DERLEME Hacettepe T p Dergisi 2008; 39:4-8 Geliflen klinik biyokimya: metabolomik Hatice Asuman Özkara 1 1 Prof. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Ankara ÖZET 2005 yılında Massachusetts Teknoloji Enstitüsü nün yeni ortaya çıkan 10 teknoloji arasında ilan ettiği metabolomik, küçük molekül -omiksi diye tanımlanabilir. Metabolomik, yüzyıldan daha uzun bir süredir tıbbi araştırmaların temelini oluşturan küçük molekül biyokimyasının moleküler genetik, genomik ve proteomik gibi alanların gölgesi ardından yeniden tüm önemi ile ortaya çıkmasını sağlamıştır. Metabolomik bir hücrede, dokuda veya biyolojik sıvılarda bulunan tüm metabolitlerin NMR (nükleer manyetik rezonans), GC-MS (gaz kromatografi-kütle spektrofotometri) ve LC-MS (sıvı kromatografi-kütle spektrofotometri) gibi yüksek verimli teknolojilerle kısa sürede, ucuz ve doğru ayrılması, tanımlanması ve ölçülmesidir. Bir canlının genetik özellikleri ve beslenme şekline uygun fenotipik yanıtını karakterize etmek için o canlının metabolik profilinin kantitatif ölçümüdür. 2005 yılında duyurumu yapılan Kanada daki Alberta Üniversitesi nin İnovasyon projesi olan İnsan Metabolom Projesi 2007 yılında sonuçlanarak 2500 metabolit tanımı ile bu alanda öncülüğü üstlenmiş, 2005 yılında National Institute of Health (NIH) Tıbbi araştırmalar başlığı altında metabolomik teknolojileri geliştirme projelerini destekleyeceğini açıklamış ve desteklemiştir. İzleyen yıllarda İngiltere de başlatılan İnsan Serum Metabolom projesi ve NIH in önderliğinde 16 araştırma laboratuvarının katıldığı LIPIDMAPS projeleri devam etmektedir. Bu projeler ve yenilerinin sonuçlanması ile yeni veritabanları, yeni teknolojiler, yeni biyobelirteçler, yeni ilaç hedefi metabolitler, yeni metabolik yollar ve ilaç direnç mekanizmaları tanımlanabilecektir. Metabolomik aynı zamanda tıbbı kişiselleştirmeye doğru atılan bir adımdır. Anahtar Kelimeler: Metabolomik, NMR, GC-MS, LC-MS, insan metabolom projesi. ABSTRACT Emerging clinical biochemistry: metabolomics Metabolomics, claimed by Massachusetts Institute of Technology as one of the 10 newly emerging Technologies in 2005 can be defined as little molecule -omics. Metabolomics has re-emerged with all its importance from under the shadow of fields such as molecular genetics, genomics and proteomics of the little molecule biochemistry that formed the basis of medical research for over a century. Metabolomics is the cheap and correct separation, definition and measurement of all metabolites in cells, tissues or biological fluids in short amounts of time with high throughput technologies such as NMR, GC-MS and LC-MS. It is the quantitative measurement of the metabolic profile of the living being to characterize the genetics and the phenotypic response to nutritional status of it. The Human Metabolome Project, the Innovation Project of Alberta University in Canada that was announced in 2005, concluded in 2007, and with 2500 metabolite definitions has become leading in the field, and has declared to support and supported the projects for developing 4 H ACETTEPE T IP D ERG S
