Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi Cilt: 9, No: 3, 2014 (58-68) Electronic Journal of Food Technologies Vol: 9, No: 3, 2014 (58-68) TEKNOLOJİK ARAŞTIRMALAR www.teknolojikarastirmalar.com e-issn:1306-7648 Derleme (Review) Şeyma Şeniz ERSÖZ, Serap COŞANSU Sakarya Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Sakarya/TÜRKİYE scosansu@sakarya.edu.tr Özet Gram-pozitif, spor oluşturan, anaerob bir bakteri olan Clostridium difficile ilk kez 1970 li yıllarda antibiyotik kullanımına bağlı ishal ve pseudomembranöz kolit görülen hastalarda tanımlanmıştır. Antibiyotik kullanımı ve ilerlemiş yaş C. difficile enfeksiyonlarında önemli risk faktörleridir. Ancak son yıllarda düşük riskli gruplarda, örneğin antibiyotik kullanmamış kişilerde de enfeksiyon oranının arttığı görülmektedir. Daha çok klinik mikrobiyolojiyi ilgilendiren bir bakteri olmakla birlikte, yakın zamanda yapılan çalışmalarda gıdalardan izole edilmesi, çiftlik hayvanları ve gıdalardan izole edilen suşlar ile hastalardan izole edilen klinik izolatların benzerlik göstermesi bu bakterinin gıdalar aracılığı ile insanlara bulaştığı şüphesini doğurmuştur. C. difficile in izole edildiği gıdalar arasında başta et ve et ürünleri olmak üzere, tüketime hazır salata, sebze ve deniz ürünleri gibi gıdalar yer almaktadır. Genellikle izolasyon oranı ve izole edildiği gıdalardaki C. difficile spor sayısı düşüktür. Ancak, bu bakterinin sporları yüksek sıcaklığa dayanıklı olup, pişmiş gıdalarda canlılığını koruyabilir. C. difficile in gıdalar aracılığıyla insanlara bulaştığına dair kesin bir kanıta henüz ulaşılamamış olmakla birlikte, son yıllarda yapılan çalışmalarda elde edilen veriler bunun olasılık dahilinde olduğunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Clostridium difficile, gıda, patojen, pseudomembranöz kolit, antibiyotik tedavisi Clostridium difficile: Its Properties and Relationship with Foods Abstract Clostridium difficile, a Gram-positive, sporeforming and anaerobic bacterium, was first recognized in patients with antibiotic-associated diarrhea and pseudomembranous colitis in 1970s. Particularly, being treated with antibiotic and increasing age are the main risk factors for C. difficile infections. However, in recent years the rate of C. difficile infection also increased in population with low risk such as people who did not take antibiotic. Although it was investigated mostly in clinical microbiology, it was suspected that foods may be vehicles for transferring this pathogen to human due to being isolated from foods recently and the similarities between clinical isolates and those from foods as well as from animals. C. difficile was isolated from meat and meat products, ready-to-eat salads, vegetables and seafoods. The isolation rates and spore contamination levels were generally low. However, C. difficile spores are resistant to heat and could survive in cooked foods. Even though there is not any absolute evidence that C. difficile is transmitted to humans via foods, the current data obtained by very recent studies show that this is within possibility. Keywords: Clostridium difficile, food, pathogen, pseudomembranous colitis, antibiotic therapy Bu makaleye atıf yapmak için Ersöz, Ş.Ş., Coşansu, S. Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi 2014, 9(3) 58-68 How to cite this article Ersöz, Ş.Ş., Coşansu, S. Clostridium difficile: Its Properties and Relationship with Foods Electronic Journal of Food Technologies, 2014, 9(3) 58-68
Ersöz, Ş.Ş., Coşansu, S. Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 1. GİRİŞ Clostridium difficile ilk kez 1935 yılında sağlıklı bebeklerin dışkılarından izole edilmiş [1] ve izole edildiği yıllarda Bacillus difficilis olarak adlandırılmıştır [2; 3; 4]. Difficilis kelimesi Latince kökenli bir kelime olup zor anlamına gelmektedir. Bu doğrultuda bir isim verilmesinin nedeni kültür ortamında gelişmesinin yavaş, izolasyonunun zor olmasından kaynaklanmaktadır [4; 5]. 1970 lere kadar Bacillus difficilis olarak adlandırılan bu bakterinin ismi, Clostridium cinsine dahil olduğunun anlaşılmasıyla Clostridium difficile olarak değiştirilmiştir [4]. Daha sonra, 1978 yılında psödomembranöz kolit hastalığına yol açtığı belirlenmiş ve klindamisin tedavisi gören hastaların dışkılarından izole edilmiştir. Tüm bu sonuçlar sitotoksin üretimiyle psödomembranöz kolit, C. difficile kolonizasyonu ve antibiyotik tedavisi arasındaki ilişkiyi araştırmaya yöneltmiştir [6]. 