68 ALFA-TOKOFEROL VE L-KARNİTİNİN RADYASYONA MARUZ KALMIŞ RATLARIN TÜKÜRÜK BEZLERİ ÜZERİNE ETKİSİ EFFECT OF ALPHA-TOCOPHEROL AND L-CARNITINE ON SALIVARY GLANDS OF RATS EXPOSED TO RADIOTHERAPY Özgür YÖRÜK, Vecdi ERTEKİN, Elif DEMİRCİ Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Kulak Burun Boğaz (ÖY), Radyasyon Onkolojisi (VE), Patoloji (ED) Anabilim Dalları, Erzurum Özet Çalışmamızda, deney hayvanlarında radyoterapi ile oluşan tükürük bezindeki histopatolojik değişikliklere karşı kombine olarak kullanılan alfa tokoferol ve L-karnitin in etkili olup olmadığı araştırıldı. Çalışmamızda 25 adet sağlıklı rat kullanıldı. Bunlar kontrol grubu (1.grup), radyoterapi grubu (2.grup), radyoterapi ve alfa-tokoferol grubu (3.grup), radyoterapi ve L-karnitin grubu (4.grup), radyoterapi ile alfa-tokoferol ve L-karnitin kombinasyonu grubu (5.grup) olmak üzere 5 gruba ayrıldı. Alfa-tokoferol 10 mg/kg/gün intramusküler olarak ve L-karnitin 100 mg/kg/gün dozunda intraperitoneal olarak beş gün boyunca verildi. İkinci gün sonunda 2., 3., 4. ve 5. gruplara 15 cgy tek seferde radyasyon uygulandı. Radyoterapi uygulaması sonrasındaki 10. gün 5 gruba dahil hayvanların tamamının tükürük bezleri çıkarıldı. Yapılan histopatolojik inceleme sonucu, alfa-tokoferol ve L-karnitinin ayrı ayrı ve kombine kullanımlarının radyoterapinin dejeneratif etkisini anlamlı ölçüde azalttığı görüldü. Anahtar kelimeler: Radyoterapi, Tükürük bezi, Antioksidan, Alfa-tokoferol, L-karnitin Summary In our study, we investigated whether Alpha- tocopherol and L- carnitine used combinely with radiotherapy in experiment animals become effective against histopathologic changes in salivary gland due to radiotherapy. In this study, 25 healthy rats were used. These rats were divided into 5 groups: control group (Group I), radiotherapy group (Group II), Alpha-tocopherol group (Group III), radiotherapy and L-carnitine group (Group IV), Alphatocopherol together with radiotherapy and L-carnitine combination group (Group V). Alpha-tocopherol (10mg/kg/day, intramuscularly) and L-carnitine (100mg/kg/day, intraperitoneally) were used for five days. In the end of the second day, 15cGy radiation was applied to the Group II, III, IV and V in one time. On the tenth day after radiotherapy, all the animals in five groups salivary glands were extracted. In histopathologic examination, it was seen that the use of alpha-tocopherol and L-carnitine separately or combinely reduced degenerative effects of radiotherapy significantly. Key words: Radiotherapy, Salivary gland, Antioxidant, Alpha-tocopherol, L-carnitine ; MJAU 2005;
68 Tablo 1. Radyoterapi ile Birlikte Alfa-Tokoferol ve L-Karnitin in ayrı ayrı ve Kombine Olarak Verildiği Gruplarda Saptanan Histopatolojik Değişiklikler görülen dejenerasyonun derecesi kontrol grubu RT grubu R + αt grubu R + LK grubu R + αt +LK grubu dejenerasyon denekler denekler denekler denekler denekler parametreleri 1 2 3 4 5 1 2 3 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 fokal hücre nekrozu + ++ - + + ++++ +++ ++++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ ++ +++ ++++ +++ +++ ++ +++ + ++ fokal asini kaybı + - - + - ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ +++ ++++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ nükleer pleomorfizm, atipi hiperkromazi + + - + + ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++++ ++++ +++ ++++ +++ binükleasyon - - + + - ++++ +++ ++++ ++ +++ +++ +++ ++ - +++ +++ +++ ++ ++ + + ++ ++ boşaltıcı duktus hasarı + + + - + ++++ ++++ ++++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ ++ +++ nükleol belirginliği - + - - - +++ +++ +++ - ++ ++ + + - ++++ ++++ ++++ +++ + - - + - seröz hücrelerde şişme dejenerasyonu + - + - + +++ ++++ ++++ ++ +++ +++ +++ ++ + + ++ ++ + +++ ++ ++ +++ ++ Oluşan hasarın şiddetini gösterimde kullanılan simgeler şunlardır. -: Yok, + : Hafif, ++: Orta, +++: Şiddetli, ++++: Çok şiddetli RT: Radyoterapi αt: Alfa -Tokoferol LK: L-Karnitin
