedir. FMF ataklarını gösteren fakat amiloid tespiti yapılamayan kişilerde klinik ve tedavi
yönünden sıkıntı çekilmektedir. Bu tip hastalarda amiloid proteinin olamadığı ya da geleneksel biyokimyasal yöntemler ile gösterilemediği ancak eser miktarda da olsa idrarada tespit edilmesi hastalığın kliniği açısından oldukça önemli etkiye sahiptir. Bu nedenle amiloid proteininin tespiti, FMF tanısı ve tedavisi için çok önemli olacaktır. Doğru zamanda konulabilecek hastalık tanısının, etkili bir tedaviyi de beraberinde getireceği açıktır. FMF in en önemli komplikasyonu olan amiloidozun ve buna neden olan amiloid proteini üzerinde yapılacak çalışmaların özellikle tanı konulamamış kişiler için çok önemli olacağını düşünmekteyiz. Hem iki boyutlu sıvı kromotoğrafi ayrım tekniğinin kullanılması hem de hastalık tanısının kısa sürede konması açısından gerçekleştirilen bu çalışmanın bu alana yeni bir bakış açısı kazandıracağına inanmaktayız. III. Materyal ve Yöntem: Hastalar: Çalışmaya Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Nefroloji kliniğinde FMF tanısı almış ve FMF olduğu düşünülen semptomatik hastalar dahil edilmiştir. Her hasta için hastalıkla ilgili genel bilgilerin olduğu bilgilendirme formu düzenlenmiştir. Laboratuar İncelemeleri: Hastalardan toplam 200cc 24 saatlik idrar örneği alınmıştır. Bu örnekler Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Moleküler Genetik Laboratuarı nda ileriki çalışmalar için total protein eldesi ethanol çöktürmesi yöntemi ile yapılmıştır. Toplanan idrar örneklerinden 50 şer cc lik falkon tüplere alınarak alınarak üzerine 1/3 oranında soğuk etanol konur. Daha sonra +4 C 0 de 20 dk beklenir. Bu aşamada proteinler çöktürülmüş olur. 10.000 g de 15 dk santrüfüj edilir. Santrifüj sonunda üst kısım dökülerek pellet kısmı alınır. Tüm falkon tüplerdeki pelletler üzerlerine resüspanse edilci solüsyon; 6 M urea (sigma), 2M thiourea (sigma), %10 glycerol (sigma), 50mM tris-hcl (ph 7.8-8.2, 10-25 C 0 ) (sigma), %2 (w/v) n- octylglucoside(octyl b-d-glucopyranoside) (sigma), 5Mm TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) (sigma), 1 m M protease inhibitor cocktail (sigma) konularak birleştirilir ve pelletlerin çözünmesi sağlanır. Pellet tam olarak çözündükten sonra PD-10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) kolon, içerisinden 25ml start solüsyonu (Beckman Coulter) geçirilerek dengelenen kolondan toplam 3.5ml çözünmüş örnek geçirilir. Kolondan toplanan örnekler için mikro BSA (Bovin Serum Albümin) protein tayin kiti (Pierce) kullanılarak protein miktarı 562nm de hesaplanır.