Geliflen klinik biyokimya: metabolomik the metabolomics technologies under the title of NIH Medical Research in 2005. In the following years the Human Serum Metabolome project initiated in England and LIPIDMAPS projects that were attended by 16 laboratories with the leadership of NIH, are continuing. With the conclusion of these projects and new ones, new databases, new technologies, new biomarkers, new drug targets, new metabolic pathways and mechanisms of drug resistance will be defined. Metabolomics is also a step taken towards the personalization of the medicine. Key Words: Metabolomics, NMR, GC-MS, LC-MS, human metabolome project. 2003 yılında tamamlanan İnsan Genom Projesi insan vücudunda 30,000-40,000 gen bulunduğunu, bunların %99.9 unun tüm bireylerde aynı, %0.1 inin farklı olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu %0.1 lik fark neden bazı kişilerin hastalık riski taşıdığını, hastalıkların şiddetinin kişilerarası neden farklılık gösterdiğini, neden bazı kişilerde ilaçlara daha iyi yanıt alındığını açıklamada önemli olacaktır. Yani, genlerin tanımlanması ile bilinmeyenler tamamen çözümlenmemiş, bu genlerin fonksiyonları araştırılmaya başlanmış, proteomik ve transkriptomik çalışmaları yapılmıştır. Ama bu araştırmalardan elde edilen bilgiler, klinik fenotipleri açıklamak için yeterli olmamıştır. Çünkü, klinik fenotipi belirleyen bilgi hücrede oluşan metabolitlerde saklıdır [1]. 100 yıldan uzun bir süredir biyokimya çalışmaları ile enzimler, substratlar, ürünler, araürünler, enzimlerin kinetik özellikleri ve bunlar üzerine etki eden faktörler tanımlanarak bugün normali ve hastalıkları anlamada kullanılan metabolik yolların büyük bir kısmı ortaya çıkarılmıştır. Bu bilgi insan hayatının kalitesini ve süresini artırmada kullanılmış ve bugün yeni teknolojiler ve veri değerlendirme yöntemleri ile daha da geliştirilmek üzere yeni bir boyut kazanmıştır [2]. Metabol Yunanca bir kelimedir ve değişmek anlamındadır. -ome ise küme demektir. Bir hücre veya canlıdaki metabolizmanın tümü metabolom, metabolom çalışması ise, metabolomiktir. Daha ayrıntılı bir tanımlama ile, metabolomik, metabolomdaki küçük moleküllü metabolitlerin yüksek verimli teknolojiler kullanılarak saptanması, miktarının belirlenmesi ve tanımlanmasıdır. Küçük moleküller peptitler, oligonükleotidler, şekerler, nükleozidler, organik asitler, ketonlar, aldehitler, aminler, amino asitler, lipitler, steroitler, alkaloidler ve ilaçlar, insan-bakteri ürünleri gibi metabolitlerdir (metabo-lite) ve molekül ağırlıkları 1500 Da un altındadır. İnsandaki metabolitlerin sayısı tam olarak bilinmemekte; en az 2 bin-3 bin en fazla 20 bin olacağı tahmin edilmektedir. Metabolomik analizleri serum, idrar, beyin omurilik sıvısı, plazma, tükürük gibi vücut sıvılarında yapılabilir. Bu analiz klinik biyokimya ile, farmakoloji, pre-klinik ilaç denemeleri, toksikoloji, transplant izlemi, kanser metabolizması, yeni doğan taraması alanlarında kullanılmaktadır [1]. Metabolomik çalışmalarında esas olarak iki teknoloji kullanılmaktadır; bunlar NMR ve değişik kütle spektrofotometreleridir. NMR, bir örnekte çok hızlı bir şekilde varolan bütün metabolitleri tanımlayabilir ve konsantrasyonlarını saptayabilir. Kütle spektroskopisi NMR ı