T.C. Ege Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Endodonti Anabilim Dalı DENTAL KÖK HÜCRELER Bitirme Tezi Stj. Diş Hekimi Ozan ÖZTÜRK Danışman Öğretim Üyesi : Doç. Dr. Ilgın AKÇAY İZMİR-2014
İçindekiler 1. Giriş... 1 2. Genel Bilgiler... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 2.1. Diş Gelişimi... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 2.2. Diş Epitel Hücreleri... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 2.3. Dental Kök Hücreler... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 2.4. Dental Pulpa Kök Hücre Farklılaşması Ve Sinyal MoleküllerHata! Yer işareti tanımlanmamış. 2.5. Dental Pulpa Hücrelerinin İzolasyonu. Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 2.6. Kriyoprezervasyon... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 3. Diş Mezenkimal Kök Hücreler... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 3.1. Diş Pulpa Kök Hücreleri (DPSCS)... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 3.1.1. Diş Gelişimi... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 3.1.2. Dental Kök Hücrelerin Kaynağı Olarak 3.Molar KullanımıHata! Yer işareti tanımlanmamış. 3.2. Eksfoliye Süt Dişlerinin Dental Pulpalarından Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 3.3. Periodontal Ligament (PDLSCS) Kaynaklı Mezenkimal Kök HücrelerHata! Yer işareti tanımlanmamış. 3.4. Diş Folikülündeki Mezenkimal Kök HücreleriHata! Yer işareti tanımlanmamış. 3.5. Apikal Papilla Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 4. Diş Doku Mühendisliğinde Epitelial Ve Mezenkimal Kök HücrelerHata! Yer işareti tanımlanmamış. 5. Dental Doku Onarımı... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 6. Rejenerasyon... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 6.1. Diş Dokusu Ve Kan Damarlarının Rejenerasyonu... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 6.2. Periodontal Rejenerasyon... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 6.3. De Novo Diş Pulpası Rejenerasyonu... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 6.4. Tüm Diş Rejenerasyonu... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 6.5. Kemik Doku Rejenerasyonu... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 7. Çeşitli Hastalıkların Tedavisinde Kullanımı Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 8. İlk Otolog Dental Doku Mühendisliğinin İnsanda Klinik Olarak DenemesiHata! Yer işareti tanımlanmamış.
8.1. Odontojen Duyarlı Epitel Hücreleri... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 8.2. Odontojenik İndüktif Mezenkimal HücrelerHata! Yer işareti tanımlanmamış. 9. Hücre reagregasyonu ile diş rejenerasyonuhata! Yer işareti tanımlanmamış. 10. Tartışma... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 11. Özet... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 12. Kaynaklar... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. 13. Özgeçmiş... Hata! Yer işareti tanımlanmamış.
Önsöz Tezimin hazırlanmasında yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Doç. Dr. Ilgın Akçay a ve hayatımda bana yol gösteren sevgili ailem ve dostlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım. İZMİR-2014 Stj. Diş Hekimi Ozan ÖZTÜRK
1. Giriş Ağızda eksik diş varlığı, çeşitli patolojik durumlardan kaynaklanabilen yaygın bir durumdur. Arktaki boşluğun düzenlenmesi, medikal ve estetik nedenlerden dolayı önemlidir. Bilim adamları son zamanlarda, diş doku mühendisliğine, mevcut protetik yöntemlerin ötesinde potansiyel bir tedavi olarak odaklanmaktadırlar. Dişhekimliğinde doku mühendisliği; kaybedilmiş dişlerin laboratuvarda geliştirilmiş dişler ile değiştirmeyi veya hasarlı dental dokuyu restore etmeyi hedeflemesi bakımından umut verici, yeni terapötik bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım, biyokompleks bir yapı yaratmak amacıyla, biyomateryallerin (yapı iskelelerinin) yüzeyine ekilmiş olan kök hücreleri temel almaktadır. Farklı mezenkimal kök hücre popülasyonları, dişlerde bulunmuştur. Bu farklı hücre tipleri, dişteki lokalizasyonlarına göre kategorize edilir. Ve özellikleri bakımından çok az farklılık bulunmaktadır. Diş doku mühendisliği uygulamalarında, pulpa ve periodontal ligamentten izole edilen kök hücrelerin, en güçlü hücreler olduğu ortaya konmuştur(1). Diş dokusu meydana gelen hasara karşı sınırlı bir tamir potansiyeline sahiptir. Pulpa kök hücreleri, tamir işlemi ve hasar görmüş hücreleri replase etmek için kaynak oluşturmaktadır. Periodontal ligament ve gelişen köklerden elde edilen kök hücreleri, dişin gelişiminde ve fonksiyonunda daha aktif bir rol almaktadır. Enfeksiyon nedeniyle uzaklaştırılmış vital pulpa dokusunun geri kazanımında, periodontal hastalık sonucu kaybedilen periodontal ligamentin rejenerasyonunda ve diş yapılarının biyolojik İmplant olarak tam ya da kısmi olarak meydana getirilmesinde dental kök hücrelerinden otolog hücre kaynağı olarak faydalanılmaktadır. Dental kök hücreleri, mezenkimal kök hücrelerine benzer birtakım özelliklere sahip olmaları yanında, aynı zamanda Parkinson gibi mezenkimal hücre bozuklukları gösteren hastalıkların tedavisinde faydalı olabilecekleri düşünülmektedir (2). Minenin rejenerasyonu için önemli olan epitel kök hücrelerine uygun kaynağın bulunması için yeni çalışmalara ihtiyaç vardır. Günümüzde yapılmış olan çalışmaların sonuçları cesaret vericidir ve diş doku mühendisliğinin, dental problem yaşayan ya da dişlerini kaybetmiş bireylere umut olabileceği inancını kuvvetlendirmektedir (1).
