1 EN STABİLİTE VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: SRICO: insan serumunda indirek immunofloresan testi (IFA) ile Rickettsia conorii antikorlarının tanısı için slaytlar. GİRİŞ: RICKETTSIA CONORII IFA SLIDE Rickettsia conorii Akdeniz ateşinin nedensel ajanıdır ve bu coğrafik bölgede endemiktir. Hastalık başlangıcında ateş, exanthema ve kalın parçanın kenarında siyah leke ile karakterizedir. IFA basitliğine, prekositesine ve çapraz reaksiyon olmamasına göre en çok kullanılan tekniktir. Bu teknik IgG ve IgM antikorlarının belirlenmesi için kullanılır. TEST PRENSİBİ: IFA metodu slayt yüzeye absorbe edilmiş antijenlerin antikorla reaksiyonuna dayanır.bağlanmayan immunglobulinler yıkama adımı ile uzaklaştırılır. Daha sonraki adımda antijen antikor kompleksi floransan etiketli anti-insan globulin ile reaksiyona girer. Immunforasan mikroskopu kullanılarak test edilir. Visible light KİT ÖZELLİKLERİ: UV light FITC Anti-human globulin Slaytlar VIRCELL IFA kit ile ilişkili kolay kullanım için numaralara sahiptir. KİT İÇERİKLERİ: 1 VIRCELL RICKETTSIA CONORII SLAYT: 10 kuyucuk içn 10 slayt, R. conorii, Moroccan strain (ATCC VR-141), Vero hücrelerinde büyüyen, ile kaplıdır, formaldehid muamele edilmiştir, acetone sabitlenmiş. Bakteri, adhesyonu sağlamak ve bakteriyal agregasyondan korumak için 0.5% normal tavuk yolk kesesinde suspansedir. 2-8ºC saklayınız ve miadını kontrol ediniz. Human anti-rickettsia conorii antibody R. conorii antigen Gerekli materyaller ama sağlanmayanlar: Uygun mikropipetler. Thermostabil inkübator. Distile su. 24x60 mm yapışkan. Fluoresan mikroskope ve kullanıcının tercihine göre uygun filtreler. Nemli hazne. Uygun özgüllükte VIRCELL IFA kit. Reaktifleri aseptik durumlarda, mikrobiyolojik kontaminasyondan uzak bir şekilde saklayınız. VIRCELL, S.L.yanlış kullanımdan olan hataların sorumluluğunu kabul etmez. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir.sadece profesyonel kullanım içindir. 2. Sadece VIRCELL IFA kitleri ile ilgili olanları kullanın. 3. Her test basamağında pipet uçlarını temizleyiniz.sadece temiz, tercihen tek kullanımlık materyal kullanınız. 1. Hasar görmüş paketleri kullanmayınız. 4. Asla ağız ile pipetlemeyiniz. 5. Kuyucuklar inaktive R. conorii antijen ile kaplıdır. Yine de kullanılan tüm malzemeler potansiyel risk faktörü gibi davranılmalıdır. Atıklar konusunda da bölgesel kanunlara göre davranılmalıdır. 6. Sadece kit ekindeki protokolü uygulayın. Inkubasyon zamanı ve sıcaklıklar farklı olursa yanlış sonuçlar verebilir. 7. Slayt üzerinde hasta örneklerinin çapraz kontaminasyonu hatalı sonuçlara neden olur. Önlemleri dikkate alın. 8. Mikroscope optikleri, ışık kaynağı kondisyonu ve tipi floresan kalitesini etkiler. 9. Gereğinden daha uzun süre oda ısısını değiştirmeyiniz. 10. Herbir slayt sadece bir kez kullanılmalıdır. Kırmayınız ve kuyucukları tekrar tekrar kullanmayınız. 11. Kit içeriğinde bulunan cam elementler kırıldığında fiziksel hasara neden olabilir. Dikkatli kullanın. 12. örneğer sorbent eklenmesinden sonra görünür bir presipitat var mı kontrol edin. NUMUNE TOPLAMA VE SAKLAMA: Kan mikrobiyolojik kontaminasyon dikkate alınarak eğitimli bir personel tarafından, venipunktür tekniği ile eğitimli bir personel tarafından alınmalıdır. Steril ve aseptik teknik kullanımı numunenin yapısını da koruyacaktır. Serum numuneleri (2-8ºC) buzdolabında ya da 7 gün içinde çalışılmayacaksa (-20ºC) de saklanır.numuneler tekrar tekrar dondurulup çözülmemeli.hiperlipemik, hemolizli ya da kontamine olmuş numune kullanmayınız. Partikül içeren numuneler, santrifüj edilerek berrak hale getirilmelidir. TEST PROSEDÜRÜ: Slaytlar uygun özgüllükte VIRCELL IFA kit reaktifleri kullanır. Test prosedüründeki verilen sayı VIRCELL IFA kit uygun olmalıdır. IgG belirlemesi: 1.- kullanmadan önce tüm reaktifleri oda ısısına getirin. Açmadan önce tüm slaytların oda ısısına çıkarın. 2.