69 Şekil 1. Sadece Radyoterapi Verilen Grupta (2. grup) Duktus Epitel Hücrelerinde Belirgin Vakuoler Dejenerasyon ve Hücrelerde Hiperkromazi ve Pleomorfizm (Hematoksilen-Eozin x 200) Şekil 2. Radyoterapi ve L-karnitin Verilen Grupta (4.grup) Duktus ve Asinüs Epitel Hasarında Kısmi Düzelme (Hematoksilen-Eozin x 200) Giriş Baş-boyun bölgesine uygulanan radyoterapi, hastaların çoğunda anlamlı akut ve kronik toksik etkiler oluşturmaktadır (1). Radyoterapi alan hastalarda tükürük salgısı azalmakta ve ağız kuruluğu meydana gelmektedir. Buna bağlı olarak beslenmede zorluk, vücut direncinin düşmesi ve kilo kaybı gözlenmektedir. Ayrıca tükürüğün diş sağlığı üzerindeki olumlu etkisinin ortadan kalkmasına bağlı olarak dental şikayetlerin ortaya çıkması gibi problemler görülmektedir (2). Radyasyonuın lokal ve genel yan etkilerinin oluşmasında serbest oksijen radikallerinin mutlak rolünün olduğu bilinmektedir. Yapılan çalışmalar, alfa-tokoferol (3,4) ve L-karnitin (LK) (5,6) in her ikisinin de antienflamatuar, antioksidan, ve sitoprotektif rollerinin olduğunu göstermiştir. Çalışmamızın amacı baş boyun bölgesine uygulanan radyoterapi sırasında ve sonrasında oluşan tükürük salgısının azalmasına sebep olabilecek histopatolojik tükürük bezi değişikliklerinin önlenmesi veya azaltılmasında antioksidan özellikleri bilinen alfatokoferol ve L-karnitin in etkinliklerinin araştırılmasıdır. Gereç ve Yöntem Çalışmamızda ağırlıkları 180-220 gram arasında değişen (ortalama 205±11.25 gram) 25 adet sağlıklı rat kullanıldı. Rastgele seçilen hayvanlar, deneyin başlangıcında, her grupta 5 er hayvan olmak üzere 5 gruba ayrıldı. Alfa-tokoferol 3. gruba iki gün süreyle intramuskuler 10 mg/kg/gün dozunda verildi. L-karnitin 4. gruba iki gün süreyle intraperitoneal 100 mg/kg/gün dozunda verildi. İkinci gün sonunda 2., 3., 4., gruplara 15 cgy tek seferde radyasyon verildi. Radyasyon sonrası 3 gün daha 3. gruba alfa-tokoferol intramuskuler, 4. gruba L-karnitin intraperitoneal ve 5. gruba alfa-tokoferol ve L-karnitin kombine olarak belirtilen dozlarda verilmeye devam edildi. İki adet rat radyasyon verilişinden 4 gün sonra ileri derecede zayıflama, yememe ve içmeme sonucu öldü. Radyoterapi uygulaması sonrasındaki 10. gün 5 gruba dahil toplam 23 ratın tamamına sakrifiye edilerek tükürük bezleri çıkarıldı. Elde edilen tükürük bezi dokuları ışık mikroskobu altında değerlendirildi. Histopatolojik İnceleme Submandibuler gland dokuları, 4 mikron kalınlığında kesitler yapılarak Hemotoxilen-Eozin (H&E) ile boyandı. H&E ile elde edilen kesitler, birbirinden bağımsız iki patolog tarafından değerlendirildi ve skorlandı (Şekil 1-3). Skorlama için kullanılan kriterler şunlardır: Fokal hücre nekrozu, fokal asini kaybı, nükleer pleomorfizm, atipi hiperkromazi, binükleasyon, boşaltıcı duktus hasarı, nükleol belirginliği, seröz hücrelerde şişme ve dejenerasyondur. İstatistiksel Değerlendirme Elde edilen histopatolojik dejenerasyon skorları, SPSS v11.0 istatistik programı ile incelendi. İncelenen parametrelerin karşılaştırılmasında Mann Whitney U testi uygulandı.