1990 lı yıllarda antibiyotik kullanımıyla birlikte sebep olduğu hastalıklarda iki kattan fazla artış gözlenmesi C. difficile in 90 ların patojeni olarak değerlendirilmesine yol açmıştır [7]. Kuzey Amerika da ve Avrupa da 2000 yılından beri görülen salgınlarda ölüm oranlarının artışından hipervirülant suşların sorumlu olduğu düşünülmektedir [8]. Hastalıkları Önleme ve Kontrol (CDC) merkezinin tahminlerine göre ABD de yılda 250 binden fazla C. difficile enfeksiyonu vakasına rastlandığı, ölüm oranlarının %1-2.5 arasında olduğu ve hastalığın yıllık maliyetinin yaklaşık 3 milyar doları aştığı bildirilmektedir [9]. Bu bakterinin neden olduğu enfeksiyon kaynaklı ölüm oranlarında artış gözlenmektedir. ABD de, C. difficile enfeksiyonu nedeniyle ölenlerin sayısı 1999-2000 yılları arasında 3000 kişi iken, 2006-2007 yılları arasında 14000 kişi olarak belirlenmiştir [10]. Bu rakamın son yıllarda binde 22,5 civarında olduğu bildirilmektedir [11]. Yine C. difficile üzerine araştırmaların yoğunlaştığı diğer bir ülke olan Kanada da ölüm oranları 1997-2005 yılları arasında %1.5 ten 5.7 ye ulaşmıştır [12]. Geniş spektrumlu antibiyotik kullanılması sağlıklı bağırsak mikroflorasının yok olmasına neden olur ve C. difficile, Clostridium perfringens ve Salmonella gibi patojen bakteriler kolaylıkla bağırsaklarda kolonize olarak enfeksiyona yol açarlar [3]. Normal bağırsak mikroflorasının zarar görmesinin C. difficile in gelişmesi ve hastalık oluşturmasında önemli bir faktör olduğu kabul edilmektedir [13]. Günümüzde hastane ishalinin en önemli nedeninin C. difficile olduğu bildirilmektedir [14]. Hastane dışında toprak, su, gıda ve hayvanların büyük bir kısmı C. difficile kaynağı olarak gösterilmektedir[7; 15; 16]. 2. ÖZELLİKLERİ C. difficile Gram-pozitif, zorunlu anaerob, spor oluşturan ve sitotoksin üreten bir bakteridir [1; 2; 17]. Optimum gelişme sıcaklığı 35-40 C dir [18]. Üreyebilmesi için atmosfer bileşiminde % 80 azot, %10 karbondioksit ve % 10 hidrojene ihtiyaç vardır [19]. Ayrıca oksijen hassaslığı yüksek olan bu bakteri çoğunlukla vejetatif formdadır ve gelişmesi için glisin ilavesine, enerji metabolizması için de beş aminoaside (lösin, izolösin, prolin, triptofan, valin) ihtiyaç duyar [4; 18]. Katı besiyerinde 48 saatlik inkübasyon süresi sonunda 1-3 mm boyutlarında yaygın koloniler oluşturur [19]. Hücreler 3-16 m uzunluğunda ve 0.5-1.9 m çapındadır. Oval şekilli sporlar subterminal pozisyonda yer alırlar. Bazı suşlar 2-6 hücreden oluşan zincirler oluşturabilirler. Sıvı kültürde genelde hareketlidirler [20]. Diğer Clostridium türlerine göre daha yavaş gelişmesinden dolayı izolasyonu zordur. C. difficile bakteriyostatik özelliğe sahip p-krezolü sentezleyebilir ve yüksek konsantrasyonlarını tolere edebilir. Bu bileşik nedeniyle besiyerinde tipik at gübresi kokusuna neden olur [1]. Besiyerinde spor oluşumu arttırmak amacıyla sodyum taurokolat ilave edilir [19]. Sporları cansız objeler üzerinde yaygın olarak bulunur ve kullanılan kimyasallara dirençli olması sonucu hastane ortamında uzun süre canlı kalabilirler, ancak vejetatif formu sporları kadar dayanıklı değildir [3; 21]. C. difficile in sağlıklı insan bağırsağında bulunma oranı %2-3, yenidoğanlarda ise %40 civarındadır [22]. Yenidoğanlarda ve bebeklerde bu kadar sık görülmesine karşın hastalık gelişmemektedir. Bunun nedeni; C. difficile toksinlerinin bağırsak epitelyum duvarına bağlanamayacak kadar zayıf olması ve bu bölgedeki hücre reseptörlerinin gelişmemesinden kaynaklanmaktadır [23; 24]. 59
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 3. C. DİFFİCİLE ENFEKSİYONU ve ANTİBİYOTİK KULLANIMI İLE İLİŞKİSİ C. difficile enfeksiyonu bağırsak florasının zarar görmesi sonucu ortaya çıkan bir hastalıktır [25]. Yol açtığı hastalık hafif ishalden yaşamı tehdit eden psödomembranöz kolit ve toksik megakolon gibi bağırsak hastalıklarına kadar değişen tablo ortaya koyar [26; 27; 28]. İnsan bağırsak sisteminde yaklaşık 300-500 farklı mikroorganizma cinsi ve dışkının her gramında yaklaşık olarak 10 12 bakteri hücresi bulunmaktadır. Bu organizmalar, kompleks karbonhidratların sindirilmesi, enerji depolanması, bağışıklık fonksiyonları ve patojen istilasına karşı korunma gibi bazı fonksiyonlara yardım ederler [25]. Antibiyotik kullanımına bağlı C. difficile enfeksiyonu, antibiyotik kullanımı sonucunda bağırsaktaki doğal floranın zarar görmesi ve ortamın C. difficile sporlarının çimlenmesi için uygun hale gelmesi ile başlar. Bağırsakta sporlar çimlendikten sonra oluşan vejetatif hücreler hızla çoğalır ve toksin üretirler. Enfektif doz konusunda kesin bir veri olmamakla birlikte, hastalığın ortaya çıkışında kişinin genel sağlık durumunun ve yakın zamanda geniş spektrumlu antibiyotik kullanmış olmanın etkili olduğu belirtilmektedir [1]. Genel olarak C. difficile enfeksiyonunun risk faktörleri arasında başta antibiyotik tedavisi olmak üzere hastanede yatarak tedavi görme, ilerlemiş yaş [2] ve gastrointestinal operasyonlar yer almaktadır [13; 14; 29; 30]. ABD de 2006-2007 yıllarında yapılan bir araştırmaya göre C. difficile enfeksiyonuna bağlı ölümlerin %90 ından fazlası 65 yaş üstü hastalarda meydana gelmiştir [10]. Bu veriler nedeniyle 65 yaş üstü bireylerde enfeksiyona yakalanma riskinin oldukça yüksek olduğu sonucuna varılmıştır. Salgınların artmasıyla birlikte daha önceleri düşük riskli kabul edilen çocuklar, gebe kadınlar ve antibiyotik almayan