2. Genel Bilgiler Kök hücreler; özdeş, farklılaşmamış hücrelere bölünme ve bunların artışına neden olma yetenekleri olan farklılaşmamış hücrelerdir (!). (3-6). Hastalık veya travma nedeniyle yaralanan oral dokuların rejenerasyonu, diş kök hücrelerin keşfi ve moleküler biyolojide son gelişmeler nedeniyle artık mümkündür. Kök hücre teknolojisindeki tecrübe, bütün tıp dallarında hızla artmaktadır. Bu tecrübe, onarıcı diş hekimliğini içeren tüm alanlarda; yeni ve koruyucu yaklaşımlara rehberlik eder. Doku mühendisliğinin yardımıyla, defektli doku ve organların tamir ve rejenerasyon hayali, yakında gerçek olacaktır (7). Kök hücreler; belirli şartlar altında, insan vücudunu oluşturan çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilirler. Kök hücrelerinin, nöral ve kas hücreleri gibi farklı şekil ve spesifik fonksiyonları bulunan olgun hücreleri geliştirme yeteneği bulunur. Kök hücreleri, embriyonik ve erişkin kök hücreler olmak üzere iki gruba ayrılır (3-6). Embriyonik kök hücreler; embriyonun oluştuğu yerde, iç hücre kitlesi olarak bilinen hücreleri içeren erken embriyonik gelişimde; ince duvarlı, içi boş yapı şeklindeki blastositin iç hücre kitlesinden oluşur. İç hücre kitlesindeki hücreler, vücut dokularını meydana getirirken; dış tabakadaki hücreler, plasenta ve uterus içinde fetal gelişim için gerekli olan diğer destekleyici dokuları oluşturur (129). Kök hücrelerin, birçok hücre tipini oluşturmak için yetenekleri bulunur. Yetişkin kök hücreler, göbek kordon kanı, kemik iliği ve kanda bulunur. Göbek kordon kanında bulunabilen pluripotent kök hücreler, az sayıdadır. Bu yetişkin kök hücreler; lösemi, kemik/kan kanserleri ve bazı hematopoetik hastalıkları tedavi etmek için yıllardır kullanılmaktadır (8). Özellikleri sayesinde, kök hücrelerin, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta, önemli bir uygulama haline gelme potansiyelleri bulunur. Doku mühendisliği; restorasyon, koruma ve/veya doku fonksiyon gelişimi için biyolojik maddeleri geliştirmeyi amaçlayan mühendislik ve canlı biliminin ilkelerini birleştirir (9). Uygulamalar, hücrelerin çoğalma ve farklılaşma yeteneğine bağlıdır. Bunun yanında, hücreler ve biyolojik iskelelerle etkileşimler sonucu yapıların oluşumuna dayanmaktadır (10,11). Dişin kaybı; 2
dental çürükler, periodontitis, travmatik yaralanma, çeşitli patolojik sendromlar gibi durumlar nedeniyle meydana gelen bir durumdur (1). Kayıp dişin değiştirilmesi sadece estetik için değil aynı zamanda fonksiyonel amaçlar için de çok önemlidir. Biyomateryal alanındaki son çalışmalar, kaybedilen dişler bölgesinde, çene kemiğine uygulanan, biyouyumlu materyallerden oluşan osseoentegre implantların yaratılmasına olanak sağlamıştır. Ancak bu uygulamanın başarılı olması birçok parametreye bağlı değişmektedir. Tekniğin başarı oranı, göreceli olarak yüksektir. Fakat, implantın alıcı alt dokusuna farklı uyumlarının olmasına bağlı, bu oran her zaman yeterli değildir. Bu yetersizliğin üstesinden gelmek için kök hücre ve doku mühendisliği alanlarındaki yeni yaklaşımlar önerilmektedir. Son zamanlarda, diş doku mühendisliği; diş kayıplarına ilişkin yeni terapötik uygulamalar ve var olan protetik yöntemleri karşılamak için bilimsel zemin sağlamaktadır. Diş doku mühendisliği üç ana parametre üzerinde durulmaktadır: kullanılması gereken hücre tipi, hücrelerin üzerine ekildiği yapı iskelesi ve uygulanması gereken büyüme faktörleri/moleküler sinyaller. Bu derlemede, diş mezenşimal kök hücre özelliklerine ve diş doku mühendisliği aracılığıyla bu hücrelerin uygulamaları alanındaki güncel çalışmalara odaklanılmaktadır (1). 2.1. Diş Gelişimi Dişler, özelleşmiş bir periodontal ligament yoluyla kemiğe entegre bir yapı oluşturan, iki ayrı özelleşmiş sert doku olan mine ve dentini içeren organlardır. Embriyolojik olarak dişler, oral epitelyal hücrelerle(ektoderm) mezenkimal hücrelerden kaynaklanan kranyal nöral krest arasında sıralı ve karşılıklı etkileşimlerle oluşan ektodermal organlardır. Epitelyal hücreler, mineyi oluşturan ameloblastlar için kaynaktır. Mezenkimal hücreler ise diğer tüm farklılaşmış hücreleri (örn, dentini oluşturan odontoblast, pulpa, periodontal ligament) sağlar. Çocuklarda diş fonksiyonu için gereken kök formasyonu, diş erüpsiyonunun meydana gelmesi için başlar (2). 3
Dişler, yaşamsal fonksiyonlar için zorunlu olmadığından, nöral ve kardiyak hastalıklarla kıyaslandığında rejeneratif tıp çalışmalarında öncelikli olarak dikkate alınmamıştır. Fakat, farklı bir açıdan hayati tehdit olasılığının daha düşük olması, yeni hücre tabanlı tedavileri denemek için dişleri ideal yapar. Bu açıdan, bir şeyler ters gitse bile hayati tehdit olasılığı düşüktür. Dişlerin erişilebilirliği, tedavinin büyük cerrahi işlemler gerektirmediği anlamına gelir. Buna, doğal yoldan kaybedilen (süt dişleri vs.) ya da cerrahi olarak çekilen dişlerden kolaylıkla elden yüksek proliferatif kök hücre popülasyonlarının varlığı da eklenir. Bu kök hücreler; diş tamiri, restorasyon, rejenerasyon, hayatı anlamlı olarak tehdit eden ana hastalıklar ve kök hücre kaynaklı terapileri geliştirmek gibi dental olmayan kullanımlar için kullanılabilir. Kök hücrelerin kaynağı olarak dişlerin, önemli ama genellikle göz ardı edilen avantajı; postnatal kök formasyonu gelişimsel süreç olduğundan, kök formasyonunu kapsayan hücrelerin, diş kök hücrelerinden ziyade embriyonik hücrelere daha fazla benzemesidir (2). Biz bu derlemede, dental kök hücrelerin önemli biyolojik alanlarını özetledik ve diş tamiri için bu hücreleri kullanarak hızlı gelişmeyi gösteren araştırmaları anlattık. Aynı zamanda, kullanılacak formlarından önce, aşılması gereken ana engelleri vurguladık (2). 2.2. Diş Epitel Hücreleri Diş dokusu oluşumuna iki ana hücre tipi katılmaktadır: mineyi oluşturan epitelyal kökenli ameloblastlar ve mezenşimal orjinli, dentin üretiminden sorumlu olan odontoblastlar (1). Mine, epitelyal kök hücrelerden türeyen ameloblastlar tarafından oluşturulur. Bunlar, diş gelişiminde rol oynayan ektodermal kökenli tek hücrelerdir. Bu hücreler ve ataları, diş erüpsiyonundan hemen sonra kaybolur. Dolayısıyla kalıcı dişte bulunmazlar. Bu yüzden, in vivo koşullarda mine üretmek için stimüle edilemezler (1). 4