70 Şekil 3. Radyoterapi ve Alfa-Tokoferol+L-Karnitin Kombine Verilen Grupta (5.grup) Duktus ve Asinüs Epitel Hasarında Belirgin Düzelme (Hematoksilen-Eozin x 200) hasarında, radyoterapi ile birlikte L-karnitin verilen grupta boşaltıcı duktus hasarı ve seröz hücrelerde şişme dejenerasyonunda, radyoterapi yanında alfatokoferol ve L-karnitin in kombine uygulandığı grupta ise fokal asini kaybı, binükleasyon ve boşaltıcı duktus hasarında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma tespit edildi (p<0.05) (Tablo 2). Bulgular Radyoterapi grubunda bulunan (2.grup) iki rat hariç, radyasyon verilen hayvanların tümü planlanan zamana kadar yaşadı. İki adet rat radyasyon verilişinden 4 gün sonra ileri derecede zayıflama ve yememe içmeme sonucu öldü. Sadece radyoterapi verilen grup ile, radyoterapi ile birlikte alfa-tokoferol ve L-karnitin in ayrı ayrı ve kombine olarak verildiği gruplarda histopatolojik değişiklikler saptandı (Tablo 1). Sadece radyasyon uygulanan submandibular bezlerinde, kontrol grubuyla kıyaslandığında radyasyon uygulanan grupta gözlenen fokal hücre nekrozu, fokal asini kaybı, nükleer pleomorfizm ve atipi hiperkromazi, binükleasyon, boşaltıcı duktus hasarı, seröz hücrelerde şişme ve dejenerasyonun derecesi istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05). Sadece radyoterapi verilen grup ile karşılaştırıldığında; radyoterapi ile birlikte alfa-tokoferol verilen grupta fokal asini kaybı ve boşaltıcı duktus Tartışma Baş boyun tümörlerinin radyasyonla tedavisi çoğu zaman tükürük bezinde kaçınılmaz yan etkilere neden olur. Tükürük bezi epitel hücreleri arasında seröz hücreler mükoz hücrelerden daha radyosensitiftir. Tükürük bezlerindeki seröz epitel hücrelerin belirgin radyosensitiviteye sahip olmasının, onların sekretuar granül içerikleriyle ilişkilidir (7,8). Tükürük bezinde radyasyonun neden olduğunu hasar tedavinin başlangıcından sonra ve nispeten düşük dozlarda görülmektedir. Nagler ve ark., ratlarda baş boyun bölgesine 15 cgy lik tek doz radyasyon uygulamasından sonraki 0.5, 1, 4 ve 24. saatlerde tükürük bezi dokusunu incelemiş ve radyasyonun tükürük bezi üzerinde oluşturduğu seröz hücre dejenerasyonu, nekroz, fokal asini kaybı ve akut inflamasyon gibi histolojik değişikliklerin radyasyondan sonraki ilk 24 saat sonra görülmeye başladığını bildirmişlerdir (9). Takeda ve ark., in-vivo çalışmalarında, 15 cgy lik tek doz radyasyon uygulanmasından sonra, radyasyonun nitrik oksit üretimini indüklediğini göstermiştir. Nitrik oksitin aşırı üretiminin de kserostomi oluşumuna neden olduğunu göstermişlerdir. Nitrik oksit sentez inhibitörünün ortamda bulunmasının radyasyon sonrası oluşan tükürük bezi hasarını iyileştirmesi, nitrik oksitin kserostomi oluşumunda önemli rolü olduğunu göstermiştir (10). Tablo 2. Tüm Gruplardan Elde Edilen Histopatolojik Sonuçların İstatistiksel Olarak Karşılaştırılması Parametre FHCN FAK NPAH BIN BDH NB SHSD RT/kontrol p<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 p>0.05 P<0.05 RT/ αt p>0.05 P<0.05 P>0.05 P>0.05 P<0.05 p>0.05 P>0.05 RT/LK p>0.05 P>0.05 P>0.05 P>0.05 P<0.05 p>0.05 P<0.05 RT/ αt+lk p>0.05 P<0.05 P>0.05 p<0.05 p<0.05 p>0.05 P>0.05 RT/kontrol: Radyoterapi uygulanan grup ile kontrol grubunun karşılaştırılması RT/αT: