Moleküler Dizileme Teknolojileri Dr. Güven Toksoy, PhD İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD 31.10.2014 22:44 1
Klasik dizileme Sanger dizileme Maxim Gilbert dizileme tekniği Yeni nesil dizileme teknolojileri 2. Nesil dizileme Illumina (Reversible Dye Terminator) Ion Torrent (native dntp proton detection) Roche (Pyrosequencing) (çekildi, teknoloji değişikliği?) Solid ABI (Ligation based) (çekildi) 3. Nesil dizileme (henüz rutinde yok 2-3 yıl) PacBio Real time sequencing (amplifikasyon gerekmiyor) Helicos (Reversible Dye Terminator) (amplifikasyon gerekmiyor) Oxford Nanopore (porotic ion detection) (amplifikasyon gerekmiyor) 31.10.2014 22:44 2
Karşılaştırma SANGER DİZİLEME Sınırlı büyüklük YENİ NESİL DİZİLEME (2. nesil) Tüm genoma kadar 900-1000 bp 75-400 bp Tüm dizi tek çıktı Mozaiklik için yetersiz Dizi başına ~5 USD (baz başına 5/1000USD) Motiften bağımsız yüksek özgünlük Altyapı göreceli ucuz Run maliyeti ucuz* Her bir hedef için çok kopya Mozaiklik için uygun Exom ~500 USD (500/30x10 3 USD) Motife göre değişen özgünlük Altyapı pahalı Run maliyeti pahalı* 31.10.2014 22:44 3
SANGER Dizileme PCR + + Dizilenecek PCR ürünü Dizilenecek hedef bölgeye uygun primer İşaretli dntp ve ddntp karışımı + (NH4) 2 SO (NH4) 4 2 SO 4 MgCL 2 MgCL MgCL 2 KCl 2 MgCL KCl (NH4) 2 2 SO KCl 4 + Polimeraz enzimi 31.10.2014 22:44 4
Elektroforez* 3 G A C T A G A T A C G A G C G T G A 5 Template DNA 5 C T G A T C T A T G C T C G C A C T 3 Primer dizisi A G T C z a m a n CTGATCTATGCTCGCACT CTGATCTATGCTCGCAC CTGATCTATGCTCGCA CTGATCTATGCTCGC CTGATCTATGCTCG CTGATCTATGCTC CTGATCTATGCT CTGATCTATGC CTGATCTATG CTGATCTAT CTGATCTA CTGATCT CTGATC O K U M A Y Ö N Ü T C A C G C T C G T A T C *işaretli nükleotid ile sonlanmış binlerce kopya içeren fragmanlar 31.10.2014 22:44 5
Yeni Nesil Dizileme Next generation sequencing (Yeni nesil dizileme) Deep sequencing (Derin dizileme) Massivelly parallel sequencing (Masif paralel dizileme) High-throughput sequencing (Yüksek kapasiteli dizileme) Second generation sequencing Illumina (Reversible Dye Terminator) Roche (Pyrosequencing) (??) Solid ABI (Ligation based) (çekildi) Ion Torrent (native dntp proton detection) Third generation sequencing PacBio Real time sequencing (amplifikasyon gerekmiyor) Helicos (Reversible Dye Terminator) (amplifikasyon gerekmiyor) Oxford Nanopore (porotic ion detection) (amplifikasyon gerekmiyor) 31.10.2014 22:44 6
İş akışı Kütüphane hazırlanması (Library preparation) DNA örnekleri fragmante edilir (ya da hedef fragmanlar elde edilir), fragmanların ucuna platforma özgün adaptörler takılır PCR ile amplifiye edilir (platforma spesifik ortamda) Dizileme (Sequencing) Yeni nesil dizilemede DNA sentezi ve okuma işlemi aynı anda gerçekleşir ve eşzamanlı olarak bir çok dizileme yapılır (Massively parallel sequencing) (kısa okuma ve hatalı okumanın ana nedeni de bu işlem sırasındaki desenkronizasyondur) Veri analizi (Data analysis) RAW data analizi, dizilerin filtrelenmesi, assambling, varyasyon analizi, biyoinformatik analiz 31.10.2014 22:44 7
Terimler De novo sequencing Resequencing Targeted sequencing Shotgun Targeted sequencing VERİ BÜYÜKLÜĞÜ Whole genome sequencing Exom sequencing Targeted sequencing Sanger sequencing normal Polimorfizm Gri bölge Patolojik/ olası patolojik 31.10.2014 22:44 8
Yeni nesil dizileme ile tanı Lab iş gücü İşlem sonrası Elde edilen bilgi Normal diziler Nadir/de novo varyasyonlar ya da etkisi bilinmeyen mutasyonlar Polimorfizm Fenotip ilişkili mutasyon Biyoinformatikçi Sonuç 31.10.2014 22:44 9
Yeni nesil dizileme ve cfdna çalışmaları 31.10.2014 22:44 10
cfdna ile anöplodi taraması FİRMA-MARKA PLATFORM ANALİZ TEKNİĞİ ve ALGORİTMA BGI:NIFTY Illumina Hiseq& İon proton MPSS SEQUENOIM: Materni T21Plus Illumina Illumina Hiseq t-mpss Verinata Health: Verifi Prenatal test Illumina Hiseq S-MPSS Integrated Genetics: Ariosa: Harmony Illumina Hiseq DANSR + FORTE (t-mpss) Natera:Panorama Illumina Hiseq Non kantatif - SNP tabanlı targeted dizileme ~20.000 SNP Premaitha healt: Iona test (2015 ocak) İon proton S-MPSS + Fetal fraksiyon düzeltmesi MPSS:Massively parallel signature sequencing FORTE:Fetal-fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation NIFTY, Natera ve Sequanom Digeorge ve diğer mikro del/dup sendromları için sonuç veriyor. 31.10.2014 22:44 11