bireylerde de hastalığın görülme oranı artmıştır [31; 32; 33]. C. difficile enfeksiyonlarındaki artışın ve hastalığın daha ciddi seyretmesinin nedenleri konusunda çeşitli teoriler ortaya atılmıştır. Bir teoriye göre; kontrolsüz antibiyotik kullanımı sonucunda yüksek virülens özelliğe sahip antibiyotiğe dirençli C. difficile suşları ortama hakim olmaktadır. Bir diğer teoriye göre de koyun, keçi, sığır, tavuk gibi çiftlik hayvanlarında C. difficile enfeksiyonları artmakta ve patojen bu çiftlik hayvanlarından elde edilen gıdalarla insanlara taşınmaktadır [1; 2; 4]. C. difficile e bağlı hastalıklarda ana risk faktörünün özellikle geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı olduğu ifade edilmektedir [13; 26]. Bazı antibiyotiklerin kullanımı diğerlerine göre hastalığın ortaya çıkmasında daha fazla risk oluşturmaktadır (Tablo 1). Özellikle klindamisin [34], sefalosporin ve florokinolon içeren antibiyotiklerin kullanılması C. difficile enfeksiyonunda artışa neden olur [3; 32]. Ayrıca ampisilin ve amoksisilin içeren antibiyotiklerin de etkili olduğu belirtilmektedir [34]. Tablo 1. Farklı antibiyotiklerin C. difficile riski açısından karşılaştırılması [26] Düşük risk Orta Risk Yüksek Risk Aminoglikozidler Ko-amoksilav 2. ve 3. Kuşak sefalosporinler Vankomisin Makrolidler Klindamisin Trimetoprim Amoksisilin/ampisilin Fluorokinolonlar Tetrasiklin Piptazobactam Benzilpenisilin 4. PATOJENİTE C. difficile, elverişli koşullar altında temel virülans faktörleri olan toksin A ve toksin B üretir [4; 17]. tcda geni tarafından kodlanan toksin A bir enterotoksin olup, kolonda iltihaplanma, yapısal bozulma ve ishale neden olur [4; 35]. tcdb geni tarafından kodlanan toksin B ise bir sitotoksindir [36]. Toksin A 308 kda, toksin B ise 260 kda molekül ağırlığındadır [37]. Toksin A ve B yi kodlayan genler kromozom üzerinde birbirine çok yakın olup, 19.6 kbp den oluşan ve patojenik lokus (PaLoc) olarak adlandırılan bölgede yer alırlar [35]. Logaritmik gelişme fazında iken, ortamda yeterli miktarda şeker yani glikoz bulunduğunda toksin A ve B nin sentezi baskılanmakta, bakteri kültürü durağan faza girdiğinde toksin üretiminde önemli bir artış 60
Ersöz, Ş.Ş., Coşansu, S. Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 gözlenmektedir. Bu nedenle, toksin üretiminden önce çoğalmaya ve kolonize olmaya öncelik tanındığı, toksin A ve B nin üretiminin bir tür katabolik baskıya maruz kaldığı düşünülmektedir [18]. Aminoasit dizilimi bakımından %45 oranında benzerlik gösteren toksin A ve B nin yapılarında yer alan bazı bölgeler tamamen aynıdır [36]. Yapısal farklıklarına rağmen her iki toksinin de hücre üzerine etkileri benzerdir. Hücre iskeletinin oluşmasında ve yapısının korunmasında önemli rolü olan Rho proteinlerini glikolizasyon yoluyla inaktive ederler ve bunun sonucunda aktin hücre iskeleti ve doku birleşme noktaları bozulur, bağırsak epitel hücrelerinin tahrip olur ve permeabilite artışı ile ishal meydana gelir [35; 38;39]. Dışkıdaki toksin miktarı ile semptomların şiddeti arasında yakın ilişki olduğu ortaya konmuştur [4]. C. difficile suşlarının yaklaşık %75 i her iki toksini de üretmekte olup, toksin üretmeyen suşlar patojenik özellik göstermezler [40]. Bağırsak mukozasında toksin B, toksin A dan yaklaşık 10 kat daha etkilidir. Toksin A üretmeyen yani sadece toksin B üreten suşların, her iki toksini de üreten suşlar kadar ciddi bir hastalık tablosuna yol açtığı gözlenmiştir [4]. Toksinlerin mukozaya etkisi üzerine yapılan bir çalışmada toksin B nin verdiği zarar yaklaşık %31 iken, toksin A nın zarar vermediği görülmüştür [41]. Üçüncü bir toksin tipi bazı C. difficile suşları tarafından üretilen binary (ikili) toksin CDT dir. Binary toksin, toksin A ve B nin her ikisini de içerir. Ancak bu toksin, PaLoc dışında bir CDT lokusunda yer alan cdta ve cdtb genleri tarafından kodlanır [35; 39]. Binary toksinin invitro koşullarda enterotoksik aktivite gösterdiği belirlenmiş, ancak C. difficile enfeksiyonunda olası rolü tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak, toksin A ve B yi sinerjist olarak etkilediği ve daha ciddi bir hastalık tablosunun ortaya çıkmasına neden olduğu düşünülmektedir [2]. Suşlardan en tehlikelisi hipervirülent bir suş olan ribotip 027 dir. Çünkü diğerlerinden daha ağır hastalıklara neden olur ve dolayısıyla ölüm oranı daha fazladır [42]. C. difficile 027 tipi 2008 yılında 16 Avrupa ülkesinde görülmüştür [43]. 