tamamlayıcı bir rol üstlenir; daha hassas bir şekilde binlerce metabolitin profilini çıkararak yeniden değerlendirip hesaplamalarını yapabilir. Metabolit profilleri bilgisayarlarla uygun programlarla işlenir, saklanır, sonuçlar değerlendirilir [2]. Metabolomik çalışmaları için daha ileri teknoloji ve yazılım, verileri değerlendirme yöntemlerine gereksinim duyulmuştur. Bu ihtiyaç nedeni ile 2004 yılında NIH tıbbi araştırma başlığı altında metabolomik teknoloji geliştirme projelerini destekleyeceğini açıklamış ve 5 yıllık bir süre için 70 milyon dolar tutan çeşitli projeler desteklenmiştir. Bu kapsamda desteklenen projelerden bazıları şunlardır; a. Hidrofobik metabolitler için flöresan problar başlıklı proje hücreiçi ve hücredışı ortamda proteine bağlı olmayan serbest yağ asitlerinin konsantrasyonunu belirlemek için yeni metot geliştirmeyi, b. Tek hücrede glikolipit metabolizması başlıklı proje iki farklı glikolipit metabolit yolunda farklı flöresan işaretli substratlarla, tek nörondaki glikolipit metabolizmasını ortaya çıkararak, nöroaktif ajanların belirlenmesini ve ilaç hedefi olarak kullanılmasını sağlamayı, c. Hücresel nörometabolomik için teknolojiler başlıklı proje mikro akışkanlı örnek birimi, elektroforezle ayırım ardından flöresan ve kütle spektrofotometri ile ayırım ve uygun metabolitlerin nanolitre hacimli kapillerler içine yakalanarak, nanolitre hacimde NMR spektroskopik karakterizasyonunu tek bir birim içinde geliştirmeyi, d. Spatio-Temporal Metabolomikin biyolojik osiloskopları başlıklı proje ise, metabolik değişkenliklerin eş-zamanlı in vivo spatiotemporal ölçülmesini hedefle- Cilt 39 Say 1 2008 5
Özkara mektedir. Ayrıca Real-time flöresan mikroskopi ve flöresan nanosensör proteinlerle birlikte sinyal iletimindeki değişiklikler ve yeni sinyal iletim yolakları bulmayı hedefleyen projeler de desteklenmiştir. NIH bu projelerle metabolomik alanında daha fazla bilgi elde edilmesi, bu bilgilerden yeni ilaç ve biyobelirteç geliştirilmesi için teknoloji geliştirilmesi yolunu açmıştır [3]. Metabolomik çalışmalar için çeşitli işbirlikleri oluşturulmuştur. Bunlardan ilk başlayan ve tamamlanan İnsan Metabolom Projesi (HMP) dir. 2005 yılında Kanada Alberta Üniversitesi nin, Genom Kanada ve Kanada İnovasyon Kurumu nun desteği ile başlattığı 7.5 milyon dolar bütçeli HMP bir inovasyon projesidir. Bu proje ile insan vücudunda idrar, BOS, plazma ve lökositlerde 1 mikromolardan daha fazla konsantrasyonda bulunan tüm metabolitleri tanımlamak, ölçmek ve normal-anormal değer aralığını belirlemek, bu verilerin serbestçe elektronik ortamda elde edilebilir olmasını sağlamak (Human Metabolome Data Base- HMDB) ve tanımlanan bileşiklere halkın ulaşmasını sağlayacak bir kütüphane (Human Metabolome Library- HML) oluşturmak amaçlanmıştır. HMP si tamamlanmış ve sonuçları www.hmdb.ca adresinde açıklanmış, bu veritabanı hakkında bilgi yayınlanmış, halkın erişebileceği bir kütüphane oluşturulmuş ve aynı web sitesinden bu kütüphaneye bir bağlantı sağlanmıştır. Bu projede 3 organik kimyacı, 6 NMR spektroskopi uzmanı, 5 kütle spektroskopisi uzmanı, 2 ayırım uzmanı, 3 doktor ve 14 biyoinformatikçi ve diğer araştırıcılar olmak üzere