Sayılar - 10 milyon adet 25-30 bp uzunlukta dizi elde edildiinde total genomun yaklaşık %4 ü dizilenmiş oluyor. Bunlardan %50 si unique dizi. Chr13 için ~154.000, chr18 135.000 ve chr21 için 65.700 dizi haritalanabiliyor. (H. Christina Fan, PNAS, October 2008) - Trizomi21 li fetus taşıyan gebelikte örnekten 10.800.000. okuma elde edililirken sadece bu okunan dizilerden 21. kromozoma ait 32 000 tanesi (%0,3) anöploidi hesaplamasında kullanılabiliyor (Chiu RW, Proc Natl Acad Sci USA 2008) - Fetal plasental DNA fraksiyonu kromozomal dozun hesaplanmasında çok önemli ve spesifiteyi arttırıyor.21. Kromozoma ait %4 oranında DNA taşıyorsa bunun trizomi durumunda %2 artış beklenmelidir. Yüksek güvenilirlik için yaklaşık 93.000 adet 21. kromozoma ait dizinin elde edilmesi gerekir. Bu da 21. kromozom DNA yükü total genomun % 1,5 olduğu için toplam okunabilir dizi sayısının minimum 6.3 milyon, ortalama MPSS verimi %25 olduğundan yaklaşık örnek başına toplam 25.000.000 okuma yapmak gerekmektedir. (Andrew B. Sparks, P APRIL American Journal of Obstetrics & Gynecology, 2012) - Targeted SNP çalışmalarında yaklaşık 25.000 yüksek polimorfizm gösteren SNP bölgesi taranıyor. 31.10.2014 22:44 12
cfdna Plazmada serbest DNA fragmanları 300bp Köken: Plasenta sitotrofoblast ve sinsisyotrofoblast hücreleri apoptosis ve yıkımı Perferik kan Plazma Plasenta kökenli DNA <%10 Maternal DNA %90 Lenfositler Eritrositler - İnsan genomu ~3 milyar baz uzunluğunda - Rastgele kırılmış halde milyonlarca küçük fragman - chr13 %3,7; chr18 %2,5 chr21 %1.5 ini oluşturuyor - Plasental DNA parçacıkları total havuzda fraksiyon %10 ise chr13 % 0,37; chr18 %0,25; chr21 %0,15 31.10.2014 22:44 13
cfdna nın yeni nesil dizilemede kullanımı Kalitatif: Plasental DNA dan elde edilen baba kökenli dizide anneden farklı baz değişiminin gösterilmesi Kantitatif: Amplifikasyon sonrası karşılaştırmalı ürün artışının saptanması Plasental DNA Maternal lokus Plasental DNA Paternal lokus Maternal DNA Plasental DNA Mat Plasental DNA Pat 31.10.2014 22:44 C G A C T A G A A G C G T G T C G T C A T T G C A T C G A Maternal DNA Plasental DNA amplifikasyon fark 14
cfdna da plasental DNA nın saptanması Y kökenli dizilerin total DNA havuzuna oranı SNP farklılılarının saptanması SNP : Genomda bulunan ve fenotipi etkilemeyen kısa baz değişiklikleridir. Toplumda değişik sıklıklarda saptanan SNP ler vardır. Genomda şimdilik bilinen SNP sayısı >70.000.000 ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCAGATACAGTAG GTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG CTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGAT GGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG GCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAG ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG TAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGG GGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG AGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATA GGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGC TTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG AGGAGGTGATTTCGCCAAT... ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCG ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCA ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGC.. ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCAGAT %92!!! Aynı yöntem nokta mutasyonları ve Rh analizlerinde de kullanılmaktadır. 31.10.2014 22:44 15 %8