5. EVCİL HAYVANLARDA C. DIFFICILE VARLIĞI C. difficile in patojenik izolatlarının olası bulaşma kaynaklarının hayvanlar olduğu düşünülmektedir. Hayvanlarda ilk çalışmalar 1980 li yıllarda başlamış olmakla birlikte, 2000 li yıllara kadar bu durum doğrulanamamıştır. İnsanlarda bulunan izolatlar ile gıdalardan ve hayvanlardan elde edilen izolatlar genellikle birbirine benzerlik göstermektedir [44; 45]. Bundan dolayı insanlarda görülen C. difficile e bağlı hastalıklara ve asemptomik taşıyıcılık durumuna hayvanlarda da rastlanmaktadır [31]. Hayvanlardan izole edilen genotiplerin heterojenitesi (yaklaşık 30-50 farklı PCR ribotipi) insanlarınkinden (yaklaşık 190 PCR ribotipi) daha düşüktür [38]. Çeşitli ülkelerde gerçekleştirilen çalışmalarda PCR ribotip 078 gibi bazı suşların insan, evcil hayvan ve et örneklerinde rastlandığı görülmektedir [46; 47; 48; 49; 50]. Evcil hayvanlar ve çiftlik hayvanları hipervirülent hayvan kaynaklı suşların olası kaynağı olarak görülmektedir [46; 51]. C. difficile; domuz, buzağı, at, devekuşu, kedi, köpek ve kümes hayvanlarında bağırsak hastalıklarının önemli bir nedenidir [52]. Tavuk [49], koyun [53], domuz [54], keçi, sığır, koyun ve buzağı gibi çiftlik ve kümes hayvanları asemptomik olarak bünyelerinde bulundurabilirler [38; 52; 55; 56]. C. difficile suşlarının hem insanlarda hem de hayvanlarda rastlanan önemli iki tanesi ribotip 027 ve ribotip 078 dir [17; 57; 58]. C. difficile in hayvanlarda görülme sıklığı ülkeden ülkeye, araştırmaya, türlere, araştırma yoğunluğuna ve hatta örnekleme prosedürüne göre farklılık göstermektedir [13; 51]. 6. C. DIFFICILE İN GIDALARDA BULUNMA SIKLIĞI İlk kez 1982 yılında, yaşlı bir hastanın konserve somon tükettikten sonra pseudomembranöz kolite yakalanmasıyla söz konusu gıdanın bulaşma kaynağı olabileceğinden şüphelenilmiş, ancak bu gıdada C. difficile varlığı araştırılmamıştır. 1981-1983 yılları arasında yapılan çalışmalarda hastane menüsünde yer alan pişmiş gıdalarda bu bakteriye rastlanmamış olmakla birlikte, çiğ gıdalar veya yetersiz pişmiş gıdaların bulaşma kaynağı olabileceği üzerinde durulmamıştır [7]. Ancak, 1988 yılında yapılan bir 61
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 çalışmada diğer Clostridium türleri ile birlikte C. difficile sporları da baldan izole edilmiştir [1]. 1982-2002 yılları arasında direkt olarak C. difficile in gıdalardaki varlığı konusunda yapılmış neredeyse hiç çalışma bulunmamaktadır. Ancak bu tarihten sonra özellikle de son beş yılda gıdalarda bu patojenin varlığını gösteren çok sayıda bilimsel araştırma makalesine rastlanmaktadır (Tablo 2). Tablo 2. C. difficile in gıdalardan izolasyon oranı ve toksin tipleri Örnek % Pozitif (Toplam Örnek Sayısı) Ribotip Gıdalar aracılığı ile insanlara bulaştığı henüz doğrulanmamış olmakla birlikte, C. difficile in gıdalardan izolasyon oranı %0-62.5 aralığında değişmektedir (Tablo 2). Çeşitli et ve et ürünleri yanında, C. 62 Ülke Örnekleme Zaman Aralığı Sığır eti 0 (145) - Hollanda 2008/2009 [47] Sığır eti 12 (115) 027, 078, C Kanada 2008 [49] Sığır eti 1.65 (121) 078 İran 2012 [60] Sığır eti (hamburger ve kıyma) 2.38 (33) 078, 014 Belçika 2012 [52] Sığır kıyması 20.8 (53) 014, 077, M26, M31 Kanada 2005 [61] Sığır kıyması 6.7 (214) 027, 077, 014 Kanada 2006 [62] Sığır kıyması 50 (26) 027, 078 ABD, Arizona 2007 [59] Sığır kıyması 2 (105) Toksinotip 0, PCRribotip Fransa 2007/2008 [63] 012 Sığır kıyması 8.3 (24) 0348, 0088 Kanada 2007 [64] Sığır ve/veya domuz kıyması 3 (100) Ribotip AI-57 Avusturya 2007/2008 [65] Dana eti 0 (19) - Hollanda 2008/2009 [47] Dana pirzola 14.3 (7) 014, 077, M26, M31 Kanada 2005 [61] Dana pirzola 4.6 (65) 027 Kanada 2006 [62] Karaciğer sosisi 62.5 (16) 027, 078 ABD, Arizona 2007 [59] (Braunschweiger) Sosis 14.3 (7) 027 ABD, Arizona 2007 [59] İspanyol sucuğu 30 (10) 027, 078 ABD, Arizona 2007 [59] Bufalo eti 8.96 (67) 078 İran 2012 [60] Deve eti 0 (124) - İran 2012 [60] Sığır karkası 7.9 (101) Belçika 2011/2012 [50] Domuz karkası 7 (100) Belçika 2011/2012 [50] Domuz eti 0 (63) - Hollanda 2008/2009 [47] Domuz (sosis, kıyma) 4.7 (107) 078, 014, UCL57, Belçika 2012 [52] UCL378 Domuz kıyması 12 (115) 078, 027, C, E, Y Kanada 2008 [49] Domuz kıyması 42.9 (7) 027, 078 ABD, Arizona 2007 [59] Domuz kıyması 4.2 (24) 0139 Kanada 2007 [64] Domuz eti 1.8 (393) 027, OVCB, T, Y, V Kanada 2007/2008 [66] Domuz sosisi 23.1 (13) 027,078 ABD, Arizona 2007 [59] Çiğ et ürünü 9.3 (243) ToksinotipV, ABD, Teksas 2004-2009 [58] Toksinotip IX Farklı tipte et örnekleri (sığır 2.4 (82) - İsviçre 2008 [67] kıyma, hamburger, koyun eti vb.) Hindi kıyma 44.4 (9) 078 ABD, Arizona 2007 [59] İnek eti 0.94 (106) - İran 2012 [60] Keçi eti 3.26 (92) 078 İran 2012 [60] Çiğ et ürünü 2.0 (102) 078 ABD, 2011/2012 [48] Pittsburgh Koyun eti 0.67 (150) - İran 2012 [60] Kuzu eti 6.3 (16) 045 Hollanda 2008/2009 [47] Salata 7.5 (40) 001,017 İskoçya 2008 [68] Tüketime hazır salata ve sebze 2.9 (104) 001, 014/020/077, 015 Fransa 2010/2011 [69] Sebze 2.4 (300) - Güney Galler 1995 [53] Sebze 4.5 (111) 078, V+ Kanada 2009 [70] Tavuk 2.7 (257) 001, 003, 087, 071, NT Hollanda 2008/2009 [47] Deniz ürünleri 4.8 (119) 078, OVCO Kanada 2010 [44] Deniz ürünleri 4.5 (67) ToksinotipV ABD, Teksas 2012 [71] Kaynak