Radyoterapi uygulanan grup ile alfatokoferol uygulanan grubun karşılaştırılması RT/LK: Radyoterapi uygulanan grup ile L-karnitin uygulanan grubun karşılaştırılması RT/αT+LK: Radyoterapi uygulanan grup ile alfatokoferol ve L-karnitinin kombine uygulandığı grubun karşılaştırılması FHCN: Fokal hücre nekrozu FAK: Fokal asini kaybı NPAH: Nükleer pleomorfizm atipi hiperkromazi BIN: Binükleasyon BDH: Boşaltıcı duktus hasarı NB: Nükleol belirginliği SHSD: Seröz hücrelerde şişme ve dejenerasyon
71 Philips, radyasyonun (tek doz, 21 Gy) uygulanması sonucu rat parotis bezi morfolojisinde görülen değişikliklerin 3 basamakta geliştiğini ve ilk basamakta (0-6 gün) akut atrofi, asiner hücre nekrozu, bez ağırlığında azalma, tükürük içeriğinde değişme ve tükürük akım hızında azalma, ikinci basamakta (6-16 gün) asiner hücre hipertrofisi, amilaz seviyelerinde artış ve bir dizi fonksiyonel parametrede iyileşme, üçüncü basamak (>16 gün) boyunca da asiner hücrelerin atrofik hale geldiğini ve amilaz konsantrasyonun yanı sıra bez ağırlığında da azalma görüldüğü şeklinde bildirdi (11). Çalışmamızda 15 Gy lik tek doz radyasyon uygulanmıştır. Çünkü rat tükürük bezinde radyasyon etkilerinin yaklaşık 15 Gy dozunda görülmeye başladığı bilinmektedir (8). Vissink ve ark., çalışmalarında 15 cgy tek doz uygulama ile 7.5 Gy lik iki doz uygulamasını karşılaştırmış ve tek doz uygulamanın etkisinin daha fazla olduğunu öne sürmüşlerdir (12). Çalışmamızda radyasyon sonrası oluşan kısa dönem etkileri araştırılmıştır, çünkü tükürük bezindeki maksimum değişiklikler ve submandibular bez dokusundaki fonksiyonel parametrelerdeki majör iyileşmeler, radyasyon sonrası ilk 10 gün içinde gerçekleşir (13). Radyasyona maruz kalan hücrelerde reaktif oksijen radikallerinin oluşmasına bağlı olarak sitotoksisite görülür (14). Hayvan deneylerinden alınan sonuçlar alfa-tokoferol ve selenyum gibi antioksidan bileşiklerin radyasyonun letal ve diğer yan etkilerine karşı koruyucu olduğunu göstermiştir (15). Funegard U ve ark., çalışmalarında 7 Gy/gün dozunda 5 gün radyoterapi alan ratların günlük besinlerine alfa-tokoferol ve beta-carotene gibi antioksidanların katılmasının, ratların günlük tükürük miktarlarının ve içeriklerinin radyoterapiden sonra değişmesini engellediğini belirtmişlerdir (16). Organizmada kullanılan alfa tokoferol ve L-karnitin güçlü antioksidan özellikteki bileşiklerdir ve özellikle lipid peroksidasyonunu belirgin şekilde inhibe etmektedirler (17,18). Potansiyel antioksidan özelliklerinden dolayı alfa tokoferol ve L-karnitin in oksidatif strese bağlı kronik hastalıkların önlenmesinde faydalı olduğu bilinmektedir (17). Çalışmamızda, radyasyon ile birlikte alfa-tokoferol verilen grupta fokal asini kaybı ve boşaltıcı duktus hasarında; radyasyon yanında L-karnitin verilen grupta boşaltıcı duktus hasarında ve seröz hücrelerde şişme dejenerasyonunda azalma görülmüştür. Alfa-tokoferol ve L-karnitinin kombine uygulandığı grupta ise fokal asini kaybı, binükleasyon ve boşaltıcı duktus hasarında azalma görülmüştür. Çalışmamızda alfa-tokoferol ve L-karnitin in ayrı ayrı ve kombine olarak uygulanmasının, ratlarda radyoterapinin neden olduğu tükürük bezi hasarını histopatolojik düzeyde önlemeye yararlı olabildiği saptanmıştır. Kaynaklar 1. Ertekin