1-5mgr/ml olacak şekilde hazırlanan protein örneği iki boyutlu sıvı kromotoğrafi cihazına toplam 2ml olacak şekilde enjekte edilir. Proteinler birinci boyutta start ve eluent solüsyonlarına bağlı olarak meydana gelen belirli ph seviyelerine göre (ph=8.4-4.0) birinci boyut kolonunda (250 x 2.1 mm id. Beckman Coulter) ayrılır ve ayrılan proteinler 280nm absorbansda ölçülür ve daha sonra birinci boyut fraksiyonları 96 lık toplama kaplarında biriktilir. Toplanan örnekler, ikinci boyutta hidrofobik özelliklerine göre, ikinci boyut ters faz kolonunda (4.6 x 33 mm, Beckman Coulter ), %0.08 lik trifloracetic acid bulunduran acetonitril ve %0.1 lik trifloracetic acid bulunduran distile su ile 45 dk boyunca 214nm de yeniden farklı fraksiyonlara ayrılır. 96 lık steril kaplarda tekrar toplanan, birinci ve ikinci boyut ayrımları tamamlanan örnekler 280nm ve 214nm de absorbanslarına göre analiz edilerek bir veri tabanından toplanır ve özel bir bilgisayar programında incelenir ve değerlendirilir. Daha sonra çalışma süresine göre, +4 derecede bir hafta veya -80 derecede altı ay süreyle saklanabilir. İki boyutlu olarak ayrılan proteinlerin tayini ve amiloid proteinin bulunması amacı ile çalışma tripsinizasyon işlemi proteinlerin peptidlere kesimi ve bu işlemi takiben kütle spektrometresi ile tanımlanması yer almaktadır. Bu amaç ile 125µg/ ml tripsin solüsyonu (Sigma) ile 37 0 C de gece boyu kesim yapılır, Daha sonra hazırlanan peptid örnekleri MALDI-MS kütle spektrometresi ile α-cyono-4-hydroxycinnamic-acid matriksi kullanılarak, Reflectron pozitif modunda analiz edilmiştir. 5 farklı peptid karışımından oluşan eksternal kalibrasyon yapılmiştır. PLGS adı verilen ticari bilgisayar programı yardımı ile Swiss-prot protein veri tabanlarına 50 ppm kütle doğruluğu ile bağlanılması suretiyle amiloid proteini tanımlanmıştır. IV. Analiz ve Bulgular: Klinik olarak özellikle asemptomatik FMF hastalarında ve amiloidozis ile uyumlu klinik tablo olmasına rağmen bilinen biyokimyasal yöntemler ile aydınlatılamamış amiloid proteini tedavinin planlanması aşamasındaki öneminden ötürü proteomiks analiz yöntemleri ile toplam 2 FMF li ve amiloidi olan, 2 FMF li ve amiloid şüphesi olan hasta ve 1 kontrol olmak üzere araştırmanın temelini teşkil eden PF2D iki boyutlu sıvı kromatografisi sisteminin proje kapsamında satın alınan 5 örneklik kiti ile çalışmaya alınmıştır. Elde edilen PF2D ph sına ve hidrofobitesine göre proteinlerin iki farklı özelliğine göre birbirinden ayrımı sağlayan sıvı kromatografisi yöntemi ile amiloid proteinin ph sı ve hidrofobik özelliği ile uyumlu bantlar şeklinde veriler elde edilmiştir. Aynı protein paterni amiloid şüphesi olan ancak bugüne kadar Ankara Üniversitesi Pediatrik Nefroloji kliniği tarafından uzun süreli takibine rağmen amiloidi tespit edilememiş hastada da
tespit edilmiştir. Amiloidi olduğu bilinen hasta örneğinin PF2D sistemindeki dağılımı oldukça net olarak analiz edilebimekte ve kontrol bireyinde bulunmayan bu protein paterninin şüpheli amiloidinin olabileceği düşünülen hastada olması oldukça açıklıkla amiloid proteini işaret etmektedir. Ancak elde edilen bu iki boyutlu protein ayrım sistemi verilerinin teyidi için kütle spektrometresi ile analiz yapılmıştır. Bu sistem ile peptidlere kesilen proteinlerin en hafif isotopik küme kütle analizini yapmak mümkündür. Bu şekilde elde edilen spektrum ve kromotogram verileri ile swiss prot gibi protein veri tabanları içerisinde bilgisayar ortamında eşleşme yapılır ve protein bilgilerine ulaşılır. Bu sistem ile amiloid proteini biyokimyasal yöntemler ile bulunamamış hastada amiloid proteini PF2D sisteminden elde edilen ph değerine ve özelliklerine uyumlu olarak tanımlanmıştır. IV. Sonuç ve Öneriler: PF2D iki boyutlu sıvı kromatografisi ile iki farklı özelliğine göre proteinlerin birbirinden ayrımı ve verdikleriprotein paternlerinin değerlendirilmesi ve eser miktarda olan ve biyokimyasal yöntemler ile tespit edilemiyen proteinlerin tanımlanması kilinik açıdan tedaviye yön verebilecek öneme sahipitir. Özellikle farklı yan etkileri ile hastalarda kullanımları öncesinde kesin tanı gerektiren ilaçların kullanımı öncesinde hastalık tanısının kesinleştirilmesi açısından yeni, oldukça gelişmiş ve hassas proteomiks yöntemlerinin kullanılması oldukça önemli ve yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde gelecek vaad etmektedir.