Ersöz, Ş.Ş., Coşansu, S. Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 difficile in izole edildiği gıdalar arasında tüketime hazır salata, sebze ve deniz ürünleri gibi gıdalar da yer almaktadır. Bugüne kadar rastlanan en yüksek izolasyon oranı %62.5 olup, tütsülenmiş baharatlı karaciğer sosisi olarak tanımlanabilecek Braunschweiger adı verilen tüketime hazır et ürününde analize alınan 16 örneğin 10 adedinden C. difficile izole edilmiştir [59]. Ancak bu gibi istisnalar dışında genel olarak hem izolasyon oranının hem de kontaminasyon düzeyinin düşük olduğu görülmektedir. Sonuçlar arasında bu kadar yüksek varyasyon olmasının; örnekleme ve izolasyon yöntemi, gıda çeşidi ve gıdaya uygulanan işlemlerin farklı olması ile laboratuvarlardaki olası çapraz bulaşmadan kaynaklanabileceği ileri sürülmektedir [45]. C. difficile fekal-oral yolla yayıldığından ve çiftlik hayvanları ile kanatlılardan izole edilmiş olduğundan, bu bakterinin gıdalar aracılığı ile insanlara bulaşma potansiyeli olduğu düşünülmektedir. Et kesim sırasında C. difficile ile enfekte olmuş hayvanlardan veya kesim hijyenine dikkat etmeyen personel nedeniyle kontamine olabilir [1]. Bazı çalışmalarda C. difficile spor sayısı da araştırılmış olup genellikle düşük düzeylerdedir [48; 49; 63; 68; 72]. Ancak, et veya diğer gıdalarda bu bakterinin sporları varsa pişirme işlemi ile öldürülemeyeceği ve 71 C de 2 saatlik ısıl işlem süresince canlı kaldıkları belirlenmiştir [73]. Diğer yandan gıdalardan izole edilen suşlardan bazılarının toksijenik olduğu ve hastalardan izole edilen suşlara benzerlik gösterdiği görülmektedir. 7. GIDALARDAN C. DIFFICILE İN İZOLASYONU ve TANIMLANMASI C. difficile in gıdalardan izolasyonunda genel olarak izlenen yol; selektif sıvı besiyerinde gerçekleştirilen zenginleştirme aşamasından sonra spor oluşturmayan bakterileri elimine etmek için alkol şoku uygulanması ve ardından selektif katı besiyerine ekim yapılması şeklindedir. Selektif katı besiyerinde gelişen tipik koloniler izole edilip morfolojik, biyokimyasal ve serolojik testler ile doğrulanmaktadır. Selektif zenginleştirme ortamı olarak %0.1 sodyum taurokolat ilave edilmiş CDMN (Clostridium Difficile Moxalactam Norfloxacin) Broth [44, 49; 65; 66; 70; 72], %0.1 sodyum taurokolat ilave edilmiş CCF (Cycloserine Cefoxitin Fructose) Broth [58], %0.1 sodyum taurokolat ve %0.5 lizozim ilave edilmiş CCM (Cycloserine Cefoxitin Mannitol) Broth [48], %0.1 sodyum taurokolat ve at kanı ilave edilmiş Clostridium Difficile Broth [47; 61] besiyerleri kullanılmaktadır. Bahsedilen besiyerlerine ilave edilen sodyum taurokolat sporların çimlenmesini teşvik ettiği için izolasyonu kolaylaştırmaktadır [74]. Selektif zenginleştirme besiyeri anaerobik koşullarda 37 C inkübe edilmekte olup, süre 2-10 gün arasında değişmektedir. Selektif sıvı besiyerinde yapılan zenginleştirme aşamasından sonra sporsuz bakterileri elimine etmek amacıyla alkol şoku uygulanmaktadır. Bu amaçla zenginleştirme kültürü 1:1 oranında %96 lık etanol ile karıştırılıp oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. İnkübasyonun sonunda kültür santrifüjlenir ve elde edilen peletten selektif katı besiyerine sürme yapılır [49; 72]. Bu aşamada en yaygın kullanılan yöntem alkol şoku uygulaması olmakla birlikte, alternatif bir yöntem de ısıl işlemdir. Isı uygulamasında zenginleştirme kültürü 70 C de 1 saat bekletilir [65]. İzolasyon için selektif katı besiyerleri olarak CDMN (Clostridium Difficile Moxalactam Norfloxacin) Agar [47; 49; 61; 72], Colombia Blood Agar [44; 66; 70], CCF (Cycloserine Cefoxitin Fructose) Agar [58] veya %5 koyun kanı ilave edilmiş Trypticase Soy Agar [48] besiyerlerinden biri kullanılmaktadır. Selektif katı besiyerine elde edilen peletten ekim yapılır ve 24-48 saat 37 C de anaerobik inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda besiyeri üzerinde gelişen gri renkli, hemolitik olmayan yaygın şekilli şüpheli koloniler izole edilerek morfolojik ve biyokimyasal testler ile doğrulanır. Gram-pozitif, subterminal pozisyonda spor oluşturan, at kanı içeren besiyerinde 365 nm UV ışığı altında sarı-yeşil floresan ışıma veren, lesitinaz aktivitesi negatif ve L-prolin aminopeptidaz aktivitesi pozitif olan izolatlar C. difficile olarak doğrulanır. Ayrıca katı besiyerinde at-fil gübresi kokusu oluşumu bu bakteri için tipik bir özelliktir [47; 49; 65; 72]. 63
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 8. SONUÇ Bugüne kadar gıdaların aracı olduğu bir C. difficile enfeksiyonu rapor edilmemiş olmakla birlikte, yapılan tarama çalışmalarında elde edilen sonuçlar bunun olasılık dahilinde olduğunu göstermektedir. C. difficile in gıdalardaki davranışı ve çeşitli gıda işleme proseslerinin etkisi konusunda yeterli bilgi mevcut değildir. Bu nedenle, C. difficile enfeksiyonlarında gıdaların rolünün daha iyi anlaşılabilmesi için bahsedilen konularda daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. 9. KAYNAKLAR 1. Doyle, M. E., 2013, Clostridium difficile as a risk associated with animals sources, Food Research Institue (FRI), January 2013, http://fri.wisc.edu/docs/pdf/fri_brief_cdifficile_jan2013.pdf 2. Kelly, C. P. and Thomas LaMont, J., 2008, Clostridium difficile More Difficult than Ever, New England Journal of Medicine, 359, 1932-1940. 