MV, Karslıoğlu İ, Sezen O. Baş-boyun bölgesi radyoterapisi ve oral mukozit: gelişimi, önlenmesi ve tedavisi. Sendrom 2003; 15: 88-94 2. Rothwell BR. Prevention and treatment of the orofacial complications of radiotherapy. JADA 1987; 114: 316-322 3. Karslioglu I, Ertekin MV, Kocer I, Taysi S, Sezen O, Gepdiremen A, Balci E. Protective role of intramuscularly administered vitamin E on the levels of lipid peroxidation and the activities of antioxidant enzymes in the lens of rats made cataractous with gamma-irradiation. Eur J Ophthalmol 2004; 14: 478-485 4. Canturk NZ, Canturk Z, Utkan NZ, Yenisey C, Ozbilim G, Yildirir C, Yalman Y. Cytoprotective effects of alpha tocopherol against liver injury induced by extrahepatic biliary obstruction. East Afr Med J 1998; 75: 77-80 5. Osakada F, Hashino A, Kume T, Katsuki H, Kaneko S. Akaike A. Neuroprotective effects of alpha-tocopherol on oxidative stress in rat striatal cultures. Eur J Pharmacol 2003; 465: 15-22 6. Neuzil J, Tomasetti M, Mellick AS, Alleva R, Salvatore BA, Birringer M, Fariss MW. Vitamin E analogues: a new class of inducers of apoptosis with selective anti-cancer effects. Curr Cancer Drug Targets 2004; 4: 355-72 7. Abok K, Brunk U, Jung B, Ericsson J. Morphologic and histochemical studies on the differing radiosensitivity of ductular and acinar cells of the rat submandibular gland. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol 1984; 45: 443-460 8. Vissink A, Gravenmade EJ, Ligeon EE, Konings AWT. A functional and chemical study of radiation effects on rat parotid and submandibular/sublingual glands. Radiat Res 1990;124: 259-265 9. Nagler RM, Baum BJ, Fox PC. Acute effects of X irradiation on the function of rat salivary glands. Radiat Res 1993; 136: 42-47 10. Takeda I, Kizu Y, Yoshitaka O, Saito I, Yamane GY. Possible role of nitric oxide in radiation-induced salivary gland dysfunction. Radiat Res 2003; 159(4): 465-470 11. Philips RM. X-ray-induced changes in function and structure of the rat parotid gland. J Oral Surg 1970; 28: 432-437 12. Vissink A, Gravenmade EJ, Ligeon EE, Konings AWT. Effects of splitdose X irradiation on rat salivary gland function. Radiat Res 1991;127: 52-57 13. Vissink A, Kalicharan D, S-Gravenmade EJ, Jongebloed WL, Ligeon EE, Nieuwenhuis P, Konings AW. Acute irradiation effects on morphology and function of rat submandibular glands. J Oral Pathol Med. 1991; 20: 449-456 14. Sun J, Chen Y, Li M, Ge Z. Role of antioxidant enzymes on ionizing radiation resistance. Free Radic Biol Med. 1998; 24: 586-593 15. Weiss JF, Landauer MR. Protection against ionizing radiation by antioxidant nutrients and phytochemicals. Toxicology 2003;189: 1-20 16. Funegard U, Johansson I, Malmer B, Henriksson R, Ericson T. Can alpha-tocopherol and beta-carotene supplementation reduce adverse radiation effects on salivary glands?. Eur J Cancer 1995 ;31A: 2347-2353 17. Bregelius-Flohe R, Traber MG. Vitamin E: function and metabolism. FASEB J. 1999;13: 1145-1155 18. Traber MG, Packer L. Vitamin E: Beyond antioxidant function. Am J Clin Nutr 1995; 62:1501-1509 Yazışma adresi: Dr.Özgür YÖRÜK Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı, Erzurum Tlf: 0 442 236 1212-1061 Gsm: 0533 355 9104 e-posta: dryoruk_40@hotmail.com