SNP tabanlı targeted dizileme (PANORAMA) ANNE SNP PROFİLİ T T/A C/C cfdna SNP PROFİLİ T G A C T A G A A G C G T G T A G T G A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T G A T T G C A T C G A T G G A C T A G A A G C G T G G A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G G A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G G A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G G A G T C A T T G C A T C G A 31.10.2014 22:44 16 T/G G/C
Örnek alımı Maternal periferik kan ~10 ml standard EDTA içeren tüp (~8 saat) Özel CF DNA örnekleme tüpü (14 gün oda ısısı) (Streck Cellfree DNA BCT CE) 31.10.2014 22:44 17
Genel Protokol Library preparation Cluster generation / Clonal amplification Massively parallel sequencing Mapping reads (Alignment) Quantifying reads Interpreting data Reporting 31.10.2014 22:44 18
Library preparation Adaptör ve barkod eklenmesi - Adaptör DNA nın tutunmasını sağlar ve amplifikasyon sırasında primer görevi yapar. - Barkod aynı çalışmada çalışılan örneklerin birbirinden ayrılmasını sağlar 31.10.2014 22:44 19
Cluster generation / Clonal amplification İllumina İon torrent DNA polimeraz PCR reaksiyonu 31.10.2014 22:44 20
Massively parallel sequencing Illumina Ion torrent 31.10.2014 22:44 21
Kantitatif Yöntem; Fetus NORMAL Anne 46 kromozom + fetus 46 kromozom Başlangıçtaki DNA Havuzu Kromozom 18 13 21 Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu Kromozom 18 13 21 Anne ye ait DNA fragmanları Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon 1 : 1 : 1 Fetusa ait DNA fragmanları tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit
Kantitatif Yöntem Amplifikasyon öncesi DNA Havuzu Chr 21 fragmanları Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu Chr 21 fragmanları maternal fetal Aynı kromozomun fragmanlarında farklı oranlarda artış?
DNA baz dizilimi ve CG zenginliğine göre amplifikasyon veriminin değişimi Mavi pikler CG zenginliği göz önüne alınmadan elde edilen sonuç Kırmızı pikler CG zenginliği dikkate alınarak normalizasyon yapılmış durum!!! Problem : Lokasyon (CNV varlığı) ve motife (CG/AT oranı) dayalı amplifikasyon farklılıkları dozun değişmesine yol açar!! Çözüm: CG zenginliği paralel dizilerin kullanılarak normalizasyon yapılması ve stabil bölgelerin analize alınması H. Christina Fan, 2010 31.10.2014 22:44 24
Kantitatif Yöntem; Fetus NORMAL Anne 46 kromozom + fetus 46 kromozom Başlangıçtaki DNA Havuzu Kromozom 18 13 21 Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu Kromozom 18 13 21 Anne ye ait DNA fragmanları Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon 1 : 1 : 1 Fetusa ait DNA fragmanları tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit
Kantitatif Yöntem; Fetus TRİZOMİK Anne 46 kromozom + fetus 47 kromozom (47,+21) Başlangıçtaki DNA Havuzu Kromozom 18 13 21 Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu Kromozom 18 13 21 Anne ye ait DNA fragmanları Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon 9:1 ; 9/1 : 9/1,5 Fetusa ait DNA fragmanları 21. Kromozom AMPLİKONLARINDA artış
Kalitatif yyöntem :Targeted sequencing Önceden belirlenmiş hedef bölgeler için tasarlanmış oligolar DNA havuzundan istenen bölgelerin ayıklanması Veri analizi Amplifikasyon atgagcatg atgagcatg cgttcgaa cgttcgaa ggcctgca ggcctgca hedef bölgeler için Havuzdaki miktarla orantılı elde edilen oligolar 31.10.2014 22:44 27
Targeted sequencing/ SNP sequencing/ MPSS/s-MPSS Dizilenen bölge sayısı MPSS SNP sequencing Targeted sequencing Yüksek sayıda dizi elde edilir Sınırlı sayıda okuma elde edilir Sınırlı sayıda okuma elde edilir Tekrar sayısı Yüksek Yüksek Yüksek Akraba evliliğinde hassasiyet Yumurta donasyonunda Hassasiyet* Değişmez Değişmez Değişmez *Fetal plasental DNA nın fraksiyonunun hesaplanmasında ve SNP tabanlı çalışmalarda analiz optimizasyonu gerektirir. Çalışan firmalar var (Harmony, Materni21), çalışmayan (Panorama) 31.10.2014 22:44 28
Gelecekteki beklentiler Mikrodelesyon ve mikroduplikasyonların yüksek hassasiyetle ve güvenilirlikle yapılması Tek gen hastalıklarının topluca taranabilmesi Tüm genom dizileme Daha uzun dizilerin amplifikasyon olmadan okunabilmesi, Maliyetlerin düşmesi Teşekkürler 31.10.2014 22:44 29