toplam 53 kişi çalışmıştır. HMDB, 2500 endojen metabolit içermektedir. Bu metabolitler 27,700 den fazla farklı sinonimle, 115 metabolik yolla, 2080 farklı enzim, 110,000 tek nükleotid polimorfizmi ve 862 genetik veya kazanılmış metabolik hastalıkla bağlantılıdır. Her metabolit için yaklaşık 90 farklı sayfada değişik özellikler sunulmuştur. HMDB endojen metabolitlerin yanı sıra 1500 ilaç, 3900 besin bileşeni içermektedir. HML deki bileşik sayısı 778 dir. HMDB deki bilgilerden kitap basılsa sayfa sayısının 30 bin olacağı belirtilmiştir [4,5]. Metabolomik araştırmalar için oluşturulan ikinci konsorsiyum Hastalıkta ve Sağlıkta İnsan Serum Metabolomu Projesi (human serum metabolome - Husermet) dir. Manchester Üniversitesi nden bir grup araştırıcının, İngiltere Bilim ve Araştırma Kurumu (BBSRC), Tıbbi Araştırma Kurumu (MRC), Astra Zeneca ve GlaxoSmithKline firmalarının desteği ile Mart 2007 tarihinde başlattığı bir projedir. Amaçları: a. İnsan serum metabolomunu ölçmede kullanılan teknolojiyi optimize etmek ve kullanmak, b. Metabolomun normal değerlerini belirlemek, yaş, cinsiyet, diyet, yaşam şekli ve kullanılan ilaçlar gibi değişkenlerle nasıl etkilendiğini ölçmek, c. Hastaların metabolomunu çalışarak hastalıklar için prognostik ve diagnostik biyobelirteçler tanımlamak, ilaçlar ve diğer tedavilerin etkinliğini saptamak, bu kapsamda öncelikle Alzheimer ve over kanserini incelemek, d. Yeni metabolitler keşfetmek, e. Bilim adamları için bir web tabanlı kaynak oluşturmak, bulunan metabolom verisini ve eşlik eden metaverinin kullanımını sağlamak, f. Verileri görüntülemek, işlemek ve genetik programlamada kullanmak için yenileri de dahil olmak üzere ilişkileri onaylamanın stratejilerini öğrenmektir [6]. Diğer bir konsorsiyum olan LIPIDMAPS (Lipid Metabolites And Pathways Strategy) konsorsiyumu NIH in liderliği ve sponsorluğu ile 16 araştırma enstitüsünün katılımı sonucu oluşmuştur. Hedefleri özgül bir hücrede yeni lipitleri bulmak ve tanımlamak, varolan tüm lipit metabolitlerini ölçmek, hücresel fonksiyon sırasında düzeylerini ve yerleşimlerindeki değişimleri ölçmek, her lipitin katıldığı biyokimyasal yolu belirlemek, lipit haritası geliştirerek bir ilişkiler ağı tanımlamaktır [7]. Bu projede hücre tipi olarak aterosklerotik plakların oluşumunda önemli olan makrofajlar seçilmiştir. Klinik uygulamalar Metabolomik kullanılarak yapılan çok sayıda araştırma bulunmaktadır. Bunların bir kısmı Harrigan GG tarafından özetlenmiştir [8]. İlk önemli sonuç dolaşımdaki TCA döngüsü araürünlerinin hipertansiyondaki rolü konusunda yapılan araştırmadan elde edilmiştir. Hipertansiyonda süksinat ve alfa-ketoglutaratın düzeylerinin kanda yükselmiş olması, kan basıncı ile mitokondri metabolizması arasında bir bağlantı olduğunu düşündürmüştür [9]. Bir başka çalışmada da, TCA döngüsü metabolitlerinin egzersizle uyarılan iskemi ile ilişkisi olduğu gösterilmiştir [10]. Dolaşımdaki oksalat ve sitratın iskemiye aday kişilerde azaldığı, kontrollarda değişmediği bunun GABA, alfa-ketoglutarat, sitrullin ve arjininosüksinat için de geçerli olduğu bulunmuştur. Araştırıcılar normale göre farklı bulunan metabolitlerin hastalıklarda hangi metabolik yolların aktive olduğunu anlamamızı sağlayacağı sonucuna varmışlardır. Bir motor nöron hastalığı olan amiyotrofik lateral skleroz (ALS) da ve diğer motor nöron hastalıklarında 6 H ACETTEPE T IP D ERG S