VI. Kaynaklar : 1.SOHAR, MJ., GAFNI, J., PRAS, M., HELLER, H. (1967). Familial Mediterranean Fever: A survey of 470 cases and review of the literature. Am. J. Med. 43: 227-253. 2.DANIELS, M., SHOHAT, T., BRENNER-ULLMAN, A., SHOHAT, M. (1995) Familial Mediterranean Fever: High gene frequency among the non-ashkenazic and Ashkenazic Jewish populations in Israel. Am. J. Med. Genet. 55: 311-314. 3.THE FRENCH FMF CONSORTIUM. (1997). A candidate gene for Familial Mediterranean Fever. Nature Genet. 17: 25-31. 4.AKAR, N., MISIROĞLU, M., YALÇINKAYA, F., AKAR, E., ÇAKAR, N., TUMER, N., AKÇAKUŞ, M., TAŞTAN, H., MATZNER, Y. (2000). MEFV mutations in Turkish patients suffering from Familial Mediterranean Fever. Hum. Mut. 15: 118-119. 5.LIVNEH, A., LANGEVITZ, P., ZEMER, D., ZAKS, N., KEES, S., LIDAR, T., MIGDAL, A., PADEH, S., PRAS, M. (1997). Criteria for the diagnosis of Familial Mediterranean Fever. Arthritis Rheum. 40: 1879-1885. 6.TUNCA, M., AKAR, S., ŞIRIN, A., ONEN, F., ÇOBANKARA, V. (2002). The results of a nationwide, multicenter analysis of the clinical and genetic characteristics of the Turkish FMF patients. Clin. Exp. Rheumatol. 20 [SUPPL 26] p.:92. 7.TEKİN, M., YALÇINKAYA, F., ÇAKAR, N., MISIRLIOĞLU, M., TAŞTAN, H., AKAR, N., TÜMER, N. (2000). MEFV mutations in multiplex families with Familial Mediterranean Fever: is a particular genotype necessary for amyloidosis? Clin. Genet. 57: 430-437. 8.PRAS, M., BRONSHPIGEL, N., ZEMER, D., GAFNI, J. (1982). Variable incidence of amyloidosis in Familial Mediterranean Fever among different ethnic groups. Johns Hopkıns Med. J. 150: 22-26. 9.MEEK, RL., ERIKSEN, N., BENDITT, EP. (1992). Murine Serum Amyloid A (3) is high density apolipoprotein and is secreted by macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89: 7949-7952.
10.YAMADA, T., WADA, A., ITOH, Y., ITOH, K. (1999). Serum amyloid A1 allels and plasma concentrations of serum amyloid A. Amyloid: Int. J. Exp. Clin. İnvest. 6: 199-204. 11. SAMUELS, J., AKSENTIJEVICH, I., TOROSYAN, Y., CENTOLA, M., DENG, Z., SOOD, R., KASTNER, D. L. (1998). Familial Mediterranean Fever at the Millenium: Clinical spectrum, ancient mutations and a survey of 100 American referrals to the National Institutes of Health. Medicine (Baltimore), 77: 268-297. 12.LIVNEH, A., ZEMER, D., SIEGAL, B., LOAR, A., SOHAR, E., PRAS, M. (1992). Colchicine prevents kidney transplant amyloidosis in Familial Mediterranean Fever. Nephron. 60: 418-422. 13.BEN-CHETRIT, E. (2003). Familial Mediterranean Fever (FMF) and renal amyloidosis phenotypegenotype correlation, treatment and prognosis J. Nephrol. 16: 431-434. 14.OZEN, S., KARAASLAN, Y., OZDEMIR, O., SAATCI, U., BAKKALOĞLU, A., KOROĞLU, E., TEZCAN, S. (1998). Prevalance of juvenile chronic arthritis and Familial Mediterranean Fever in Turkey: a field study. J. Rheumatol. 25: 2445-2449. 15.BENSON, MB., COHEN, AS. (1979). Serum Amiloid A protein in amyloidosis, rheumatic and neoplastic diseases. Arthritis Rheum. 22: 36-42.
VII. Ekler : 22-24 Mart 2007 tarihlerinde İstanbulda yapılan uluslararası II. Moleküler Tıp Kongresinde bu çalışma sunulmuştur. Sunum özeti ektedir. NOT :Verilen kesin rapor 2 nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, kesin rapor Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD veya disket ile verilecektir.