3. Ghose, C., 2013, Clostridium difficile infection in the twenty-first century, Emerging Microbes and Infections, 2(9), e62. 4. Kazanowski, M., Smolarek, S., Kinnarney, F. and Grzebieniak, Z., 2013, Clostridium difficile: epidemiology, diagnostic and therapeutic possibilities-a systematic review, Techniques in Coloproctology, 1-10. 5. Tsutsumi L. S., Owusu Y. B., Hurdle J. G. and Sun, D., 2014, Progress in the Discovery of Treatments for C. difficile Infection: A Clinical and Medicinal Chemistry Review, Current Topics in Medicinal Chemistry, 14, 152-175. 6. Voth D. E. and Ballard, J. D., 2005, Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease, Clinical Microbiology Reviews, 18(2), 247-63. 7. Rodriguez-Palacios, A., Brogmann, S., Kline, T. R. and LeJeune, J. T., 2013, Clostridium difficile in foods and animals: history and measures to reduce exposure, Animal Research Reviews, 14(1), 11-29. 8. Warny, M., Pepin, J., Fang, A., Killgore, G., Thompson, A., Brazier, J., Frost, E. and McDonald, L. C., 2005, Toxin-production by an emerging strain of Clostridium difficile associated with outbreaks of severe disease in North America and Europe, Lancet, 336, 1079-1084. 9. Musgrave, C. R., Bookstaver, P. B., Sutton, S. S. and Miller, A. D., 2011, Use of alternative or adjuvant pharmacologic treatment strategies in the prevention and treatment of Clostridium difficile infection, International Journal of Infectious Diseases, 15(7), e438 e448. 10. McDonald, L. C., Lessa, F., Sievert, D., Wise, M., Herrera, R., Gould, C., Malpiedi, P., Dudeck, M., Srinivasan, A., Fridkin, S. and Cardo, D., 2012, Vital signs: Preventing Clostridium difficile infections, Morbidity and Mortality Weekly Report, 61, 157-162. 11. Bass, S. N., Bauer, S. R., Neuner, E. A. and Lam, S. W., 2013, Comparison of treatment outcomes with vancomycin alone versus combination therapy in severe Clostridium difficile infection, Journal of Hospital Infection, 85(1), 22-27. 12. Lai, C. C., Lin, S. H., Tan, C. K., Liao, C. H., Huang, Y. T. and Hsueh, P. R., 2013, Clinical manifestations of Clostridium difficile infection in a medical center in Taiwan, Journal of Microbiology, Immunology and Infection; doi: 10.1016/j.jmii.2013.06.007. 13. Weese, J. S., 2010, Clostridium difficile in food innocent bystander or serious threat? Clinical Microbiology and Infection, 16(1), 3-10. 14. Khanna, S. and Pardi, D. S., 2012, Clostridium difficile Infection: New Insights Into Management, In: Mayo Clinic Proceedings, Elsevier, 87(11), 1106-1117. 64
Ersöz, Ş.Ş., Coşansu, S. Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 15. Gould, L. H. and Limbago, B., 2010, Clostridium difficile in Food and Domestic Animals: A New Foodborne Pathogen? Clinical Infectious Diseases, 51(5), 577-582. 16. Brazier, J. S., 1998, The epidemiology and typing of Clostridium difficile, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, 47-57. 17. Smits, W. P., 2013, Hype or Hypervirulence A reflection on problematic C. difficile strains, Virulence, 4(7), 592-596. 18. Gibbs, P. A., 2009, Pathogenic Clostridium species. In; Foodborne Pathogens: Hazards, Risk Analysis and Control; 2nd edition, Ch. 23, pp. 820-843. Eds. C.deW. Blackburn & P.J. McClure, Woodhead Publishing Ltd., Cambridge, UK, CRC Press Boca Raton USA. 19. Kıyan, M., 1999, Anaerop, Sporlu, Gram Pozitif Basiller. In: Ustaçelebi Ş. Temel ve Klinik Mikrobiyoloji. 1. Baskı, Ankara: Güneş Kitabevi, syf. 645-649. 20. Acha, N. P. and Szyfres, B., 2001, Zoonoses and Communicable Diseases Common to Man and Animals (third ed.), vol. 1, Pan American Health Organization (PAHO), Washington, DC. pp.384. 21. Planche, T. and Arnold, A., 2009, Clostridium difficile, Medicine, 37(12), 641-643. 22. Libby, D. B. and Bearman, G., 2009, Bacteremia due to Clostridium difficile-review of the literature, International Journal of Infectious Diseases, 13(5), e305-e309. 23. Libby, J. M. and Wilkins, T. D., 1982, Production of Antitoxins to Two Toxins of Clostridium difficile and Immunological Comparison of the Toxins by Cross-Neutralization Studies, Infection and Immunity, 35(1), 374. 24. Boral, Ö. B., 2002, C. difficile infeksiyonu ön tanılı hastaların dışkı örneklerinde toksin A ve B'nin belirlenme sıklığı, Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi, 32(3-4), 220-224. 25. Gough, E., Shaikh, H. and Manges, A. R., 2011, Systematic Review of Intestinal Microbiota Transplantation (Fecal Bacteriotherapy) for Recurrent Clostridium difficile Infection. Clinical Infectious Diseases, 53(10), 994-1002. 26. Monaghan, T., Boswell, T. and Mahida, Y. R., 2009, Recent advances in Clostridium difficileassociated disease, Postgraduate Medical Journal, 85(1001), 152-162. 