- 390 µl PBS e 10 µl örnek ekleyerek 1/40 ve 1/80 dilusyonda serum örnekleri hazırlayın 2 (1/40 dilusyon). 50 µl PBS ile (1/80 dilusyon) çift dilusyon hazırlayın. Kontrol serum 3 ve 4 seyreltilmez. 3.- 20 µl 1/40 ve 1/80 dilusyon iki slayt kuyucuğuna uygulayın 1. pozitif 3 ve negatif 4 kontrolleri aynı yapın. 4.-Slaytı nemli haznede 37ºC de 30 dakika bekletin. SAKLAMA GEREKLİLİKLERİ: 2-8ºC de saklayınız. Miadı geçmiş kitleri kullanmayınız. Bu kit 2-8ºC de ağzı kapalı olarak saklanırsa geçerli kalır. AÇILAN REAKTİFLERİN SAKLANMASI: Paketi bir kez açarak kullanınız. Manufacturer: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fé *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712
2 EN 5.- PBS ile 2 slaytı yıkayın 1 (kuyucuklarda direk PBS den kaçının) ve PBS de 10 dakika batırın.distile su ile slaytlara derin yıkama yapın. 6.-Slaytların hava ile kurumasını sağlayın 1. 7.- Herbir kuyucuğa 20 µl anti-human IgG FITC konjugat solusyonu 5G ekleyin. (Dilusyona gerek yok). 8.-Aşama 4, 5 ve 6 tekrar edin. 9.-Herbir kuyucuğa küçük bir damla mounting medium 6 ekleyin ve dikkatlice yapışkanla kaplayın. 10.-slaytları olabildiği kadar çabuk floresan mikroskopta 400x büyütmede okuyun. Eğer bunu yapamıyorsanız, bakana kadar 24 saatten uzun olmayacak şekilde 2-8ºC de karanlıkta saklayın. 11.-eğer dilusyon test ediyorsanız, 1/640 dilusyona kadar analiz edin. İNTERNAL KALİTE KONTROL: Her üretim lotu pazara sürülmeden önce internal (Q.C.) testi yapılır.bu validasyon prosedüründen daha önemlidir. KULLANICILAR İÇİN VALİDASYON PROTOKOLÜ: VIRCELL IFA kite uygun kullanıcılar için validasyon protokolü verilmiştir: Pozitif, negatif ve cut off kontroller her teste çalışılmalıdır.bu kitin ve testin validasyonunu sağlar. Görülen floresan pattern aşağıdaki gibi olmalıdır: Pozitif kontrol: Yeşil elma fluoresan nukleus ve sitoplazmada. Negatif kontrol: Kırmızı hücresel pattern. SONUÇLARIN YORUMLANMASI: Serum titresi bir pozitif reaksiyonda görülen en yüksek dilusyondur. Nukleus ve sitoplazmada elma yeşili floresan görüldüğünde reaksiyon pozitiftir. Kırmızı hücresel pattern görüldüğünde reaksiyon negatiftir. Bazen, serum hücrelerin %50 sinde pozitif floresan vererek reaksiyona girebilir. Bu pattern değerlendirilemez spesifik olmayan reaksiyon ile ilişkilidir. Bu kılavuzdan farklı sonuçlar pozitif olarak değerlendirilemez. IgG ve IgM antikorları primoenfeksiyon ve reenfeksiyon sırasında farklı davranır. primoenfeksiyonda IgG ve IgM hemen tüm hücrelerde görülür (IgM, IgGden önce görülür). reenfeksiyonda IgMantikorları tüm olgularda görülmez, bu nedenle IgG Belirlemesi tanı için tek yararlı metoddur. IgG yüksek titresi hastanın hayatı boyunca bir çok hastalıkta görülür, IgM ise enfeksiyondan 2 ya da 3 ay sonra ölçülebilir ve bu nedenle güncel enfeksiyonlar için geçerli markırdır. Serum antikorları IFA ile erken belirlenebilir (semptomların başlangıcından 7 gün sonra). Titre 1/40 genellikle pozitif belirtir. LİMİTLER: 1.- Bu kit sadece insan serumunda kullanmak içindir. Slaytlar uygun özgüllükteki VIRCELL IFA kiti ile kullanılır. diğer orjine sahip reaktifler kullanılarak yapılan test sonuçlarından VIRCELL sorumlu değildir. 2.- Kitin kullanıcısına, kitin içeriğini iyice okuyarak, anlayıp çalışması önerilir. Güvenilir sonuç elde etmek için, protokole tamamen uymak gerekir. Özellikle, doğru numune ve doğru reaktif pipetleme ve inkübasyon zamanı adımlarına tamamen uymak gereklidir. 3.- Numunelerin sonuçları klinik değerlendirme ve diğer teşhislerle birlikte yorumlanmalıdır. Kesin teşhis ayırma tekniği ile konulmalıdır. 4.- Bu test enfeksiyonun yerini belirtmeyecektir. Ayırım yapma amacı ile kullanılmaz. 5.-Antikor seviyesinin eksikliğinin tespiti enfeksiyon olasılığını içermemesi söz konusu değildir. 6.-Samples collected very early in the course of an infection may not have detectable levels of IgG. In such cases, it is recommended an IgM assay be performed, or a second serum sample be obtained 14 to 21 days later to be tested in parallel with the original sample to determine seroconversion. 