Hayvan modellerinde; epitelyal kök hücreleri, yeni doğan veya genç (büyümeye devam eden) hayvanların 3. molar dişlerinden izole edilmiştir. İlk olarak, epitel izole edilmiş ve in vitro koşullarda hücreler, enzimatik olarak separe edilmiş ve çoğaltılmıştır. Bunlar, aynı dişten izole edilerek biomateryallere maruz bırakılarak mezenkimal kök hücreler ile kombin edilmiştir (12,13). Yukardaki yaklaşımlar diş formasyonu/rejenerasyonunun gözlenmesi açısından umut vericidir. Ancak yine de klinik uygulamalar zorluk çıkarmaktadır. Çünkü çocuklardan bir diş jermi gerekmektedir. Otolog kök hücrelerin kullanımı, en çok istenmektedir. Bunun için de, iyi, güvenilir bir kaynak gereklidir (1). 2.3. Dental Kök Hücreler Kök hücre özelliklerine sahip hücrelerin çeşitli popülasyonları dişin farklı bölgelerinden izole edilmiştir. Bunlar; çocukların dökülen süt dişleri ve yetişkin dişlerinin pulpası, diş kökünü kemiğe bağlayan periodontal ligament, sürmemiş dişi çevreleyen doku ve gelişmekte olan köklerin uçlarına ait hücreleri içerir. Bütün bu hücreler, nöral krest hücrelerinden gelişen ortak bir soyu paylaşabilirler. Ayrıca bu hücreler, in vitro koşullarda mezenkimal hücre soylarına (osteoblast, kondrosit, adipositler) diferansiyasyonunu içeren mezenkimal kök hücre benzeri özelliklere sahiptir. Farklı hücre popülasyonları; kaynak doku, kültür koşullarının belirsizliğinin sürmesine bağlı farklılıklar nedeniyle kültürdeki büyüme oranları ve hücre farklılaşmaları yönünden farklılık gösterir (2). 5
2.4. Dental Pulpa Kök Hücre Farklılaşması Ve Sinyal Moleküller Büyüme faktörleri ve morfogenetik faktörler, spesifik membran reseptörlerine bağlanır ve bir dizi sinyal yolunun oluşumunu sağlar (14,15). Gelişim boyunca sinyal moleküller, hücresel fonksiyonlarda ana rol oynar. Ayrıca dentin ile pulpadaki tamir sürecinde önemli bir role sahiptirler (15,16). Bunlar dentinden salındığında biyoaktiflerdir ve hücresel cevapları indüklemek için yeteneklidirler; örneğin, tersiyer dentin ve dental pulpa tamirinin sağlanması. Dentinin düzenlenmesi; çürük, asidik bağlanma ajanları ya da pulpa örtücü materyaller ile demineralize edilmiş dentin matrisinden salınan büyüme faktörlerinin hareketini kolaylaştırır. Kalsiyum hidroksit; dentini remineralize edebilen biyoaktif moleküllerin salınımına izin vermesi yönünden gösterilmiştir (17). Bu, DPSCs lerin, odontoblastlara diferansiyasyonunu ve mineralize matrislerin salgılanmasını içerir (18,19,20). 2.5. Dental Pulpa Hücrelerinin İzolasyonu Kök hücreler; akım sitometrisi, flüoresans aktif hücre sınıflandırması, manyetik aktif hücre sınıflandırması gibi çeşitli teknikler ve biyomarkerların (yüzey markerları ve yan popülasyonlar) kullanımıyla belirlenmiştir. Manyetik aktif hücre sınıflandırması (MACS), çeşitli hücre popülasyonlarının seperasyonu için kullanılan, bu hücre popülasyonlarının yüzey antijenlerine bağlı bir metottur. Bu yöntem, belirli bir yüzey antijenine karşı, antikorla kaplanan manyetik nanopartiküllerle inkübasyonlarına izin verilmesi sonucu hücrelerin ayrılmasını sağlar. Bu da, manyetik nanopartiküllere katılmak için antijen sunan hücrelere neden olur. Daha sonra, güçlü bir manyetik alana yerleştirilirler. Bu süreçte, diğer hücrelerin akışı sırasında; hücreler, kolonda kalan nanopartiküllere bağlanmıştır. Bu yöntemle; hücreler, belirli antijenlere saygı duyularak separe edilebilir. Floresan aktif hücre sınıflandırması (FACS), akış sitometrisinin spesifik bir tipidir. İki ya da daha fazla kabın içine, her seferinde bir hücre olmak üzere, hücreleri ayırmayı sağlar. Bu, spesifik ışık saçılımı ve her bir hücrenin floresan karakteristikleri üzerine dayanır. Ve özellikle ilgi çekici olan hücrelerin, fiziksel separasyonlarının yanı sıra; özel hücrelerden floresan sinyallerinin hızlı, objektif ve kantitatif şekilde alınmasını 6
sağlar. Hücre yüzey markerları, kök hücreleri sınıflandırma ile izolasyon ve farklılaşma durumlarını izleme bakımından kullanışlıdır. Çünkü; bu yüzey markerları, bozulmamış hücrelerle direkt görüntülenebilir (3). 2.6. Kriyoprezervasyon Hematopoetik kök hücreler dondurularak saklanmış (kryoprezervasyon) ve transplantasyon için başarıyla kullanılmıştır. Diş pulpası, kolaylıkla uzun süreli (21) dondurularak depolanabilir ve yetişkin doku rejenerasyonu için (22) bir akryobank üretmek için kullanılabilir. Diş pulpa kök hücreleri, kriyoprezervasyondan sonra, potansiyellerini korurlar. (23). Bütün dental pulpanın kriyoprezervasyonu, güvenli şekilde iyileşmeyi sağlar. Bütün pulpa için değişik kriyoprezervasyon teknikleri gerekir. Kriyoprezervasyon, hastaların ihtiyaçlarına göre depolama ve iyileşme potansiyeliyle beraber terapotik üç boyutlu doku rekonstriksiyonu için hücreleri meydana getirir. 20 adet süt ve 32 adet kalıcı dişe sahip olduğumuzdan, dental pulpa kök hücreleri, hastaların vital pulpalarından elde edilebilir.bu işlem, kök hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olan kök hücre markerlarının yardımı ile yapılabilir (3). 3. Mezenkimal Kök Hücreleri Mezenkimal kök hücreler, çeşitli dokuları kapsayan bir çeşit hücre tipine prolifere ve diferansiye olabilen, hematopoetik olmayan, multipotent hücrelerdir. Bunlar; ilk defa, 48yıl önce, Dr Friedenstein ve bilimsel grubunun kemik iliğinde spesifik hücre popülasyonunu tanımlamalarıyla karakterize edilmiştir (24). Bu hücreler şu gibi spesifik özellikler göstermiştir: 7
1 Fibroblast benzeri morfoloji 2 Plastik doku kültürü yüzeylere yapışma yeteneği 3 Osteojenik potansiyel Bunlar CD90, CD73, CD105, CD44 gibi açık protein markerlarını (hücre membranındaki proteinler bu hücrelerde mevcuttur.) ifade eder ve bunlar CD34, CD31, CD45 için negatiftir (25). Bunlar multipotenttir ve osteoblast, nöroblast, kıkırdak, endotel, kas ve yağ hücrelerine farklılaşabilirler (26). Mezenkimal kök hücreler, ayrıca; yağ dokusu, iskelet kası, amniyon sıvısı, kordon kanı, göbek kordonu ve dişte bulunmuştur. Dişteki varlıkları, özellikleri ve nispeten kolay izolasyon teknikleri nedeniyle; dental mezenkimal kök hücreleri üzerinde, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta; potansiyel, yeni ve önemli uygulama olarak yaygın şekilde çalışılmaktadır. Dişlerde çeşitli mezenkimal kök hücre potansiyelleri bulunur. Dişteki konumlarına göre gruplandırılabilirler: Dental pulpa kök hücreleri, DPSCs (27) Eksfoliye Süt dişlerindeki kök hücreler, SHEDs (28) Periodontal ligament kök hücreleri, PDLSCs (29) Diş folikül kök hücreleri, DFSCs (30) Diş apikal papilla kökenli kök hücreleri, SCAPs (31) Yukarıdaki gruplar benzer olmasına rağmen, ileriki paragraflarda analiz edilecek popülasyonlara spesifik karekteristik özellik göstermektedir (1). 8