27. Quesada-Gómez, C., Vargas, P., López-Ureña, D., Gamboa-Coronado, M. M. and Rodríguez- Cavallini, E., 2012, Community-acquired Clostridium difficile NAP1/027-associated diarrhea in an eighteen month old child, Anaerobe, 18, 581-583. 28. Mitchell, B. G. and Gardner, A., 2012, Mortality and Clostridium difficile infection: a review, Antimicrobial Resistance and Infection Control, 20(1), 1-6. 29. Jump R. L. P., Pultz, M. J. and Donskey, C. J., 2007, Vegetative Clostridium difficile survives in room air on moist surfaces and in gastric contents with reduced acidity: a potential mechanism to explain the association between proton pump inhibitors and C. difficile-associated Diarrhea? Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51(8), 2883-2887. 30. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A. and Lyras, D., 2014, Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis, FEMS Microbiology Letters, 352, 140-149. 31. Rupnik, M., 2007, Is Clostridium difficile-associated infection a potentially zoonotic and foodborne disease? Clinical microbiology and infection, 13(5), 457-459. 32. Johnson, S., 2009, Recurrent Clostridium difficile infection: A review of risk factors, treatments, and outcomes, Journal of Infection, 58, 403-410. 33. Clements, A. C. A., Magalhaes, R. J. S., Tatem, A. J. and Riley, T. V., 2010, Clostridium difficile PCR ribotip 027: assessing the risks of further worldwide spread, The Lancet, 10, 395-404. 65
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 34. Mylonakis, E., Ryan, E. T. and Calderwood, S. B., 2001, Clostridium difficile- Associated Diarrhea: a review, Archives of Internal Medicine, 161(4), 525-533. 35. Vaishnavi, C., 2010, Clinical spectrum and pathogenesis of Clostridium difficile associated diseases, Indian Journal of Medical Research, 131, 487-499. 36. Songer, J. G., 2004, The Emergence of Clostridium difficile as a pathogen of food animals, Animal Health Research Reviews, 5(2), 321-326. 37. Trejo, F. M., De Antoni, G. L. and Pérez, P. F., 2013, Protective effect of bifidobacteria in an experimental model of Clostridium difficile associated colitis, Journal of Dairy Research, 80(3), 263-269. 38. Rupnik, M., Wilcox, M. H. and Gerding, D. N., 2009, Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis, Nature Reviews Microbiology, 7, 526-536. 39. Kılıç, A., 2013, Clostridium difficile Enfeksiyonu: Epidemiyoloji, Risk Faktörleri, Patogenez, Klinik Özellikler, Tanı ve Tedavi, Mikrobiyoloji Bülteni, 47(3), 556-566. 40. Nazlıgül, Y. ve Gül, C., 2006, Nozokomiyal diyare, Güncel Gastroenteroloji, 10(3), 225-229. 41. Riegler, M., Sedivy, R., Pothoulakis, C., Hamilton, G., Zacherl, J., Bischof, G., Cosentini, E., Feil, W., Schiessel, R. and LaMont, J. T., 1995, Clostridium difficile Toxin B Is More Potent than Toxin A in Damaging Human Colonic Epithelium In Vitro, The Journal of Clinical Investigation, 95(5), 2004-2011. 42. Indra, A., Lassing, H., Baliko, N., Much, P., Fiedler, A., Huhulescu, S. and Allerber, F., 2009, Clostridium difficile: a new zoonotic agent? Wiener Klinische Wochenschrift, 121, 91-95. 43. Kuijper, E. J., Barbut, F., Brazier, J. S., Kleinkauf, N. et al., 2008, Update of Clostridium difficile infection due to PCR ribotype 027 in Europe, 2008, Eurosurveillance, 13(7-9), 1-7. 44. Metcalf D., Avery B. P., Janecko N., Matic N., Smith, R. R. and Weese, J. S., 2011, Clostridium difficile in seafood and fish, Anaerobe, 17, 85-86. 45. Marsh, J. W., 2013, Counterpoint: Is Clostridium difficile a food-borne disease? Anaerobe, 21, 62-63. 46. Debast, S. B., van Leengoed, L. A. M. G., Goorhuls, A., Harmanus, C., Kuijper, E. J. and Bergwerff, A. A., 2009, Clostridium difficile PCR ribotype 078 toxinotype V found in diarrhoeal pigs identical to isolate from affected humans, Environmental Microbiology, 11(2), 506-511. 47. Boer, E., Nahuis, A. Z., Heuvelink, A. E., Harmanus, C. and Kuijper, E. J., 2011, Prevalence of Clostridium difficile in retailed meat in The Netherlands, International Journal of Food Microbiology, 144, 561-564. 48. Curry, S. R., Marsh, J. W., Schlackman, J. L. and Harrison, L.H., 2012, Prevalence of Clostridium difficile in uncooked ground meat products from Pittsburgh, Pennsylvania, Applied and Environmental Microbiology, 78(12), 4183-4186. 49. Weese, J. S., Avery, B. P., Rousseau, J. and Reid-Smith, R., 2009, Detection and enumeration of Clostridium difficile spores in retail beef and pork, Applied and Environmental Microbiology, 75(15), 5009-5011. 50. Rodriguez, C., Avesani, V., Broeck, J. V., Taminiaua, B., Delmée, M. and Daube, G., 2013, Presence of Clostridium difficile in pigs and cattle intestinal contents and carcass contamination at the slaughterhouse in Belgium, International Journal of Food Microbiology, 166, 256-262. 51. Blanco, J. L., Álvarez-Pérez, S. and García, M. E., 2013, Is the prevalence of Clostridium difficile in animals underestimated? The Veterinary Journal, 197, 694-698. 66