Geliflen klinik biyokimya: metabolomik sinyal moleküllerinin analizi bu hastalıklarda normale göre aberran sinyal yollarının kullanıldığını ortaya çıkarmıştır. Bu yollarda bulunan moleküller yeni ilaç tasarlaması için hedef moleküller olabilirler [11]. Metabolomik çalışmalarında metabolik akış temelli çalışmalar metabolik yolları ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Bu analizlerde işaretli bir atom kullanılır. İşaretli bu atomun metabolitlere katılımının izini sürerek atomun hangi metabolik yollara girdiği anlaşılabilir. Bu iz sürme yöntemine SIDMAP (stable isotope dynamic metabolic profiling) adı verilmektedir [12]. Bu yöntemle düşük doğum ağırlıklı bebeklerde de novo lipogenez rapor edilmiştir. Bu bebekler postnatal dönemde yüksek enerji gereksinimi duymakta ve yeterli büyümeyi sağlayabilmeleri için yüksek oranda yağ almaları gerekmektedir. SIDMAP araştırıcıları de novo lipogenezisin parenteral beslenme veya anne sütü ile beslenmeye adaptasyonda önemli bir fizyolojik role sahip olduğunu öne sürmüşlerdir. Stabil izotop içeren asetatın düşük doğum ağırlıklı bebeklere verilmesi palmitat, stearat ve kolesterolun sentezini sağlamış ve bu da bu bebeklerde normal büyümeyi gerçekleştirmiştir. SIDMAP önemli bir metabolomik sonuç çıkarmıştır. Bu da şudur: Yeni doğan bebekler de novo lipogenez kullanırlar. Bunu bebeğin büyümesi için periferal dokularda gerekli enerji ve depoyu ve diyetle alınan farklı yağlara adaptasyonda plazma yağ asiti bileşimini sağlamak için kullanırlar [13]. Kanser hücrelerinde de novo nükleik asit sentezi ile ilişkili farklı yollar SIDMAP ile çalışılmıştır. Kanser hücreleri glukozu primer substrat olarak kullanırlar, metabolizmaları hızlıdır. İşaretli-D glukoz kullanılarak yapılan çalışmada de novo nükleik asit sentezinde bazı kanser hücrelerinin farklı yollar kullandıkları gösterilmiştir. Tiamin taşınım bozukluğu olan hücre dizileri ve pankreas adenokarsinoma hücreleri gibi apoptoza duyarlı hücrelerde, pentoz fosfat yolu, oksidatif olmayan kısmıyla, inflamatuvar meme kanseri hücreleri gibi apoptoza dirençli hücrelerde oksidatif kısmıyla kullanılmaktadır. Pentoz fosfat yolunun kullanımı yağ asiti sentezi ve desaturasyon hızı ile ilgilidir. Gleevec isimli ilacın bcr-abl lösemi hücrelerinde etki mekanizması SIDMAP ile gösterilmiştir. Onkogen ürünü bir tirozin kinazdır; glukoz alımını, hekzokinaz aktivitesini ve oksidatif pentoz fosfat yolu metabolizmasını artırmaktadır. Gleevec bu olayı efektif bir şekilde de novo nükleik asit sentezini azaltarak inhibe etmektedir. SIDMAP Gleevec in hücrelerde oksidatif olmayan pentoz fosfat yolunda fonksiyonel kapasiteyi artırmak yoluyla direnç geliştirdiğini göstermiştir [14]. Beyin tümörlerinde yapılan metabolomik çalışmalarda ise, farklı beyin tümör ve kanserlerinde farklı metabolitlerin yükseldiği bulunmuştur [15,16]. Bu alanda kullanılan teknolojilerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Metabolomik analizler hastalıkların