3.1. Pulpa Kök Hücreleri (DPSCS) Bilim adamları; diş pulpasının, dentin/pulpa yapısının rejeneratif özellikleri nedeniyle, dentin restorasyonu/tamiri için sorumlu kök hücreleri içermesi gerektiği görüşünü taşımaktadır (27). Pulpanın mezenkimal kök hücreler içerebileceği gerçeği; mine ve dentinin beraber hasarlandığı ve pulpa içine penetre olan çeşitli diş hasarlarında, tamir için yeni dentin üreten odontoblastların oluşumunu sağlayan limitli, doğal bir iyileşme sürecini stimüle etmesi gözlemine dayanarak ileri sürülmüştür (32,33). 2000 yılında, Gronthos et al., ilk defa kök hücrelerinin yetişkin dental pulpalarındaki varlığını rapor etmiştir (27). Bu çalışma yetişkin 3. molarlarındaki (19-29 yaşındaki) DPSCs nin izolasyonunu rapor etmiş ve bunların; tipik fibroblast şekli, kemik iliğindeki mezenkimal kök hücrelerine benzer protein marker ifade modeli ve mezenkimal kök hücrelere göre in vitro daha yüksek çoğalma oranına sahip olduklarını göstermişlerdir (34). Bu hücreler, sporadik ama yoğunlukla kalsifiye nodüller üreten yüksek miktarda koloni oluşumu ve yüksek proliferasyon oranı sergilerler (35). Bu özel özellik; 3.molarların büyüme, formasyon ve erüpsiyonlarına bakarak son kalıcı dişler olmalarına bağlanmış olabilir (1). DPSCs daha sonra HA/TCP tozuyla birlikte immun direnci baskılanmış farelere transplante edilmiştir. 6 hafta sonra, insan dişindekine benzer yapıda dentin-pulpa yapısı gözlemlemişlerdir. Kollagen matriksi, odontoblast benzeri tabaka ile dikey olarak doldurulmuştur. Odontoblast benzeri hücreler, sitoplazmayı kan damarlarıyla infiltre pulpa benzeri interstisyel doku ile doldurup dentin matriksine kadar genişletmiştir (1). 2002 de aynı grup; DPSCs nin, aynı hücrelerin oluşumuna yol açabilen proliferasyonunu ve sinir, yağ hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerine diferansiye olabileceğini göstermişlerdir (34). Yeni bir çalışma ile, DPSCs nin taşıyıcı olarak seramik HA/TCP kullanarak, farelerde deri altı transplantasyonunu takiben kemik üretebileceği gözlemlenmiştir (36). Buna ek olarak, DPSCs depolanmış ve 2 yıl sonra çözüldüğünde pro-osteoblastlara diferansiye olma yetenekleri sürmüştür. Ayrıca spesifik antijen yüzeylerinin varlığı değişmeden kalmış ve hücreler diş dokusu üretebilmiştir (21). 9
Odontoblastlar, osteoblastlar, kas, yağ, nöronlar ve kondrositlere dönüşme yeteneği olan bu hücreler,son zamanlarda hepatosit morfolojik özellik ve fonksiyonları geliştirme özelliği gösterirken, in vitro koşullarda onaylanmıştır (6,37). Ayrıca DPSCs; fonksiyonel olarak aktif nöronlara dönüşür.implante DPSCs ; potansiyelleri, nöral bozukluklar için hücresel terapi olarak önerilen, endojen akson rehberliğini indükler (38-40). 2006 da bir çalışma, DPSCs nin üç farklı 3D yapı iskelelerine (süngersi kollagen, gözenekli seramik, lifli bir titanium kafes) yerleştirildiğinde ve fareye 6 ya da 12 hafta transplante edildiğinde, dental pulpa benzeri dokudansa bağlayıcı dokuya benzer yapıda bir doku meydana geldiğini bildirmiştir (41). Bütün bu çalışmalar, DPSCs nin diş doku mühendisliğinde kullanılabileceğini göstermektedir.en önemli sorun, endodontide yeni pulpanın yeniden oluşturulacağı steril kök kanalı içersinde yapı iskelesini oluşturmaktır. Kök hücreleri; eğer pulpa, dental apikal papilla ya da periapikal bölgenin kemiği gibi dişin diğer bölgeleri nekroze olmasaydı canlı pulpanın artık parçalarında bulunabilirdi. Dünyanın dörtbir yanındaki araştırmacılar, farklılaşmalarını destekleyecek ideal mikroçerçevenin yanı sıra DPSCs yi yerleştirmek için yeterli iskeleyi bulmak için uğraşıyor. Mikroçerçevredeki araştırmanın; farklılaşma ve hücre ile dokuların çoğalması üzerindeki rolü, rejeneratif tıbbın geleceği üzerinde hayati önem arz etmektedir (1). Bir pedodontist olan Dr. Sangtao Shi, 2003 yılında 6 yaşındaki kızının süt dişlerini kullanırken, bebek diş kök hücrelerini keşfetmiş ve bunları, insan eksfoliye süt dişlerindeki kök hücreler (SHED) olarak isimlendirmiştir.dental pulpa kök hücreleri(dpscs), dental pulpanın hücreden zengin tabakası içinde bulunabilir.nöral krest orjinli olmaları, multipotansiyel özelliklerini açıklar.bu kök hücreler, belli uyaranlar altında; adipositler, nöronlar, kondrositler ve mezenkimal kök hücreleri içeren birçok hücre tipine diferansiye olur (42-44). Bunlar, geniş terapotik uygulamaları olan en yüksek potansiyelli kök hücrelerdir (45). Dental pulpa kök hücreleri, yetişkinlerde ve çocuklarda bulunabilir (46). 10
Diş kökenli kök hücreler, dental dokuları üretebilir (47-51). SHED ve DPSCs, morfolojik ve fonksiyonel karakteristikleri olan, insan diş pulpalarına yakından benzeyen bir dokuyu üretmeleri bakımından yeteneklidir (52-55). 3.1.1. Diş Gelişimi Diş gelişiminde ilk adım; epitelden, mezenkime gelen sinyallerle gelişimsel süreci başlatan uyarıyı oluşturmaktır. Dental epitelial hücrelerin lokalize olarak çoğalmalaları gerçekleşir.hücreler, mezenkimal hücrelerin yoğunlaştığı bir tomurcuk oluşturur. Epitelial hücrelerin, tomurcukta diferansiyasyon ve lokalize proliferasyonları, takke aşamasına önderlik eder. Bu, epitelial uyarı merkezi tarafından kron morfolojisinin başlatıldığı, mine düğümünün epitelial katlanmaları düzenlediği aşamadır. Çan aşamasında, özelleşmiş diş hücrelerinin öncüleri; ameloblast, koordine mine birikimleri ve dentin üreten odontoblastlar oluşur. Diş erüpsiyonu, kemik rezorpsiyonu ve kök gelişiminin koordinasyonunu içerir ve postnatal meydana gelir. Diş gelişimi boyunca, her süreçte sinyaller, epitelial ve mezenkimal hücreler arasında değişilir. İlk kilit sinyaller, indüksiyon (epitelyum) ve tomurcuk oluşumu ile (mezenkim) meydana gelir. Mezenkimal hücreler epitelden sinyalleri aldığında; mezenkim, karşılayıcı sinyalleri epiteliyuma geri gönderir. Biyolojik olarak yerleştirilen dişler için amaçlanan, bu sinyalleri, saf mezenkim indükleyebilen epitelyum hücrelerine veya diş gelişimini stimüle etmek için saf epitelyum indükleyebilen mezenkim hücrelerine dönüştürmektir (2). 11
Şekil 1. Diş gelişiminin diagramatik gösterimi 3.1.2. Dental Kök Hücrelerin Kaynağı Olarak 3.Molar Kullanımı İnsan 3. molarları (yirmilik dişler), gelişimlerine çocukluk boyunca (5-6yaşları) postnatal başlar ve kalsifiye olmaya 7-10 yaşlarında başlar. 18-25 yaşlarında, 3.molarların kökleri gelişimlerini tamamlamıştır. Bu dişler, dental kliniklerde en sık çekilen dişlerdir. Ama hala kök gelişimine devam ettiklerinden DPSC, PDL hücreleri ve SCAP hücreleri içeren dental kök hücrelerin mükemmel kaynağını sağlarlar (2). 12
Şekil 2. İnsan 3. Moların çekimini takiben alınan fotoğraf ve diyagramı.hemiseke edilen bir dişin iç dokuları sağda gösterilmiştir.diş sürme sürecinde olduğu için, kök gelişimi tamamlanmamış ve apikal papillası görülebilir. Bu dişin diagramatik görünümü ise solda gösterilmiştir (2). 3.2. Eksfoliye Süt Dişlerinin Dental Pulpalarından Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler İn vitro; kemik oluşumunu indükleme, dentin oluşturma ve diğer dental olmayan mezenkimal hücre türevlerine dönüştürme kapasiteleri olan kök hücreler, insanda dökülen süt dişlerinin pulpalarından izole edilmiştir (56-13