Ersöz, Ş.Ş., Coşansu, S. Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 52. Rodriguez, C., Taminiau, B., Avesani, V., Broeck, J. V., Delmée, M. and Daube, G., 2014, Multilocus sequence typing analysis and antibiotic resistance of Clostridium difficile strains isolated from retail meat and humans in Belgium, Food Microbiology, 42, 166-171. 53. Al Saif, N. and Brazier, J. S., 1996. The distribution of Clostridium difficile in the environment of South Wales, Journal of Medical Microbiology, 45, 133-137. 54. Songer, J. G., Post, K. W., Larson, D. J., Jost, B. H. and Glock, R. D., 2000, Infection of neonatal swine with Clostridium difficile, Swine Health and Production, 8,185-189. 55. Rodriguez-Palacios, A., Stämpfli, H. R., Duffield, T., Peregrine, A. S., Trotz-Williams, L. A., Arroyo, L. G., Brazier, J. S. and Weese, J. S., 2006, Clostridium difficile PCR Ribotypes in Calves, Canada, Emerging Infectious Diseases (www.cdc.gov/eid), 12(11), 1730-1736. 56. Simango, C. and Mwakurudza, S., 2008, Clostridium difficile in broiler chickens sold at market places in Zimbabwe and their antimicrobial susceptibility, International Journal of Food Microbiology, 124, 268-270. 57. Cartman, S. T., Heap, J. T., Kuehne, S. A., Cockayne, A. and Minton, N. P., 2010, The emergence of hypervirulence in Clostridium difficile, International Journal of Medical Microbiology, 300, 387-395. 58. Harvey, B. R., Norman, K. N., Andrews, K., Norby, B., Hume, M. E., Scanlan, C. M., Hardin, M. D. and Scott, H. M., 2011, Clostridium difficile in retail meat and processing plants in Texas, Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 23(4), 807 811. 59. Songer, J. G., Trinh, H. T., Killgore, G. E., Thompson, A. D., McDonald, L. C. and Limbago, B. M., 2009, Clostridium difficile in retail meat products, USA, Emerging Infectious Diseases (www.cdc.gov/eid), 15(5), 819-821. 60. Rahimi, E., Jalali, M. and Weese, J. S., 2014, Prevalence of Clostridium difficile in raw beef, cow, sheep, goat, camel and buffalo meat in Iran, Biomed Central Public Health, 14(119), 1-4. 61. Rodriguez- Palacios, A., Staempfli, H. R., Duffield, T. and Weese, J. S., 2007, Clostridium difficile in retail ground meat, Canada, Emerging Infectious Diseases (www.cdc.gov/eid), 13(7), 485-487. 62. Rodriguez-Palacios, A., Reid-Smith, R., Daignault, D., Janecko, N., Avery, B. P., Martin, H., Thomspon, A. D., McDonald, L. C., Limbago, B. and Weese, J. S., 2009, Possible seasonality of Clostridium difficile in retail meat, Canada, Emerging Infectious Diseases, 15(5), 802-805. 63. Bouttier, S., Felix, B., Lambert, S., Collignon, A. and Barbut F., 2010, Clostridium difficile in ground meat, France, Emerging Infectious Diseases, 16(4), 733-734. 64. Visser, M., Sepehrim, S., Olson, N., Du, T., Mulvey, M. R. and Alfa, J. M., 2012, Detection of Clostridium difficile in retail ground meat products in Manitoba, The Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology, 23(1), 28-30. 65. Jöbstl, M., Heuberger, S., Indra, A., Nepf, R., Köfer, J. and Wagner, M., 2010, Clostridium difficile in raw products of animal origin., International Journal of Food Microbiology, 138, 172-175. 66. Metcalf, D., Reid-Smith, R. J., Avery, B. P. and Weese, J. S., 2010, Prevalence of Clostridium difficile in retail pork, Canadian Veterinary Journal, 51, 873-876. 67. Von Abercron, M., Marie, S., Karlsson, F., Wigh, G. T., Wierup, M. and Krovacek, K., 2009, Low Occurrence of Clostridium difficile in Retail Ground Meat in Sweden, Journal of Food Protection, 8, 1732-1734. 68. Bakri, M. M., Brown. D. J., Butcher. J. P. and Sutherland, A. D., 2009, Clostridium difficile in readyto-eat salads, Scotland, Emerging Infectious Disease, 15, 817 818. 67
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 58-68 69. Eckert, C., Burghoffer, B., Barbut, F. 2013. Contamination of ready-to-eat raw vegetables with Clostridium difficile in France. Journal of Medical Microbiology, 62, 1435 1438. 70. Metcalf, D. S., Costa, M. C., Dew, W. M. V. and Weese, J. S., 2010, Clostridium difficile in vegetables, Canada, Letters in Applied Microbiology, 51, 600-602. 71. Norman, K. N., Harvey, R. B., Andrews, K., Hume, M. E., Callaway, T. R., Anderson, R. C. and Nisbet, D. C., 2014, Survey of Clostridium difficile in retail seafood in College Station, Texas, Food Additives & Contaminants: Part A, DOI: 10.1080/19440049.2014.888785. 72. Weese, J. S., Reid-Smith, R. J., Avery, B. P. and Rousseau, J., 2010, Detection and characterization of Clostridium difficile in retail chicken, Letters in Applied Microbiology, 50(4) 362-365. 73. Rodriguez-Palacios, A., Reid-Smith, R. J., Staempfli, H. R. and Weese, J. S., 2010, Clostridium difficile survives minimal temperature recommended for cooking ground meats, Anaerobe, 16, 540 542. 74. Brazier, J. S. and Borriello, S. P., 2000, Microbiology, epidemiology and diagnosis of Clostridium difficile infection, Current Topics in Microbiology and Immunology, 250, 1 33. 68