7.- Erken alınan numunlerde IgG seviyesi tespit edilmeyebilir.bu durumlarda IgM testi yapılmalıdır.ikinci serum 14-21 gün sonra alınmalıdır, serokonversiyonun tespiti için ilk alınan numuneyle paralel çalışılmalıdır. 8.-Tek-örnek antikor belirleme sonuçları güncel enfeksiyon tanısı için kullnılamaz. Çiftli örnekler (akut ve nekahat döneminde) toplanmalı ve serokonversiyona bakmak ya da antikor seviyesindeki artışı belirlemek için çalışılmalıdır. 9.-otoimmun hastalıklı serumlar IFA kullanılarak aşırı hücrelerle nonspesifik reaksiyon verebilir. Bu serumlar bu metod ile değerlendirilemez. PERFORMANS DUYARLILIK VE ÖZGÜLLÜK: 153 serum örneği diğer ticari IFA kitlerine karşı RICKETTSIA CONORII IFA IgG ile test edilmiştir. Sonuçlar aşağıdadır: ÖRNEK NO DUYARLILIK ÖZGÜLLÜK IgG 153 100.0% 100.0% Sera with non-specific reactivity were excluded from final calculations. ÇALIŞMA-İÇİ KESİNLİK: 3 serum (2 pozitif ve 1 negatif) 5 grupta aynı koşullarla aynı kişi tarafından test edilmiştir. Bir dilusyondan fazla titre değişimi görülmemiştir. ÇALIŞMALAR-ARASI KESİNLİK: 3 serum (2 pozitif ve 1 negatif) 5 grupta aynı koşullarla aynı kişi tarafından test edilmiştir. Bir dilusyondan fazla titre değişimi görülmemiştir. ÇAPRAZ REAKSİYONLAR VE ETKİLEŞİMLER: Benzer grubun bakterileri (Brucella, Salmonella), taksonomik ilişkili bakteriler (Coxiella burnetii) ve antinuklear antikorlar için pozitif oluğu bilinen 12 örnek IgG testi ile test edilmiştir. Çapraz bir reaksiyon veya etkileşim görülmedi. ETİKETTE KULANILAN SEMBOLLER: 2ºC x 8ºC In vitro diyagnostik medikal alet Miadı kadar kullanın (miadı) 2-8ºC de saklayınız Yeteri kadar r <X> test içerir. Lot Katalog No Inserte bakınız <X>kuyucuklar
3 TEST PROSEDÜRÜNÜN ÖZETİ: Slayt kuyucuklarına serum dilusyon ve kontrolleri ekleyin 1 Nemli hazne Nemli Hazne 30 dakika 37ºC de PBSile iki kez yıkayın 2 ve bir kez distile su ile yıkayın Fluoresan konjugat ekleyin 5G Kuru H 30 dakika 37ªC de PBSile iki kez yıkayın 2 ve bir kez distile su ile yıkayın Kuru h Küçük bir damla mounting medium 6 Yapışkan ile kaplayın Slaytı fluoresan mikroskopta okuyun 400x 1. De Micco, C., D. Raoult, and M. Toga. 1986. Diagnosis of Mediterranean spotted fever by using an immunofluorescence technique. J Infect Dis 153:136-8. 2. Fenollar, F. and D. Raoult. 1999. Diagnosis of rickettsial diseases using samples dried on blotting paper. Clin Diagn Lab Immunol 6:483-8. 3. Herrero-Herrero, J. I., D. H. Walker, and R. Ruiz-Beltran. 1992. Use of western blot to analyze the reactivity of sera from patients with Mediterranean spotted fever. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11:939-42. 4. La Scola, B. and D. Raoult. 1997. Laboratory diagnosis of rickettsioses: current approaches to diagnosis of old and new rickettsial diseases. J Clin Microbiol 35:2715-27. 5. Manor, E., J. Ighbarieh, B. Sarov, I. Kassis, and R. Regnery. 1992. Human and tick spotted fever group Rickettsia isolates from Israel: a genotypic analysis. J Clin Microbiol 30:2653-6. 6. Marquez, F. J., M. A. Muniain, J. M. Perez, and J. Pachon. 2002. Presence of Rickettsia felis in the Cat Flea from Southwestern Europe. Emerg Infect Dis 8:89-91. 7. McGill, S. L., R. L. Regnery, and K. L. Karem. 1998. Characterization of human immunoglobulin (Ig) isotype and IgG subclass response to Bartonella henselae infection. Infect Immun 66:5915-20. 8. Novakovic, S., M. Morovic, and B. Dzelalija. 1991. Comparison of serologic methods for the diagnosis of Mediterranean spotted fever. Acta Virol 35:587-92. For any question please contact customer service: technicalservice@vircell.com REVISED: October-05 LITERATÜR:
4
5 Manufacturer: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fé *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712