60). 2003 yılında, Miura M et al., süt dişlerindeki dental pulpanın içinde, multipotent mezenkimal tip kök hücrelerin varlığını ortaya koymuştur (61). İzolasyonları için, 7-8 yaşlarındaki çocukların kesicileri kullanılmış ve SHEDs in in vitro; sinir benzeri hücreler, odontoblast, osteoblast, adipositlere dönüşebilme yeteneğine sahip olduklarını göstermişlerdir. Farelerde transplantasyon deneylerine dayanarak; SHEDs in kemik oluşturma yeteneğinin yanı sıra dentin üretmek için yeterli kapasiteye sahip olduğu gösterilmiştir. Yetişkin dental pulpalarından gelen mezenkimal hücrelerin aksine, bunlar dentin-pulpa yapısı oluşturma kabiliyetine sahip değildi. Süt dişleri; gelişim süreçleri, doku yapısı ve fonksiyon bakımından kalıcı dişlerden farklıdır. SHED in daha yüksek çoğalma oranı, in vivo daha iyi osteoindüktif yeteneği ve daha düşük miktarda diş pulpası oluşturma yeteneği vardır (61). Bu gözlemlere dayanarak, birkaç çalışma, SHEDs in diş doku mühendisliğinde kullanılmasını önermektedir (62,63). SHED, diş dilimleri/yapı iskeleleri üzerine ekilmiş ve immun bağışıklığı yetersiz farelere subkutanöz implante edilmiş; bunlar, tübüler dentin ve anjiyogenik endotel hücrelerini üretme yeteneği olan fonksiyonel odontoblastlara dönüşmüşlerdir (58). Cordeiro et al., süt dişlerindeki kök hücrelerinin aynı zamanda hasarlı dişlerin tamiri veya kemik oluşumunun uyarılması için kullanılan kök hücreler için ideal kaynak olabileceğini öne sürmüştür (64). Bu araştırma grubu, SHEDs i, insan diş dilimlerinin içine poly-l-laktik asit (PLLA) içeren, bakterilerden ayrışabilen bir yapı iskelesi üzerine ekerek hazırlamış ve bu iskeleleri, subkutan olarak fareye transplante etmiştir. SHEDs, odontoblastlara dönüşmüş ve endotelial hücrelere birlikte transplante edildiğinde yapı iskelesi vaskülarize olmuştur. Bu nedenle, SHEDs, hasarlı diş dokularını tamir etmek ve kemik rejenerasyonunun uyarılması için kök hücreler yönünden önemli bir kaynak olmalıydı. Bu; hasarlı dentin ve pulpa restorasyonuna olan terapötik yaklaşımların, daha önce ekstrakte edilip korunan süt dentisyonundaki otolog kök hücrelerin kullanımıyla gelecekte başarılı olabileceği anlamına gelir. Ancak esas soru, bizim terapötik yaklaşımlar için heterolog kök hücreleri kullanabilip kullanamayacağımızdır (1). İn vivo koşullarda SHEDs i dental pulpa doku mühendisliğinde kullanarak yapılan çalışmalarda; pulpanın enfeksiyon nedeniyle uzaklaştırıldığı yerde, kök hücrelerle değiştirilmiş ve çalışmalar; diş vitalitesi 14
için önemli olan, oluşturulan bu dokunun, diş pulpasına benzer mimari ve hücreselliğe sahip olduğunu ortaya koymuştur (52). Bir başka ilginç klinik uygulama, SHED in Parkinson hastalığını (PD) hafifletmedeki terapotik etkinliğini araştırma sırasında kullanılmıştır (60). SHED kürelerinin, parkinson olan farelerin striatumlarına transplantasyonu; davranış bozukluklarını kısmen iyileştirmiştir. Bu çalışmanın sonuçları; SHED in, PD tedavisi için kullanılan postnatal kök hücreleri yönünden, yararlı kaynağı olabileceğini gösterir. SHED, çocukların dökülen süt dişlerinden izole edilir. Ama PD gibi bir hastalığın, otolog kök hücre terapisi; bu hücrelerin, çocukluk çağından depolanmasını gerektirir. Yetişkin diş pulpasından elde edilen DPSCs, benzer özelliklere sahip olabilir ve bu otolog hücrelerin toplanması ve genişlemesi, hastadan bir diş çekilmesini gerektirir (2). SHED ve diğer kök hücreler, kranial nöral krest ektomezenşiminden türetilmiştir ve bu yüzden gelişimsel ve fonksiyonel olarak özdeş görüneceklerdir. Ama çalışmalar, farklı davrandıklarını ve farklı gen ifade profillerinin olduğunu göstermiştir. SHED, DPSC ve mezenkimal kök hücrelerden türeyen kemik iliğine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek çoğalma oranlarına sahiptir (65). Gen ifade profillerinin karşılaştırılması sonucu, DPSC ve SHED arasında 4386 genin, iki kat veya daha fazla oranda farklı izlendiği gösterilmiştir. Fibroblast büyüme faktörü ile transforme edici faktör (TGF-β) gibi bazı büyüme faktörleri içeren, hücre proliferasyonu ve ekstraselüler matriks formasyonu ile ilgili yollara katılan genler bakımından SHED in daha yüksek izlenimi gözlenmiştir (65). TGF-β özellikle önemlidir; çünkü dentin hasarından sonra salınabilir ve pulpa kök hücrelerini odontoblastlara diferansiye etmek için harekete geçebilir (66). DPSC, yüksek çoğalma oranına sahip olup uzun süreli kültürden sonra kök hücre özelliklerini korur (67). Bu yüzden, mezenkimal kök hücrelerin genel allojenik kaynağı olarak kullanılabilir. Henüz tüm süt dişlerini kaybetmemiş çocuklarda otolog kök hücrelerin kullanımı şu anda sınırlıdır. Bu hücrelerin ticari bankacılığı, çocuk yetişkin hale geldiğinde kullanımlarına izin vermek için yaygın hale gelmektedir.sınırlı çalışmalar, dondurulan SHED hücrelerinin özelliklerini, kriyoprezervasyonundan sonra 2 yıl sürdürdüğünü göstermiş (68); ama uzun süreli depolanmasının (10yıl ve üzeri) etkileri henüz değerlendirilememiştir. Çocuklar doğal olarak süt dişlerini 15
kaybettiğinde, kordon kanının aksine bu hücreleri depolamanın birden çok yolu vardır (2). 3.3. Periodontal Ligament (PDLSCS) Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler Periodontal ligament (PDL); çiğneme boyunca şok absorbsiyonu görevi gören, alveolar kemik soketinin iç duvarı ile kemik benzeri sement arasında lokalize olan, özelleşmiş hücreler içeren fibröz konnektif bir dokudur (69). Periodontal ligament, çiğneme kuvvetleri nedeniyle sürekli baskı altındadır. Bu yüzden PDLSC nin, PDL hücre sayılarının korunmasında endojen rol oynaması muhtemeldir. Bu, PDL benzeri yapıları oluşturmada diğer dental kök hücre popülasyonlarından neden daha iyi olduklarını açıklayabilir (57). Periodontal ligament, çekilmiş dişin kökünden izole edilebilen ve kendini yenileyen ve sement, alveolar kemik gibi diğer dokulara dönüşebilen kök hücreleri içerir (70). PDLSCs in vitro adipositler, osteoblastlar, kondrositlere dönüşebilir (71). Farelerde transplantasyon üzerine bu hücreler kemik, sement, kıkırdak ve periodontal ligament benzeri yapıları oluşturmuştur.oysaki domuzlarda yapılan çalışmada PDLSCs periodontal lezyonları iyileştirmek amacıyla kullanılmıştır (72). Bir başka çalışmada; PDLSCs, 3. molarlardan izole edilen dental apikal papilladaki kök hücrelerle kombine edildiğinde ve yapı iskelesine ekilip genç domuzların alveolar kemiğine transplante edildiğinde; kök ve periodontal kompleks oluşumu gözlenmiştir. (49) Orcioni et al. in daha yeni çalışması, insan PDLSSCs ının yüksek Ca2+ ve nitrik oksit üretimi sergileyen osteoblastlara dönüştüğünü göstermiştir. Bu gözleme dayanarak, çoğalan PDLSCs nin nitrik oksitle birlikte lokal transplantasyonunun, periodontal lezyonların tedavisi için yeni, umut verici bir metot olabileceği öne sürülmüştür (73). Üstelik farelerde transplantasyon üzerine, APTG-CM (apikal diş jermi hücreleri) ile önceden kültürlenmiş PDLSCs, sement/periodontal ligamentin yapılarını üretmiştir 16