hayvan modellerine de uygulanmaya başlanmış ve kardiyovasküler, metabolik ve nörodejeneratif hastalıkların gelişimi hakkında bilgi edinilmesi mümkün olmuştur [17]. Metabolomik teknolojilerinin gelişmesi desteklenmekte, değerlendirme yöntemleri geliştirilmekte, metabolomik analizlerin standardizasyonu için 2004 yılında kurulan metabolomik derneği çalışmalar yapmakta [18, 19] ve sonuçta elde edilen sağlıklı veriler çeşitli veri tabanlarına yerleştirilerek, hem bilimadamları, hem de halkın kullanımına sunulmaktadır. Metabolomik klinik biyokimyanın gelişen yüzünü oluştururken, tıbbı da kişiselleştirmektedir. Bir yazarın yazdığı gibi bizler doğanın bize sağladıklarından daha fazlasını üretmeye çalışıyoruz. Kendi vücut şeklimize göre giysi hazırlayıp, tenimize uygun renkleri, yüz şeklimize uygun saç biçimini seçiyoruz. Neden genetik yapımıza ve biyokimyamıza uygun tedaviyi seçmeyelim [1]. Kaynaklar 1. Bren L. Metabolomics: working toward personalized medicine. FDA Consum. 2005; 39:28-33. 2. German JB, Hammock BD, Watkins SM. Metabolomics: building on a century of biochemistry to guide human health. Metabolomics 2005; 1:3-9. 3. http://grants.nih.gov 4. Wishart DS, Tzur D, Knox C, et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res 2007; 35(Database issue):d521-6. 5. Wishart DS. Human metabolome database: completing the human parts list. Pharmacogenomics 2007; 8:683-6. 6. http://www.husermet.org 7. http://www.lipidmaps.org 8. Harrigan GG. Metabolomics a systems contribution to pharmaceutical discovery and drug development. Drug Discovery World Spring 2006; 39-46. 9. He W, Miao FJ, Lin DC, et al. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G-protein-coupled receptors. Nature 2004; 429:188-93. 10. Sabatine MS, Liu E, Morrow DA, et al. Metabolomic identification of novel biomarkers of myocardial ischemia. Circulation 2005; 112:3868-75. 11. Rozen S, Cudkowicz ME, Bogdanov M, et al. Metabolomic analysis and signatures in motor neuron disease. Metabolomics 2005; 1:101-8. 12. http://www.sidmap.com 13. Garg M, Bassilian S, Bell C, et al. Hepatic de novo lipogenesis in stable low-birth-weight infants during exclusive breast milk feedings and during parenteral nutrition. JPEN J Parenter Enteral Nutr 2005; 29:81-6. Cilt 39 Say 1 2008 7
Özkara 14. Serkova N, Boros LG. Detection of resistance to imatinib by metabolic profiling: clinical and drug development implications. Am J Pharmacogenomics 2005; 5:293-302. 15. Griffin JL, Kauppinen RA. A metabolomics perspective of human brain tumours. FEBS J 2007; 274:1132-9. 16. Griffin JL, Salek RM. Metabolomic applications to neuroscience: more challenges than chances? Expert Rev Proteomics 2007; 4:435-7. 17. Griffin JL. Understanding mouse models of disease through metabolomics. Curr Opin Chem Biol 2006; 10:309-15. 18. MSI Board Members: Sansone SA, Fan T, Goodacre R, et al. The Metabolomics Standards Initiative. Nat Biotech 2007; 25:846-7. 19. Castle AL, Fiehn O, Kaddurah-Daouk R, et al. Metabolomics Standards Workshop and the development of international standards for reporting metabolomics experimental results. Brief Bioinform 2006; 7:159-65. 8 H ACETTEPE T IP D ERG S