(74). Lezyonları restore etmek için kullanılabilinen hücresel terapilerde,periodontal ligamentin, kök hücrelerin diğer alternatif kaynağı olduğu görülür (1). 3.4. Diş Folikülündeki Mezenkimal Kök Hücreleri Diş folikülü; erüpsiyondan önce gelişen diş jerminin, mine organı ve dental papilini saran ektomezenkim kaynaklı konnektif dokudur (75).Diş folikülü; sement, periodontal ligament, alveolar kemik formasyonunda önemli rol oynar (30). Dental folikül hücreleri (DFC), kollagen sentezleyen ve liflerle komşu kemik ve sement yüzeylerini etkileyen PDL fibroblastlarına diferansiye olarak PDL yi oluşturur. DFC, SCID farelerine transplantasyon sonrası sementoblast benzeri hücreler oluşturabilir (76,77). Bu hücreler, periodontal ligament gelişimi çalışmalarının ve rejeneratif, rekonstrüktif tedavilerin gelişiminde yeni bir yöntem olabilir (1). İnsan 3. molarlarından izole edilen dental folikül projenitör hücreleri; kültürde hızlı bağlantılarıyla, kök hücre markerları varsayılan Nestin ve Notch-1 sentezlenmesi ve in vitro kompakt kalsifiye nodülleri oluşturma yeteneği ile karakterizedir (78). DFC immün bağışıklığı olan farelere transplante edildiğinde, her nasılsa sement ya da kemik formasyonunun belirtileri çok az olmuştur (78). DFC; SCAP ile ortak bir dokudan gelişen hüreleri temsil eder ve belki de bu yüzden diğer dental kök hücrelerden daha fazla plastisite sergiler.ancak, aynı zamanda SCAP a benzer bu hücrelerin özellikleri ve potansiyel kullanımları üzerinde daha fazla araştırmanın yapılmasına ihtiyaç vardır (2). DFSCs nin in vivo sement oluşturabilmeleri mümkün iken (79); DFSCs in vitro osteoblast,adiposit ve sinir benzeri hücrelere diferansiye olmuştur (80-82). 17
3.5. Apikal Papilla Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler Kök apikal papilladaki (SCAP) kök hücreler olarak bilinen dental kök hücrelerin eşsiz popülasyonu, büyüyen diş köklerinin uçlarında lokalizedir. Apikal papilla dokusu sadece oral kavitede diş erüpsiyonundan önce, diş gelişimi boyunca mevcuttur (83). Dental pulpanın öncü dokusu olan SCAPs, üst dental papilladan izole edilen kök hücrelerdir. SCAPs nin önemli bir kaynağı, 3.molarlar ve açık apikalli dişlerdir (1). SCAPs nin in vitro koşullarda osteoblast, odontoblast ve antipositlere diferansiye olabileceği oysaki invivo koşullarda osteoblast ve odontoblastlara diferansiye olabileceği bulunmuştur (84,85). İnsan SCAPs nın diş formasyonu için, DPSCs ye kıyasla daha yüksek diferansiyasyon oranına ve daha fazla etkiye sahip oldukları gösterilmiştir (45). Mini domuzların diş soketlerine, SCAP hücreleri (kök oluşturmak için) ve PDLSC nin (periodontal ligament oluşturmak için) co-nakliyle dentin ve periodontal ligament oluşturulmuştur. Bu bulgular, bu hücre popülasyonlarının PDLSC ile birlikte, yapay diş kronuyla kaplanması ile yapılan metal implanta benzer şekilde kullanılabilen biyolojik kök üretmek için kullanılabileceğini öne sürer. Çoğu insan dokularının gelişimlerinin erken zamanlarında, kök hücre izolasyonu klinik olarak mevcut değildir; çünkü kökler postnatal gelişir ve dental klinik pratiğinde; kök apikal papilla, çekilen yirmilik dişlerden elde edilebilir (2). Ayrıca, fareler üzerinde taşıyıcı olarak SCAPs ve PDLSCs ın yanı sıra HA/TGT (hidroksilapatit,trikalsiyum fosfat) transplantasyonu, dentin ve sement/sharpey lifleri formasyonu ile sonuçlanmıştır.bu sonuçlara göre, dental mezenkimal kök hücrelerinin kombinasyonunun kök/periodontal ligament kompleksini canlandırabileceği öne sürülmüştür (49). 18
4. Diş Doku Mühendisliğinde Epitelial Ve Mezenkimal Kök Hücreler Dişin iki farklı dokudan oluştuğu göz önüne alındığında, yapımı dental mezenkimal ve epitelial hücrelerin kooperasyonunu gerektirir. Birçok çalışma, diş rekonstrüksiyonu için cesaret verici sonuçlarla, in vitro ve in vivo koşullarda, kök hücrelerin yukardaki kombinasyonlarının kullanmıştır (86,87). Sıçanlar, domuzlar ve farelerden kökenli dental mezenkimal ve epitelial kök hücreler laboratuarda kültürlenmiş ve farelerde transplantasyon öncesinde farklı biyomateryallerin yüzeyine ekilmiştir. Bütün bu yayınlanan raporlar, dental kök hücrelerin kombinasyonunun; odontoblast ile ameloblastlara diferansiyasyonlarına liderlik edebilmleri sonucunda dentin ve mine formasyonunu göstermiştir (13,88,89,90). Labaratuvarda biyolojik olarak düzenlenen bu dişler, ektopik yerde oluşturulmuştur. Ve alveolar kemik yüzeyine, doğru impantasyona izin veren; tam kök ve periodontal dokular gibi önemli ögelerin eksikliği ile karakterize edilmiştir. Ancak, 2007 de Nakao et al., fare mandibulası üzerinde diş formasyonu üzerine bir çalışma yayınlamıştır. Özellikle, dental epitelial ve mezenkimal kök hücreleri, kollajen jel damla üzerine tohumlanmış ve fare dişi kavitesine implante etmiştir (91). Labaratuvarda biyolojik olarak düzenlenen diş jermi; odontoblastlar, ameloblastlar, dental pulpa, kan damarları, kron, periodontal ligament, kök ve alveolar kemikle birlikte yapısal olarak uygun dişin oluşumuna öncülük eder. Mandibula içine implantasyon; dişin gelişimi, maturasyonu ve erüpsiyon ile sonuçlanmıştır (91). Bu sonuçlar, dental kök hücrelerin insanda kayıp diş yerine kullanılabilmesi yönünden önemli bir göstergedir. 2009 yılında başka bir çalışmada, alveolar kemik üzerindeki kayıp diş alanına labaratuvarda biyolojik olarak düzenlenen dişin transplantasyonu ile 19
farelerde başarılı fonksiyonel diş replasmanı gösterilmiştir (92). Diş epitelial ve mezenkimal molar diş jerminden türetilen kök hücreler kültürlenmiş ve farelerdeki kayıp dişler alanında alveolar kemiğe transplantasyon öncesinde biyomateryalle kombine edilmiştir. Özellikle, üst 1.molar çekilmiş ve dental kavite ile oral kavite epitelinin fiziksel rehabilitasyonuna izin vermesi için transplantasyon 3 hafta sonra gerçekleştirilmiştir. Son olarak, oral bölgede görülen, labaratuvarda biyolojik olarak düzenlenen dişin doğru yapıda olduğu gösterilmiştir.ayrıca, deneysel ortodontik tedaviye ve çeşitli termal, elektriksel stimuluslarla mekanik stress ve ağrı mücadelesi gibi zararlı uyaranlara yanıt vermiştir. Kron genişliğini ayarlamak gibi dişi oluşturan parametrelerin ayarlanması güncel tekniklerle mümkün olmadığından dolayı boyutu normale göre daha küçük olmuştur (1). 5. Dental Doku Onarımı Doku rejenerasyonunda potansiyellerini sunmak için dental kök hücrelerin şu anda dikkate alındığı birçok araştırma alanları vardır. Bunlar; dentin, periodontal ligament, dental pulpa gibi hasarlı diş dokularını onarmak için hücrelerin kullanımlarını içerir (48,57,52,53,93-97). Dental kök hücrelerin, kemik ve sinirler gibi dental olmayan dokuların tamirini kolaylaştırmak için kaynak olarak kullanımının yanı sıra mine doku mühendisliğinin kullanımı önerilmiştir (38-40,60,98,99,100). 20
6. Rejenerasyon 6.1. Diş Dokusu ve Kan Damarlarının Rejenerasyonu SHED in, damarlanmaya benzer bir süreç sonucunda, fonksiyonel vasküler endotelial hücrelere diferansiye olma potansiyeline sahip olduğu gözlenmiştir (101,102). Bu bulgular, dental pulpa orjinli kök hücrelerin; kalp, beyin veya uzuvların bazı iskemik durumlarının tedavisinde yararlı olabileceği umudunu arttırır. Diş pulpa doku mühendisliğinin zorluklarından biri; tüm vaskülarizasyonların kök kanalı boyunca apikal foramen boyunca erişmesi gerektiği gerçeğini göz önünde bulundurarak fonksiyonel damar ağının üretimidir. Bu nedenle, dental pulpa doku mühendisliğinde vaskülogenezisin eşlik ettiği girişimlerinin uyarılması için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır (3). 6.2. Periodontal Rejenerasyon Periodonsiyum dişi çene içinde korumak için dişleri çevreleyen ve destekleyen özel dokuların bir kümesidir. Periodontitis, periodonsiyumu etkileyen bir enflamatuar hastalıktır ve bağ dokusu ataşmanı ile alveolar kemik desteğinin irreversibl kaybıyla sonuçlanır. Fonksiyonel periodonsiyumun hücre bazlı replasmanı için sorun; yeni ligament ve kemik oluşturma ve kemik ile diş kökü arasındaki bağlantının yanı sıra, ligament ve kemik dokuları arası uygun bağlantıları sağlamaktır. Mevcut araştırmanın bir amacı zamansal ve bölgesel olarak periodontal gelişimdeki anahtar olayları tekrarlamak için diş kök hücrelerinin farklı popülasyonlarını kullanmaktır; böylece periodonsiyumun rejenerasyonu, sıralı bir şekilde gerçekleşebilir (95). 21
Periodontal rejenerasyon metodlarında teorik olarak, insan periodontal ligament hücre transplantasyonunu kolaylaştırmak için periodontal ligamentin, düzenlenen hücre tabakalarını içermesi gerektiği düşünülür (96). Periodontal ligament hücreleri insan 3.molar dişlerinden izole edilmiş, hücrelerin düşük sıcaklıkta süren tedavisi boyunca ligamentin uygun hücre tabakaları olarak spontan ayrılmasını indükleyen poly (N -isopropilakrilamid) (PIPAAm) grefte alanların üzerinde kültürlenmiştir. HPDL hücre tabakaları, birinci molarlarından periodonsiyum ve sementleri kaldırılan atimik farelere implante edilmiştir. Hücresel olmayan sement benzeri tabaka ile birlikte, doğal periodontal ligament fibrillerinin, bu tekniğin gelecek periodontal rejenerasyonlar için uygun olabileceği gözlenmiştir. Umut verici olmasına rağmen bu yaklaşım, gerekli herhangi bir kemik değişimini dikkate almaz (2). Bu yaklaşımlarla önemli olan sorun, yeniden canlandırılan herhangi bir periyodonsiyumun bütünlüğü ve fonksiyonunu çiğneme boyunca uzun zaman periotlarında ne derece koruyabileceğidir. Şiddetli periodontitis için mevcut tedaviler zayıftır. Fakat kusurlarına rağmen bu uygulamaların herhangi yeni diş kök hücre bazlı tedavilerinde, yakın gelecekte yoğun araştırma konusu olması muhtemeldir (2). 6.3. De Novo Diş Pulpası Rejenerasyonu Dental pulpa, enfekte olduğunda pulpanın kaldırılması gerekir ve bu, endodontik tedavi gereken kök pulpası için kısmen problemlidir. Bu yüzden pulpanın restorasyonu, diş hekimliğinde dikkat gerektiren bir uygulamadır; çünkü enfekte pulpanın, inorganik materyallerle restorasyonu, canlı olmayan diş ile sonuçlanır. Yeni bir çalışmada, boşaltılan kök kanal boşluğunda diş kök hücreleri kullanarak dental pulpanın de novo rejenerasyonu gösterilmiştir (97). DPSC ve SCAP, insan 3.molarlarından izole edilmiş, poly-d, L- lactide/glycolide iskele üzerine ekilmiş ve kök kanal boşluğuna eklenmiştir. Ve SCID, farelere subkutanöz transplantasyon ile takip edilmiştir. Diş fragmanlarının, ameliyattan 3-4 ay sonraki histolojik analizi, kök kanal 22
boşluğuna iyi yerleşmiş olan vaskülarize, pulpa benzeri dokuyla tamamen dolduğunu göstermiştir. Ayrıca, mineralize dokuya benzeyen dentin tabakası, kanalın dentin duvarlarına yerleşmiştir (97). Son yapılan çalışmalar, farelerde genetik olarak işaretlenmiş hücreleri kullanılması aracılığıyla; hücrelerin çoğunluğu damarlar tarafından sağlandığından boş pulpa kavitesinin rejenere olduğunu göstermiştir. Ayrıca kök hücreleri eklenmesinin, boyutta küçük farklılıklar yaptığını göstermiştir. Bu yüzden; kök hücre pulpa restorasyonu, eksojen kök hücreler sağlama açısından problem olmayabilir; ama pulpa çıkarıldıktan sonra yeterli kan temininin cerrahi olarak sağlanması gereklidir (2). 6.4. Tüm Diş Rejenerasyonu Eksik dişin tamamlanması sanatının güncel durumu; kemikte hazırlanan boşluğa vidalanan, daha sonra plastik veya seramik kronla kaplanan, metal ile kaplı bir vidayı yerleştirmeyi içeren dental implantlardır. İmplantın uygulanabilmesi için, belirli miktarda kemik gerekir. Çünkü bu implantlar PDL şok absorbe edici olmadan kemiğe direkt bağlanır, çiğneme kuvvetleri implantların başarısız olabileceği bir neden olarak direkt olarak kemiğe iletilir. Postmenapozal osteopetroziste meydan gelen, kemik kayıpları gibi implantlar için yetersiz kemik olması durumunda, implantlar kemik greftleri ile desteklenmelidir. Diş hekimliğinde hedef, kayıp dişi biyolojik olarak onarmak için bir metoda; özünde metal yerine hücre bazlı implantlara sahip olmaktır. Biyolojik onarım için minimum gereksinim; fonksiyonel diş, kökler, periodontal ligament ve sinir ile kan malzemeleri için gereken temel bileşenleri oluşturmaktır. Dişin görünür bölümü olan kronu, daha az önemlidir; çünkü fonksiyon için temel olmasına rağmen sentetik diş kronları, iyi fonksiyonlu ve boyutsal, şekilsel ve renk olarak mükemmel olabilir. Bu nedenle biyolojik diş replasmanı için esas önemli olan biyolojik kök oluşturmaktır (2). Şu anda, bütün diş rejenerasyonunda ana engeller; diş germ hücreleri ile aynı özelliklere sahip hücrelerin embriyonik olmayan kaynaklarını 23
belirlemek ve diş oluşturma potansiyelini koruyan hücreleri çoğaltabilen kültür sistemlerini geliştirmektir (Şekil-1).Diş gelişiminin; epitelial ve mezenkimal olmak üzere iki hücre tipini gerektirdiği gerçeği düşünüldüğünde bu daha da zordur (103-105). Odontojenik indüksiyon potansiyeli, dental epitele bağlıdır (106-108). Pretomurcuk safhasında mezenkimal kök hücreler, nöral krest hücreleri ortak kök hücre benzeri özelliklere sahip olduğu sürece, diş epiteli; odontojenik olmayan mezenkimal hücrelerle kombine edildiğinde, diş oluşumunu uyarabilir (109).Mezenkimin epitelial uyarımından sonra, bu doku uyarılmış doku haline gelir ve uyarıları, hala uyarılmamış epitele geri götürür (2). Ikea et al., yetişkin bir farede, kayıp diş bölgesindeki alveolar kemiğe laboratuarda biyolojik olarak düzenlenen diş germinin transplantasyonuyla elde edilen tam fonksiyonel bir diş oluşumunu bildirmiştir (110). Xu et al., faredeki bir diş tomurcuğunu, Arg-Gly-Asp bağlanma yeri bağlayıcı peptid ile birlikte, hem üretilmek hem de tedavi edilmek için kullanılan 2 gözenek büyüklüğünde, ipek fibroinden üretilen iskelelere ekmiştir (111). Diş dokuları yeniden canlandırılmış olsa da, dişin doğru düzenlenmesi için başarı oranı sadece %15-20 dir.yani, yapısal olarak sağlam dişlere ulaşmak için ileri çalışmalar gereklidir (3). 6.5. Kemik Doku Rejenerasyonu DPSCs ler, pre-osteoblastlara diferansiye olduklarında, kalsifiye bir kemik dokusu haline gelen bir ekstraselüler matriksi oluştururlar (112). Bunun dışında, bu dokuların, immünolojik olarak bağışıklanmış farelere transplante edildiklerinde remodelasyona uğradıkları görülmüştür. Ve hapsolmuş osteositlerle bir lameller kemik oluşturdukları gösterilmiştir (113). 24
7. Çeşitli Hastalıkların Tedavisinde Kök Hücreler Kök hücreler, hayatı tehdit edici çeşitli hastalıkların tedavisinde önemli bir rol oynarlar. Kemik, kan damarları, bütün diş ve diş dokularını oluşturmanın dışında, diş pulpa kök hücreleri aynı zamanda myokard enfarktüsü, Parkinson hastalığı, Diabetes mellitus ve belirli kanser formlarını tedavi etmek için kullanılabilir (3). 8. İlk Otolog Dental Doku Mühendisliğinin İnsanda Klinik Olarak Denemesi 2009 yılında, d Aquiono et al., insanda, yetişkin diş pulpa mezenkimal kök hücreleri (DPSCs) ve kollagen süngerinden oluşan biyolojik yapının implantasyonuyla, alt çenedeki kemik kaybının restorasyonunu gösteren çalışmasının sonuçlarını göstermiştir (114). Başlangıçta bu klinik çalışmaya, mandibuladaki gömülü 3.molarların varlığını ortaya koymak için çekilen panoramik radyografları alınan 17 hasta katılmıştır. Hastalardan, mandibulada bilateral olarak 3. molarların çekilmesiyle; çekimin, hastaların kortikal alveolar laminalarını en azından 1,5cm yüksekliğinde etkileyeceği, ikincil olarak 2. molar distalinin etkileneceği tahmin edilmiştir. Bu durum, 3. molar çekiminden sonra, yavaş kemik tamirine neden olur ve komşu 2.moların kaybına yol açabilir. Bu çalışmada, hastaların kaydı için önemli bir parametre iki benzer alt molara sahip olmaktır; böylece biyokompleksin implantasyonu için bir tanesini test (T) grubu, diğerini de kontrol (C) grubu olarak kullanabiliriz. Ayrıca DPSCs nin izolasyonu için gereken çekim için, hastaların dokunulmamış 3. molarlara sahip olması gerekmekteydi (1). Maksiller 3.moların çekimi üzerine DPSCs izole edilip 21 gün boyunca kültürlenmiştir. Akış sitometrisi, protein markerlarını genellikle DPSCs nin hücresel yüzeyinde belirlemek için uygulanmış ve kollagen sünger üzerine yerleştirilmiştir. Uygulanan günde, hasta madibular 3. molarlarının çekimini yaptırmıştır. Kontrol grubunda (C), DPSCs siz kollagen 25
sünger yerleştirilmiş, oysa diğer yandan test grubunda (T) DPSCs ile doldurulmuş kollagen süngerli biyolojik yapı yerleştirilmiştir. Hastalar ameliyat sonrası 1 hafta takip edilmiş ve ilk trimester için aylık gözlemlenmiştir (1). Ameliyattan üç ay sonra iki grubun radyografileri önemli ölçüde farklı idi. T grubu daha yüksek oranda mineralizasyon sergilemiş ve kontrol grubuna kıyasla daha yüksek kortikal seviye göstermiştir. T grupları tamamen yenilenmiştir. Enfeksiyon ya da enflamasyon olmadığı ve fonksiyonların normal olduğu gözlenmiştir. Ayrıca histolojik ve immunfloresans analiz için T ve C gruplarından bir örnek alınmıştır. T grubunda, havers kanallarını çevreleyen lameller bir mimariyle, vaskülarize ve iyi organize kemik gözlenmiştir. Oysaki C grubundaki kemik, tam olmayan ve kemik reabsorbsiyonu gösteren geniş havers kanallarıyla birlikte immatür idi. İmmunfloresan analiz, her iki grupta da osteonektin, osteokalsin, kemik alkalin fosfataz izlerini göstermiştir, ama farklı miktarlarda. Fakat T grubunda farklı seviyede kemik maturasyonu olduğunu onaylayan daha yüksek seviyede kemik morfogenetik protein 2 ve vasküler endotelial büyüme faktörü izlenmiştir. Genel olarak insanlarda otolog kemik rejenerasyonunun ilk raporu, mandibuladaki DPSCs nin kollagen süngerde kullanımıyla kemik defektlerinin optimal tamirini ve 2. molar boyunca periodontal dokuların restorasyonunu gösterir (1). Maksilla ve mandibuladaki kemikler genellikle periodontal hastalıklar, mandibulanın nekrozu gibi dejeneratif hastalıkları takiben reabsorbsiyona uğrar. Yazarlar, DPSCs nin hasarlı dokuların restorasyonu/rejenerasyonu için basit ve doğal alternatif olabileceğini öne sürer. Bunlara kemik mühendisliğinde, yeni yöntem olarak seslenmektedirler. Diş tedavilerinde otolog kök hücrelerin kullanılması tekniğinin onaylanmasından önce daha fazla klinik çalışmaya ihtiyaç vardır. Ancak, steril bir pulpal kavitenin revaskülarizasyonu için periodontal kemik dokusu, dental papilla ya da pulpa kavitesinde kalan canlı hücrelerden orjinli kök hücrelerin kullanımı tekniği zaten endodontide uygulanmaktadır (1). 26
8.1. Odontojen Duyarlı Epitel Hücreleri Erken evre embriyolarının endojen dental epitelinden başka, odontogenezisi indükleme yeteneği olan epitelyum hücrelerinin herhangi bir kaynağı bugüne kadar tanımlanamamıştır. Kültürde yetiştirilebilen ve mezenkim hücrelerini uyarmasından sonra dişleri oluşturabilen epitel hücrelerinin, kaynaklarını tanımlamada esas sınırlama; bu epitelyum hücrelerinin olgunlaşmamış durumlarını korumasıdır (2). Mallasez epitelyum artıkları, kök oluşumu sırasında kalan; bu yüzden yetişkin dişlerinde bulunan, izole edilebilen ve kültürlenebilen hücrelerin bir grubudur (115-119). ERM hücreleri in vitro olarak besleyici tabakalar üzerinde muhafaza edildiğinde, primer dental pulpa hücreleriyle rekombinasyonu takiben mine benzeri doku oluşturmak için indüklenebilirler (119). Embriyo ve yetişkinlerin oral mukoza epitelial hücreleri, rekombinasyon deneylerinde kullanılmış ve tüm fonksiyonel dişler değil, embriyonik dental mezenkimle kombine edilen dişlerin, kompleks diş yapılarını doğurduğu gösterilmiştir (120,121). Oral epitelial hatları, 18. Embriyonik günde, p53 i eksik fare embriyolarında belirlendiğinde diş oluşumuna ait bazı kanıtlar görülmüştür. Oral epitelial hücreleri, fetal embriyonik 16,5. günde molar mezenkimal dokularıyla kombine edilmiş ve 2-3 haftalığına transplante edilmiştir (120). Postnatal oral mukozal epitelyum aynı zamanda embriyonik dental epitelyum replasmanı için potansiyel sunabilir, çünkü genç hayvanlardan izole edilen, hücre tabakaları olarak büyüyen hücreler, diş benzeri yapıları doğurabilir (121). Kültürün ardından diş oluşumuna katkı sağlayabilen eksojen faktörlerin bu hücrelere eklenmesiyle uyarılabileceğini düşündüren epitel hücrelerinin kaynakları vardır. Bu faktörler; fibroblast büyüme faktörü, kemik morfogenetik protein ve Wnt ailelerinin sinyal proteinlerini içerir. Ama 27